專利名稱：具有抗hiv－1活性的異喹啉新化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及3-位取代的異喹啉新化合物。該類新化合物對HIV-1基因組TAR RNA具有結合作用，能夠抑制HIV-1 Tat蛋白與TAR RNA的結合，從而干擾病毒的復制，產生抗病毒活性。抑制HIV-1復制體外實驗結果表明，在不顯示毒性的劑量下，該類化合物顯示了很好的抗病毒活性，這與體外轉錄的實驗結果相吻合。同時該類化合物具有抗腫瘤作用。
HIV-1 TAR RNA是存在于HIV-1病毒mRNA上的一段基因組，當HIV-1Tat蛋白結合于TAR RNA時，激活了病毒的轉錄，使轉錄物延長，病毒得以復制。目前抗HIV-1藥物主要針對病毒復制和轉錄兩個階段的關鍵酶蛋白酶和逆轉錄酶。但這兩種酶由于病毒本身的變異和遺傳異質性而極易產生耐藥性。因此，研究者再次回到HIV-1病毒的基礎研究中，發(fā)現了TAR RNA和Tat蛋白結合在病毒生命中的重要作用。由此HIV-TAR RNA成為近年來研究的熱點。目前，國外正有一些研究機構從事TAR RAN為靶的抗艾滋病藥物研究；國內除本組外尚無人對該靶進行藥物設計的研究。因此，如以TAR RNA為研究靶，發(fā)現一種新的抗HIV-1的藥物，那么就可以達到醫(yī)治艾滋病患者的目的。
文獻中已經描述了大量的異喹啉化合物。具有鎮(zhèn)痛作用，抗病毒活性，抗腫瘤活性，調節(jié)免疫，中樞神經系統(tǒng)作用及抗菌，肌肉松弛作用。1-(4-甲基哌嗪基)-3-苯基異喹啉顯示了強抗腫瘤活性。二聚體萘基異喹啉類生物堿有良好的抗HIV-1、HIV-2的活性。
除了本發(fā)明化合物是新穎的以外，它們還被證明是有效地抗HIV-1作用的物質。因此它們可用于艾滋病治療。
本發(fā)明更確切地涉及(I)化合物。 其中R1所代表的基團選自COR3，其中R3代表氫原子，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)、單-(C1-C6)烷基氨基、單-(C1-C6)烷基胍基、二-(C1-C6)烷基胍基，各基團的烷基部分可以是直鏈或支鏈的，CONHR3其中R3是如上定義的，
R0所代表的基團選自氫，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基，COR3，其中R3是如上定義的。
R2所代表的基團選自氫，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基，COR3其中R3是如上定義的，Ra、Rb、Rc和Rd可以相同或不同，彼此獨立地所代表的基團選自氫、鹵素、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基?！渲懈魍榛糠挚梢允侵辨溁蛑ф湹?；——羥基、直鏈或支鏈的烷基羰基氧基、直鏈或支鏈(C1-C6)酰基、芳氧基和芳基——(C1-C6)烷氧基；——其中烷氧基部分可以是直鏈或支鏈的……。
所有化合物及其在藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽，毫無疑問-“芳基”被理解為苯基、萘基、四氫萘基、二氫萘基、茚基或2，3-二氫茚基，各自任選地被一個或多個相同或不同的基團取代，取代基選自鹵素、羥基、氰基、硝基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基；--其中各烷氧基部分可以是直鏈或支鏈的--，直鏈或支鏈(C1-C6)?；?、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基羰基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基羰基和氧代。
--“雜環(huán)”被理解為飽和或不飽和的單-或二-環(huán)基團，具有芳族和非芳族特征，具有5至12個環(huán)原子，含有一個、兩個或三個相同或不同的雜原子，雜原子選自氧、氮和硫，雜環(huán)被理解為可以任選地被一個或多個相同或不同的取代基取代，取代基選自鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、硝基、氧代和氨基(任意被一個或兩個直鏈或支鏈(C1-C6)烷基取代)。
在雜環(huán)中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃-4-酮、吡嗪基、嘧啶基、異惡唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。
在藥學上可接受的酸中，可以不加任何限制地提到鹽酸、氰溴酸、硫酸、膦酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、抗壞血酸、草酸、甲磺酸、樟腦酸等。
在藥學上可接受的堿中，可以不加任何限制地提到氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙胺、叔丁胺等。
按照一種有利的變例，優(yōu)選的本發(fā)明化合物是，其中，R1是COR3其中R3是如式(I)定義的。按照一種有利的變例，優(yōu)選的取代基R1是CONR3aR3b其中當R3b代表氫原子時，R3a代表單鏈(C1-C6)烷基氨基、單鏈(C1-C6)烷基胍基；R3a和R3b相連時，代表哌嗪。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的取代基R2是氫原子和單一直鏈(C1-C6)烷基。尤其有利的是R2代表氫原子和甲基。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的化合物是3-乙氨基-異喹啉-3-甲酰胺3-丙氨基-異喹啉-3-甲酰胺3-(2-胍基)-乙基-異喹啉-3-甲酰胺3-(3-胍基)-丙基-異喹啉-3-甲酰胺優(yōu)選化合物以及它們與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽構成本發(fā)明的完整內容的一部分。
本發(fā)明還涉及式(I)化合物的制備方法，其特征在于使用(II)化合物作為原料 其中Ra、Rb、Rc和Rd是如上定義的。
按照有機合成中的Pictet-Spengler反應條件，使該式(II)化合物與(III)化合物反應R2CHO(III)其中，R2是如式(I)定義的。
得到式(IV)化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd和R2是如上定義的。
按照有機合成中常規(guī)成酯條件，與甲醇反應得到式(V)化合物。 其中Ra、Rb、Rc、Rd和R2是如上定義的。
按照有機合成中常規(guī)甲基化條件，與碘甲烷反應得到式(VI) 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0和R2是如上定義的。
受到有機合成中常用的氧化劑的作用，得到式(VII)化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0和R2是如上定義的。
按照常規(guī)的酰胺化條件，用式(VIII)化合物處理R3aNHR3b(VIII)其中R3a和R3b是如上定義的。
得到式(I/a)化合物，即式(I)化合物的一個特定例子 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0、R2、R3a和R3b是如上定義的。
將該式化合物置于式(IX)化合物的作用下[H2N-C(-SCH3)＝NH]2·H2SO4(IX)得到式(I/b)化合物，即式(I)化合物的一個特定例子
其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0、R2和R3a是如上定義的。
化合物(I/a)和(I/b)構成本化合物的整體。如果必要的話，這些化合物按照常規(guī)的純化工藝進行純化，如果需要的話，可以任選地用藥學上可接受的酸或堿轉化為加成鹽。
式(II)、(III)、(VIII)、(IX)化合物是商業(yè)上可得到的化合物，或者是按照有機合成的已知方法得到的化合物。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，包含至少一種式(I)化合物或與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽作為活性成分，單獨或結合一種或幾種藥學上可接受的、惰性的、無毒的賦形劑或載體。
在按照本發(fā)明的藥物組合中，可以特別提到適用于口服、胃腸外(靜脈內、肌肉或皮下)，經皮或透皮、經鼻、直腸、經舌、經眼或呼吸給藥的那些，尤其是片劑或糖衣丸、舌下片、扁囊劑、膠囊劑、錠劑、栓劑、霜劑、軟膏劑、皮膚凝膠、可注射成可飲用制劑、氣霧劑、滴眼劑或滴鼻劑等。
本發(fā)明化合物具有抗HIV-1活性。含有一至少一種式(I)化合物的藥物組合因此可以用于HIV-1的治療。
作為藥物，有用劑量因患者年齡與體重、給藥途徑、疾病性質與嚴重性和所接受的任何其它治療而異。
下列實施例闡述而絕非限制本發(fā)明所用原料和/或試劑是已知的產品，或者是按照已知操作制備的產品。
實施例和合成步驟中所述化合物的結構是按照常規(guī)的光譜技術(紅外，NMR、FAB-質譜……)測定的。
實施例1 3-乙氨基-異喹啉-3-甲酰胺步驟A1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-甲酸在反應瓶中加入L-苯丙氨酸2g(1.2mmol)，36％的HCHO 4.6ml(4mmol)和濃HCl 15.4ml(0.17mol)。在蒸氣浴上加熱1.5小時并間歇振蕩。冷卻至室溫。再加入36％的HCHO 2ml(1.4mmol)和濃HCl 4ml(2.8mmol)，加熱3小時。冷卻至室溫后過濾。濾餅溶解在2.7ml熱水中，再加入乙醇5.3ml。趁熱加入10％的氨水，用PH試紙檢驗至中性。冷卻后用乙醇-水重結晶過濾，用乙醇洗滌、干燥得白色晶體1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸1.32g，產率615％，mp 335℃。
步驟B1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-甲酸甲酯將0.5g步驟A中得到的產物溶于12ml無水甲醇中。在-10℃下(冰鹽浴)緩慢攪拌加入SOCl20.25ml。室溫持續(xù)攪拌4小時。70-80℃回流6小時，減壓蒸去溶劑，干燥得1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸甲酯鹽酸鹽。干燥產物加2ml水攪拌，用飽和K2CO3中和。分別用25ml、20ml、20ml乙醚萃取三次，收集乙醚萃取液。用TLC檢測(乙酸乙酯∶石油醚∶氨水＝1∶1∶1d v/v/v)，加無水氯化鈣干燥過夜。過濾，減壓蒸除乙醚，得黃色油狀物1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸甲酯0.42g，產率77.8％。
步驟C異喹啉-3-甲酸甲酯將1.1g步驟B中得到的產物溶于69ml二甲苯中，同時加入0.69g(22mmol)升華硫。微沸加熱8.5小時。用TLC檢測原料消失(乙酸乙酯∶石油醚∶氨水＝1∶1∶1d v/v/v)。減壓蒸除二甲苯，用柱色譜法分離，洗脫劑為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶0.5 v/v。得白色針晶異喹啉-3-羧酸甲酯0.55g，產率51.07％，mp69-70℃(文獻mp 70-71℃)。
步驟D3-乙氨基-異喹啉-3-甲酰胺在干燥三頸燒瓶中加入1.2ml(0.018mmol)乙二胺。用4ml氯仿+1滴甲醇溶解異喹啉-3-羧酸甲酯0.15g(0.8mmol)。在2-2.5小時內滴加到反應瓶中。反應完畢，減壓蒸除溶劑。加入0.5ml水，用5ml×3氯仿萃取，合并氯仿層，蒸除溶劑。柱色譜分離(氯仿∶甲醇＝1∶0.1 v/v)得預期產物0.08g，產率46.4％。
熔點黃色油狀EI-MS216(M+H)+IR υN-H3365；υC＝O16801H-NMR9.10(s，1H，1-H)；8.55(s，1H，4-H)；7.97(d，J＝7.5Hz，1H，8-H)；7.92(d，1H，5-H，J＝7.5Hz)；7.68(m，2H，6-H；7-H)3.57(q，2H，2′-H)；2.96(t，2H，3′-H)；1.96(s，2H，4′-NH2)實施例23-丙氨基-異喹啉-3-甲酰胺操作同實施例1，在步驟D中使用1，3-丙二胺作為反應物。
熔點黃色油狀EI-MS229(M)+IR υN-H3370；υC＝O16581H-NMR9.39(s，1H，1-H)；8.56(s，1H，4-H)；8.26(d，8-H，J＝7.8Hz，1H)8.20(d，J＝7.8Hz，1H，5-H)；7.85(m，2H，6-H；7-H)；3.43(m，2H，2′H)2.74(t，2H，3′-H)1.76(m，2H，4′-H)實施例33-(2-胍基)-乙基-異喹啉-3-甲酰胺步驟G稱取S-甲異硫脲硫酸鹽0.021g，加0.03ml水和0.03ml 2M氫氧化鈉，快速攪拌下滴加實施例1中得到的化合物0.1g混懸于2ml H2O的混合液，加畢，室溫攪拌兩天，4℃放置過夜，過濾，沉淀分別用少量的水和甲醇洗滌，收集沉淀，真空干燥，得到預期化合物。
熔點312-313℃FAB-MS＞250℃實施例4 3-(3-胍基)-丙基-異喹啉-3-甲酰胺操作同實施例3，在步驟G中使用實施例2得到的化合物作為反應物。
熔點＞250℃FAB-MS271本發(fā)明化合物的藥理研究。
實施例5 抗癌篩選試驗，分別用KB、Hela、HL-60、BGC及BEL-7402腫瘤細胞進行試驗，用MTT法或SRB法。
MTT法分別將生長狀態(tài)良好的、處于對數生長期的HL-60、Bel-7402、KB及Hela細胞以1×104個/mL濃度接種于96孔板，37℃5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄舊液，換新培養(yǎng)液，加入滅菌處理的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，棄去培養(yǎng)液，每孔加20mL含5mg/mL MTT的RPMI 1640(含10％小牛血清)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心，2500rpm，20min，吸出上清，室溫晾干。加入一定量的二甲基亞砜溶解紫色殘留物，于570nm處酶標儀上測定吸收值。
SRB法同MTT法一樣。
分別將生長狀態(tài)良好的、處于對數生長期的HL-60、Bel-7402、KB及Hela細胞以1×104個/mL濃度接種于96孔板，37℃5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄舊液，換新培養(yǎng)液，加入滅菌處理的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，取上清，每個小孔中加入100μl 10％ TCA(三氯醋酸)，靜置5分鐘后，于4℃放置1小時固定。然后倒掉固定液，每個小孔用水洗5遍。室溫干燥后，每孔加入0.4％ SRB100μl，室溫放置10分鐘后，用1％ HOAc(醋酸)洗5遍，空氣干燥，加入10mMTris 200μl/每孔，振蕩溶解，于540nm單波長處測定OD值實施例6轉錄水平拮抗HIV-1 Tat/TAR RNA的結合我們成功構建了兩個質粒。一個是Tat基因表達質粒(plasmid I)，另一個是以HIV-1 LTR片段為啟動子，含有氯霉素乙酰轉移酶(CAT)報告基因的質粒(plasmid II)。轉化大腸桿菌后，經酶切鑒定得到陽性克隆。利用磷酸鈣介導這兩種質粒共轉染293細胞，24小時后加入3種樣品，濃度均為30μmol/L。收集48小時培養(yǎng)上清液，用CAT ELISA試劑盒在405/490nm波長下檢測細胞上清液中CAT活性。考察樣品對Tat-TAR相互作用的影響。
以未加樣品的plasmid I、II共轉染體系的CAT活性為100％，用相對活性表示加樣共轉染體系的CAT活性。
實施例7抑制HIV-1復制體外試驗。
采用MT4細胞與HIV IIIB株進行試驗，使用的病毒量分為100TCID50和1000TCID50(tissue cultured infection dose)。MT4細胞和HIV IIIB株與不同劑量下的藥物培養(yǎng)5天后，在顯微鏡下觀察CPE(細胞病變——空泡、腫脹、融合等)。設立五組實驗對照藥物+MT4細胞空白對照MT4細胞+HIV IIIB陰性對照水+MT4細胞+HIV IIIB陽性對照AZT+MT4細胞+HIV IIIB實驗組藥物+MT4細胞+HIV IIIB
權利要求
1.式(I)化合物其中 R1所代表的基團選自COR3，其中R3代表氫原子，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)、單-(C1-C6)烷基氨基、單-(C1-C6)烷基胍基、二-(C1-C6)烷基胍基，各基團的烷基部分可以是直鏈或支鏈的。CONHR3其中R3是如上定義的。R0所代表的基團選自氫，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基，COR3，其中R3是如上定義的。R2所代表的基團選自氫，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基，COR3中R3是如上定義的。Ra、Rb、Rc和Rd可以相同或不同，彼此獨立地所代表的基團選自氫、鹵素、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基?！渲懈魍榛糠挚梢允侵辨溁蛑ф湹?；——羥基、直鏈或支鏈的烷基羰基氧基、直鏈或支鏈(C1-C6)?；?、芳氧基和芳基——(C1-C6)烷氧基；——其中烷氧基部分可以是直鏈或支鏈的……。所有化合物及其在藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽，毫無疑問—“芳基”被理解為苯基、萘基、四氫萘基、二氫萘基、茚基或2，3-二氫茚基，各自任選地被一個或多個相同或不同的基團取代，取代基選自鹵素、羥基、氰基、硝基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、氨基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基；——其中各烷氧基部分可以是直鏈或支鏈的——，直鏈或支鏈(C1-C6)?；⒅辨溁蛑ф?C1-C6)烷氧基羰基，直鏈或支鏈(C1-C6)烷基氨基羰基和氧代?！半s環(huán)”被理解為飽和或不飽和的單一或二-環(huán)基團，具有芳族和非芳族特征，具有5至12個環(huán)原子，含有一個、兩個或三個相同或不同的雜原子，雜原子選自氧、氮和硫，雜環(huán)被理解為可以任選地被一個或多個相同或不同的取代基取代，取代基選自鹵素、羥基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、直鏈或支鏈(C1-C6)烷氧基、硝基、氧代和氨基(任意被一個或兩個直鏈或支鏈(C1-C6)烷基取代。在雜環(huán)中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃-4-酮、吡嗪基、嘧啶基、異惡唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。
2.根據權力要求1的式(I)化合物，其特征在于R1代表COR3基，其中R3是如式(I)定義的。它們及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
3.根據權力要求1或2的式(I)化合物，其特征在于R1代表CONHR3a，R3a代表單鏈(C1-C6)烷基氨基、單鏈(C1-C6)烷基胍基。它們及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
4.根據權力要求1的式(I)化合物，其特征在于R2所代表的基團選自氫、直鏈或支鏈(C1-C6)烷基、COR3，其中R3是如上定義的。它們及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
5.根據權力要求1或4的式(I)化合物，其特征在于R2代表氫或甲基。它們及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
6.根據權力要求1的式(I)化合物，它是3-(2-胍基)-乙基-異喹啉-3-甲酰胺。它及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
7.根據權力要求1的式(I)化合物，它是3-(3-胍基)-丙基-異喹啉-3-甲酰胺。它及其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽。
8.式(I)化合物的制備法，其特征在于使用(II)化合物作為原料 其中Ra、Rb、Rc和Rd是如上定義的。按照有機合成中的Pictet-Spengler反應條件，使該式(II)化合物與(III)化合物反應R2CHO(III)其中，R2是如式(I)定義的。得到式(IV)化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd和R2是如上定義的。按照有機合成中常規(guī)成酯條件，與甲醇得到式(V)化合物。 其中Ra、Rb、Rc、Rd和R2是如上定義的。按照有機合成中常規(guī)甲基化條件，與碘甲烷反應得到式(VI) 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0和R2是如上定義的。受到有機合成中常用的氧化劑的作用，得到式(VII)化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0和R2是如上定義的。按照常規(guī)的酰胺化條件，用式(VIII)化合物處理R3aNHR3b(VIII)其中R3a和R3b是如上定義的。得到式(I/a)化合物，即式(I)化合物的一個特定例子 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0、R2、R3a和R3b是如上定義的。將該式化合物置于式 (IX)化合物的作用下[H2N-C(SCH3)＝NH]2·H2SO4(IX)得到式(I/b)化合物，即式(I)化合物的一個特定例子 其中Ra、Rb、Rc、Rd、R0、R2和R3a是如上定義的。
9.藥物組合物，包含至少一種根據權利要求1至8任意一項的式(I)化合物作為活性成分，單獨或結合一種或幾種藥學上可接受的、惰性的、無毒的賦形劑或載體。
10.根據權利要求9的藥物組合物，包含至少一種根據權利要求1至9任意一項的活性成分，用于抗艾滋病治療。
全文摘要
式(I)化合物其中R
文檔編號C07D217/00GK1398854SQ0212891
公開日2003年2月26日 申請日期2002年8月21日 優(yōu)先權日2002年8月21日
發(fā)明者楊銘, 林偉, 于曉琳 申請人:北京大學