專利名稱：附子苷及同系物，其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的化合物及其同系物，該化合物是從烏頭植物中提取得到的新物質(zhì)，明確地講是附子苷及同系物，同時(shí)公開了其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物，屬于中藥有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所述的附子、川烏分別為毛莨科植物烏頭Aconitumcarmichaeli Debx的子根的加工品和干燥母根，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，逐風(fēng)寒濕邪.溫經(jīng)止痛功效，用于亡陽虛脫，肢冷脈微，陽痿，宮寒，心腹冷痛，虛寒吐瀉，陰寒水腫，陽虛外感，寒濕痹痛及關(guān)節(jié)疼痛，寒疝作痛，麻痹止痛。在我國附子和烏頭品種資源豐富，分布較廣，有著廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有藥用價(jià)值的附子苷及其同系物。
本發(fā)明還提供了從附子、烏頭中提取上述物質(zhì)的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了以該化合物為活性成分的藥物組合物，用于制備強(qiáng)心、抗心衰的藥物；同時(shí)提供了制備具有升高血壓作用的藥物。
本發(fā)明從附子、烏頭(Aconitum carmichaeli Debx的子根、母根)中分離得到一個(gè)單體化合物及其同系物，屬于多元醇糖苷，經(jīng)過藥理活性篩選，該化合物具有多種藥物活性，是現(xiàn)有的附子、烏頭的提取物是不具備的。
本發(fā)明所說的化合物具有下述結(jié)構(gòu)通式 其中R表示為-H或-CH2OH或-CHOH-CH2OH。
本發(fā)明的提取方法包括以下步驟1、將附子包括烏頭(或取其一組分)粉碎加水煎煮得提取液；2、提取液濃縮后進(jìn)行醇提，回收醇至無醇味，得水母液；3、也可將提取液濃縮后通過有機(jī)溶媒萃取，萃取液分別減壓回收并抽提，得到各有機(jī)溶劑提取物及水母液；所述的有機(jī)溶媒包括乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇；4、將水母液蒸干，用醇如甲醇或乙醇溶解，經(jīng)硅膠色譜分離，以氯仿、二氯甲烷、甲醇或它們的混合物如氯仿/甲醇為洗脫液；5、硅膠柱層析分離，以氯仿/甲醇(10％-30％)為洗脫液，繼以氯仿/甲醇(40％-100％)洗脫得所需產(chǎn)物。
6、將所得物經(jīng)HPLC，C18柱，15％甲醇洗脫，分別得到丙三醇2-O-β-D-呋喃半乳糖-(1→3)-β-D-呋喃半乳糖苷及其同系物。
所得單體化合物用醇如甲醇或乙醇重結(jié)晶可得本發(fā)明純品。
上述化合物是從附子包括烏頭中分離的單體化合物，經(jīng)過光譜分析，分別具有如下理化特性為淡黃色粉末，易溶于水，飛行時(shí)間質(zhì)譜(m/z)439.1(M+Na+)，該化合物的13C-NMR譜中有15個(gè)碳信號(hào)，該化合物的DEPT譜中出現(xiàn)4個(gè)仲碳信號(hào)，δppm68.0，69.1，63.9，62.6和11個(gè)叔碳信號(hào).該化合物用H2SO4封閉水解可以檢出β-半乳糖，13C-NMR(DMSO)譜δppm108.6(C1′)，82.3(C2′)，85.4(C3′)，83.7(C4′)，74.8(C5′)，63.9(C6′)，109.2(C1″)，82.7(C2′)，78.0(C3″)，83.1(C4″)，73.5(C5″)，62.6(C6′)67.9(C1)，80.6(C2)和67.3(C3)為丙三醇的三個(gè)碳，1H-NMR(DMSO)中δppm5.0(dJ＝7.51H C1′-H)和5.05(dJ＝7.51H C2′-H)).在該化合物的HMBC譜中可以看到端基質(zhì)子(H1，5.00ppm)與C1′(108.6)相關(guān).表明一個(gè)呋喃半乳糖連于C2位。另外一個(gè)端基質(zhì)子(H2，5.05ppm)C3′(85.4ppm)有相關(guān)；為丙三醇2-O-β-D-呋喃半乳糖-(1→3)-β-D-呋喃半乳糖苷，定名為附子苷。
上述工藝提取物包括附子苷的同系物，即在附子苷C1或C3位上由-H或-CH2OH或-CHOH-CH2OH取代的同系物，由于也具備了其藥理活性主架結(jié)構(gòu)，在不改變本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
經(jīng)過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選，上述化合物具有強(qiáng)心，抗心衰及升高血壓的藥理活性。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述通式的化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。
本發(fā)明的化合物和組合物可用于制備治療強(qiáng)心、抗心衰的藥物。
同時(shí)還可制備具有升高血壓作用的藥物。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，濕潤劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制成所需劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優(yōu)選含有10-90％，更優(yōu)選20-80％，最好為70％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明的施藥量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，日劑量為0.01～10mg/kg。
附子苷及其同系物成分的提取分離和鑒定，闡明了它們功能主治的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有強(qiáng)心，抗心衰，升高血壓的活性。


圖1為附子苷對心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響圖。
圖2為附子苷對鈣通道電流的影響(左上)正常對照組(中)3×10-5μg/ml組，(下)30×10-5μg/ml組，(右下)為電流-電壓關(guān)系曲線。
圖3附子苷對正常大鼠收縮壓的影響曲線。
圖4附子苷對正常大鼠舒張壓的影響曲線。
圖5附子苷對休克大鼠收縮壓的影響曲線。
圖6附子苷對休克大鼠舒張壓的影響曲線。
下述的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明化合物的強(qiáng)心，抗心衰及升高血壓藥理活性。
實(shí)驗(yàn)例1附子苷對豚鼠離體工作心的作用1.材料和方法1.1 Langendoff離體心臟灌流法取豚鼠18只，隨機(jī)分為三組，每組6只，即對照組，給藥高、中劑量組。將豚鼠猛擊頭部致死后，迅速開胸、取心，按常規(guī)生理技術(shù)，做肺靜脈及左心室插管并順向罐流心臟。保持灌充95％O2和5％的CO2混合氣體，保持心臟前負(fù)荷在1.17kPa，后負(fù)荷在5.38kPa。多導(dǎo)生理計(jì)錄儀(RM-6000，日本)同步記錄左室內(nèi)壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升下降速率(±dp/dtmax)、左室舒末壓(LVEDP)，記錄儀紙速為100mm/s。實(shí)驗(yàn)中灌流液為Kerbs-Henselaf液(mmol/L)NaCl 140，KCl 5.4，MgCl2·5H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.8，Glucose 5.0，丙酮酸鈉4.0，Tris 10，用HCl調(diào)pH為7.2-7.4(室溫29℃)。
1.2 心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的記錄在離體灌流的豚鼠心臟上，使用懸浮玻璃微電極，按微電極電生理常規(guī)技術(shù)，胞內(nèi)引導(dǎo)心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位，經(jīng)微機(jī)(power-leb，ssss)分析以下電生理參數(shù)動(dòng)作電位時(shí)程(APD50)、動(dòng)作電位幅值(APA)、超射(OS)和最大除極速度(Vmax)。
1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本文中數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(X±S)，各組之間的數(shù)值比較采用樣本均數(shù)t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 附子苷對豚鼠離體心功能的影響分組與給藥同1.1。在離體豚鼠心臟灌流模型穩(wěn)定后，分別記錄LVSP、±dp/dtmax和HR。然后灌入不同劑量附子苷(3μg·mL-1、30μg·mL-1)，10分鐘后分別記錄上述各項(xiàng)指標(biāo)，可以看出，附子苷可使心臟收縮性能各項(xiàng)指標(biāo)明顯增加，左室內(nèi)壓(LVSP)和左室內(nèi)壓最大上升下降速率(±dp/dtMAX)呈現(xiàn)劑量依賴性升高，說明在一定范圍內(nèi)，不同劑量的附子苷對心室肌有正性肌力作用。其結(jié)果見表1表1附子苷對離體工作心功能的影響(Table 1 Effects of Fuzigan)on isolated working heart in guinea-pig)LVSP -dp/dtMAX+dp/dtMAXHR(p/kPa)(p/kPa·S-1)(p/kPa·S-1) (beat/min)Control 9.87±1.48 496.544±19.08707.42±35.73189.24±26.72Fuzigan(3μg·mL-1) 12.48±1.77*513.84±21.11748.14±34.57*175.37±23.13Fuzigan(30μg·mL-1) 14.76±1.91***525.63±24.59*792.28±37.41***163.52±31.42n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 VS control group.
2.2 附子苷(3μg/mL、30μg/mL)對心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響分組與給藥同1.1。在離體豚鼠心臟灌流模型穩(wěn)定后，使用懸浮玻璃微電極方法，引導(dǎo)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位，并記錄APD50、APA、OS和Vmax。在灌流液中加入附子苷后(3μg·mL-1、30μg·mL-1)，與正常對照組相比，附子苷使APD50明顯增加，并具有劑量依賴性。而大劑量的附子苷(30μg·mL-1)可使心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位的APA和OS的參數(shù)增加，心率不變。其結(jié)果見表2和圖1。
表2附子苷對心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響
(Table 1 Effects of Fuzigan on isolated working heart in guinea-pig)APD50APA OS Vmax(t·mS-1)(V·mV-1) (V·mV-1) (V·S-1)Control 311.28±23.78 98.76±10.23 24.54±3.63143.54±26.12Fuzigan(3μg·mL-1)341.71±25.12*101.23±17.89 25.22±4.86151.21±29.70***Fuzigan(30μg·mL-1) 376.76±26.27***115.73±18.23*29.45±4.57*157.52±31.42n＝6，*P＜0.03，**P＜0.01，***P＜0.001 VS control group.
3討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離體器官灌流模型的標(biāo)本上，附子苷可使豚鼠離體心臟的LVSP、±dp/dtMAX明顯增加，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，而心率沒有改變，表明附子苷可導(dǎo)致心肌的收縮能力的增加，產(chǎn)生正性肌力的效應(yīng)。這一結(jié)果初步揭示附子苷對心肌功能的基本作用。
一般認(rèn)為，心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極達(dá)50％時(shí)的時(shí)程，即為APD50來表示平臺(tái)期。而平臺(tái)期的長短，主要取決于鈣離子經(jīng)L型鈣通道內(nèi)流和鉀離子經(jīng)延遲外向鉀通道的外流。豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的平臺(tái)期十分明顯，是闡述藥物對生物電作用的主要依據(jù)，在豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，附子苷具有明顯的延長APD50的作用，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。同時(shí)，附子苷除使APD50延長外，還可使APA和OS等參數(shù)增加，表明附子苷激活與心肌細(xì)胞除極化有關(guān)的內(nèi)向離子流，即鈉電流或鈣電流有關(guān)。
上述結(jié)果還提示，附子苷可能激活L型鈣通道，使大量細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生心肌收縮能力的增強(qiáng)。也可能激活心室肌細(xì)胞膜上的鈉通道，通過鈉-鈣交換機(jī)制，產(chǎn)生的正性肌力作用。本課題組應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，觀察了附子苷對鈣離子通道的作用，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)以報(bào)道相一致。
實(shí)驗(yàn)例2附子苷對豚鼠心室肌細(xì)胞鈣通道的影響1.材料和方法1.1 成年豚鼠心室肌細(xì)胞的分離取雌性成年豚鼠，用酚巴比妥鈉(30mg/kg i.p)麻醉后做氣管插管并進(jìn)行人工呼吸后，開胸做冠狀動(dòng)脈插管，然后取心臟并固定于langendorff灌流架上，從主動(dòng)脈逆向灌流2min后，換無Ca2+臺(tái)式液再灌5min，最后換膠源酶(15mg/100ml，Japan)的無Ca2+臺(tái)式液灌流10min，將心臟從房室溝處剪下心室部分，放入含細(xì)胞貯存液的小燒杯中，用眼科剪將心室剪成1mm3小碎塊，在37℃的水浴箱中輕輕振蕩10min，收集已分離的單個(gè)心室肌細(xì)胞，用儲(chǔ)存液離心沖洗兩次在放入4℃冰箱中保存，以便記錄時(shí)使用。灌流過程中持續(xù)通O2，灌流液溫度控制在37℃，灌流速度8ml/min(室溫29℃)。
1.2 分離細(xì)胞所用溶液含Ca2+臺(tái)式液成分為(mmol/ml)NaCl 143，KCl 5.4，CaCl-2H2O 1.8，MgCl2-6H2O 0.5，NaH2PO4-2H2O 0.25，HEPES 5。用NaOH調(diào)ph值至7.4。無Ca2+臺(tái)式液去掉上述臺(tái)式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同。
細(xì)胞貯存液(mmol/ml)KOH 70，L-谷氨酸50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2-6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA0.5。用KOH調(diào)ph值至7.4。
1.3 全細(xì)胞通道電流的記錄方法用兩次拉制法將毛坯(上海腦研所生產(chǎn))拉成微電極，其尖端真徑范圍為0.85-1μm。拋光、沖灌電極液后，電阻范圍為1-3MΩ。將微電極經(jīng)微電極夾持器的側(cè)管與注射器相連。邊用注射器向微電極加正壓，邊將微電極緩緩插入浴液，直至接觸心肌細(xì)胞，去掉正壓，轉(zhuǎn)而用注射器抽吸，形成10-20cmH2O的負(fù)壓。當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜表面形成1-5GΩ封接電阻時(shí)，用力吸破電極尖端上的膜片，形成全細(xì)胞記錄。
1.4 全細(xì)胞鈣通道電流的測定所用溶液鈣通道電極液(mmol/ml)CsCl 130，ATP 2，EGTA 5，HEPES 5，ETCsOH調(diào)PH值至7.3。細(xì)胞外液(mmol/ml)CaCl22H2O 2，MgCl2，1；T etraethyammopnium-Cl(TMA-Cl)135，Glucose 10，4-Aminopyridine(4-AP)5，HEPES 10，ET TMA-OH調(diào)PH至7.41.5 數(shù)據(jù)的采集及分析由計(jì)算機(jī)軟件控制產(chǎn)生數(shù)字脈沖，經(jīng)數(shù)/模(D/A)轉(zhuǎn)換成模擬脈沖電壓信號(hào)，控制細(xì)胞的膜電位。電流信號(hào)通過0.1GΩ探頭經(jīng)膜片鉗放大器的電流一電壓轉(zhuǎn)換輸入到模/數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換卡變成數(shù)字化信號(hào)，其頻率為10KHz，低通濾波器濾波頻率為3KHz。
1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本文中數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(X±S)，各組之間的數(shù)值比較采用樣本均數(shù)t—檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 附子苷(30μg/ml)和(300μg/ml)對心室肌細(xì)胞鈣通道的影響對照組將保持電壓控制在-50mV，鈣通道在去極化至-40mV時(shí)被激活，最大內(nèi)向峰值鈣電流在0mV(-0.28±0.03，nA)，當(dāng)加入附子苷7分鐘后，其峰值鈉電流分別增加到(-0.35±0.15、-0.39±0.16，nA)(6例)，鈣電流峰值分別增加了48％、50％，分別高于對照組(P＜0.01)。翻轉(zhuǎn)電位約在50-60mV，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。
實(shí)驗(yàn)觀察期間未見電流出現(xiàn)自然衰減現(xiàn)象(Run down)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示附子苷在一定范圍內(nèi)對豚鼠心室肌細(xì)胞鈣通道有激動(dòng)作用。
3.討論細(xì)胞外Ca2+離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+離子濃度增加，是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，細(xì)胞外V進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)受多條途徑的控制，其中細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣離子通道(voltage-dependentcalcium channel，VDC)對細(xì)胞內(nèi)的Ca2+離子濃度增加起著非常重要的作用。在其正常的電壓范圍內(nèi)，鈣通道的開放與關(guān)閉呈現(xiàn)出一定規(guī)律性，調(diào)控Ca2+離子進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)鈣離子通道受某些因素影響時(shí)，通道蛋白發(fā)生改變，使其在正常的電壓范圍內(nèi)，鈣通道的開放與關(guān)閉發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度的增加。另外受體操從性鈣通道，通過興奮性G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)，在細(xì)胞內(nèi)通過多條途徑，調(diào)控著鈣離子通道，并對細(xì)胞外Ca2+離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)也有重要作用。
我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)，單次大計(jì)量應(yīng)用附子苷(5μg/mL)可使鈣電流幅值明顯增加(P＜0.01＝。而累計(jì)增加劑量(50μg/mL)時(shí)，對鈣通道電流的增加并不顯著，其結(jié)果說明附子苷對鈣通道的作用，是在(5-50μg/mL)濃度范圍內(nèi)，附子苷通過鈣通道，使細(xì)胞外Ca2+離子流入細(xì)胞內(nèi)，并使心室肌細(xì)胞產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)。
4.結(jié)論附子苷對鈣通道有激動(dòng)作用，其作用機(jī)制是激活鈣通道，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)例3附子苷對正常及休克大鼠血壓等的作用1.實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物Wistar大鼠，雌雄各半，體重200±16g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
藥物 附子苷由吉林省中醫(yī)中藥研究院提供。
儀器 LBS-2B型二道生理記錄儀，成都儀器廠產(chǎn)。
2.實(shí)驗(yàn)方法取大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，將大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3g/kg)麻醉后，背位固定于蛙板，剪頸部毛后，切開頸部皮膚，分離氣管，行氣管插管。于大鼠腹股溝部，分離股動(dòng)脈、股靜脈。股動(dòng)脈插管，連接壓力換能器以記錄血壓，連接肢體導(dǎo)聯(lián)，記錄II導(dǎo)心電圖，同步記錄心率。各項(xiàng)指標(biāo)均記錄于二導(dǎo)記錄儀。各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定15分鐘后，給藥高、低劑量組靜脈注射給藥，空白對照組靜注等量容積生理鹽水。
休克大鼠模型制備實(shí)驗(yàn)分組及給藥同上所示，各組動(dòng)物血壓穩(wěn)定后，按上述方法給藥，觀察其對失血性休克血壓、心電及心率的變化。由頸動(dòng)脈插管用注射器緩慢取血至血壓降至5.3kPa，在確保維持血壓穩(wěn)定25分鐘無血壓回升時(shí)，認(rèn)定模型成立。
數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均采用組間t-檢驗(yàn)法，均值(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。
3.結(jié)果3.1對正常大鼠收縮壓的影響(見表3)表3.附子苷對正常大鼠收縮壓的影響(x±S，n＝6)
組別 給藥前 給藥后min(kPa)kPa 5 1015 2030給藥組(0.05g/kg) 14.04±3.8815.96±4.1315.36±3.4615.0±3.39 14.28±3.8114.16±3.51*給藥組(0.1g/kg) 13.44±3.1015.12±3.2415.36±3.3214.64±3.1013.44±2.7413.2±2.40生理鹽水組12.68±1.2013.90±0.9012.70±1.0 12.50±1.2013.40±0.5011.21±0.90各組給藥前后對比，*p＜0.05(與鹽水組比較)。參見圖3。
3.2 附子苷對正常大鼠舒張壓的影響(見表4)表4附子苷對正常大鼠舒張壓的影響(x±S，n＝6)給藥后組別 給藥前5min 10min 15min 20min 30min給藥組(0.05g/kg) 11.04±4.1012.24±4.1711.64±4.01 11.04±4.0111.15±4.4110.08±4.23給藥組(0.1g/kg) 10.56±3.6411.76±3.5412.0±3.3911.28±3.0110.32±2.7610.32±2.76生理鹽水組 12.68±1.2013.90±0.9012.70±1.012.50±1.2013.40±0.5011.21±0.90各組給藥前后對比，p＞0.05.。參見圖4。
3.3 附子苷對休克大鼠收縮壓的影響(見表5)表5附子苷對休克大鼠收縮壓的影響(x±S，n＝6)組別 給藥前 給藥后min(kPa)kPa 51015 20 30給藥組(0.05g/kg) 14.14±3.88 9.12±2.38*9.60±2.65* 9.92±2.83** 10.08±2.85** 9.84±2.56**給藥組(0.1g/kg) 13.58±3.10 8.88±2.17*9.12±1.82* 10.32±1.82** 10.32±1.82** 10.32±1.82**生理鹽水組13.68±1.20 6.70±1.37 6.53±1.0 5.82±1.245.65±0.97 5.60±0.90給藥組與鹽水組比較*p＜0.05 **p＜0.01。參見圖5。
3.4 附子苷對休克大鼠舒張壓的影響(見表6)表6附子苷對休克大鼠舒張壓的影響(x±S，n＝6)
組別 給藥前給藥后min(kPa)kPa5 10152030給藥組(0.05g/kg) 11.05±3.885.40±1.85 5.40±1.855.88±1.556.12±1.556.12±1.76給藥組(0.1g/kg)10.56±3.645.68±1.18 5.92±0.816.88±1.186.88±1.186.88±1.18生理鹽水組 13.68±1.206.70±1.37 6.53±1.0 5.82±1.245.65±0.975.60±0.90參見圖6。
3.5 對心電圖的影響、對正常及失血性休克大鼠，心電圖各波及P-Q間期、P-P間期無明顯影響(p＞0.05)3.6 對心率的影響給藥各組及對照組對心率無明顯影響，但失血性休克，血液有增加趨勢，但與生理鹽水對照組比較無明顯差異。
4.討論前期研究工作發(fā)現(xiàn)，從附子中分離得到的附子苷對離體工作心臟具有正性肌力作用。對豚鼠心肌細(xì)胞單鈣具有激活作用。僅從整體心肌和細(xì)胞水平尚難以表達(dá)附子苷的作用。本實(shí)驗(yàn)以失血性休克大鼠為模型，觀察了附子苷對血壓等的作用，結(jié)果表明，附子苷高低劑量組可使收縮壓明顯升高(p＜0.05，p＜0.01)，對舒張壓無明顯影響，具有起效快，持續(xù)時(shí)間較長，量效關(guān)系較明顯的特點(diǎn)。特別是僅收縮壓增加而舒張壓不變，可表現(xiàn)為脈壓差增大，對休克狀態(tài)下的微循環(huán)灌注更為有利。另外，本實(shí)驗(yàn)也觀察到對正常大鼠也有一定的升壓作用，在給藥后30分鐘時(shí)間點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取附子5kg去除雜質(zhì)粉碎成粗粉，加水30升，加熱煮沸條件下提取3次每次1小時(shí)，合并各次的提取液，濃縮至藥材的2倍，加乙醇使醇濃度達(dá)到60％，放置，濾過，回收乙醇至無醇味得水母液，將水母液蒸干，用甲醇溶解，經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿/甲醇(10％-30％)洗脫，繼以氯仿/甲醇(40％-100％)洗脫得提取物，經(jīng)HPLC C18色譜柱分離15％甲醇洗脫得附子苷丙三醇2-O-β-D-呋喃半乳糖-(1→3)-β-D-呋喃半乳糖苷(0.5克)。
實(shí)施例2取附子5kg、烏頭5kg，混合后粉碎成粗粉，加水10倍量，加熱(室溫至所用液體沸點(diǎn))條件下提取4次每次1.5小時(shí)，合并各次的提取液，濃縮適當(dāng)體積，依次用乙醚、醋酸己酯、四氯甲烷萃取后，萃取液分別減壓回收并抽提的乙醚提取物，醋酸乙酯提取物、四氯甲烷提取物及水母液，將水母液蒸干，用甲醇溶解，經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿/甲醇(10％-30％)洗脫，繼以氯仿/甲醇(40％-100％)洗脫得提取物，經(jīng)HPLC C18色譜柱分離25％甲醇洗脫得附子苷同系物丁四醇2-O-β-D-呋喃半乳糖-(1→3)-β-D-呋喃半乳糖苷(0.3克)。
實(shí)施例3制備強(qiáng)心片劑取實(shí)施例1或?qū)嵤├?制備的化合物附子苷提取物20克，加人賦形劑藥用淀粉20克，混合均勻，造粒整粒壓片，制得片劑，每片含化合物附子苷提取物200毫克。
實(shí)施例4制備本發(fā)明抗心衰膠囊取實(shí)施例1或?qū)嵤├?制備的化合物附子苷提取物20克，加人賦形劑藥用淀粉30克，充分混合均勻，裝入膠囊，每粒含化合物附子苷提取物200毫克。
實(shí)施例5制備強(qiáng)心注射劑取實(shí)施例1或?qū)嵤├?所得產(chǎn)物用甲醇重結(jié)晶得本發(fā)明純品附子苷10克，加入注射用水50ml溶解，加入活性炭0.5g，100℃加熱15分鐘，濾過，濾液加注射用生理鹽水1950ml溶解，微孔濾膜(φ0.2μm)濾過，經(jīng)高壓滅菌后，無菌分裝安瓶中，每瓶2ml，即得。
權(quán)利要求
1.一種化合物附子苷，具有以下通式
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R為-H或-CH2OH或-CHOH-CH2OH。
3.根據(jù)權(quán)利要求2化合物的制備方法，包括以下步驟1)將附子包括烏頭(或取其一組分)粉碎加水煎煮得提取液；2)提取液濃縮后進(jìn)行醇提，回收醇至無醇味，得水母液；3)也可將提取液濃縮后通過有機(jī)溶媒萃取，萃取液分別減壓回收并抽提，得到各有機(jī)溶劑提取物及水母液；所述的有機(jī)溶媒包括乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇；4)將水母液蒸干，用醇如甲醇或乙醇溶解，經(jīng)硅膠色譜分離，以氯仿、二氯甲烷、甲醇或它們的混合物如氯仿/甲醇為洗脫液；5)硅膠柱層析分離，以氯仿/甲醇(10％-30％)為洗脫液，繼以氯仿/甲醇(40％-100％)洗脫得所需產(chǎn)物。6)將所得物經(jīng)HPLC，C18色譜柱用25％甲醇洗脫，分別得到丙三醇2-O-β-D-呋喃半乳糖-(1→3)-β-D-呋喃半乳糖苷及其同系物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2中任意一項(xiàng)的化合物在制備治療強(qiáng)心、抗心衰、升高血壓作用的藥物中的應(yīng)用。
5.用于制備治療強(qiáng)心、抗心衰的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
6.用于制備具有升高血壓作用的藥物組合物，其中含有治療有效活性成分的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5、6所述的藥物組合物，優(yōu)選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優(yōu)選含有10-90％，更優(yōu)選20-80％，最好為70％。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新化合物附子苷，具有以下通式，其中R為－H或－CH
文檔編號(hào)C07H15/04GK1488636SQ0213309
公開日2004年4月14日 申請日期2002年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
發(fā)明者徐東銘, 徐雅娟, 楊世杰, 趙宏峰 申請人:吉林省中醫(yī)中藥研究院