專利名稱：重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種新的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，表達(dá)該重組細(xì)胞因子的核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞，和該重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的生產(chǎn)方法及其在制備治療腫瘤的藥物中的用途和含有它的藥物組合物。
背景技術(shù)：
趨化因子是一類在結(jié)構(gòu)和功能上相互關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子，通過(guò)蓖麻毒素敏感的G蛋白受體發(fā)生作用。它可以選擇性地富集某些白細(xì)胞的亞類，從而在感染和免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還有一些趨化因子還具有指導(dǎo)淋巴細(xì)胞的遷移和歸巢，刺激或抑制血管生成等作用。趨化因子及其受體在淋巴細(xì)胞遷移過(guò)程的作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)環(huán)節(jié)中，一是由血液進(jìn)入淋巴結(jié)、Peyer’s集結(jié)和炎癥組織的過(guò)程中，一是在指導(dǎo)淋巴細(xì)胞在淋巴組織、器官中定向的過(guò)程中。根據(jù)趨化因子N端兩個(gè)保守Cys的結(jié)構(gòu)狀況可以將其分為四類，外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子SLC(secondary lymphoid-tissue Chemokine)屬CC類趨化因子，其兩個(gè)半胱氨酸之間無(wú)其它氨基酸間隔，是CC類趨化因子受體CCR7(CCchemokine receptor)的一個(gè)配體，其基因定位于人染色體9p13。CC類趨化因子主要作用于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)、NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞。SLC可以和ELC(Epstein-Barr virus-induced molecule-1 ligand chemokine)共同指導(dǎo)T細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)入淋巴組織T細(xì)胞區(qū)。SLC和ELC在脾臟的T細(xì)胞區(qū)、淋巴結(jié)和Peyer’s集結(jié)處組成型表達(dá)。其中SLC在淋巴結(jié)高度內(nèi)化的小靜脈(high endothelial venules，HEVs)和Peyer’s集結(jié)處高度表達(dá)。對(duì)SLC趨化T細(xì)胞的作用，已經(jīng)有確定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。在SLC基因缺陷的plt鼠(paucity of lymph node T cell，plt)的HEV中不能大量表達(dá)SLC蛋白，也就不能引發(fā)T細(xì)胞的粘附作用，雖然SLC及CCR7的另一個(gè)配體MIP-3β都是通過(guò)CCR7發(fā)生作用，但在T細(xì)胞的快速粘附過(guò)程中，可能只有SLC才有能力被提呈，CCR7與SLC之間的互作對(duì)于完成T細(xì)胞進(jìn)入淋巴器官的過(guò)程是不可或缺的。結(jié)果它可以在體外引發(fā)大多數(shù)依賴整聯(lián)蛋白(integrin)的外周血淋巴細(xì)胞發(fā)生粘附作用。將SLC注入腫瘤組織后可以吸引淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞到達(dá)腫瘤組織發(fā)揮作用。樹(shù)突狀細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤治療的研究報(bào)道漸多，SLC及其他趨化因子則可以改善免疫治療的效果。已有研究表明在通常情況下，雖然腫瘤細(xì)胞表面可以表達(dá)異常蛋白，但其逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制使得免疫系統(tǒng)不能有效地發(fā)揮作用，SLC則可使腫瘤組織中免疫增強(qiáng)蛋白顯著增加，有助于激活免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷功能。此外，SLC還能抑制腫瘤組織的血管生成，阻斷其養(yǎng)分供應(yīng)途徑，限制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。已有實(shí)驗(yàn)表明將重組的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的SLC蛋白用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺癌治療時(shí)，可使40％個(gè)體的腫瘤消退，其余個(gè)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也明顯受到抑制，而對(duì)照組腫瘤細(xì)胞則無(wú)限增生。目前正在開(kāi)展的SLC在免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用機(jī)制的研究結(jié)果表明SLC是一個(gè)很有希望的腫瘤免疫治療候選分子(主要參考文獻(xiàn)1.Cyster，在次要的淋巴樣的組織中趨化因子和細(xì)胞遷移(Chemokines and cell migration in secondary lymphoidorgans).科學(xué)(Science).1999，2862098-2102.2.Federica，趨化因子受體在初次，效應(yīng)，和記憶免疫反應(yīng)中的作用(The role ofchemokine receptors in primary，effector，and memory immuneresponses).免疫學(xué)年鑒(Annu.Rev.Immunol.)2000，18503-602.3.Campobell，在組織-特異性和微環(huán)境-特異性的淋巴細(xì)胞尋靶中的趨化因子(Chemokines in tissue-specific and microenvironment-specificlymphocyte homing).當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin.In Immu.)2000，12336-341.4.Nagira，作為淋巴細(xì)胞的有效的化學(xué)引誘劑的新的人趨化因子次要的淋巴樣的組織中趨化因子的分子克隆和對(duì)染色體9p13的定位(Molecular cloning of a novel human chemokine secondarylymphoid-tissue chemokine that is a potent chemoattractant forlymphocytes and mapped to chromsome 9p13).JBC.1997，27219518-19524.5.Sharma，次要的淋巴樣的組織中趨化因子介導(dǎo)體內(nèi)的T細(xì)胞依賴性的抗腫瘤反應(yīng)(Secondary lymphoid tissue chemokinemediates T cell-dependent antitumor response in vivo.)免疫學(xué)雜志(J.Immunology).2000，164(9)4558-4563.)。
我們采用人工合成的方法獲得了此基因的序列，并以大腸桿菌為宿主表達(dá)目的蛋白可以以較低的成本生產(chǎn)出完全人源的SLC，避免治療過(guò)程中免疫原性的干擾。
本發(fā)明的另一方面是提供一種適合在大腸桿菌中表達(dá)的編碼所述的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面是提供兩種可用于表達(dá)所述的趨化性細(xì)胞因子的大腸桿菌質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一方面是提供一種用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是提供一種利用大腸桿菌生產(chǎn)廣譜、高效的腫瘤免疫治療制劑-重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的生產(chǎn)方法和純化方法。
本發(fā)明的另一方面是上述的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面是提供一種藥物組合物，其含有上述的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子。
另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面和具有創(chuàng)造性的有益效果對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.重疊PCR方法拼接擴(kuò)增帶有大腸桿菌腸毒素信號(hào)肽的SLC的10個(gè)核苷酸序列及設(shè)計(jì)的中間引物。
圖2.重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子(SLC)的核苷酸及氨基酸序列圖3.表達(dá)質(zhì)粒載體pTMF-SLC的物理圖譜及其多克隆位點(diǎn)序列。
圖4.表達(dá)質(zhì)粒載體pALM-SLC的物理圖譜及其多克隆位點(diǎn)序列。
圖5.pTMF-SLC表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果其中泳道1、2為pTMF-SLC未誘導(dǎo)的沉淀和上清，泳道3、4、5、6分別為pTMF-SLC上清、沉淀、沉淀、上清，泳道7為Marker，泳道8為pTMF-SLC沉淀，泳道9、10為pTMF-SLC上清和沉淀，泳道11、12為空載體對(duì)照的上清和沉淀。
圖6 pALM-SLC表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果其中泳道1，2分別為空載體的超聲上清和沉淀；泳道3，4分別為pALM-SLC-slc超聲上清和沉淀；泳道5分子量標(biāo)記。
圖7.重組人SLC的包含體經(jīng)柱上復(fù)性后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，其中泳道1用6M鹽酸胍裂解后的離心沉淀用6M鹽酸胍裂解，泳道2用8M尿素裂解后的沉淀再用6M鹽酸胍裂解，泳道3分子量Marker，泳道4復(fù)性結(jié)果。
圖8.pALM-SLC表達(dá)可溶形式的重組SLC經(jīng)親和層析純化后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果其中泳道1、2分別為結(jié)合緩沖液的洗脫液和上樣峰；泳道3pTMF-SLC超聲上清；泳道4清洗緩沖液洗脫峰；泳道5為洗脫緩沖液I洗脫峰；泳道6洗脫緩沖液II洗脫峰；泳道7分子量標(biāo)記；泳道9pTMF-SLC。
圖9.Western Blot檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)重組人SLC的結(jié)果純化SLC的Western blotting結(jié)果，其中泳道1對(duì)照；2分子量標(biāo)記；3SLC純化產(chǎn)物。
圖10.重組SLC與Jurkat細(xì)胞細(xì)胞膜制備物的ELISA結(jié)果。
圖11.重組SLC對(duì)人外周淋巴細(xì)胞趨化性測(cè)定結(jié)果。
圖12.重組人SLC趨化人外周血淋巴細(xì)胞的顯微攝影照片A為重組SLC的趨化性結(jié)果，B和C分別為空白和無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照pALM-SLC-SLC上清純化產(chǎn)物對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的趨化作用A.0.04μg/ml的重組SLC；B.PBS對(duì)照；C.1mg/mlBSA對(duì)照具體實(shí)施方式
在本發(fā)明的上下文中，所使用的術(shù)語(yǔ)除非另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明提供了一種重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，它保留了人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的成熟肽部分，由大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子編碼，它能特異性地與表達(dá)其天然受體CCR7的成熟T細(xì)胞結(jié)合，并能特異性地對(duì)T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。編碼序列中包括編碼C-myc標(biāo)簽序列，其中C-myc標(biāo)簽可以用于表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)及純化；在各個(gè)標(biāo)簽序列之間以及重組趨化性細(xì)胞因子之間存在酶切位點(diǎn)，便于在不同載體之間移植，或者與其他導(dǎo)向蛋白分子融合表達(dá)。
本發(fā)明提供了兩種可用于表達(dá)重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒。一種質(zhì)粒以pTMF為基礎(chǔ)構(gòu)建，pTMF質(zhì)粒由北京安波特基因工程技術(shù)有限公司以具有T7啟動(dòng)子的pET28a為背景質(zhì)粒，通過(guò)設(shè)計(jì)和合成一個(gè)帶有多種酶切位點(diǎn)的DNA片段置換pET28a的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成(圖3)。該質(zhì)粒除了具有高效表達(dá)的特點(diǎn)外，還具備如下特點(diǎn)具有多種較稀少的酶切位點(diǎn)，便于插入各種外源基因使它們或共表達(dá)或成融合蛋白表達(dá)；在兩組酶切位點(diǎn)之間有一凝血酶的酶切位點(diǎn)，可將表達(dá)的融合蛋白純化后分開(kāi)；在多克隆位點(diǎn)的3’端有(His)6密碼子，便于表達(dá)產(chǎn)物作金屬鰲合層析純化。在重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子基因下游融合一段人原癌基因c-myc標(biāo)簽序列后進(jìn)行雙酶切，將此片段連接到pTMF多克隆位點(diǎn)，這種含有人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的質(zhì)粒命名為pTMF-SLC。另一種質(zhì)粒以pALM為基礎(chǔ)構(gòu)建，pALM質(zhì)粒由北京安波特基因工程技術(shù)有限公司以具有pL啟動(dòng)子的pAL-781(購(gòu)自Invitrogen公司)為背景質(zhì)粒，通過(guò)設(shè)計(jì)和合成一個(gè)帶有多種酶切位點(diǎn)的DNA片段置換pAL-781的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成(圖4)，為便于檢測(cè)與純化，在重組人外周淋巴組織組織趨化性細(xì)胞因子和多組氨酸標(biāo)簽序列之后加入c-myc標(biāo)簽序列，這種含有重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的質(zhì)粒命名為pALM-SLC。
本發(fā)明還提供了一種含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞最好為大腸桿菌。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的方法，這一方法可以歸結(jié)為如下步驟1.按照SLC的成熟肽序列，選擇大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，設(shè)計(jì)10個(gè)基因片段，經(jīng)體外重疊PCR擴(kuò)增出可以編碼SLC的完整基因。
2.將得到的SLC基因和質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)相應(yīng)的酶切后，插入多克隆位點(diǎn)。構(gòu)建成高效表達(dá)的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
3.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使其表達(dá)所述的趨化因子。
4.分離純化表達(dá)的趨化因子。
本發(fā)明生產(chǎn)重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的方法最好包括以下步驟1.依據(jù)GenBank(ACCESSION No.AB002409)提供的SLC成熟肽的氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，設(shè)計(jì)出適合在大腸桿菌中表達(dá)的SLC核苷酸序列，并在其5’端加入有利于可溶表達(dá)的大腸桿菌腸毒素信號(hào)肽。將此人工設(shè)計(jì)序列拆分為10個(gè)長(zhǎng)度為50-60個(gè)核苷酸的片段，各片段間有15-20個(gè)堿基重疊以便復(fù)性后延伸，各片段的核苷酸序列見(jiàn)附圖1。經(jīng)重疊PCR的方法用高保真熱穩(wěn)定DNA聚合酶pfu(購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)公司)擴(kuò)增最終產(chǎn)生長(zhǎng)度為405bps的全長(zhǎng)序列，為便于連接到不同載體中，分別在編碼序列上游和下游設(shè)計(jì)了含有NcoI、EcoRI或XhoI、BamHI酶切位點(diǎn)的接頭(adaptor)序列。上述片段與載體分別經(jīng)NcoI、EcoRI或XhoI、BamHI雙酶切后電泳回收(上述內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司，柱離心式DNA凝膠回收試劑盒為上海華舜公司生產(chǎn))，回收產(chǎn)物經(jīng)連接反應(yīng)后，熱激轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞BL21(購(gòu)自Invirtrogen Inc，USA)和GI724(購(gòu)自Invitrogen公司)，構(gòu)建成表達(dá)載體pTMF-SLC和pALM-SLC。
2.誘導(dǎo)pALM-SLC和pTMF-SLC表達(dá)載體的表達(dá)，挑取經(jīng)測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的克隆pTMF-SLC和pALM-SLC分別在含終濃度為50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨芐青霉素的LB和RM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜(LB培養(yǎng)基在800ml水中加入胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母抽提物5g，固體培養(yǎng)基加入1.5％瓊脂粉，加水定容為1L；RM培養(yǎng)基在800ml水中加入Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO43g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，酪蛋白酶解物20g，MgCl2·6H2O 0.203g，50％甘油20ml，調(diào)pH為7.0，加水定容為1L)。按1∶100轉(zhuǎn)接過(guò)夜培養(yǎng)物，快速振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)在pTMF-SLC培養(yǎng)基中加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在pALM-SLC培養(yǎng)基中按1∶100的比例加入終濃度為100微克/毫升的色氨酸誘導(dǎo)表達(dá)?？焖僬袷幣囵B(yǎng)3-4小時(shí)后離心收集菌體，用PBS洗滌后超聲碎菌，12000rpm離心10分鐘，分別收集超聲上清和沉淀進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，初步鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量、表達(dá)量以及表達(dá)形式，然后用Western blot的方法進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量和特異性。用培養(yǎng)的表達(dá)SLC受體CCR7的Jurkat細(xì)胞和人新鮮外周血提取的淋巴細(xì)胞制備細(xì)胞膜制備物，具體方法為2000rpm離心5min收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗滌兩次后加入適量PBS，選擇輸出功率指數(shù)為3-4，占空比為40％的條件下超聲60秒，破碎細(xì)胞。12000rpm離心15min，取上清待用，或-20℃保存。以ELISA的方法檢測(cè)純化的重組SLC與Jurkat細(xì)胞以及外周血T淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜制備物結(jié)合的特異性。
3.pTMF-SLC和pALM-SLC表達(dá)載體經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)以包含體或可溶形式存在于產(chǎn)物中。經(jīng)包含體柱上復(fù)性的和親和層析純化的SLC產(chǎn)物分別進(jìn)行趨化性測(cè)定，檢測(cè)重組SLC對(duì)T淋巴細(xì)胞的趨化作用。
用pALM-SLC轉(zhuǎn)化大腸桿菌GI724(購(gòu)自Invitrogen公司)，挑取經(jīng)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到2ml RM培養(yǎng)基中(在800ml水中加入Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO43g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，酪蛋白酶解物20g，MgCl2(·6H2O 0.203g，50％甘油20ml，調(diào)pH為7.0，加水定容為1L)30℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1∶50(V/V)的比例接種于50ml RM培養(yǎng)基中30℃放大培養(yǎng)，然后以1∶50(V/V)的比例轉(zhuǎn)接于2L RM培養(yǎng)基中，于30℃生長(zhǎng)至OD600＝0.5～0.7，在以1∶100的比例加入Trp于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，離心收集菌體。重組SLC以可溶表達(dá)為主(附圖6)。誘導(dǎo)表達(dá)的重組SLC經(jīng)親和層析進(jìn)行了純化，經(jīng)親和層析后的樣品電泳結(jié)果見(jiàn)附圖8，由圖可見(jiàn)，親和層析所得的樣品純度極高，超過(guò)95％。上述純化產(chǎn)物因?yàn)閹в衅銫端帶有c-myc標(biāo)簽序列，因此可以用9E10為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)附圖9。實(shí)施例3.重組人SLC與Jurkat細(xì)胞及人外周血淋巴細(xì)胞膜制備物的結(jié)合活性測(cè)定制備T淋巴細(xì)胞的裂解物，未用NP40等去污劑處理以減少干擾，T淋巴細(xì)胞選擇Jurkat細(xì)胞(ATCC TIB-152)，包被及其后的實(shí)驗(yàn)均按標(biāo)準(zhǔn)的ELISA過(guò)程操作。具體操作取96孔細(xì)胞板，每個(gè)孔中加入用包被液稀釋的Jurkat細(xì)胞細(xì)胞膜的粗制物100μl(＞20μg/孔)，4℃包被過(guò)夜，PBS(pH7.4)洗板后加入含4％脫脂奶粉或1％BSA的PBS封閉液，37℃封閉2hr，PBS洗板三次。按不同比例稀釋表達(dá)的SLC超聲上清，37℃孵育1-2hr；用含0.05％吐溫20的PBS洗板三次，每次1min，下同；加入鼠抗人C-myc隆抗體(1∶1000)孵育1-2hr，洗板；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶2500)孵育1hr以上，洗板5次，每孔加入顯色液(每10ml檸檬酸緩沖液中含4mg OPD，用前加入15μl30％H2O2)15μl，避光顯色至出現(xiàn)差異，用2N H2SO4終止反應(yīng)，在490nm讀取吸光值以鼠抗C-myc抗體為二抗，HRP-羊抗鼠IgG為三抗。純化的重組SLC與T淋巴細(xì)胞的制備物之間有較明顯的特異性結(jié)合，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，當(dāng)濃度為50μg/ml時(shí)表現(xiàn)出較高的活性(附圖10)。實(shí)施例4.重組人SLC對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的趨化性測(cè)定趨化因子的重要生物學(xué)功能在于可以特異性地對(duì)特定的細(xì)胞亞群產(chǎn)生趨化作用。在測(cè)定趨化性時(shí)，首先進(jìn)行聚碳酸酯膜的預(yù)處理在聚碳酸酯膜面向趨化物質(zhì)的一面覆蓋上0.5％IV型膠原蛋白，室溫下兩小時(shí)，然后在雙蒸水中輕輕涮洗，晾干后備用。在趨化性測(cè)定板(Neuroprobe Inc，USA)底板每孔加入160μl不同濃度的待測(cè)液及空白(磷酸緩沖液，PBS)和無(wú)關(guān)蛋白(小牛血清白蛋白，BSA)對(duì)照(樣品在加之前在37℃水浴20-30分鐘)，使其形成外凸彎月面，以防氣泡產(chǎn)生；將不含PVP的聚碳酸膜(Neuroprob Inc，USA)光面向下蓋在底板之上，硅膠墊片按位置蓋在濾膜之上，加上上層板后將各個(gè)位置的螺母均勻擰緊，防止孔間污染。上層板各孔加滿細(xì)胞液(130μl)，避免氣泡，每平方毫米上細(xì)胞數(shù)量為1000左右則細(xì)胞量為105個(gè)；將加了細(xì)胞的趨化性板在37℃含5％CO2，飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)，其間上孔中的細(xì)胞經(jīng)由聚碳酸膜上面向下做趨化運(yùn)動(dòng)。孵育結(jié)束后用吸水紙吸去上孔的培養(yǎng)液，松開(kāi)螺絲，將趨化板翻轉(zhuǎn)，提起底板，勿動(dòng)濾膜，此時(shí)濾膜粘附于硅膠墊上，有遷移細(xì)胞的一面向上。取下濾膜，在清水中漂洗無(wú)遷移細(xì)胞的一面，用橡皮刷刷去未遷移細(xì)胞，不要碰到膜另側(cè)。將濾膜的光面向上置于載玻片上，70％甲醇固定10分鐘，用Baso劉氏染料(Baso Inc，Taiwan)染色，晾干后在高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。計(jì)算趨化指數(shù)(chemotactic index，CI)
綜合幾次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得到了重組SLC濃度與對(duì)淋巴細(xì)胞趨化指數(shù)的關(guān)系，從附圖11可知，SLC對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的最大趨化活性在0.004μg/ml-0.006μg/ml之間，重組SLC在0.04μg/ml時(shí)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞趨化性作用的鏡檢結(jié)果見(jiàn)附圖12。
SEQUENCE LISTING<110> 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所北京安波特基因工程技術(shù)有限公司<120> 重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子及其制備方法和用途<130> I020284<160> 17<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 405<212> DNA<213> Artificial<220><221> CDS<222> (1)..(405)<223><400> 1atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt tct 48Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser1 5 10 15att gct aca aac gcg tac gct agc gat ggc ggc gcg cag gat tgc tgc 96Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys20 25 30ctg aaa tat agc cag cgt aaa att ccg gcg aaa gtt gtt cgc agc tac144Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr35 40 45cgt aaa cag gaa ccg agc ctg ggc tgc agc atc ccg gcg atc ctg ttt192Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe50 55 60ctg ccg cgt aaa cgt agc cag gcg gaa ctg tgc gcc gat ccg aaa gaa240Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu65 70 75 80ctg tgg gtg cag cag ctg atg cag cat ctg gat aaa acc ccg agc ccg288Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro85 90 95cag aaa ccg gcg cag ggc tgc cgt aaa gat cgt ggc gcg agc aaa acc336Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr100 105 110ggc aaa aaa ggc aaa ggc agc aaa ggc tgc aaa cgt acc gaa cgt agc384Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser115 120 125cag acc ccg aaa ggc ccg tag405Gln Thr Pro Lys Gly Pro *130<210> 2<211> 134<212> PRT<213> Artificial<400> 2Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser1 5 10 15Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys20 25 30Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr35 40 45Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe50 55 60Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu65 70 75 80Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro85 90 95Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr100 105 110Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
115 120 125Gln Thr Pro Lys Gly Pro130<210> 3<211> 44<212> DNA<213> Artificial<400> 3aaaaagaata tcgcatttct tcttgcatct atgttcgttt tttc 44<210> 4<211> 57<212> DNA<213> Artificial<400> 4gcatctatgt tcgttttttc tattgctaca aacgcgtacg ctagcgatgg cggcgcg 57<210> 5<211> 54<212> DNA<213> Artificial<400> 5agcgatggcg gcgcgcagga ttgctgcctg aaatatagcc agcgtaaaat tccg54<210> 6<211> 60<212> DNA<213> Artificial<400> 6caggctcggt tcctgtttac ggtagctgcg aacaactttc gccggaattt tacgctggct 60<210> 7<211> 60<212> DNA<213> Artificial<400> 7aaacaggaac cgagcctggg ctgcagcatc ccggcgatcc tgtttctgcc gcgtaaacgt 60<210> 8<211> 60<212> DNA<213> Artificial<400> 8tgcacccaca gttctttcgg atcggcgcac agttccgcct ggctacgttt acgcggcaga 60<210> 9<211> 59<212> DNA<213> Artificial<400> 9cgaaagaact gtgggtgcag cagctgatgc agcatctgga taaaaccccg agcccgcag 59<210> 10<211> 60<212> DNA<213> Artificial<400> 10ttttgctcgc gccacgatct ttacggcagc cctgcgccgg tttctgcggg ctcggggttt 60<210> 11<211> 58<212> DNA<213> Artificial<400> 11cgtggcgcga gcaaaaccgg caaaaaaggc aaaggcagca aaggctgcaa acgtaccg58<210> 12<211> 47<212> DNA<213> Artificial<400> 12ctacgggcct ttcggggtct ggctacgttc ggtacgtttg cagcctt47<210> 13<211> 25<212> DNA<213> Artificial<400> 13ggctcgagat ggcgcagtct ctggc25<210> 14<211> 21<212> DNA<213> Artificial<400> 14caggctcggt tcctgtttacg 21<210> 15<211> 19<212> DNA<213> Artificial<400> 15aaacaggaac cgagcctgg 19<210> 16<211> 16<212> DNA<213> Artificial<400> 16ttttgctcgc gccacg 16<210> 17<211> 25<212> DNA<213> Artificial<400> 17ccgaattcct acgggccttt cgggg2權(quán)利要求
1.一種重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，它保留了人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的成熟肽部分，由大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子編碼，它能特異性地與表達(dá)其天然受體CCR7的成熟T細(xì)胞結(jié)合，并能特異性地對(duì)T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，其特征在于，所述的趨化性細(xì)胞因子部分是帶有大腸桿菌腸毒素信號(hào)肽的人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子。
3.按照權(quán)利要求2所述的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，其特征在于具有如下的氨基酸序列1MKKNIAFLLA1011SMFVFSIATN2021AYASDGGAQD3031CCLKYSQRKI4041PAKVVRSYRK5051QEPSLGCSIP6061AILFLPRKRS7071QAELCADPKE8081LWVQQLMQHL9091DKTPSPQKPA100101QGCRKDRGAS110111KTGKKGKGSK120121GCKRTERSQT130131PKGP*135
4.一種編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4的核苷酸序列，其特征在于具有如下的核苷酸序列1 ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA 3031 TCT ATG TTC GTT TTT TCT ATT GCT ACA AAC 6061 GCG TAC GCT AGC GAT GGC GGC GCG CAG GAT 9091 TGC TGC CTG AAA TAT AGC CAG CGT AAA ATT 120121 CCG GCG AAA GTT GTT CGC AGC TAC CGT AAA 150151 CAG GAA CCG AGC CTG GGC TGC AGC ATC CCG 180181 GCG ATC CTG TTT CTG CCG CGT AAA CGT AGC 210211 CAG GCG GAA CTG TGC GCC GAT CCG AAA GAA 240241 CTG TGG GTG CAG CAG CTG ATG CAG CAT CTG 270271 GAT AAA ACC CCG AGC CCG CAG AAA CCG GCG 300301 CAG GGC TGC CGT AAA GAT CGT GGC GCG AGC 330331 AAA ACC GGC AAA AAA GGC AAA GGC AGC AAA 360361 GGC TGC AAA CGT ACC GAA CGT AGC CAG ACC 390391 CCG AAA GGC CCG TAG 405
6.一種含有權(quán)利要求4或者5所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
7.按照權(quán)利要求6所述的載體，它是pTMF-SLC。
8.按照權(quán)利要求6所述的載體，它是pALM-SLC。
9.一種含有權(quán)利要求6-8中任何一項(xiàng)所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
10.按照權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，它是大腸桿菌。
11.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的方法，包括a.按照大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，設(shè)計(jì)適合在大腸桿菌中表達(dá)的人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，此序列中包含有大腸桿菌腸毒素信號(hào)肽序列，b.用重疊PCR的方法將人工合成的帶有大腸桿菌外毒素信號(hào)肽序列的人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子序列片段體外拼接為完整分子，插入表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)，c.分離純化表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行此重組趨化性細(xì)胞因子與其天然受體的結(jié)合活性測(cè)定和對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的趨化性測(cè)定。
12.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
13.一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子作為活性成分，以及藥用載體或者賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及涉及一種新的重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子，表達(dá)該重組細(xì)胞因子的核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞，和該重組人外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子的生產(chǎn)方法及其在制備治療腫瘤的藥物中的用途和含有它的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1480465SQ0214155
公開(kāi)日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2002年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月2日
發(fā)明者尹長(zhǎng)城, 黃華樑, 劉明學(xué), 林晴, 春雷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 北京安波特基因工程技術(shù)有限公司