專利名稱：小麥乙烯受體蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的小麥(Triticumaestivum)乙烯受體蛋白及其多核苷酸編碼序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種與植物的熟性有關(guān)的、具有乙烯結(jié)合能力的乙烯受體蛋白。
背景技術(shù)：
控制農(nóng)作物熟性的因素十分復(fù)雜，有關(guān)控制作物熟性的基因及其產(chǎn)物的研究歷來是植物生長發(fā)育研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。乙烯作為控制作物生長發(fā)育的五大植物激素之一，是作物成熟和衰老過程中最主要的調(diào)節(jié)因子，乙烯信號(hào)啟動(dòng)了作物體內(nèi)一系列與控制熟性有關(guān)的基因表達(dá)和酶系反應(yīng)。
乙烯受體蛋白是乙烯生物合成和乙烯信號(hào)傳遞途徑中的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)傳遞因子，廣泛存在于各類農(nóng)作物、瓜果蔬菜及花卉中，決定乙烯的生物合成以及植物對乙烯的敏感能力，并控制植物成熟和衰老的進(jìn)程。
首例乙烯受體蛋白編碼基因基因etr1于1993年從模式植物擬南芥中克隆到，其后采用etr1基因片段作為探針，在不足6年的時(shí)間內(nèi)從馬鈴薯、蘋果、香蕉和番茄等近30種作物的cDNA庫中，成功地克隆了與擬南芥乙烯受體蛋白編碼基因在功能和結(jié)構(gòu)上同源的熟性相關(guān)基因。國外已從數(shù)十種作物、蔬菜、水果和花卉中克隆到與熟性相關(guān)的乙烯受體蛋白編碼基因，但目前尚無小麥乙烯受體基因克隆的相關(guān)研究報(bào)道。
植物乙烯感應(yīng)機(jī)制及其相關(guān)基因在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守性，這種保守性使乙烯受體蛋白在調(diào)節(jié)各類植物乙烯生物合成和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)中具有廣泛的生物學(xué)功能，該蛋白結(jié)構(gòu)上的變異、甚至是某個(gè)氨基酸殘基的點(diǎn)突變，均會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株在葉片脫離、花期延遲或果實(shí)成熟等性狀的變化，這在擬南芥、煙草、石竹等植物的轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建上均有成功的例子。
與熟性相關(guān)的乙烯受體蛋白編碼基因在植物葉片脫落和果實(shí)成熟中起著重要的作用，其突變導(dǎo)致屬主植物熟性改變。擬南芥乙烯受體蛋白的顯性突變等位基因etr1-1在轉(zhuǎn)基因的香石竹中異源表達(dá)，使異源屬主獲得乙烯不敏感特性，從而導(dǎo)致熟性的變異。大約一半的轉(zhuǎn)基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了6天，延遲期最長達(dá)16天。轉(zhuǎn)基因花不表現(xiàn)花瓣內(nèi)卷曲的典型的乙烯依賴性衰敗現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因植株的花瓣始終保持堅(jiān)挺，直至逐步褪色和腐爛。
為了有效地、針對性地改變植物品種的成熟性(如花期延長或果實(shí)成熟延緩)，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與成熟性有關(guān)的蛋白及其編碼基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的乙烯受體蛋白(即小麥乙烯受體蛋白)以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在改變植物成熟性(如花期延長或果實(shí)成熟延緩)方面的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的小麥乙烯受體蛋白多肽，該多肽源自小麥的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結(jié)合功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述小麥乙烯受體蛋白多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-2223位的序列；(b)具有SEQ ID NO8中1-2223位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)小麥乙烯受體蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的小麥乙烯受體蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-2226個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗小麥乙烯受體蛋白多肽活性的化合物，以及抑制小麥乙烯受體蛋白多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在小麥乙烯受體蛋白的方法，它包括將樣品與小麥乙烯受體蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在小麥乙烯受體蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)小麥乙烯受體蛋白多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制小麥乙烯受體蛋白多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的小麥乙烯受體蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種改變植物成熟性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列，所述的小麥乙烯受體蛋白多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結(jié)合功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從小麥中分離獲得了新的乙烯受體蛋白，發(fā)現(xiàn)其與其他物種中分離的乙烯受體蛋白有一定同源性，并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小麥乙烯受體蛋白具有乙烯結(jié)合能力，并且轉(zhuǎn)入植物后，可導(dǎo)致植物熟性的變化。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“小麥乙烯受體蛋白”、“小麥乙烯受體蛋白多肽”或可互換使用，都指具有小麥乙烯受體蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的小麥乙烯受體蛋白或多肽”是指小麥乙烯受體蛋白多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化小麥乙烯受體蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括小麥乙烯受體蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然小麥乙烯受體蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“小麥乙烯受體蛋白多肽”指具有小麥乙烯受體蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與小麥乙烯受體蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括小麥乙烯受體蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與小麥乙烯受體蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗小麥乙烯受體蛋白多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含小麥乙烯受體蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了小麥乙烯受體蛋白多肽的可溶性片段。通常，該片段具有小麥乙烯受體蛋白多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供小麥乙烯受體蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然小麥乙烯受體蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“小麥乙烯受體蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼小麥乙烯受體蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的小麥乙烯受體蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或小麥乙烯受體蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的小麥乙烯受體蛋白多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼小麥乙烯受體蛋白多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，小麥乙烯受體蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含小麥乙烯受體蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得成熟性改變(如花期延長或果實(shí)成熟延緩)的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的小麥乙烯受體蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)剐←溡蚁┦荏w蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組小麥乙烯受體蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價(jià)值的能抑制或刺激小麥乙烯受體蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對小麥乙烯受體蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與小麥乙烯受體蛋白基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制小麥乙烯受體蛋白的分子，也包括那些并不影響小麥乙烯受體蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的小麥乙烯受體蛋白基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的小麥乙烯受體蛋白基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)小麥乙烯受體蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用小麥乙烯受體蛋白基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與小麥乙烯受體蛋白基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得?？剐←溡蚁┦荏w蛋白的抗體可用于檢測樣品中的小麥乙烯受體蛋白。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用小麥乙烯受體蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測小麥乙烯受體蛋白水平的測試方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的小麥乙烯受體蛋白水平，可用于解釋小麥乙烯受體蛋白在成熟性方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在小麥乙烯受體蛋白的方法是利用小麥乙烯受體蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與小麥乙烯受體蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在小麥乙烯受體蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用小麥乙烯受體蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測小麥乙烯受體蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從小麥cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2226個(gè)堿基，其開放讀框位于1-2223位，編碼全長為741個(gè)氨基酸的小麥乙烯受體蛋白(SEQ IDNO2)。小麥乙烯受體蛋白具有明確的結(jié)合乙烯的功能，但結(jié)合能力比見報(bào)道的擬南芥野生型ETR1低10倍，顯示其較強(qiáng)的延遲花期或果實(shí)成熟能力。此外，小麥乙烯受體蛋白在核酸水平上與已見報(bào)道的乙烯受體基因的最高同源性為64.2％，最低為43.3％，在氨基酸水平上的同源性最高為56.4％，最低為39.8％，是一個(gè)能用于構(gòu)建延遲花期或果實(shí)成熟的轉(zhuǎn)基因花卉、果蔬等轉(zhuǎn)基因植物的新基因。
小麥乙烯受體蛋白為改變植物的成熟性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景?？梢酝ㄟ^與熟性相關(guān)的基因如乙烯受體蛋白編碼基因的導(dǎo)入，改變現(xiàn)有優(yōu)良農(nóng)作物品種的熟性，獲得轉(zhuǎn)基因早熟小麥、水稻或其它農(nóng)作物品種，解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的實(shí)際問題。
轉(zhuǎn)乙烯受體蛋白編碼基因植株通過改變或打亂宿主植物的乙烯信號(hào)傳遞的遺傳控制機(jī)理，使轉(zhuǎn)基因植株獲得乙烯敏感或不敏感特性，在熟性上表現(xiàn)出早熟或晚熟等變異。這一技術(shù)路線完全不僅在研究思路和構(gòu)建途徑上有創(chuàng)新性，而且還具有更強(qiáng)的可操作性和更高的成功率。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1小麥乙烯受體蛋白基因的克隆使用Qiagen公司的mRNA Isolation Kit按公司提供的試劑盒操作說明書分離純化小麥的mRNA。使用Promega公司的Universal Riblone cDNASynthesis System，以上述分離的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選用λgt11噬菌體載體(Promega)，與加EcoRI接頭的cDNA連接成重組體，然后包裝鋪板。噬菌斑密度大約為15000pfu/Φ150mm平板，噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。采用隨機(jī)引物法標(biāo)記擬南芥、水稻和煙草乙烯受體基因DNA為探針，65℃雜交20-24小時(shí)。根據(jù)雜交結(jié)果挑取陽性噬菌斑，共獲得10個(gè)陽性噬菌斑。
經(jīng)酶切和進(jìn)一步的雜交鑒定確定其中一個(gè)含完整小麥的乙烯受體蛋白ETR1基因。經(jīng)全核苷酸序列分析結(jié)果表明小麥乙烯受體蛋白編碼基因全長為2226bp(SEQ ID NO1)，其ORF位于1-2223位，編碼全長為741個(gè)氨基酸的小麥乙烯受體蛋白，其序列如SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例2RT-PCR法獲得小麥乙烯受體蛋白的編碼序列為了驗(yàn)證序列的正確性，根據(jù)SEQ ID NO1的序列，設(shè)計(jì)和合成了如下引物正向引物5’-3’ 27ATGGGACCCGGATCAGTTG (SEQ ID NO3)反向引物5’-3’ 2190 TTGATTCCAGCTTTGCAAGG (SEQ ID NO4)以用常規(guī)方法抽提的小麥Poly A+RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃5分鐘，隨后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收，連接到T-Easy載體上采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果結(jié)果驗(yàn)證了小麥乙烯受體蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO1)的正確性。
實(shí)施例3小麥乙烯受體蛋白的結(jié)構(gòu)分析將小麥乙烯受體蛋白全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL +DDBJ +PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations +PDB +SwissProt +Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥乙烯受體蛋白及其編碼基因與已報(bào)道的下列物種的乙烯受體蛋白有一定同源性在核苷酸水平上，與擬南芥、水稻和煙草的乙烯受體蛋白基因的同源性分別為43.3％，46.6％、64.2％；在氨基酸水平上，與擬南芥、水稻和煙草的乙烯受體蛋白的同源性分別為48.2％、39.8％、56.4％。
此外，小麥乙烯受體蛋白基因在SEQ ID NO1的187-210位處含保守的乙烯結(jié)合位點(diǎn)的典型結(jié)構(gòu)tttatagttctttgtggagcaaca(SEQ ID NO5)，相應(yīng)的氨基酸殘基為SEQ ID NO2中的63-70位FIVLCGAT(SEQ ID NO6)。這暗示本發(fā)明蛋白具有乙烯受體蛋白的相應(yīng)功能。
實(shí)施例4小麥乙烯受體蛋白的點(diǎn)突變據(jù)報(bào)道，擬南芥乙烯受體蛋白的顯性突變等位基因etr1-1當(dāng)氨基酸序列中65位半胱氨酸殘基(Cys65)點(diǎn)突變?yōu)槔野彼?Tyr)或絲氨酸殘基(Ser)后突變蛋白不能結(jié)合乙烯，在轉(zhuǎn)基因的香石竹中異源表達(dá)，使異源屬主獲得乙烯不敏感特性，從而導(dǎo)致熟性的變異。大約一半的轉(zhuǎn)基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了6天，延遲期最長達(dá)16天。
在本實(shí)施例中，在分析小麥乙烯受體蛋白序列的基礎(chǔ)上，在需要突變的部位設(shè)計(jì)引物ttttatcgttctttatggagcaa(SEQ ID NO7)，使用TaKaRa MutanBEST Kit，以實(shí)施例2中獲得的PCR產(chǎn)物為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID NO2中第67位半胱氨酸殘基(tgt)Cys67點(diǎn)突變?yōu)槔野彼酺yr67(tat)的突變等位基因etrw02(即SEQ ID NO1中第200位g→a)。
采用BioDev PCR產(chǎn)物快速純化回收試劑盒并應(yīng)用Promega pGEM-T EasyVector Systems對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到E.coli DH5α中，然后在含Ap(50μg/ml)/IPTG/X-gal的LB平板上選擇白斑。經(jīng)核苷酸序列分析證明67位半胱氨酸殘基(tgt)確實(shí)已點(diǎn)突變?yōu)槔野彼?tat)。將該點(diǎn)突變的基因定名為小麥乙烯受體基因突變體etrw02。
實(shí)施例5小麥乙烯受體蛋白及其突變體etrw02在酵母菌中表達(dá)及其乙烯結(jié)合能力本實(shí)施例中，使用中間過渡載體—轉(zhuǎn)運(yùn)載體pPIC9K(購自Invitrogen公司)。pPIC9質(zhì)粒由兩區(qū)段組成，一區(qū)段來源于常用的大腸桿菌克隆載體pBR322，包括復(fù)制起始區(qū)(ori)和氨芐青霉素抗性基因片斷；另一區(qū)段來源于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)染色體上的酒精氧化酶基因片段的表達(dá)盒，主要結(jié)構(gòu)如下酒精氧化酶基因的5’旁側(cè)序列—酒精氧化酶基因啟動(dòng)子—酒精氧化酶基因終止區(qū)-3’旁側(cè)序列。外源植酸酶基因插入到酒精氧化酶基因啟動(dòng)子之后。
將實(shí)施例2獲得的小麥乙烯受體基因，實(shí)施例4獲得的突變體ETRW02基因和擬南芥野生型etr1基因插入到轉(zhuǎn)運(yùn)載體pPIC9的多克隆位點(diǎn)上(EcoRI酶切位點(diǎn))，與a-因子信號(hào)肽編碼序列正確融合，受可誘導(dǎo)的酵母酒精氧化酶AOX1啟動(dòng)子控制，得到重組轉(zhuǎn)運(yùn)載體pPETRW01(小麥野生型)、pPETRW02(小麥突變體)和pPETRA01(擬南芥野生型)。
以pPETRW02為例，在重組畢赤酵母的構(gòu)建過程中，首先要將重組轉(zhuǎn)運(yùn)載體pPETRW02中的來源大腸桿菌的DNA部分用限制性內(nèi)切酶BglII切去，用剩下的DNA部分電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過其上的酒精氧化酶基因的3’旁側(cè)序列和5’旁側(cè)序列與酵母染色體上的同源序列進(jìn)行同源重組，將位于酒精氧化酶基因的3’旁側(cè)序列和5’旁側(cè)序列之間的植酸酶基因雙交換整合到酵母染色體上，并替換下染色體上的酒精氧化酶基因，使酵母由能利用甲醇為碳源生長變?yōu)椴荒芾眉状忌L，利用此標(biāo)記初步篩選到重組酵母(mut-)，進(jìn)一步通過受體酵母為His缺陷型而重組后將變?yōu)榉侨毕菪瓦@一標(biāo)記，最終篩選到重組酵母P.pastorispPETRW02。
按相同方法，獲得重組酵母pPETRW01和pPETRA01(對應(yīng)于小麥乙烯受體蛋白和擬南芥的etr1)。
采用14C標(biāo)記乙烯利(購自Sigma公司)，研究小麥乙烯受體基因及其突變體ETRW02在酵母菌中的乙烯結(jié)合功能。
結(jié)果表明，含擬南芥野生型ETR1的酵母菌的乙烯結(jié)合能力為5700±21014C2H4dpm/mg，含小麥的ETR1的酵母菌的乙烯結(jié)合能力為1456±13314C2H4dpm/mg，而65位半胱氨酸被取代的突變體ETRW02的乙烯結(jié)合能力為580±10514C2H4dpm/mg。小麥的ETR1的乙烯結(jié)合能力比擬南芥野生型ETR1低約4倍，而小麥ETR1突變體乙烯結(jié)合能力比擬南芥野生型ETR1低10倍。
實(shí)施例6小麥乙烯受體蛋白基因突變體etrw02的植物表達(dá)載體在本實(shí)施例中，將etrw02中BamH1/EcoR1片段克隆到pUC衍生質(zhì)粒pAB80(p35s-gusA-Tnos)(購自Stratagene公司)上，替代gusA基因，使etrw02基因被控制在CaMV 35s啟動(dòng)子(全植株表達(dá))之下。具體步驟如下1.用PCR引物AB33和AB34擴(kuò)增得到etrw02 5’端3.1kb片段。擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH1/EcoR1酶切，將酶切片段連接到用同樣雙酶切的pAB80質(zhì)粒上，得質(zhì)粒pBWE-2。
AB33上游引物(-440 to-417)5’端含有BamH1酶切位點(diǎn)5’-CCCGGATCCTCTTCTCCGATCAATTCTTCCC-3’(SEQ ID NO8)AB34下游引物(+2657 to+2638)，5’端含有EcoR1酶切位點(diǎn)5’-CCGGAATTCGCCTTTACATGCCCTCG-3’(SEQ ID NO9)2.用PCR引物AB35和AB36擴(kuò)增得到etrw02 3’端3.9kb。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR1酶切后連接到同樣用EcoR1酶切的pBWE-2質(zhì)粒上。這樣克隆有正確表達(dá)方向的質(zhì)粒稱謂pBWE22。
AB35上游引物(+2638 to+2657)，3’端含有EcoR1酶切位點(diǎn)5’-CGAGGGCATGTAAAGGCGAATTCCGG-3’(SEQ ID NO10)AB36下游引物(+5659 to+2640)，5’端含有EcoR1酶切位點(diǎn)5’-CCGGAATTGGTCTAAACAACGCCAAG-3’(SEQ ID NO11)3.pBWE22上的SalI/ClaI片段(含完整的突變體基因etrw02，其表達(dá)由CaMV 35s啟動(dòng)子控制)插入到二元載體pAB2(Stratagene公司)中，得到質(zhì)粒pBWE220。
按相同方法，獲得含完整的野生型基因etrw01，其表達(dá)由CaMV 35s啟動(dòng)子控制的質(zhì)粒pBWE110。
實(shí)施例7花期延長的轉(zhuǎn)基因香石竹的構(gòu)建將二元載體pBWE220分別利用三親結(jié)合方法從E.coli中轉(zhuǎn)到Agrobacteriumtumefaciens AGLO(購自Stratagene公司)，助質(zhì)粒為pRK2013(購自Stratagene公司)。而后用Agrobacterium tumefaciens轉(zhuǎn)染香石竹葉片。在、待分化培養(yǎng)基上長出分化芽后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。一周后于溫室培養(yǎng)共得到12株經(jīng)Southern和Northern雜交證明確實(shí)含有小麥etrw02(67位半胱氨酸被酪氨酸取代的突變體)基因片段的轉(zhuǎn)基因植株。
轉(zhuǎn)基因植株的花期與非轉(zhuǎn)基因植株比較，大約一半的轉(zhuǎn)基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了8天，延遲期最長達(dá)20天。轉(zhuǎn)基因花不表現(xiàn)花瓣內(nèi)卷曲的典型的乙烯依賴性衰敗現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因植株的花瓣始終保持堅(jiān)挺，直至逐步褪色和腐爛。
按相同方法，使用質(zhì)粒pBWE110將野生型的小麥乙烯受體蛋白基因轉(zhuǎn)入香石竹，獲得轉(zhuǎn)基因的植株，結(jié)果大約三分之一的轉(zhuǎn)基因植株與對照比較花的衰敗平均至少延遲了4天，延遲期最長達(dá)10天。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所<120>小麥乙烯受體蛋白及其編碼序列<130>025278<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2226<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220><221>CDS<222>(1)..(2223)<223><400>1atg gat tgt aaa ggc ttt gtt ccc caa tgg gac ccg gat cag ttg tta48Met Asp Cys Lys Gly Phe Val Pro Gln Trp Asp Pro Asp Gln Leu Leu1 5 10 15atc aaa tta acg tat acc tcc ata ttc ttt att gca tgg gcc ata cct96Ile Lys Leu Thr Tyr Thr Ser Ile Phe Phe Ile Ala Trp Ala Ile Pro20 25 30ccc atc cat att agg ggt gaa ttc ttc gtt act aag gtc gct ttt aaa144Pro Ile His Ile Arg Gly Glu Phe Phe Val Thr Lys Val Ala Phe Lys35 40 45ttt cca tat aaa agc tgg gta ctc gtc gtg cag ttt ggt gct ttt ata192Phe Pro Tyr Lys Ser Trp Val Leu Val Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile50 55 60gtt ctt tgt gga gca aca cat ctt atc aac ttg tgg act ctc acc ccc240Val Leu Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Leu Thr Pro65 70 75 80cat aca agg act gtg gcg ata gtg aaa cca aac gca tta gtc ttg act288His Thr Arg Thr Val Ala Ile Val Lys Pro Ash Ala Leu Val 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1.一種分離的小麥乙烯受體蛋白多肽，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結(jié)合功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-2223位的序列；(b)具有SEQ ID NO8中1-2223位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)小麥乙烯受體蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有小麥乙烯受體蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的小麥乙烯受體蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種改變植物成熟性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列，所述的小麥乙烯受體蛋白多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯結(jié)合功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入小麥乙烯受體蛋白多肽DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的乙烯受體蛋白－小麥乙烯受體蛋白，編碼小麥乙烯受體蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種小麥乙烯受體蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種小麥乙烯受體蛋白的多核苷酸的用途，尤其是用于改變植物的成熟性。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1480464SQ0213678
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者林敏 , 楊滔, 王憶平, 陸偉, 林 敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所