專利名稱：一種純化血紅蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，尤其涉及一種采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)從動物的血紅細(xì)胞裂解液中直接純化血紅蛋白的方法。
背景技術(shù)：
人血液代用品是國際科學(xué)界及企業(yè)界關(guān)注的研究熱點和難點，世界各主要發(fā)達(dá)國家都將其列入跨世紀(jì)的重大項目。尤其近二十年，對天然血液供應(yīng)安全性的焦慮以及預(yù)期的高回報潛力激起了人們對開發(fā)血液代用品的極大興趣。目前所研究的人血液代用品可大致分為三大類全氟碳化合物，基于血紅蛋白的血液代用品和通過血型轉(zhuǎn)換而成的紅細(xì)胞。其中由于全氟碳化合物不具備天然血紅蛋白的生物學(xué)載氧特性，其研究與開發(fā)已不再是重點；通過血型轉(zhuǎn)換成的紅細(xì)胞具有貯存期短、不易運輸?shù)热秉c，其研究與應(yīng)用也受到極大的限制；基于血紅蛋白的血液代用品由于具有天然血紅蛋白的載氧、運輸CO2和調(diào)節(jié)血液pH的功能，倍受研究人員關(guān)注，成為血液代用品研究的重點。
血紅蛋白(Hb)存在于血紅細(xì)胞中，血紅細(xì)胞破裂可得到血紅蛋白溶液。血液代用品的臨床用量較大，其溶液中所殘留的微量雜蛋白可能在患者體內(nèi)形成抗體，并引發(fā)免疫反應(yīng)。因此要盡量清除各種雜蛋白及其他雜質(zhì)，產(chǎn)品純度要求達(dá)到幾乎100％。所以，高效分離純化工藝是基于血紅蛋白的血液代用品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)之一。
文獻(xiàn)中已有的血紅蛋白分離方法包括離心、透析、吸附等方法，都涉及兩個以上步驟，其中至少有一步固液分離，即分離紅細(xì)胞碎片和血紅蛋白。1993年Shorr發(fā)展的膜過濾一層析法是迄今報道的制備血紅蛋白的較好方法(Shorr，R.G.Process for hemoglobin extractionand purification.US Patent 5,264,555.1993.)。但該法具有膜污染和濃度極化問題，且膜分離過程耗時較長，從而增加了成本和污染的機(jī)會。目前，血紅蛋白的分離純化技術(shù)大都只適合實驗室或小規(guī)模制備，因此有必要開發(fā)新的高效大規(guī)模制備血紅蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡捷、高效的從人或動物新鮮血紅細(xì)胞中大規(guī)模分離純化血紅蛋白的方法。
本發(fā)明提供的利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)(也稱膨脹床吸附技術(shù))從動物的血紅細(xì)胞裂解液中直接純化血紅蛋白的方法包括如下步驟(如圖1所示)1)床層平衡用pH值為5.0～8.0的平衡液緩沖液以2～5cm/min-1的線流速自下而上平衡擴(kuò)張床吸附介質(zhì)，直至擴(kuò)張床層穩(wěn)定；2)進(jìn)料吸附將紅細(xì)胞裂解液pH值調(diào)成5.0～8.0，以2～5cm/min-1的線流速自下而上進(jìn)料，進(jìn)料過程中注意保持適當(dāng)高度和空隙率；3)淋洗進(jìn)料完畢后，保持床層擴(kuò)張狀態(tài)，用pH值為5.0～8.0的平衡液緩沖液以2～5cm·min-1的線流速自下而上洗去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)和其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的物質(zhì)；4)改變pH值洗脫將床層改為固定床操作，用pH值為6.0-8.0的平衡緩沖液以2～5cm·min-1的線流速自上而下流過床層，收集樣品。
整個純化過程控制在2～20℃。
所述的擴(kuò)張床吸附介質(zhì)為粒徑分布在50～300μm之間的陽離子交換介質(zhì)或金屬親和層析介質(zhì)。優(yōu)選離子交換介質(zhì)為Sepharose BigBeads(Amersham Bioscience Biotech)、Spherosil(Biosepra.Inc)、Streamline SP(Amersham Bioscience Biotech)。金屬親和層析介質(zhì)優(yōu)選為固定了二價金屬的親和層析介質(zhì)；進(jìn)一步優(yōu)選固定了Cu2+、Zn2+、或Ni2+等金屬離子的親和層析介質(zhì)。金屬親和層析介質(zhì)優(yōu)選STREAMLINE介質(zhì)(Pharmcia公司)。
優(yōu)選在步驟4)之后還可進(jìn)一步包括步驟5)高鹽洗脫和步驟6)介質(zhì)再生5)高鹽洗脫用含有0.5～1.5mol/L-1鈉鹽的平衡緩沖液自上而下繼續(xù)洗脫與介質(zhì)結(jié)合較牢的物質(zhì)；6)介質(zhì)再生用5～10倍擴(kuò)張床體積的0.01～0.5mol/L-1堿溶液，優(yōu)選為NaOH溶液沖洗介質(zhì)。
優(yōu)選平衡緩沖液可以是PBS(K2HPO4/NaH2PO4)，巴比妥鈉-鹽酸，乙酸-乙酸鈉緩沖液等；優(yōu)選平衡緩沖液的鹽濃度為10～80mmol/L-1。
優(yōu)選步驟5)中的鈉鹽為NaCl或Na2SO4。
所述的血紅細(xì)胞裂解液來源于人或牛、豬、羊等動物的新鮮血液，得到的血紅細(xì)胞裂解液直接用于純化血紅蛋白。
本發(fā)明提供的直接從紅細(xì)胞提取純化血紅蛋白的新方法，其特征在于裂解紅細(xì)胞后，不經(jīng)過離心、過濾或其它膜分離過程除細(xì)胞碎片，而直接采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)，以自下而上的進(jìn)料方式使層析介質(zhì)膨脹擴(kuò)張，這不同于現(xiàn)有的吸附技術(shù)純化血紅蛋白?，F(xiàn)有的吸附采用自上而下的進(jìn)料方式，固體吸附介質(zhì)壓積在一起，不能直接用于吸附帶固體的料液。本發(fā)明采用自下而上的進(jìn)料方式，使吸附介質(zhì)處于懸浮狀態(tài)，顆粒之間存在較大空隙，使得料液中的固體能夠通過。因此利用本發(fā)明，能夠?qū)⒑屑?xì)胞碎片、雜蛋白、血紅蛋白的紅細(xì)胞裂解液直接引入吸附柱，細(xì)胞碎片、雜蛋白直接通過，血紅蛋白被介質(zhì)吸附，實現(xiàn)從人或牛、豬、羊等動物的血紅細(xì)胞裂解液中直接純化血紅蛋白。
實驗證明，該技術(shù)省去離心去除碎片步驟，有效地控制了純化過程中無載氧能力的高鐵血紅蛋白的生成，僅需一步操作，產(chǎn)品純度達(dá)電泳純，高鐵血紅蛋白含量不高于5.4％，與現(xiàn)有的較理想的膜過濾一層析純化方法相比，擴(kuò)張床吸附法操作時間短，提取收率高，產(chǎn)品活性損失小，是一種簡捷、高效、適合工業(yè)化生產(chǎn)的天然血紅蛋白制備方法。Shorr等人的膜過濾-層析法和本發(fā)明擴(kuò)張床純化血紅蛋白的比較見表1。
表1



圖1為擴(kuò)張床吸附純化血紅蛋白流程2為Streamline SP擴(kuò)張床純化牛血紅蛋白的洗脫圖譜圖3為純化后血紅蛋白的高效凝膠過濾色譜4為不同方法制備的血紅蛋白的SDS-PAGE圖譜其中的1表示電泳的樣品是經(jīng)擴(kuò)張床純化后的血紅蛋白2，3表示電泳的樣品是采用Shorr方法純化得到的血紅蛋白4表示電泳的樣品為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白圖5 Streamline SP介質(zhì)在擴(kuò)張床中動態(tài)吸附容量測定層析圖譜具體實施方式
實施例1(1)樣品處理0.9％NaCl洗凈的堆積牛紅細(xì)胞1ml，按紅細(xì)胞∶蒸餾水＝1∶29(體積比)的比例混合，置冰箱中在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌30min，此時紅細(xì)胞迅速溶脹以至破裂，胞內(nèi)血紅蛋白釋放到溶液中，得到紅細(xì)胞裂解液，溶液經(jīng)Benesch等(Benesch，R.E.，Benesch.R.and Yung，Suzanna..Equationsfor the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixture，Analytical Biochemistry.1973，55245-248)建立的多波長法檢測，Hb濃度為8.0mg/ml-1。
(2)床層平衡用250ml平衡緩沖液40mmol/L-1PBS(K2HPO4/NaH2PO4，pH6.0)自下而上平衡擴(kuò)張床介質(zhì)，選用的擴(kuò)張床介質(zhì)為Streamline SP(Amersham Bioscience Biotech公司)，進(jìn)料流速為3.5cm/min-1，使其形成穩(wěn)定的擴(kuò)張床。
(3)進(jìn)料吸附取8.0mg/ml-1步驟(1)得到的紅細(xì)胞裂解液5ml，調(diào)pH為6.0，以3.5cm/min-1的流速自下而上進(jìn)料，血紅蛋白吸附到擴(kuò)張床介質(zhì)上。
(4)淋洗用同樣的PBS緩沖液淋洗，以3.5cm/min-1的流速自下而上淋洗，除去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片及其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的雜質(zhì)，監(jiān)測流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至該波長無紫外吸收且不再變化。
(5)改變pH值洗脫調(diào)節(jié)PBS平衡緩沖液pH值為7.0，以3.5cm/min-1
的流速自上而下進(jìn)行洗脫，收集血紅蛋白峰即為最終純品(圖2)；35min后血紅蛋白峰回落，基線走平。
整個操作過程溫度為20℃。
經(jīng)Streamline SP擴(kuò)張床純化的洗脫圖譜見圖2。對樣品的監(jiān)測是采用280nm，此時血紅蛋白和脂類均有很強的吸收，收集峰后從其吸收光譜和電泳后的結(jié)果可知A峰為血紅蛋白；經(jīng)吸收光譜和考馬斯亮藍(lán)法檢測可知B為非蛋白組分，初步判斷為脂類(細(xì)胞破裂過程中，大量的脂類會從細(xì)胞膜上游離出來)，C為含量很低的雜蛋白峰。
純化后的A峰血紅蛋白用高效凝膠過濾色譜柱AlltechMacrosphrer GPC300檢測，凝膠介質(zhì)顆粒尺寸為7μm，柱尺寸為250×4.5mm；流動相為19mmol/L-1Tris-HCl(含75mmol/L-1NaCl，pH8.0)；進(jìn)樣量50μl，流速0.2ml/min-1，檢測波長416nm，從檢測結(jié)果圖3可知血紅蛋白為單峰。
從圖4可知，血紅蛋白峰(A)經(jīng)SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測只有一條在16KD的帶，即產(chǎn)品達(dá)到電泳純。圖4中的第2，3條電泳帶是采用Shorr方法純化得到的血紅蛋白，電泳結(jié)果均有雜蛋白?？梢姳景l(fā)明的純化效果好于Shorr所報道的方法。根據(jù)Benesch建立的血紅蛋白測定方法，計算出上樣前的血紅蛋白總量，用完全收集洗脫下來的血紅蛋白樣品，測定出血紅蛋白含量，再除以上樣前的血紅蛋白量即得回收率，經(jīng)計算得血紅蛋白的回收率為94％。經(jīng)Benesch的多波長法對無載氧活性的高鐵血紅蛋白的濃度進(jìn)行測定，最終產(chǎn)品高鐵血紅蛋白含量僅為5.4％。
實施例2(1)樣品處理經(jīng)0.9％NaCl洗凈的堆積人紅細(xì)胞1ml，按紅細(xì)胞∶蒸餾水＝1∶29(體積比)的比例混合，置冰箱中在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌30min，此時紅細(xì)胞迅速溶脹以至破裂，胞內(nèi)血紅蛋白釋放到溶液中。
(2)床層平衡用3倍柱體積的平衡緩沖液(10mmol/L-1巴比妥鈉-鹽酸，pH6.9)自下而上平衡擴(kuò)張床介質(zhì)，選用的擴(kuò)張床介質(zhì)為Spherosil，進(jìn)料線流速2cm/min-1，使其形成穩(wěn)定的擴(kuò)張床。
(3)進(jìn)料吸附取8.0mg/ml-1步驟(1)得到的紅細(xì)胞裂解液10ml，
調(diào)pH為5.0，以相同的流速2cm/min-1自下而上進(jìn)料吸附到擴(kuò)張床。
(4)淋洗然后用同樣的緩沖液淋洗，以流速2cm/min-1，除去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片及其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的雜質(zhì)，監(jiān)測流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至該波長無紫外吸收且不再變化。
(5)改變pH值洗脫調(diào)節(jié)緩沖液pH值為8.0，在2℃下以流速2cm/min-1，自上而下進(jìn)行洗脫，收集血紅蛋白峰即為最終純品，直至血紅蛋白峰回落，基線走平。
(6)高鹽洗脫用含有1.0 mol/L-1NaCl的平衡緩沖液pH6.9洗脫與介質(zhì)結(jié)合較牢固的雜質(zhì)。
(7)介質(zhì)再生步驟(5)之后還可進(jìn)一步包括步驟(6)介質(zhì)再生用5～10倍擴(kuò)張床體積的0.1～1mol/L-1堿溶液，優(yōu)選為NaOH溶液沖洗介質(zhì)。
整個操作過程溫度為2℃。
純化后的血紅蛋白產(chǎn)品達(dá)到電泳純，回收率為88％，高鐵血紅蛋白含量僅為4.5％。
實施例3(1)樣品處理經(jīng)0.9％NaCl洗凈的堆積豬紅細(xì)胞1ml，按紅細(xì)胞∶蒸餾水＝1∶29(體積比)的比例混合，置冰箱中在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌30min，此時紅細(xì)胞迅速溶脹以至破裂，胞內(nèi)血紅蛋白釋放到溶液中。
(2)床層平衡用3倍柱體積的平衡緩沖液(80mmol/L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.0)自下而上平衡擴(kuò)張床介質(zhì)，選用的擴(kuò)張床介質(zhì)為Streamline SP，進(jìn)料流速5cm/min-1，使其形成穩(wěn)定的擴(kuò)張床。
(3)進(jìn)料吸附取8.0mg/ml-1步驟(1)得到的紅細(xì)胞裂解液5ml，調(diào)pH為8.0，以相同的流速自下而上進(jìn)料。
(4)淋洗然后用同樣的平衡緩沖液淋洗，除去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片及其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的雜質(zhì)，監(jiān)測流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至該波長無紫外吸收且不再變化。
(5)改變pH值洗脫調(diào)節(jié)平衡緩沖液pH值為7.2，以流速5cm/min-1自上而下進(jìn)行洗脫，收集血紅蛋白峰即為最終純品，直至血紅蛋白峰回落，基線走平。
(6)高鹽洗脫改換含有1.5mol/L-1NaCl的平衡洗脫液pH5.0，洗脫與介質(zhì)結(jié)合較牢固的雜質(zhì)。
整個操作過程溫度為10℃。
純化后的血紅蛋白達(dá)到電泳純，回收率達(dá)94％，高鐵血紅蛋白含量僅為4.9％。
實施例4(1)樣品處理經(jīng)0.9％NaCl洗凈的堆積羊紅細(xì)胞1ml，按紅細(xì)胞∶蒸餾水＝1∶29(體積比)的比例混合，置冰箱中在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌30min，此時紅細(xì)胞迅速溶脹以至破裂，胞內(nèi)血紅蛋白釋放到溶液中。
(2)床層平衡用3倍柱體積的平衡緩沖液(100mmol/L-1磷酸鈉緩沖液，pH8.0)自下而上平衡擴(kuò)張床介質(zhì)，選用的擴(kuò)張床介質(zhì)為固定有Zn2+的STREAMLINE，進(jìn)料流速5cm/min-1，使其形成穩(wěn)定的擴(kuò)張床。
(3)進(jìn)料吸附取8.0mg/ml-1步驟(1)得到的紅細(xì)胞裂解液5ml，調(diào)pH為7.0，以相同的流速自下而上進(jìn)料。
(4)淋洗然后用同樣的緩沖液淋洗，除去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片及其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的雜質(zhì)，監(jiān)測流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至該波長無紫外吸收且不再變化。
(5)改變pH值洗脫調(diào)節(jié)緩沖液pH值為6.0，以流速5cm/min-1自上而下進(jìn)行洗脫，收集血紅蛋白峰即為最終純品，直至血紅蛋白峰回落，基線走平。
(6)高鹽洗脫改換洗脫液為含有1.0mol/L-1NaCl的平衡緩沖液pH8.0，洗脫與介質(zhì)結(jié)合較牢固的雜質(zhì)。
(7)層析柱的再生洗脫完畢后，用30mmol/L-1EDTA洗下金屬離子，用0.5mol/L-1NaOH洗脫，待記錄走到基線時，用1倍體積0.5mol/L-1HCl清洗，用去離子水洗至流出液pH5.5左右時，用2倍床層體積0.2mol/L-1ZnSO4自上而下過柱，便可再生STREAMLINE介質(zhì)。
整個操作過程溫度為15℃。
純化后的血紅蛋白達(dá)到電泳純，回收率達(dá)95％，高鐵血紅蛋白含量僅為3.6％。
實施例5介質(zhì)在擴(kuò)張床操作條件下從牛紅血細(xì)胞裂解液中吸附血紅蛋白的動態(tài)吸附容量的測定如圖5所示，其中A為透過峰，B為洗脫峰。床層平衡、進(jìn)料、淋洗條件與實施例1相同，但是進(jìn)料采用的樣品是純度為99.9％的天然血紅蛋白溶液(Sigma公司)，濃度為8.0mg/ml-1，pH6.0，進(jìn)料流速3.5cm/min-1；40分鐘后采用高鹽液洗脫20mmol/L-1PBS加1.0mol/L-1NaCl，pH6.0。收集整個洗脫峰，經(jīng)計算得在擴(kuò)張床吸附中介質(zhì)的動態(tài)吸附容量為70～75mg血紅蛋白/ml濕吸附介質(zhì)，說明本發(fā)明方法已達(dá)到制備級層析的要求，可用于工業(yè)上高效大規(guī)模制備血紅蛋白。
權(quán)利要求
1.一種純化血紅蛋白的方法，包括如下步驟(1)床層平衡用pH值為5.0～8.0的平衡液緩沖液以2～5cm/min-1的線流速自下而上平衡擴(kuò)張床吸附介質(zhì)，直至擴(kuò)張床層穩(wěn)定后；其中擴(kuò)張床吸附介質(zhì)為粒徑分布在50～300μm之間的陽離子交換介質(zhì)或金屬親和層析介質(zhì)；(2)進(jìn)料吸附將紅細(xì)胞裂解液pH值調(diào)成5.0～8.0，以2～5cm/min-1的線流速自下而上進(jìn)料，進(jìn)料過程中注意保持適當(dāng)高度和空隙率；(3)淋洗進(jìn)料完畢后，保持床層擴(kuò)張狀態(tài)，用pH值為5.0～8.0的平衡液緩沖液以2～5cm/min-1的線流速自下而上洗去滯留在床層中未結(jié)合的蛋白、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)和其它與介質(zhì)結(jié)合不牢的物質(zhì)；(4)改變pH值洗脫將床層改為固定床操作，在2～20℃溫度情況下，用pH值為6.0-8.0的平衡緩沖液以2～5cm/min-1的線流速自上而下流過床層，收集樣品，整個純化過程控制在2-20℃。
2.如權(quán)利要求1所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于步驟4)之后包括5)高鹽洗脫用含有0.5～1.5mol/L-1鈉鹽的平衡緩沖液自上而下繼續(xù)洗脫與介質(zhì)結(jié)合較牢的物質(zhì)；6)介質(zhì)再生用5～10倍擴(kuò)張床體積的0.01～0.5mol/L-1堿溶液，優(yōu)選為NaOH溶液沖洗介質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于所述的平衡緩沖液可以是PBS，巴比妥鈉-鹽酸或乙酸-乙酸鈉緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于所述的平衡緩沖液鹽濃度為10～80mmol/L-1。
5.如權(quán)利要求1所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于所述的金屬親和層析介質(zhì)優(yōu)選為固定了二價金屬的親和層析介質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于所述的二價金屬為Cu2+、Zn2+、或Ni2+。
7.如權(quán)利要求1所述的純化血紅蛋白的方法，其特征在于血紅細(xì)胞裂解液來源于人或牛、豬、羊的血液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種純化血紅蛋白的方法。本方法采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)，以自下而上的進(jìn)料方式使層析介質(zhì)膨脹擴(kuò)張，細(xì)胞碎片、雜蛋白等雜質(zhì)直接通過床層，血紅蛋白被介質(zhì)吸附，實現(xiàn)從人或牛、豬、羊等動物的血紅細(xì)胞裂解液中直接純化血紅蛋白。該技術(shù)省去離心或過濾去除碎片步驟，僅一步操作產(chǎn)品即達(dá)電泳純，操作時間短，提取收率高，產(chǎn)品活性損失小，是一種簡捷、高效、適合工業(yè)化生產(chǎn)的天然血紅蛋白制備方法。
文檔編號C07K14/805GK1491964SQ0214591
公開日2004年4月28日 申請日期2002年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月23日
發(fā)明者蘇志國, 路秀玲, 金業(yè)濤, 趙東旭 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所