專利名稱：用于檢測和定量β－內(nèi)酰胺青霉素的方法和試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于檢測和定量β-內(nèi)酰胺青霉素的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶聯(lián)物(conjugate)和抗體。
其中“檢測”是指定性分析物質(zhì)是否存在。
其中“測定”是指對物質(zhì)進行定量分析。
本發(fā)明希望對于主要的第一代β-內(nèi)酰胺青霉素如氨芐青霉素(ampicillin)、青霉素G、羥氨芐青霉素(amoxycillin)、鄰氯青霉素(cloxacillin)、雙氯青霉素(dicloxacillin)和苯唑青霉素(oxacillin)具有廣譜的適用性，但也并不限于這些特定的β-內(nèi)酰胺青霉素。
出于預(yù)防和治療的雙重目的，而通常在畜牧業(yè)中使用抗生素。β-內(nèi)酰胺類抗生素作為生長增強劑一般用于肉和乳品工業(yè)。這類抗生素，也被稱為青霉素，通常被用來治療奶牛的乳腺炎，以此提高牛奶產(chǎn)量和牛的產(chǎn)奶期。β-內(nèi)酰胺也可添加在用于促進家禽和豬生長的動物飼料中?？股氐氖褂?，通過預(yù)防這類動物中的疾病或抑制腸中天然菌群的活性，使得動物生長到適銷大小的速度比不使用這類生長增強劑的動物快。
然而，當β-內(nèi)酰胺殘留在肉和乳制品中時，會帶來相關(guān)的問題。與接觸任何抗生素一樣，人連續(xù)接觸β-內(nèi)酰胺可導致用于治病的藥物的效力降低，這是因為致病菌形成了耐藥菌株。消費食品中存留的β-內(nèi)酰胺也能導致青霉素敏感人群的過敏反應(yīng)。含有這類抗生素的乳制品也會干擾加工過程中所用的細菌培養(yǎng)物。
因此，在整個歐洲共同體(European Community)推行了嚴格的準則，這些準則規(guī)定了在奶和肉中停用β-內(nèi)酰胺的時間以及最高推薦濃度(MRLs)。對奶和肉樣品進行常規(guī)檢測，以確保其遵守該EC法規(guī)。采用各種方法來檢測如β-內(nèi)酰胺的抗生素。這些檢測多數(shù)是基于微生物抑制檢測，這種檢測耗時并僅對個別β-內(nèi)酰胺具有特異性。因此，有必要開發(fā)出一種用于快速檢測奶和肉品中β-內(nèi)酰胺的方法，如果該方法通用，即可檢測大多數(shù)(如果不是全部時)β-內(nèi)酰胺抗生素，則將特別有價值。
已進行了許多努力，嘗試著在β-內(nèi)酰胺致敏的動物中生成(raise)抗體，目的是建立用于檢測β-內(nèi)酰胺的一般的免疫分析法(immunoassay)。這種方法的第一階段是產(chǎn)生可在動物宿主中誘發(fā)免疫應(yīng)答的免疫原。但這也存在問題，因為β-內(nèi)酰胺環(huán)在與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的過程中不能保持完整。已知的可在開放的β-內(nèi)酰胺環(huán)上進行偶聯(lián)的方法參見US 4,347,312A、US5，128,240A、de Haan等(1985年)和Faghihi Shirazi等(1991年)中的描述。這可以產(chǎn)生對開放形式的β-內(nèi)酰胺環(huán)敏感的抗血清，但是不一定對一般的環(huán)結(jié)構(gòu)敏感。
另外，例如也可對閉合的β-內(nèi)酰胺環(huán)上的游離羧基進行酯化，參見EP309299-A和Usleber等(1994年)中的描述。對以這種方式偶聯(lián)的β-內(nèi)酰胺抗生素而生成的抗血清，僅對?；鶄?cè)鏈特異并且僅與具有類似側(cè)鏈的其他β-內(nèi)酰胺抗生素發(fā)生交叉反應(yīng)，例如異惡唑基青霉素。另外，也可通過6-氨基青霉烷酸上的6-氨基進行偶聯(lián)，例如EP 309299A和de Leuw等(1997年)中的描述。在這種情況下，β-內(nèi)酰胺環(huán)在偶聯(lián)過程中可以保持完整，此時抗體與主要的第一代β-內(nèi)酰胺有高度的交叉反應(yīng)性。β-內(nèi)酰胺青霉素上的其它潛在偶聯(lián)位置是青霉素的D-α-氨基乙酰氨基上的α-氨基，例如Nagakura等(1991年)所描述的。Nagakura等(1991年)披露的細胞系，Abp4和Abp7，涉及半抗原和采用MBS(馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺)交聯(lián)劑的偶聯(lián)物，該文獻推斷其中一個細胞系(Abp4)可識別噻唑烷環(huán)，而另一細胞系(Abp7)可識別?；鶄?cè)鏈。Abp4與青霉素G、6-氨基青霉烷酸和某些頭孢菌素發(fā)生交叉反應(yīng)，而Abp7是高度特異性的，它與第一代β-內(nèi)酰胺的交叉反應(yīng)性很小或沒有反應(yīng)性。
本發(fā)明描述了新的半抗原(氨芐青霉素衍生物)在青霉素的D-α-氨基乙酰氨基上的α-氨基處與賦予抗原性(antigenicity-conferring)的載體物質(zhì)發(fā)生的偶聯(lián)作用，產(chǎn)生免疫原。本發(fā)明還描述了如何將針對這種免疫原產(chǎn)生的抗體用于開發(fā)可用來檢測奶和肉等中β-內(nèi)酰胺抗生素的存在的通用分析方法(assay)。
發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供了包括6-[D-α-氨基乙酰氨基]青霉素衍生物的半抗原，所述青霉素衍生物在α-氨基上與取代或未取代的苯基二醛(phenyldicarbaldehyde)交聯(lián)，其中苯基二醛選自取代或未取代的鄰苯二醛、取代或未取代的間苯二醛和取代或未取代的對苯二醛。
代表性的6-[D-α-氨基乙酰氨基]青霉素衍生物具有下式結(jié)構(gòu)，其中偶聯(lián)位置如箭頭所示 苯基二醛優(yōu)選為取代或未取代的對苯二醛，最優(yōu)選為未取代的對苯二醛。適宜的取代包括在對位和鄰位進行醛、硫代異氰酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺官能基的加成。
在適宜的溶劑，例如二甲基甲酰胺和二甲亞砜中，取代或未取代的苯基二醛與6-[D-α-氨基乙酰氨基]青霉素衍生物反應(yīng)可制得半抗原。
在另一方面，本發(fā)明涉及包括與賦予抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的本發(fā)明的半抗原的免疫原。所述載體物質(zhì)優(yōu)選為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成的多肽或半合成的多肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及抗(raised against)本發(fā)明的免疫原的抗體，該抗體可與完整的β-內(nèi)酰胺環(huán)中的至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位(epitope)結(jié)合。所述抗體優(yōu)選固定在支持底物(backing substrate)上。
本發(fā)明還提供制備所述抗體的方法，該方法包括下列步驟經(jīng)重復(fù)給予本發(fā)明的免疫原使動物免疫(immunise)，所述動物優(yōu)選為脊椎動物、最優(yōu)選為哺乳動物；從免疫動物中收集所形成的血清抗體。優(yōu)選地，該方法還包括將所述血清抗體固定到支持底物上，所述底物優(yōu)選為固體載體(solidsupport)，最優(yōu)選為聚苯乙烯固體載體。所述抗體優(yōu)選為多克隆抗體。所述抗體也可是單克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明包括包含本發(fā)明半抗原的偶聯(lián)物，其中半抗原與可檢測到的標記物共價結(jié)合。優(yōu)選地，所述標記物選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或其混合物。優(yōu)選地，所述標記物為酶，優(yōu)選為過氧化物酶，最優(yōu)選為辣根過氧化物酶(HRP)。或者或另外地，發(fā)光物質(zhì)可以是生物發(fā)光、化學發(fā)光或熒光物質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明包括檢測或定量樣品中β-內(nèi)酰胺青霉素的方法，該方法包括將樣品與本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物和本發(fā)明抗體或其混合物接觸；檢測或定量結(jié)合的偶聯(lián)物；從校準曲線中推出樣品中β-內(nèi)酰胺青霉素的存在及含量。
所述抗體優(yōu)選為多克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明包括用于檢測或定量β-內(nèi)酰胺青霉素的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物，以及本發(fā)明的抗體或其混合物。所述試劑盒可任選地包括檢測或定量樣品中β-內(nèi)酰胺青霉素的偶聯(lián)物和抗體的使用說明書。
優(yōu)選地，所述樣品為溶液形式，如生物流體，包括奶；或者細胞組織的切片物(cutting)，例如肉。
在本發(fā)明的方法和試劑盒中，可在α-氨基位置上進行交聯(lián)的(免疫原和偶聯(lián)物)各自的交聯(lián)劑可以相同或不同。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物在測試樣品如肉和奶，用于檢測或定量β-內(nèi)酰胺青霉素中的用途。
本發(fā)明涉及新的半抗原，它能與具有抗原性的常規(guī)載體物質(zhì)偶合制得新穎的免疫原。然后將所得的免疫原給予動物，優(yōu)選為脊椎動物宿主，最優(yōu)選為哺乳動物宿主，以誘發(fā)生成期望的多克隆抗血清，該抗血清可用來開發(fā)出以偶聯(lián)物(半抗原-標記物)或其混合物為檢測試劑的檢測β-內(nèi)酰胺青霉素的通用免疫分析法。
下表中總結(jié)了氨芐青霉素和其它β-內(nèi)酰胺青霉素的化學結(jié)構(gòu)，其通式如下
表1 β-內(nèi)酰胺青霉素的化學結(jié)構(gòu)
本發(fā)明的目的是制備對β-內(nèi)酰胺青霉素基團的整個均有特異性的抗體。為達到這種廣譜特異性，可用雙官能交聯(lián)劑如取代或未取代的苯基二醛，優(yōu)選為取代或未取代的對苯二醛，其中未取代的對苯二醛如附

圖1所示，通過氨基，對氨芐青霉素進行衍生化處理。在衍生化期間保存氨芐青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，這樣以確保保留青霉素共有的抗原決定部位。
盡管本發(fā)明的半抗原(氨芐青霉素衍生物)可提供確定的結(jié)構(gòu)性抗原決定部位，但是它本身并不具備免疫原性，因此必須要偶聯(lián)到適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)上，這樣所形成的免疫原才會在注射到宿主動物體內(nèi)后誘發(fā)免疫應(yīng)答。適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)包括蛋白或蛋白片段如白蛋白、血清蛋白例如球蛋白、目鏡蛋白(ocular lens protein)和脂蛋白。示例性的蛋白載體包括牛血清白蛋白、卵清蛋白(egg ovalbumin)、牛丙種球蛋白(bovinegamma globulin)、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白(keyhole limpethaemocyanin)等?；蛘撸部刹捎镁哂凶銐驍?shù)量的可利用胺基的合成聚氨基酸，例如賴氨酸，也可以是具有反應(yīng)性官能團的其他合成或天然聚合物。具體地說，碳水化合物(carbohydrate)、酵母或多糖均可與半抗原偶聯(lián)而形成本發(fā)明的免疫原。
半抗原(氨芐青霉素衍生物)也可與標記物偶聯(lián)而形成可用于免疫分析的檢測試劑，所述標記物如酶(例如辣根過氧化物酶)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)。例如，熒光物質(zhì)可以是熒光素或其衍生物的一價殘基。
按附圖1所示的反應(yīng)路線1，制備半抗原及其與載體物質(zhì)或標記物(例如酶或其他標記)的偶聯(lián)物。因此，例如，室溫下將氨芐青霉素與對苯二醛在二甲基甲酰氨中反應(yīng)18小時，可得到Schiff堿中間體。在pH 4-5的醋酸鹽緩沖液中，該中間體與載體物質(zhì)(例如牛血清白蛋白)或標記物(例如酶或其他標記)反應(yīng)，然后用例如氰硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)還原Schiff堿，可分別得到本發(fā)明的免疫原和本發(fā)明的偶聯(lián)物。
為了確定半抗原是否與載體物質(zhì)形成了足夠的偶聯(lián)，可在進行免疫之前，采用基體輔助的UV激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI MS)對每一免疫原進行評估。就優(yōu)選的載體物質(zhì)，牛血清白蛋白，而言，優(yōu)選每載體分子最少6個半抗原分子。
為了形成多克隆的抗血清，將免疫原與Freund佐劑(Freund’s Adjuvant)混和，然后將所得混合物注入宿主動物如兔、羊、小鼠、豚鼠或馬體內(nèi)。進一步注射(促升(boost))后，取血清樣品供抗體滴定評估。當達到最佳滴定時，將宿主動物體放血以產(chǎn)生適宜量的特異性抗血清。所需的抗體純化程度取決于具體的應(yīng)用目的。對于大多數(shù)應(yīng)用而言，根本無需進行純化，但是對于其他情況，如抗體需固定在固體載體上的情況，則需要進行純化步驟來除去不需要的物質(zhì)并減少或除去非特異性結(jié)合。
對氨芐青霉素產(chǎn)生的抗體，在生化分析中可用作檢測生物流體如奶中和食品如肉中是否存在β-內(nèi)酰胺青霉素的試劑。
附圖簡述圖1為反應(yīng)路線1，它表示的是制備本發(fā)明的半抗原，接著與載體物質(zhì)或標記物偶合，形成本發(fā)明免疫原或本發(fā)明偶聯(lián)物的總反應(yīng)路線。
圖2為微量滴定盤中進行的競爭性ELISA滴定法示意圖。
圖3為競爭性ELISA的校準曲線。
圖4為采用每種β-內(nèi)酰胺青霉素作為標準品(standard)在ELISA中所得到的校準曲線。
實施例1制備半抗原在20℃通氮下，將183mg(1.364mmole)對苯二醛加到在10ml二甲基甲酰胺中的500mg(1.24mmole)氨芐青霉素三水合物溶液中?；旌衔锉芄獠⒃谑覝叵聰嚢?4小時。為確定反應(yīng)完全，可進行薄層色譜法(TLC)(80％氯仿，20％甲醇v/v)分析，顯示起始物質(zhì)沒有剩余，并且新斑點(spot)的極性比氨芐青霉素低。將制得的半抗原置于-20℃下在氮氣下貯藏(可穩(wěn)定1年)。
實施例2制備免疫原(半抗原-牛血清白蛋白)將實施例1制得的半抗原溶液滴加到10ml 0.1M醋酸鈉緩沖液(pH 4.1)中的200mg牛血清白蛋白(BSA)溶液中。將混合物避光并在室溫下攪拌4小時。加入30mg氰硼氫化鈉，對Schiff堿進行還原處理。將混合物攪拌90分鐘，并加入5mg氰硼氫化鈉。再攪拌10分鐘后，4℃下用磷酸鹽緩沖的鹽水(pH7.2)對混合物進行透析(dialyse)24小時(3個轉(zhuǎn)換)。用MALDI MS測量與BSA偶合的半抗原量，結(jié)果表明半抗原分子與BSA分子的偶聯(lián)比例為6.3∶1。
實施例3制備偶聯(lián)物(半抗原-HRP)按類似于制備免疫原的方法，進行實施例1制得的半抗原與HRP的偶聯(lián)。取實施例1制得的半抗原溶液40μl，加到2ml 0.1M醋酸鈉緩沖液(pH4-5)中的20mg HRP(辣根過氧化物酶)中?；旌衔锉芄獠⒃谑覝叵聰嚢?小時。加入氰硼氫化鈉(0.7mg)后，將混合物攪拌90分鐘。用2個PD-10柱(Pharmacia Biotech)對所得偶聯(lián)物進行純化，避光并于2-8℃下用雙重去離子水透析過夜。
實施例4
制備對抗實施例2的免疫原而產(chǎn)生的抗體用Freund完全佐劑(FCA)配制實施例2的免疫原的水溶液，得到在50％(v/v)FCA中的含有2mg/ml免疫原的乳液。用該乳液對3只羊進行免疫，在每只動物腹脅上的4個位置分別皮下注射0.25ml溶液。后繼免疫(促升)采用經(jīng)50％(v/v)Freund不完全佐劑(FIA)乳化的1mg/ml免疫原，并以同樣方式隔月給予動物，共1年。在每次促升后的7-14天采取血樣。對每一樣品進行處理以產(chǎn)生抗血清，它再經(jīng)辛酸和硫酸銨沉淀純化而得到免疫球蛋白G(IgG)部分。按下述方法，采用競爭性ELISA微量滴定盤分析法(microtiterplate assay)對IgG部分進行評估。
實施例5開發(fā)競爭性ELISA法進行檢測板滴定(checkerboard titration)，測定最佳捕捉抗體和偶聯(lián)物(氨芐青霉素-HRP)濃度。采用連續(xù)稀釋法，在10mM的Tris(pH8.5)中配制每一待測抗血清的IgG部分(按實施例4制備)。用上述稀釋液涂覆(coat)增強結(jié)合的96孔聚苯乙烯微量滴定盤的孔(如圖2所示)，將滴定盤(125μl/孔)置于37℃下保溫2小時。滴定盤用Tris緩沖的鹽水(pH7.4，含有TweenTM20)(TBST)洗滌4次并輕打干燥(tapped dry)。將TBST中的50μl的10ng/ml氨芐青霉素溶液(在分析范圍之中)加到適當?shù)目字?圖2)。將50μl TBST加到剩余(對照)孔中。在含有EDTA、D-甘露醇、蔗糖、硫汞撒(thimerosal)和BSA的Tris緩沖液中(pH7.2)配制偶聯(lián)物(氨芐青霉素-HRP)的連續(xù)稀釋液，然后將75μl的每種稀釋液加到孔中(如圖2所示)。將滴定盤于37℃下保溫2小時。用TBST在10分鐘內(nèi)洗滌6次，除去過量的沒結(jié)合的偶聯(lián)物。向滴定盤的每一孔中加入125μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，然后將滴定盤于室溫、黑暗條件下保溫15-20分鐘。向每孔中加入125μl 0.2M的H2SO4以終止反應(yīng)。然后用微量滴定盤讀數(shù)器測量450nm處的吸光度。捕捉抗體的1/1000稀釋液(dilution)和偶聯(lián)物的1/15,000稀釋液，產(chǎn)生了可接受的最高吸光度2.15，而且在0-10ng/ml抗體濃度之間的吸光度明顯降低了80％。
用如上述的在Tris(pH8.5)中的抗-氨芐青霉素抗血清的IgG部分1/1000的最佳涂覆稀釋液涂覆微量滴定盤。在TBST中配制氨芐青霉素(鈉鹽)的標準溶液，并在下列濃度下應(yīng)用0，1，5，10，50，100，200，500ng/ml。由所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)得到的靈敏的校準曲線如圖3所示，其中B為xng/ml氨芐青霉素于450nm測定的吸光度值，B0為0ng/ml氨芐青霉素于450nm的吸光度值。
實施例6氨芐青霉素免疫分析法與每種β-內(nèi)酰胺青霉素的交叉反應(yīng)性在TBST中配制芐基青霉素(青霉素G-PenG)、羥氨芐青霉素(Amox)、鄰氯青霉素(Clox)、雙氯青霉素(Diclox)和苯唑青霉素(Oxa)的標準溶液，濃度為0，1，5，10，50，100，200和500ng/ml。在氨芐青霉素免疫分析中，使用每種β-內(nèi)酰胺青霉素標準品制得校準曲線(圖4)，用于測定免疫分析與每種青霉素的交叉反應(yīng)性。結(jié)果見表2，按下式計算交叉反應(yīng)性％CR＝IC50氨芐青霉素/IC50青霉素×100其中％CR表示百分交叉反應(yīng)性，IC50氨芐青霉素為引起50％吸收信號位移(displacement)時氨芐青霉素的濃度，IC50青霉素為評估％CR時引起50％信號位移時β-內(nèi)酰胺青霉素的濃度。
氨芐青霉素免疫分析法與每種β-內(nèi)酰胺青霉素存在高度的交叉反應(yīng)性(表2)。高度的交叉反應(yīng)性表示交叉反應(yīng)性大于35％，相對于氨芐青霉素的100％而言。該免疫分析法最高的特異性為氨芐青霉素(100％CR)，羥氨芐青霉素(87％CR)和芐基青霉素(benzylpenicillin)(72％CR)。由于奶中羥氨芐青霉素、氨芐青霉素和芐基青霉素的最高建議濃度(MRL)為4μg/kg，而苯唑青霉素、鄰氯青霉素和雙氯青霉素的MRL為30μg/kg，因此上述測定的每種β-內(nèi)酰氨青霉素的IC50值顯示所述ELISA適于用作依照EC規(guī)則2377/90的β-內(nèi)酰胺抗生素的通用免疫分析法。
表2氨芐青霉素免疫分析法與β-內(nèi)酰胺青霉素的交叉反應(yīng)性
實施例7采用通用免疫分析法定量分析奶中的β-內(nèi)酰胺抗生素采用標準抗微生物方法，檢測多種奶樣品中是否存在β-內(nèi)酰胺抗生素。采用本發(fā)明ELISA對這些標示值的樣品進行分析。按實施例5方法涂覆微量滴定盤并配制試劑。如下適用免疫分析法。用蒸餾水溶解脫脂奶粉，制得1％的奶緩沖液(pH7.4)，取25μl該緩沖液加到滴定盤孔中。加入奶緩沖液后，加載氨芐青霉素標準品(每孔25μl)，接下來加入奶樣品(每孔25μl)。標準品和樣品均制備雙份。然后每孔加入75μl偶聯(lián)物(氨芐青霉素-HRP)。將微量滴定盤置于37℃保溫2小時，使反應(yīng)完全。待反應(yīng)完全后，按實施例5的方法洗滌滴定盤并顯色(develop)。分析結(jié)果如表3所示，其中給出了本發(fā)明所述的β-內(nèi)酰胺ELISA測試的多種奶樣品的計算濃度。所述的β-內(nèi)酰胺ELISA用于檢測已知不含β-內(nèi)酰胺的奶樣品(樣品1-6)以及已知含有β-內(nèi)酰胺的奶樣品(樣品7和8)。ELISA結(jié)果確認樣品1-6中β-內(nèi)酰胺抗生素的含量為陰性，而樣品7和8的結(jié)果為陽性。
示于表3中的ELISA結(jié)果證實，該免疫分析方法可成功地用于檢測牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺。已知陰性的樣品經(jīng)本發(fā)明ELISA確認為陰性，而已知陰性的樣品經(jīng)本發(fā)明ELISA確認為陰性。
表3
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權(quán)利要求
1.包括6-[D-α-氨基乙酰氨基]青霉素衍生物的半抗原，所述青霉素衍生物在α-氨基上與取代或未取代的苯基二醛交聯(lián)，其中苯基二醛選自取代或未取代的鄰苯二醛、取代或未取代的間苯二醛和取代或未取代的對苯二醛。
2.如權(quán)利要求1的半抗原，其中苯基二醛為取代或未取代的對苯二醛，優(yōu)選為未取代的對苯二醛。
3.制備如權(quán)利要求1或2的半抗原的方法，其中取代或未取代的苯基二醛在合適的溶劑中與6-[D-α-氨基乙酰氨基]青霉素衍生物反應(yīng)。
4.包括如權(quán)利要求1或2中的半抗原的免疫原，其中半抗原與賦予抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合。
5.如權(quán)利要求4的免疫原，其中載體物質(zhì)為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽或半合成多肽。
6.抗如權(quán)利要求4或5的免疫原的抗體，其中抗體能與完整的β-內(nèi)酰胺環(huán)中的至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6的抗體，其中抗體固定在支持底物上。
8.制備如權(quán)利要求6或7中的抗體的方法，該方法包括將如權(quán)利要求4或5的免疫原重復(fù)給予動物而使動物免疫，以及從免疫動物中收集所得到的血清抗體。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中該方法還包括將所述血清抗體固定在支持底物上。
10.包括如權(quán)利要求1或2的半抗原與可檢測到的標記物共價結(jié)合的偶聯(lián)物。
11.如權(quán)利要求10的偶聯(lián)物，其中標記物選自酶，優(yōu)選為過氧化物酶，最優(yōu)選為辣根過氧化物酶；發(fā)光物質(zhì)，優(yōu)選選自生物發(fā)光、化學發(fā)光或熒光物質(zhì)；放射性物質(zhì)；或它們的混合物。
12.用于檢測和定量樣品中的β-內(nèi)酰胺青霉素的方法，該方法包括將樣品與如權(quán)利要求10或11的偶聯(lián)物或其混合物和與如權(quán)利要求6或7的抗體或其混合物接觸；檢測或定量結(jié)合的偶聯(lián)物；以及從校準曲線中推出樣品中β-內(nèi)酰胺青霉素的存在或含量。
13.用于檢測和定量β-內(nèi)酰胺青霉素的試劑盒，該試劑盒包括如權(quán)利要求10或11的偶聯(lián)物或其混合物，以及如權(quán)利要求6或7的抗體或其混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供包括6－[D－α－氨基乙酰氨基]青霉素衍生物的半抗原，所述青霉素衍生物在α－氨基上與取代或未取代的苯基二醛交聯(lián)。另外，本發(fā)明提供包括與賦予抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的前述半抗原的免疫原，包括與標記物結(jié)合的前述半抗原的偶聯(lián)物，以及抗前述免疫原的抗體，該抗體能與完整的β－內(nèi)酰胺環(huán)中的至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位結(jié)合。本發(fā)明還提供用于檢測或定量樣品中β－內(nèi)酰胺抗生素的方法和試劑盒，以及前述偶聯(lián)物和前述抗體在檢測或定量β－內(nèi)酰胺抗生素中的用途。本發(fā)明對主要的第一代β－內(nèi)酰胺具有廣譜特異性，并可用于檢測奶和肉等中殘留的β－內(nèi)酰胺抗生素的存在。
文檔編號C07D499/40GK1405563SQ02127338
公開日2003年3月26日 申請日期2002年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月2日
發(fā)明者羅伯特·I·麥康奈爾, 埃爾·O·本奇克, 斯蒂芬·P·菲茨杰拉德, 約翰·V·拉蒙特 申請人:蘭多克斯實驗室有限公司