專利名稱：修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及白蛋白的制備方法，特別是修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法背景技術(shù)最近幾年醫(yī)學(xué)發(fā)展發(fā)現(xiàn)，獻血人員，常常有不易被發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒，如乙肝病毒、丙肝病毒、甲肝病毒，甚至艾滋病病毒攜帶者，血液制品有傳播這些病毒性疾病的嫌疑，因此，血漿白蛋白的生產(chǎn)受到了限制，人血白蛋白的短缺問題將日趨明顯。每年對白蛋白的需要量很大，每年產(chǎn)量就在200噸左右，需要數(shù)十萬人獻血，所以價格比較昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對人血白蛋白的需求量大，價格昂貴，且易于傳播病毒性疾病的不足，提供一種利用修飾豬血白蛋白替代人血白蛋白的制備方法。
血液是由血細胞和血漿組成的。人血漿白蛋白由575個氨基酸組成的單一肽鏈。在人體內(nèi)具有獨特的作用和功能，它是血液內(nèi)多種物質(zhì)運輸?shù)闹匾d體，也與多種藥物的體內(nèi)代謝相關(guān)。人們通過研究發(fā)現(xiàn)，華法令、安定和洋地黃毒甙，這三種藥物在人血白蛋白上至少有三個結(jié)合位點，許多藥物發(fā)揮作用與解毒都是通過與白蛋白結(jié)合后發(fā)生的。
人血白蛋白的分子量據(jù)估計約為65.00，由于分子量較小而含量多。故它的主要機能是維持血漿膠體滲透壓。保留適當?shù)乃衷谘獫{里，維持血液循環(huán)，正常人血漿總蛋白量在6.5-7.5克％之間，其中白蛋白占3.9-4.5克％。余為球蛋白。
白蛋白低于3克％時，往往發(fā)生全身水腫，肝硬化和嚴重腎衰患者，由于肝臟合成白蛋白功能障礙或肝臟功能異常，血液膠體滲透壓降低，造成腹水或水腫。如靜脈輸入白蛋白，提高其在血漿里的濃度，就能引起利尿，使水腫消失。
豬血白蛋白的PEG——修飾解除抗原性的基礎(chǔ)豬血白蛋白是豬血清中主要的蛋白質(zhì)，其含量約占血清中蛋白質(zhì)總量的一半左右，分子量67000，等電點為4.7在血液中參與維持滲透壓以及物質(zhì)運輸?shù)裙δ?。其性質(zhì)比較穩(wěn)定，來源十分豐富，在分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。但多是在診斷和檢測方法上的應(yīng)用。將牛血清白蛋白作為一種放大載體，來增強免疫反應(yīng)的靈敏度，常用的修飾劑有用三聚氨氰活化PEG，環(huán)氧溴丙烷活化的瓊脂糖球。環(huán)氧氰丙烷活化羊甲氧基聚乙二醇，研究了環(huán)氧氯丙烷活化左右旋糖苷等，1977年Abraham etyal用聚乙二醇共價修飾牛血清白蛋白時免疫特性的變化，其基本原理是先把PEG的OH與三聚氯氰中氯連接，然后再通過三聚氯氰與蛋白質(zhì)中的氨基相連。修飾后的牛血清白蛋白的性質(zhì)發(fā)生了根本性的變化，如溶解度，丙烯酰胺電脈中的電泳移動性，高于交換層析圖譜和沉降系數(shù)與天然牛血清白蛋白相比，都有明顯的改變。另外，多聚物(聚乙二醇)結(jié)合到具有免疫屏障，導(dǎo)致蛋白無免疫原性。
近年來，人們對聚乙二醇結(jié)合的牛血清白蛋白酯酶活性免疫反應(yīng)性的變化做了進一步探索研究。結(jié)果表明，在被修飾的白蛋白分子中，60個氨基其中15個被活性PEG偶聯(lián)，結(jié)果其免疫反應(yīng)性喪失而成為無免疫原性牛血清白蛋白，并且有63％的酯酶活性被保留。
隨著生物工程的發(fā)展，許多蛋白質(zhì)類藥物的廣泛使用成為可能。牛血清白蛋白有18個決定簇，而每一個瘊定簇又有由一事實上數(shù)量的殘基所組成。一般是一種抗原決定簇具有一種抗原特異性。為此，人們利有化學(xué)物質(zhì)修飾蛋白質(zhì)掩蓋異源蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的抗原部位，避免在體內(nèi)應(yīng)用中的免疫反應(yīng)取得了有益的效果。研究證明聚乙二醇應(yīng)用效果較好，應(yīng)用聚乙二醇修飾的許多酶，蛋白質(zhì)，在體內(nèi)應(yīng)用中抗原性顯著降低，體內(nèi)作用時間明顯延長，藥效也有了很大提高，目前，美國FDA已批準聚乙二醇修飾的腺苷脫氨酶(PEG——ADA)臨術(shù)上治療由于該酶缺陷而造成的嚴重綜合免疫缺陷癥(SCID)，從而確定了化學(xué)修飾在醫(yī)藥研究中的地位，因此用聚乙二醇修飾牛血清白蛋白降低其抗原性，從而代替人血漿白蛋白應(yīng)用于臨床。
人群病毒攜帶率逐年增多，如我國人群中乙肝病毒攜帶率高達12％；丙肝病毒攜帶率更高達15％；此外還有甲肝病毒、艾滋病病毒等等，使獻血員的血液合格率下降，新獻血員的血液合格率僅為50％，而老獻血員血液合格率相當?shù)?，血源困難使代替人血白蛋白的研究勢在必行，引起各國重視。
用基因工程手段來生產(chǎn)人血白蛋白，但純化難度極大。
用動物血白蛋白來代替人血白蛋白，這需要解決的是動物血白蛋白對人體抗原性問題。
用PEG解除異體蛋白抗原性。據(jù)報導(dǎo)美國FDA到目前為止，至少批準了七種PEG修飾蛋白(酶)藥物用于臨床。
A、Abuchowski，A、Matsushima等用PEG修飾牛血白蛋白，其抗原性喪失，由于英國瘋牛病使這項研究擱淺。
以PEG為修飾劑，來修飾豬血白蛋白，當其氨基修飾率達50％時，其免疫原性完全解除，并作了毒理等較系統(tǒng)的研究工作，表明PEG修飾豬血白蛋白成為人血白蛋白代用品。
豬血白蛋白的制備取無菌采取的豬血，先制成血清，再經(jīng)生化分離精制手段，得到電泳純的豬血白蛋白，冷凍干燥備用。具體按國家規(guī)定人血白蛋白低溫乙醇法工藝操作細則要求進行，并同時按人血白蛋白的檢定項目操作細則把好原料質(zhì)量關(guān)。
修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，包括a、無水苯的制備；b、三聚氯氰的重結(jié)晶；c、豬血清白蛋白結(jié)；d、PEG1900活化；e、活化PEG與豬血清白蛋白的偶聯(lián)。
具體的修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，包括a、無水苯的制備取1000ml園底燒瓶，將優(yōu)級純苯700ml置入園底燒瓶中，加入金屬鈉片20片左右，上接一套回流裝置，氣體出口處裝入無水氯化鈣(目的防止水分進入)，下面把園底燒瓶放于電熱套中回流3小時后，取下冷凝管，安置斜形冷凝管，右接溫度計，溫度保持30℃微沸，待冷凝管一端有液體滴出，用棕色玻璃瓶接收，即為無水苯，備用。
b、三聚氯氰的重結(jié)晶取三聚氯氰80g，置于1000ml園底燒瓶中，再加入無水苯500ml，攪拌混合溶解，園底燒瓶放入電熱套中上接一套回流冷凝裝置，加熱回流3小時，取下冷凝管，將液體趁熱過濾，置入500ml帶塞三角燒瓶中，放入40冰箱保存24小時以上，可以看到三聚氯氰的結(jié)晶。
將苯傾出后，取出結(jié)晶三聚氯氰置于園底燒瓶中，以上方法重復(fù)操作，得到重結(jié)晶的三聚氯氰。
c、豬血清白蛋白結(jié)晶(1)2g豬血清白蛋白→溶解于20ml蒸餾水中(最后量體積V1)→加入飽和(NH4)3SO4V3ml(等體積)→室溫放置20分鐘→過濾→濾液V2繼續(xù)滴加(NH4)2SO4不斷攪拌→當沉淀溶解很慢時停止滴加→用0.2NH2SO4調(diào)PH4.6——4.8→放置24——48hr→有結(jié)晶。
(2)重結(jié)晶將沉淀(結(jié)晶)于2000轉(zhuǎn)/分10分鐘。去上清→用少量蒸餾水溶解結(jié)晶沉淀→攪拌下滴加(NH4)2SO4溶液→沉淀溶解很慢時停止滴加→用0.2NH2SO4調(diào)PH4.6-4.8放置24——48hr→結(jié)晶。
將結(jié)晶用少量PBS液PH7.4溶解。裝入透析袋中共4個。用100ml燒杯裝800ml PBS緩沖液，進行透析共24h，間歇換液時間為3.3.6.6.6小時次日取出透析袋，將液體倒入凍干瓶中，凍干備用。
d、PEG1900。5000活化。
取制備重結(jié)晶三聚氯氰(5，7g0.03mol)溶解在400ml含有10g無水碳酸的(在干熱箱中干熱160℃2小時后使用)的無水苯溶液中，加PEG——1900(19g0.01mot在室溫22-24℃)攪拌日上攪拌過液。
取攪拌過液(活化PEG)用三角玻璃漏斗過濾(上加濾紙)置于三角燒瓶中。過濾后澄明溶液400ml放在攪拌日上攪拌約30分鐘后，緩慢加入石油醚600ml出現(xiàn)白色沉淀繼續(xù)攪拌20分鐘后用G4錘熔玻璃漏斗過濾。濾器上有白色粘筒沉淀濾液澄清透明，再將白色沉淀移入三角燒瓶中加無水苯400ml溶解，此過程重復(fù)操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度計監(jiān)測，直到檢測不到游離的三聚氯氰吸收峰為止，得到活化PEG——1900置于干燥器中抽真空，苯揮散盡，備用。PEG——5000采用上述相同的方法制備反應(yīng)式為 e、活化PEG與豬血清白蛋白的偶聯(lián)取四次重結(jié)晶豬血白蛋白(400mg.6.04.umol)溶解在40ml0.1MPH9.2四硼酸鈉溶液中，將此液放在4℃冰箱中保存2小時后，取出，加入活化PEG-1000(3.55gl.74mol此量是氨基集團的5倍)，在置于4℃冰箱中在攪拌器上攪拌21小時后，取下攪拌液裝入透析袋中，用0.01MPH7.4PBS緩沖液透析，透析時間早10.30至次10.30，24小時，每間歇3，3，6，6，.小時更換透析液，次日早9.30分，取出透析袋，將袋液體置入凍干瓶中凍干10小時后，呈白色粉末狀，收集瓶中備用。
反應(yīng)式為
PEG——修飾豬血白蛋白的條件及影響程度PEG——1900和PEG500兩種PEG均在25℃18小時修飾率為最高，均可達到90％左右。而在37℃時次之。50％左右4℃時效果最差，可達30-40％。表明溫度對PEG修飾豬血白蛋白反應(yīng)有比較明顯的影響。(見表1)甲氧基聚乙二醇與白蛋白的共價偶聯(lián)，用三聚氯氰作為偶聯(lián)劑，反應(yīng)式如下 在此反應(yīng)中，三聚氯氰分子中的氯原子是活性原子，可被親核試劑取代。一個或二個氯原子可被提供電子基因取代。形成穩(wěn)定的C-C1鍵]John Son等人報道三聚氯氰與氨基亞胺及氫氧基反應(yīng)應(yīng)形成穩(wěn)定鍵。在接近40時，第一個氯原子迅速發(fā)生反應(yīng)，第二個氨原子在25℃反應(yīng)，第三個在80℃發(fā)生反應(yīng)。這與實驗結(jié)果相符。在4℃時，修飾率30-40℃，而到25℃時修修飾達到80-90％，修飾率可提高1倍多。但37℃時，修飾率卻低于25℃修飾率，這可能是有兩種原因(1)溫度一下提到37℃，不利于延緩一個氯原子的反應(yīng)，而又遠末達到第三個氯原子參加反應(yīng)的最佳30℃所以僅僅是第二個氯原子活性加強，而總體修飾率下降，37℃是豬血白蛋白最接近天然構(gòu)象的溫度在這種構(gòu)象情況下，由于游離氨基的位置與此溫度下的活化PEG中氯原子的位置不易形成C-C1鍵，而使修飾率降低。
PEG——修飾豬血白蛋白抗原性、安全性、有效化實驗及檢定結(jié)果。
PEG——修飾豬血白蛋白分子量5000，其氨基修飾率為50％。
1、PEG——白蛋白抗原性。
(1)免疫擴散瓊脂板法合格。
(2)過敏試驗實驗動物為豚鼠，隔周注射抗原，連續(xù)四次，為合格。(見表2)結(jié)果表明，豬血白蛋白有明顯過敏反應(yīng)，甚至引起動物死亡，而PEG—白蛋白組沒有任何過敏反應(yīng)。
(3)放射性標記PEG——白蛋白在家兔體上的清除試驗(見表3)結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有白蛋白免疫動物對白蛋白迅速清除，其余各組的清除速率(未免疫動物對白蛋白、PEG——白蛋白，白蛋白免疫動物及PEG——白蛋白免疫動物對PEG——白蛋白，PEG——白蛋白免疫動物對白蛋白)基本相似，均未見迅速被清除現(xiàn)象，這說明，白蛋白注射到家兔后產(chǎn)生白蛋白抗體，當再注入白蛋白時白蛋白抗體迅速與其發(fā)生免疫反應(yīng)而被清除，而PEG——白蛋白免疫家兔即不產(chǎn)生白蛋白抗體，也不產(chǎn)生PEG——白蛋白抗體，因此當再注入白蛋白或PEG——白蛋白時不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也觀察不到被迅速清除現(xiàn)象，也說明PEG——白蛋白與白蛋白抗體之間也不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
以上實驗說明PEG——白蛋白完全被解除了抗原性。
2、毒性實驗按中國藥典方法，做了PEG——白蛋白的急性毒性試驗及慢性毒性試驗。慢性毒性實驗觀察了動物體重、白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、尿毒氮、轉(zhuǎn)氨酶、臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦)重量，檢查動物各臟器病理變化，均未見異常，說明PEG——白蛋白對動物無毒性作用。
3、安全試驗按藥典要求，以豚鼠為對象，作了PEG——白蛋白安全實驗。結(jié)果表明PEG——白蛋白符合生物制品規(guī)程中安全試驗要求。
4、動物體內(nèi)清除率及其分布放射性同位素示蹤實驗表明PEG——白蛋白在動物體內(nèi)清除率與天然白蛋白基本相似，均無明顯積疊作用；31天后在各臟器殘留百分率為肝臟3.8％，甲狀腺0.95％、腎臟0.055％，脾臟及胸腺也有少量殘留，而在腦及卵巢基本陰性。
5、滲透壓試驗以豬血白蛋白為對照，作了PEG——白蛋白滲透壓試驗，結(jié)果表明PEG——白蛋白為等摩爾濃度的豬血白蛋白是等滲的，說明PEG——白蛋白具有維持正常機體滲透壓作用。
6、PEG——豬血白蛋白PH值、水份、類毒素、熱原檢查、無菌試驗均合格。
7、其它
PEG——白蛋白分子中蛋白含量測定、游離氨基測定、純度、PEG——白蛋白的水份測定。符合白蛋白指標的要求。
豬血白蛋白的化學(xué)修飾將具有較好的應(yīng)用價值，它有三點優(yōu)勢，第一、原料來源豐富，國內(nèi)大多數(shù)屠宰加工廠都將豬血作為廢棄物扔掉，所以，用豬血生產(chǎn)白蛋白有豐富的原料來源。同時又可減少廢棄權(quán)物的污染；第二，成本低，由于原料價格低，用于修飾豬血白蛋白的化學(xué)試劑PEC價格及三聚氯氰價格也不高，所以，修飾后的豬血白蛋白的成本要明顯低于人血白蛋白成本。成品價格預(yù)計可比人血白蛋白成品價格低2-3倍；第三，安全性高，以豬血為原料，可以完全排除甲肝、乙肝、丙肝、瘋牛病、艾滋病等病毒的污染，不會傳播由這些病毒引起的傳染病。除此而外，修飾后的豬血白蛋白還可作為多種生物活性大分子制劑的保護劑。有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟效益。
具體實施例方式
實施例11、健康檢疫新供采血豬必須健康檢查同時采血作相關(guān)人畜共患病檢疫，陰性者采血對象。
2、采血豬的選擇較以黑色豬為宜。采血瓶為180℃干熱，每個采血(3立升)瓶加入4％拘櫞納與2％氯化鈉300毫升。用玻璃紙包扎的棉塞。經(jīng)酸堿處理及純水沖洗后玻璃管與膠管，干燥后包扎、消毒、備用。
將豬固定后，洗凈頸部剪毛消毒，酒精擦試后，取頸動脈切口，插入采血管邊搖邊接血，達6立升為止。拔掉膠管，將瓶嚴密包扎，靜適于溫水中，漿折出。之后將采血瓶放于冷庫中靜置使血漿分層。在放入冷庫時用來蘇爾或石炭酸紗布擦洗一下。
將采血瓶分離出的豬血血漿嚴格按人用白蛋白低溫醇法工藝細則制出合格的凍干豬血白蛋白，質(zhì)量標準余過敏原外完全符合人用注射白蛋白質(zhì)量標準，具體蛋白含量達96％以上，純度電脈一條。無菌安全、熱原、內(nèi)毒素含量、水分、PH等都要符合要求。
實施例2a、PEG——1900和PEG——5000的活化，取二次重結(jié)晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g無水碳酸鈉的無水苯中，加19g(0.01mol)PEG——1900或50g(0.01mol)PEG——5000在室溫(22——24℃)攪拌過夜后過濾，取澄清濾液400ml放在攪拌器上攪拌20min，緩慢加入石油醚600ml，出現(xiàn)白色沉淀后繼續(xù)攪拌20min，用G4錘熔玻璃漏斗過濾，再將沉淀移入三角燒瓶中，加無水苯400ml溶解，此過程重復(fù)操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度計監(jiān)測，直到檢測不到游離的三聚氯氰吸收峰為止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥備用。
b、活化PEG與豬血白蛋白的偶聯(lián)取4次重結(jié)晶的豬血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸鈉溶液中，將此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG——19003.55g(1.87mmol)或活化PEG-50009.35g(1.87mmol)，于25℃水浴中攪拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS緩沖液透析。透析后置于凍干瓶中凍干10h，得呈白色粉末狀的PEG——1900——BSA和PEG——5000——BSA。
實施例3用實施1和2的方法制備PEG——修飾合格三批中試樣品，各3000克PEG——修飾的豬血白蛋白按新生物制品藥新申報資料要求作各項實驗和相關(guān)檢定。
表1豬血白蛋白不同PEG及不同條件下修飾結(jié)果

表2PEG——白蛋白過敏試驗結(jié)果

說明1，2，3號注射PEG—白蛋白4，5，6號注射白蛋白表3 PEG——I125——白蛋白在家兔體內(nèi)清除試驗
說明1、未免疫動物；2、白蛋白免疫動物；3、PEG—白蛋白免疫動物。
權(quán)利要求
1.修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，包括a、無水苯的制備；b、三聚氯氰的重結(jié)晶；c、豬血清白蛋白結(jié)；d、PEG活化；e、活化PEG與豬血清白蛋白的偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，包括a、無水苯的制備取1000ml園底燒瓶，將優(yōu)級純苯700ml置入園底燒瓶中，加入金屬鈉片20片左右，上接一套回流裝置，氣體出口處裝入無水氯化鈣(目的防止水分進入)，下面把園底燒瓶放于電熱套中回流3小時后，取下冷凝管，安置斜形冷凝管，右接溫度計，溫度保持30℃微沸，待冷凝管一端有液體滴出，用棕色玻璃瓶接收，即為無水苯，備用；b、三聚氯氰的重結(jié)晶取三聚氯氰80g，置于1000ml園底燒瓶中，再加入無水苯500ml，攪拌混合溶解，園底燒瓶放入電熱套中上接一套回流冷凝裝置，加熱回流3小時，取下冷凝管，將液體趁熱過濾，置入500ml帶塞三角燒瓶中，放入40冰箱保存24小時以上，可以看到三聚氯氰的結(jié)晶；將苯傾出后，取出結(jié)晶三聚氯氰置于園底燒瓶中，以上方法重復(fù)操作，得到重結(jié)晶的三聚氯氰；c、豬血清白蛋白結(jié)晶(1)2g豬血清白蛋白→溶解于20ml蒸餾水中(最后量體積V1)→加入飽和(NH4)3SO1V3ml(等體積)→室溫放置20分鐘→過濾→濾液V2繼續(xù)滴加(NH1)2SO4不斷攪拌→當沉淀溶解很慢時停止滴加→用0.2NH2SO4調(diào)PH4.6——4.8→放置24——48hr→有結(jié)晶；(2)重結(jié)晶將沉淀(結(jié)晶)于2000轉(zhuǎn)/分10分鐘，去上清→用少量蒸餾水溶解結(jié)晶沉淀→攪拌下滴加(NH4)2SO4溶液→沉淀溶解很慢時停止滴加→用0.2NH2SO4調(diào)PH4.6-4.8放置24——48hr→結(jié)晶；將結(jié)晶用少量PBS液PH7.4溶解，裝入透析袋中共4個；用100ml燒杯裝800ml PBS緩沖液，進行透析共24h，間歇換液時間為3.3.6.6.6小時次日取出透析袋，將液體倒入凍干瓶中，凍干備用；d、PEG1900活化取制備重結(jié)晶三聚氯氰(5,7g 0.03mol)溶解在400ml含有10g無水碳酸的(在干熱箱中干熱160℃2小時后使用)的無水苯溶液中，加PEG——1900(19g0.01mot在室溫22-24℃)攪拌日上攪拌過液；取攪拌過液(活化PEG)用三角玻璃漏斗過濾(上加濾紙)置于三角燒瓶中，過濾后澄明溶液400ml放在攪拌日上攪拌約30分鐘后，緩慢加入石油醚600ml出現(xiàn)白色沉淀繼續(xù)攪拌20分鐘后用G4錘熔玻璃漏斗過濾，濾器上有白色粘筒沉淀濾液澄清透明，再將白色沉淀移入三角燒瓶中加無水苯400ml溶解，此過程重復(fù)操作多次，每次操作用紫外(UV—2201型)分光光度計監(jiān)測，直到檢測不到游離的三聚氯氰吸收峰為止，得到活化PEG——1900置于干燥器中抽真空，苯揮散盡，備用；e、活化PEG與豬血清白蛋白的偶聯(lián)取四次重結(jié)晶豬血白蛋白(400mg.6.04.umol)溶解在40ml0.1MPH9.2四硼酸鈉溶液中，將此液放在4℃冰箱中保存2小時后，取出，加入活化PEG-1000，在置于4℃冰箱中在攪拌器上攪拌21小時后，取下攪拌液裝入透析袋中，用0.01MPH7.4PBS緩沖液透析，透析時間早10.30至次10.30，24小時，每間歇3，3，6，6，.小時更換透析液，次日早9.30分，取出透析袋，將袋液體置入凍干瓶中凍干10小時后，呈白色粉末狀，收集瓶中備用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，a、PEG——1900的活化，取二次重結(jié)晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g無水碳酸鈉的無水苯中，加19g(0.01mol)PEG——1900在室溫(22——24℃)攪拌過夜后過濾，取澄清濾液400ml放在攪拌器上攪拌20min，緩慢加入石油醚600ml，出現(xiàn)白色沉淀后繼續(xù)攪拌20min，用G4錘熔玻璃漏斗過濾，再將沉淀移入三角燒瓶中，加無水苯400ml溶解，此過程重復(fù)操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度計監(jiān)測，直到檢測不到游離的三聚氯氰吸收峰為止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥備用；b、活化PEG與豬血白蛋白的偶聯(lián)取4次重結(jié)晶的豬血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸鈉溶液中，將此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG——19003.55g(1.87mmol)，于25℃水浴中攪拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS緩沖液透析；透析后置于凍干瓶中凍干10h，得呈白色粉末狀的PEG——1900——BSA。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，PEG的活化，可為PEG——5000的活化。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，a、PEG——5000的活化，取二次重結(jié)晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g無水碳酸鈉的無水苯中，加50g(0.01mol)PEG——5000在室溫(22——24℃)攪拌過夜后過濾，取澄清濾液400ml放在攪拌器上攪拌20min，緩慢加入石油醚600ml，出現(xiàn)白色沉淀后繼續(xù)攪拌20min，用G4錘熔玻璃漏斗過濾，再將沉淀移入三角燒瓶中，加無水苯400ml溶解，此過程重復(fù)操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度計監(jiān)測，直到檢測不到游離的三聚氯氰吸收峰為止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥備用；b、活化PEG與豬血白蛋白的偶聯(lián)取4次重結(jié)晶的豬血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸鈉溶液中，將此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG-50009.35g(1.87mmol)，于25℃水浴中攪拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS緩沖液透析；透析后置于凍干瓶中凍干10h，得呈白色粉末狀的PEG——500——BSA。
全文摘要
修飾豬血白蛋白代替人血白蛋白的制備方法，包括a.無水苯的制備；b.三聚氯氰的重結(jié)晶；c.豬血清白蛋白結(jié)；d.PEG1900活化；e.活化PEG與豬血清白蛋白的偶聯(lián)。以PEG為修飾劑，來修飾豬血白蛋白，當其氨基修飾率達50％時，其免疫原性完全解除，并作了毒理等較系統(tǒng)的研究工作，表明PEG修飾豬血白蛋白成為人血白蛋白代用品。
文檔編號C07K14/435GK1504484SQ02144679
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者王樹岐, 茍仕金, 茍鴻鷹 申請人:沈陽南科專利技術(shù)開發(fā)公司