專利名稱：成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子在造血方面的協(xié)同作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及成骨生長(zhǎng)肽(Osteogenic growthpeptide，OGP)與粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)在造血方面的協(xié)同作用，以及含有OGP和G-CSF的藥物組合物。
背景技術(shù)：
Itai Bab等人于1988年在人和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)成骨生長(zhǎng)肽(Osteogenicgrowth peptide，OGP)，一種能促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)的14個(gè)氨基酸組成的多肽。OGP是來源于組蛋白H4 C末端的14肽，即組蛋白H4的基因轉(zhuǎn)錄后，在mRNA水平經(jīng)由AUG85起始翻譯，加工后的產(chǎn)物[Bab I，et al.(1999)J Biol Chem274(20)14474-14481]。當(dāng)骨髓再生時(shí)，能釋放幾種促進(jìn)成骨的因子進(jìn)入血液循環(huán)而致全身成骨反應(yīng)增強(qiáng)，經(jīng)分離純化得到成骨生長(zhǎng)肽[Bab I，et al.(1988)Endocrinology 123345-352；Bab I，et al.(1992)EMBO J.111867-1873]。
存在于人和鼠血清中的OGP，它們的OGP序列完全一致，具有相同的生物活性[Greenberg Z，et al.(1995)J Clin Endocrinol Metab 82330-2335]。生理狀態(tài)下，OGP主要以結(jié)合的形式，即OGP-OGP結(jié)合蛋白(OGPBP)復(fù)合物的形式存在，約占OGP總量的80％-97％[Greenberg Z，et al.(1995)JCE& M.80(8)2330-2335]。血清中OGP結(jié)合蛋白為α2巨球蛋白，其作用可能是保護(hù)血清中的OGP以免降解，或調(diào)解OGP活性部分在血清中的水平[GavishH，et al.(1997)Biochemistry 3614883-14888]。OGP的C端5肽，可能是在OGP與其結(jié)合蛋白的解離過程中的酶解產(chǎn)物，同樣天然存在并具有與OGP許多相似活性[Bab I，et al.(1999)J Pept Res 54408-414]合成的成骨生長(zhǎng)肽(sOGP)，與天然分子序列完全一致，體外具有促成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞、人及兔的骨髓基質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性；體內(nèi)促進(jìn)大鼠骨形成和骨小梁質(zhì)量[Bab I.，et al.(1992)EMBO J.111867-1873；Robinson D.et al.(1995)J.Bone andMineral Research 10(5)690-696]。
OGP不但具有成骨作用，而且有助于造血。OGP可以促進(jìn)外周血白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞數(shù)的增加，放射損傷的小鼠在骨髓移植前開始給予sOGP，可以幫助造血重建并增加小鼠的存活率[Gurevitch O，et al.(1996)Blood 88(12)4719-4724]。環(huán)磷酰胺造成的小鼠骨髓損傷給予OGP的C端5肽，可以加快小鼠外周血白細(xì)胞的恢復(fù)，并可以動(dòng)員小鼠外周血干細(xì)胞[Rita F，et al.(2002)Leukemia Research 19-27]。但是，OGP在造血方面的作用效果較弱，明顯弱于粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
G-CSF已經(jīng)用于臨床，目前已有幾種商品出售。如非格司亭(filgrastim)，為來源于大腸桿菌的非糖基化的重組蛋白；來格司亭(lenograstim)，來源于中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞的糖基化分子。還有托司亭(nartograstim)，是N端被取代了的分子[Maruyama K，et al.(1998)Bone Marrow Transplant 22(4)313-320]。G-CSF的主要生物作用是促使粒系祖細(xì)胞增殖及分化為中性粒細(xì)胞，以及促進(jìn)成熟中性粒細(xì)胞的存活和功能完善，包括吞噬功能、殺菌功能以及依賴抗體細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等[Ohsaka A，et al.(1998)Br JHaematol 100(1)66-69]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于難治性急性粒細(xì)胞白血病，慢性粒細(xì)胞白血病，在造血祖細(xì)胞危象期使用聯(lián)合預(yù)處理方案(包括全身照射、大劑量阿糖胞苷、G-CSF)后進(jìn)行異體骨髓移植，能降低復(fù)發(fā)率及改善無病存活率，而不引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)[Takahashi M，et al.(1997)Am J Hematol56(1)42-44；Takahashi S，et al.(1998)Am J Hematol 57(4)303-308]。目前，G-CSF還被用于動(dòng)員外周血干細(xì)胞，用于自體或異體移植，最常用的動(dòng)員方案為使用環(huán)磷酰胺后再用G-CSF或單用G-CSF，但這兩種方案所動(dòng)員的造血干/祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)具有不同的克隆源潛能，故不同目的應(yīng)采用不同的動(dòng)員方案[Cesana C，et al.(1998)Bone Marrow Transplant 21(6)561-568]。
目前，已發(fā)現(xiàn)許多生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)高劑量化療組或正常組小鼠外周血干細(xì)胞的動(dòng)員，用于外周血干細(xì)胞移植，或提高放化療后骨髓有核細(xì)胞數(shù)量，恢復(fù)外周血白細(xì)胞數(shù)。其中有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素3(IL-3)，干細(xì)胞因子(SCF)，F(xiàn)LT-3配體等等[Bungart B，et al.(1990)Br J Haematol 76(2)174-179；Lane T，et al.(1995)Blood 85(1)275-282；Brugger W，et al.(1992)Blood 79(5)1193-1200；Molineux G，et al.(1991)Blood 78(4)961-966；Ashihara E，et al.(1998)Eur J Haematol 60(2)86-92]。臨床上主要應(yīng)用重組人粒系集落刺激因子(rh G-CSF)和/或重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rh GM-CSF)動(dòng)員外周血干細(xì)胞用于外周血干細(xì)胞移植或促進(jìn)放化療后造血功能恢復(fù)。但兩者價(jià)格昂貴，工薪階層不勝負(fù)擔(dān)。此外，臨床使用上還存在一些問題高劑量rh G-CSF會(huì)導(dǎo)致骨痛等副反應(yīng)，高劑量rh GM-CSF會(huì)伴隨著發(fā)熱。并且用它們動(dòng)員外周血干細(xì)胞用于外周血干細(xì)胞移植時(shí)，很難在一個(gè)給藥療程得到足量的外周血干細(xì)胞用于移植，給干細(xì)胞提供者帶來痛苦，而接受者需要等待下一次干細(xì)胞移植，增加了危險(xiǎn)性。IL-8，IL-11，SCF，F(xiàn)LT-3配體或巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)也可以動(dòng)員外周血干細(xì)胞，但效果弱于G-CSF或GM-CSF[Andrews RG，et al.(1992)Blood 80920-927；Haas R，et al.(1993)12643-649；Lemoli RM，et al.(1993)211668-1672；Jacoben SE，et al.(1995)J Exp Med 1811357-1363；Laterveer L，et al.(1996)87781-788；Hunter MG，et al.(1995)864400-4408]。
因此，本領(lǐng)域迫切需要價(jià)格低廉的、用于促進(jìn)造血的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種價(jià)格低廉的、用于促進(jìn)造血的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供所述藥物組合物的制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種藥物組合物，含有安全有效量的成骨生長(zhǎng)肽、安全有效量的粒細(xì)胞集落刺激因子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。
在一有效量中，所述的藥物組合物還含有選自下組的組分GM-CSF、EPO、白介素2、或其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的成骨生長(zhǎng)肽選自下組人OGP、OGP相關(guān)肽、及其醫(yī)藥上可接受的鹽，以及它們的混合物。
在另一優(yōu)選例中，成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為1∶1到20∶1。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物，藥物組合物的劑型是針劑、或凍干粉劑。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備藥物的方法，包括步驟將成骨生長(zhǎng)肽、粒細(xì)胞集落刺激因子以及藥學(xué)上可接受的載體混合在一起，制得藥物，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。
在本發(fā)明的第三方面，通過了OGP和/或OGP相關(guān)肽聯(lián)合rhG-CSF的用途，它們被用于制備增強(qiáng)rhG-CSF在造血方面功能的藥物組合物。


圖1顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，對(duì)不同時(shí)間白細(xì)胞(WBC)數(shù)的的影響。
#聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.0005*聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.05圖2顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，對(duì)不同時(shí)間淋巴細(xì)胞(LY)數(shù)的的影響。
#聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.0005*聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.05圖3顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，各實(shí)驗(yàn)組的胸骨切片的病理觀察，圖3A為正常對(duì)照組；3B為單獨(dú)給予sOGP組；3C為sOGP聯(lián)合rh G-CSF組；3D為單獨(dú)使用rh G-CSF組。
圖4顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，各實(shí)驗(yàn)組的脾臟切片的病理觀察，圖4A為正常對(duì)照組；4B為單獨(dú)給予sOGP組；4C為sOGP聯(lián)合rh G-CSF組；4D為單獨(dú)使用rh G-CSF組。
圖5顯示了同時(shí)給予sOGP、rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥前后不同時(shí)間白細(xì)胞(WBC)數(shù)的影響。
#聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.00005。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)成骨生長(zhǎng)肽(OGP)聯(lián)用G-CSF具有協(xié)同作用，可以明顯加強(qiáng)G-CSF的功效，從而更有效地促進(jìn)粒系為主的造血細(xì)胞增殖，動(dòng)員外周血干細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所述，術(shù)語“促進(jìn)造血”是指OGP聯(lián)合G-CSF對(duì)正常人外周血干細(xì)胞的動(dòng)員作用，對(duì)病理狀況或放射損傷或使用化療藥物時(shí)產(chǎn)生的外周血中性粒細(xì)胞的減少的恢復(fù)作用。
在本文中，術(shù)語“氨基酸”除非特指，均指以下20種天然氨基酸(以三字母符表示)Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Lys，Arg，Phe，Tyr，Trp，Pro，Cys，Met，His，Val。該術(shù)語包括D型和L型氨基酸。此外，該術(shù)語還包括非天然氨基酸、甲基化氨基酸、allo氨基酸。
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)可用于本發(fā)明的G-CSF可以是任何來源的天然的，重組的G-CSF，其類似物和活性片段，以及醫(yī)藥上可接受的鹽。特別優(yōu)選的是重組的人G-CSF。G-CSF的商品化產(chǎn)品包括(但并不限于)非格司亭(filgrastim)、來格司亭(lenograstim)，托司亭(nartograstim)、或其混合物。
粒細(xì)胞集落刺激因子的安全有效量通常為0.1-1000ug/kg體重，較佳地為0.2-250ug/千克體重。例如，用于人體，rhG-CSF在不同的適應(yīng)癥，如放化療前后，動(dòng)員外周血，骨髓移植時(shí)等，劑量范圍0.4-100ug/kg體重。用于大鼠等哺乳動(dòng)物時(shí)，劑量可用到100-500ug/kg體重。
成骨生長(zhǎng)肽如本文所用，術(shù)語“成骨生長(zhǎng)肽”包括OGP的天然多肽，人工合成多肽，所有類似物，OGP相關(guān)肽，以及醫(yī)藥上可接受的鹽。
可用于本發(fā)明的成骨生長(zhǎng)肽包括上述各種形式的OGP，尤其是人工合成的或重組表達(dá)的OGP。
一種優(yōu)選的OGP是天然序列的OGP，其氨基酸序列如下ALKRQGRTLYGFGG；此外，OGP相關(guān)肽也可用于本發(fā)明，優(yōu)選的OGP相關(guān)肽是來源于OGP的C末端，具有式(I)氨基酸序列的肽X1-X2-Y-X3-F-X4-X5-X6-X7(I)其中X1為氨基、乙?；?、乙?；被峄蛉グ被陌被?；X2、X6可以不存在或是單個(gè)氨基酸，也可以是多個(gè)氨基酸或肽；X3、X4、X5是單個(gè)氨基酸；X7為氨基、羧基或羥基，其中X1至X6中所述的氨基酸選自Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Lys，Arg，Phe，Tyr，Trp，Pro，Cys，Met，His，Val；Y為酪氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，且OGP相關(guān)肽的長(zhǎng)度為5-15個(gè)氨基酸。
以前的研究已經(jīng)表明，只要保留Y和F兩個(gè)活性位點(diǎn)，式(I)結(jié)構(gòu)的OGP相關(guān)肽就具有OGP活性(參見美國(guó)專利5,814,610和Chen YC等人，J MedChem 2002 Apr 11；45(8)1624-32)。
至于獲得OGP及其相關(guān)肽的方法，沒有任何特別限制。它們可以是固相或液相化學(xué)合成技術(shù)、或是基因工程方法、或用酶切加工方法制得的。
一種優(yōu)選的方法是使用常規(guī)肽化學(xué)合成技術(shù)，以固相法或液相法合成本發(fā)明的OGP及其相關(guān)肽，但較好是使用固相合成方法(例如參見Birr，C.，Aspect of the Merrifield Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg，1978；Stewart et al.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.co.，Rockford，IL，1984；Barany，G.And MerrifieldR.B.in The Peptides，Vol.2；Gross，E.& Meienhoffer J.，eds.，AcademicPress，New York，pp3-284，1979)。簡(jiǎn)單地說，首先按照已設(shè)計(jì)好的和給定的氨基酸序列，利用適當(dāng)?shù)幕罨瘎┖涂s合劑將經(jīng)適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的肽鏈C末端氨基酸殘基連接到固相載體上。根據(jù)連接的氨基酸的不同，可選擇使用各種不同的用于肽合成的固相載體，例如包括但不只限于聚乙醇、二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺樹脂。
并可用已知方法將用上述技術(shù)或以重組DNA技術(shù)制得的OGP制成其醫(yī)藥上可接受的鹽。例如，可按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，用適當(dāng)?shù)乃帷A處理這些肽得到合適的鹽。
在本發(fā)明中，成骨生長(zhǎng)肽的安全有效量通常為0.1ug-100mg/kg體重，較佳地為0.5ug-10mg/千克體重。
藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物中，含有以下組分(1)OGP和/或OGP相關(guān)肽，或其醫(yī)藥上可接受的鹽，(2)可接受藥物量的G-CSF或其醫(yī)藥上可接受的鹽，(3)藥學(xué)上可接受的載體，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。較佳地，摩爾比為1∶1至20∶1。
一種優(yōu)選的確定的方法是，先將G-CSF的用量選定為常規(guī)的可接受量的G-CSF，然后根據(jù)上述摩爾比確定OGP的用量。由于OGP為短肽，成本較低，因此其用量通常大于或等于G-CSF的用量，以獲得最佳的效益/成本比。
除了含有OGP和/或OGP相關(guān)肽(及rhG-CSF)外，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有任何臨床上使用的應(yīng)用于造血方面的藥物，GM-CSF、EPO、或其醫(yī)藥上可接受的鹽，或其混合物。此外，還可以含有任何臨床上使用的應(yīng)用于提高免疫方面的藥物，如白介素2(IL-2)或其混合物，及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
除了含有上述組分之外，本發(fā)明的藥物組合物還包含常規(guī)的溶劑和防腐劑。對(duì)于溶液形式的藥物組合物，其pH范圍沒有特別限制，通常為從4到8.5。此外，藥物組合物還可制成凍干制劑。
本發(fā)明中藥物組合物可含適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑，如水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液以制成可經(jīng)腸胃道以外途徑給藥的溶液劑、針劑、乳劑、滴鼻劑、滴眼劑。也可加入淀粉、乳糖、滑石粉、蔗糖、葡萄糖或甘油、液體石蠟、脂質(zhì)體、白蛋白或明膠等賦形劑或載體，將本發(fā)明的OGP及G-CSF制成可經(jīng)胃腸道途徑給藥的栓劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑或脂質(zhì)體包裹劑。這些制劑中除含有活性成分和適當(dāng)?shù)妮d體或賦形劑外，還可根據(jù)需要添加一些其他輔助成分，例如一種或多種稀釋劑、填充劑、乳化劑、防腐劑、表面活性劑、吸收促進(jìn)劑、緩沖劑、香味劑及著色劑。
至于本發(fā)明藥物組合物的施用方法，沒有特別限制，可以是與制劑形式相匹配的各種給藥方式，例如，皮下、肌內(nèi)、滴注等。
本發(fā)明的藥物組合物具有以下用途(1)促進(jìn)外周血干細(xì)胞移植供者的外周血干細(xì)胞動(dòng)員；(2)治療病理狀況或放射損傷或化療藥物時(shí)產(chǎn)生的外周血中性粒細(xì)胞的減少；(3)加速骨髓移植時(shí)外周血白細(xì)胞的恢復(fù)，幫助供者細(xì)胞的存活；(4)應(yīng)用于急性放射病的防治；本發(fā)明人制備了OGP和G-CSF的組合物，并通過下列實(shí)驗(yàn)觀察OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠的促造血作用a)OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響；b)OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)的影響；c)OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠外周血紅細(xì)胞、血小板數(shù)的影響；d)OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)及骨髓有核細(xì)胞分類的影響。
e)對(duì)正常小鼠胸骨切片的病理觀察；f)OGP聯(lián)合rh G-CSF對(duì)于正常小鼠脾臟重量的影響；g)對(duì)正常小鼠脾臟切片的病理觀察。
結(jié)果表明，成骨生長(zhǎng)肽(OGP)聯(lián)合G-CSF可以明顯促進(jìn)正常小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)的增加，其增加數(shù)為單獨(dú)使用相同劑量G-CSF的2-3倍，相對(duì)于正常對(duì)照組增加5-6倍。sOGP聯(lián)合rh G-CSF可以明顯促進(jìn)正常小鼠外周血淋巴細(xì)胞(LY)的增加，其增加數(shù)為單獨(dú)使用相同劑量rh G-CSF的2-3倍，相對(duì)于正常對(duì)照組增加3-4倍。同時(shí)，促進(jìn)小鼠脾臟的增大，脾臟切片中有核細(xì)胞分類檢測(cè)可促使脾臟粒系方向造血。通過骨髓有核細(xì)胞記數(shù)，骨髓涂片檢測(cè)，胸骨切片檢測(cè)，給藥組并未發(fā)生骨髓的異常增生。
至于協(xié)同作用的機(jī)理，本發(fā)明人認(rèn)為，OGP可能通過降低造血干/祖細(xì)胞表面的黏附分子如整合素等，促使干/祖細(xì)胞從骨髓釋放到外周血，進(jìn)行髓外，如脾臟造血以加強(qiáng)G-CSF的功能；也可能通過影響骨髓基質(zhì)微環(huán)境、作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，增加其它造血因子的表達(dá)，或者G-CSF受體的上調(diào)，從而促進(jìn)G-CSF的作用。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明并不受上述機(jī)理的限制。
本發(fā)明的這些研究說明，sOGP聯(lián)合rh G-CSF這一藥物組合物可以有效地促進(jìn)造血，而未發(fā)生骨髓異常增生等副反應(yīng)。并且該藥物組合有可能用于免疫系統(tǒng)的疾病。在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1用Fmoc系統(tǒng)或Boc系統(tǒng)合成OGP及其相關(guān)肽按中國(guó)專利申請(qǐng)CN 99113596.2中所述的方法，用Fmoc系統(tǒng)或Boc系統(tǒng)合成OGP及其相關(guān)肽。以Boc系統(tǒng)合成OGP為例，起始0.32mmol BocQ-Pam-樹脂，按多肽順序由C端逐個(gè)向N端延伸。各種Boc氨基酸所用的保護(hù)基分別為L(zhǎng)ys(ClZ)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)，Tyr(BrZ)?？s合劑為DCCI，加HOBT以活化各氨基酸的羧基。每輪循環(huán)開始，以50％TFA去除Boc，然后以10％DIEA中和。肽鏈合成后，用含5％對(duì)甲苯酚的干燥氟化氫在0℃處理80分鐘，把肽鏈從樹脂上裂解下來，同時(shí)去除各種保護(hù)基，用1N HAc抽提，SephadexG10脫鹽后冷凍干燥，獲得粗肽，然后用TSK HW-40F凝膠柱層析分離純化。進(jìn)行氨基酸組成和純度鑒定。
結(jié)果制得了氨基酸序列為ALKRQGRTLYGFGG的OGP，以及多種OGP相關(guān)肽。
實(shí)施例2成骨生長(zhǎng)肽和G-CSF在促造血方面的協(xié)同作用2.1材料成骨生長(zhǎng)肽實(shí)施例1中制得的合成OGP(sOGP)。
粒細(xì)胞集落刺激因子市售的重組人粒系集落刺激因子(rh G-CSF)。
2.2方法采用清潔級(jí)Balb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組7-10只。分兩批實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)1.
小鼠共分4組。研究sOGP與rh G-CSF協(xié)同作用時(shí)，先給予sOGP 5天后，再同時(shí)給予sOGP和rh G-CSF。
A組正常對(duì)照組；B組單獨(dú)給予sOGP組，劑量為0.5nmol/鼠；C組聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，sOGP劑量為0.5nmol/鼠，而rh G-CSF劑量為100ug/kg體重，兩者摩爾比約為5.5∶1；D組單獨(dú)給予rh G-CSF組，劑量為100ug/kg體重。
B組從第一天開始給予sOGP，連續(xù)13天，每天給藥；C組在連續(xù)給予sOGP5天后，再同時(shí)給予sOGP和rh G-CSF，持續(xù)8天；D組從第6天開始給予rhG-CSF，持續(xù)8天。各組小鼠于第14天處死。
檢測(cè)指標(biāo)如下(1)各組分別于第1天(未給藥時(shí))，第5天，第8天，第10天，第12天，第14天檢測(cè)外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)，外周血淋巴細(xì)胞(LY)數(shù)，紅細(xì)胞(RBCs)數(shù)以及血小板(PLT)的變化；(2)第14天檢測(cè)各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)(BMNC)，骨髓分類變化；(3)第14天檢測(cè)各組小鼠胸骨切片的情況；(1)第14天檢測(cè)各組小鼠脾重，脾臟切片的情況。
實(shí)驗(yàn)2.
小鼠共分4組。研究sOGP與rh G-CSF協(xié)同作用時(shí)，同時(shí)給予sOGP和rhG-CSF。
A組正常對(duì)照組；B組單獨(dú)給予sOGP組，劑量為0.5nmol/鼠；C組聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，sOGP劑量為0.5nmol/鼠，而rh G-CSF劑量為100ug/kg體重，兩者摩爾比約為5.5∶1；D組單獨(dú)給予rh G-CSF組，劑量為100ug/kg體重。
B組從第一天開始給予sOGP，連續(xù)10天，每天給藥；C組同時(shí)給予sOGP和rh G-CSF，持續(xù)10天；D組從第一天開始給予rh G-CSF，持續(xù)10天。各組小鼠于第11天處死。
檢測(cè)指標(biāo)如下(1)各組分別于第1天(未給藥時(shí))，第3天，第5天，第7天，第9天，第11天檢測(cè)外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)；(2)第11天檢測(cè)各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)(BMNC)；(3)第11天檢測(cè)各組小鼠脾重。
2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以x±se表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。
2.4結(jié)果結(jié)果如圖1-5以及表1-5所示，其中表1顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，對(duì)其外周血粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例的影響，對(duì)紅細(xì)胞(RBCs)數(shù)以及血小板(PLC)數(shù)的影響。
表1

表2顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，對(duì)正常小鼠股骨的骨髓有核細(xì)胞總數(shù)及其分類變化的影響。
表2骨髓(細(xì)胞數(shù)/股骨)(％)對(duì)照 sOGPsOGP+rhG-CSFrhG-CSF紅系紅系母細(xì)胞 1.57±0.371.13±0.30 1.38±0.381.63±0.32早幼紅細(xì)胞 4.57±0.483.37±0.38 3.25±0.492.50±0.33中幼紅細(xì)胞 12.14±0.86 13.75±1.5611.38±0.71 12.13±1.92晚幼紅細(xì)胞 22.14±1.52 19.63±2.2319.63±1.82 16.00±2.11粒系粒系母細(xì)胞 0.86±0.270.75±0.25 0.63±0.180.63±0.36早幼粒細(xì)胞 2.29±0.361.50±0.27 1.75±0.371.88±0.44中、晚幼粒細(xì)胞 11.43±0.90 13.75±1.3714.25±1.54 11.00±1.00成熟粒細(xì)胞 21.43±1.76 24.25±1.6124.75±2.38 30.83±2.77噬酸、噬堿性粒細(xì)胞 1.71±0.291.63±0.92 1.50±0.321.63±0.42巨核細(xì)胞 1.29±0.181.00±0.27 0.75±0.251.13±0.23淋巴系淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞 20.57±1.51 19.25±1.6520.75±1.42 19.38±2.00有核細(xì)胞數(shù)/股骨(×107)1.98±0.071.82±0.11 1.99±0.111.90±0.13表3顯示了給予sOGP 5天后，再聯(lián)合rh G-CSF對(duì)正常小鼠給藥，對(duì)正常小鼠脾臟重量的影響。
表3對(duì)照 sOGP sOGP+rhG-CSF rhG-CSF脾重(g) 0.136±0.004 0.114±0.0050.262±0.0110.252±0.007表4顯示了同時(shí)給予sOGP和rh G-CSF，對(duì)正常小鼠股骨的骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的影響。
表4對(duì)照 sOGP sOGP+rhG-CSF rhG-CSF有核細(xì)胞數(shù)/股骨(×107) 1.74±0.081.74±0.061.88±0.081.75±0.12表5顯示了同時(shí)給予sOGP和rh G-CSF，對(duì)正常小鼠脾臟重量的影響。#聯(lián)合給藥組與單獨(dú)使用rh G-CSF組比較，p＜0.05。
表5對(duì)照sOGP sOGP+rhG-CSF rhG-CSF脾重(g) 0.112±0.004 0.102±0.005 0.300±0.021 0.244±0.0172.5討論1.先給予sOGP 5天后再同時(shí)給予rh G-CSF對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)的影響；對(duì)白細(xì)胞分類的影響，即粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)及其比例的影響，對(duì)紅細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)的影響；對(duì)骨髓有核細(xì)胞數(shù)及骨髓細(xì)胞分類的影響；對(duì)胸骨切片的觀察；對(duì)小鼠脾臟切片的觀察；對(duì)小鼠脾臟重量的影響。
(1)從圖1可見，在給藥11天后，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)顯著高于其它組，約是rh G-CSF組的2.5倍(p＜0.0005)，正常對(duì)照組的5倍(p＜0.00005)。給藥13天后，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，外周血白細(xì)胞數(shù)顯著高于其它組，約是rh G-CSF組的2倍(p＜0.05)，正常對(duì)照組的4倍(p＜0.001)。圖2顯示，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，在給藥11天及13天，可使外周血淋巴細(xì)胞(LY)數(shù)顯著高于其它組，約是rh G-CSF組的2倍(p＜0.05)，約是對(duì)照組的2倍(p＜0.05-0.0005)。從表1可見，對(duì)白細(xì)胞分類的影響，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組，其中粒細(xì)胞在白細(xì)胞中所占比例高于對(duì)照組以及sOGP組，而低于rh G-CSF組；其中淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中所占比例低于對(duì)照組以及sOGP組，而高于rh G-CSF組。而關(guān)于對(duì)紅細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)的影響，各組間無顯著性差異。
(2)從圖3可見，陰性對(duì)照組(A圖)骨髓細(xì)胞正常增生，三系細(xì)胞配比正常，未見特殊病變；單獨(dú)給予sOGP組(B圖)骨髓細(xì)胞正常增生，三系細(xì)胞配比正常，未見特殊病變；sOGP聯(lián)合rh G-CSF組(C圖)骨髓細(xì)胞正常增生，三系細(xì)胞配比正常，未見特殊病變；單獨(dú)使用rh G-CSF組(D圖)骨髓細(xì)胞正常增生，三系細(xì)胞配比正常，成熟粒系在粒系中比例略高(反應(yīng)性增生，非病理變化)。
(3)從圖4可見，陰性對(duì)照組(A圖)白髓正常，紅髓內(nèi)有少量造血細(xì)胞，粒、紅細(xì)胞比例約為0.5∶1，粒系多為不成熟細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞約占粒細(xì)胞的25％左右，巨系輕度增生；單獨(dú)給予sOGP組(B圖)白髓正常，紅髓內(nèi)少量造血細(xì)胞，粒、紅比例約為1∶1，粒系內(nèi)成熟粒細(xì)胞約占粒細(xì)胞的30％左右；sOGP聯(lián)合rh G-CSF組(C圖)白髓輕到中度萎縮，紅髓中度增生，內(nèi)有多量造血細(xì)胞粒、紅比例約為1.75∶1，巨系中度增生，粒系內(nèi)成熟粒細(xì)胞約占粒細(xì)胞的60％左右；單獨(dú)使用rh G-CSF組(D圖)白髓輕到中度萎縮，紅髓中度增生，內(nèi)有多量造血細(xì)胞粒、紅比例約為2∶1，巨系中度增生，粒系內(nèi)成熟粒細(xì)胞約占粒細(xì)胞的60％左右。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，脾內(nèi)髓外造血(粒系、紅系、巨系)，第三、四組明顯，第二組不太明顯。根據(jù)其病理形態(tài)及各系統(tǒng)各階段細(xì)胞配比認(rèn)為骨髓造血功能的反應(yīng)性增生而非屬腫瘤性增生。
(4)由表2可見，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組小鼠的股骨骨髓有核細(xì)胞數(shù)與其它三組無顯著性差異，并未造成骨髓異常增生。與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組的早幼粒細(xì)胞數(shù)少，中、晚幼粒細(xì)胞數(shù)以及成熟粒細(xì)胞數(shù)增高，說明可以加快早幼粒細(xì)胞成熟，并可能加快較成熟的粒細(xì)胞從骨髓釋放到外周血，從而促進(jìn)外周血白細(xì)胞數(shù)。
(5)由表3可見，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組小鼠，單獨(dú)使用rh G-CSF組小鼠的脾臟重量顯著性地高于其它兩組，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組小鼠脾臟重量有高于單獨(dú)使用rh G-CSF組的趨勢(shì)，但沒有顯著性差異，說明可能通過促進(jìn)脾臟造血，從而增加外周血白細(xì)胞數(shù)。
2.同時(shí)給予sOGP、rh G-CSF，檢測(cè)其對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響；對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)的影響；對(duì)小鼠脾臟重量的影響。
(1)由圖5可見，同時(shí)給予sOGP、rh G-CSF組10天后，外周血白細(xì)胞數(shù)顯著性高于其它組，約是rh G-CSF組的2.3倍(p＜0.0005)，正常對(duì)照組的5.3倍(p＜0.00005)。
(2)由表4可見，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組小鼠的股骨骨髓有核細(xì)胞數(shù)與其它三組無顯著性差異，并未造成骨髓異常增生。
(3)由表5可見，同時(shí)給予sOGP、rh G-CSF組，單獨(dú)使用rh G-CSF組小鼠的脾臟重量顯著性地高于其它兩組，聯(lián)合使用sOGP、rh G-CSF組小鼠脾臟重量顯著性高于單獨(dú)使用rh G-CSF組(p＜0.05)。
實(shí)施例3成骨生長(zhǎng)肽和G-CSF在促造血方面的協(xié)同作用在本實(shí)施例中，研究在成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的不同摩爾比情況下的協(xié)同作用。
基本上按實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)方法2的方法，不同點(diǎn)僅在于改變OGP的用量，使成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.5∶1，1∶1，10∶1，20∶1。
結(jié)果，仍然觀察到了成骨生長(zhǎng)肽和G-CSF在促造血方面的協(xié)同作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，含有安全有效量的成骨生長(zhǎng)肽、安全有效量的粒細(xì)胞集落刺激因子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，還含有選自下組的組分GM-CSF、EPO、白介素2、或其混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的成骨生長(zhǎng)肽選自下組人OGP、OGP相關(guān)肽、及其醫(yī)藥上可接受的鹽，以及它們的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為1∶1到20∶1。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，成骨生長(zhǎng)肽的安全有效量為0.1ug-100mg/kg體重，粒細(xì)胞集落刺激因子的安全有效量為0.1-1000ug/kg體重。
6.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，藥物組合物的劑型是針劑、或凍干粉劑。
7.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的人OGP具有以下氨基酸序列ALKRQGRTLYGFGG；所述的OGP相關(guān)肽是來源于OGP的C末端，具有式(I)氨基酸序列的肽X1-X2-Y-X3-F-X4-X5-X6-X7 (I)其中X1為氨基、乙酰基、乙?；被峄蛉グ被陌被?；X2、X6可以不存在或是單個(gè)氨基酸，也可以是多個(gè)氨基酸或肽；X3、X4、X5是單個(gè)氨基酸；X7為氨基、羧基或羥基，其中X1至X6中所述的氨基酸選自Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Lys，Arg，Phe，Tyr，Trp，Pro，Cys，Met，His，Val；Y為酪氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，且OGP相關(guān)肽的長(zhǎng)度為5-15個(gè)氨基酸。
8.一種制備藥物的方法，其特征在于，包括步驟將成骨生長(zhǎng)肽、粒細(xì)胞集落刺激因子以及藥學(xué)上可接受的載體混合在一起，制得藥物，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為1∶1到20∶1。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，藥物的劑型是針劑、或凍干粉劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的成骨生長(zhǎng)肽、安全有效量的粒細(xì)胞集落刺激因子以及藥學(xué)上可接受的載體，其中成骨生長(zhǎng)肽與粒細(xì)胞集落刺激因子的摩爾比為0.25∶1至100∶1。本發(fā)明的研究表明，OGP與粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)之間具有很好的協(xié)同作用，可以更有效促進(jìn)G－CSF的造血功能。本發(fā)明提供了還提供了所述藥物組合物的制法和用途，尤其是促進(jìn)G－CSF的造血方面功能，以及促進(jìn)以淋巴細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C07K14/51GK1478546SQ02136688
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者劉智慧, 陳統(tǒng)一, 崔大敷, 施德源, 費(fèi)儉, 陳中偉, 李默漪, 邵云潮, 石嘉豪, 費(fèi)琴明, 陸怡, 陳紅紅, 程文英, 羅偉華 申請(qǐng)人:上海益眾生物技術(shù)有限公司