專利名稱：一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，特別是用有機(jī)溶劑沉析的方法，屬于微生物發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，Transglutaminase EC 2.3.2.13，TG)，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶。它可以催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺酰胺基的水解，從而進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，生產(chǎn)出滿足人們需求的新型蛋白食品，在食品加工中具有極其重要的作用。此外，該酶還可用于毛織物加工，用于酶的固定化或?qū)⒉煌肿又g進(jìn)行聯(lián)接，將抗體與藥劑進(jìn)行聯(lián)接等，所以谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在紡織工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)也有很好的應(yīng)用前景。被譽(yù)為“21世紀(jì)超級粘合劑”。
國外對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的研究已較為深入。生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法主要有①從動植物組織中提取(此法提取的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶簡寫為TG)，②微生物發(fā)酵法生產(chǎn)(此法生產(chǎn)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶MicrobialTransglutaminaSe，簡寫為MTG)。
從動植物組織中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，見諸報(bào)道的如Brookhart等人1983年從豚鼠肝臟中提?。籝asueda等人1994年從魚組織中提?。籉alcone等人1993年從植物組織中提取。通過離心、過濾、層析等分離純化過程得到純化了230倍的TG。上世紀(jì)六十年代以來，對來自動物體，主要是豚鼠肝臟的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的純化方法、性質(zhì)以及應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究[Folk and Cole1965，1966；Connellan et al.1971；Folk 1980；Brookhart et al.1983；Matheis and Whitaker 1987；Ikura 1988；Miwa 1989；Singh 1991；Larre etal.1992，1993]。豚鼠肝臟是近三十年來商用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的唯一來源，這種稀有的來源、復(fù)雜的分離純化工藝，導(dǎo)致了這種酶的售價較高。來自植物體(豌豆種子、羽扇豆種子)的TG的分離純化工藝還不成熟。由此可見，來自動物、植物中的TG很難應(yīng)用于食品工業(yè)。
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)MTG已受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其日本、丹麥、荷蘭等國家投入了大量的人力、財(cái)力研究與開發(fā)。國內(nèi)本校江南大學(xué)環(huán)境生物技術(shù)研究室從1997年就開展了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)MTG的研究工作。目前已取得實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，酶活達(dá)到3.0u/ml；在10L發(fā)酵罐中，酶活達(dá)到3.2u/ml；300L發(fā)酵罐中，酶活達(dá)到3.15u/ml的成果。
MTG是一種胞外酶，分泌在發(fā)酵液中，因此，分離、提取處理過程與其它酶制劑相似。發(fā)酵結(jié)束后，先對發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，除去菌體，然后對上清液進(jìn)行處理，可得到酶制劑產(chǎn)品。應(yīng)用其它酶處理過程相似的技術(shù)，如離子交換、色譜、紙層析、超濾等也可用于MTG的純化處理。據(jù)報(bào)道將這些方法有機(jī)結(jié)合使用，可提高酶的純度和分離效率。某些方法在提取時還需向酶中加入酶穩(wěn)定劑，如各種鹽、蛋白質(zhì)、類脂及表面活性劑等。
Ando和Motoki等人1989年提出了從MTG發(fā)酵液中提取MTG的方法。發(fā)酵液經(jīng)離心分離得到上清液，經(jīng)超濾濃縮得濃縮液，通過CG-50離子交換樹脂得到活性酶，再次通過CG-50離子交換樹脂得到活性酶，通過稀釋，通過藍(lán)瓊脂糖柱得到MTG酶產(chǎn)品，酶被純化了174倍，酶活的總回收率為42％。
Geber等人1994年對提取MTG方法進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)酵液被離心和過濾后，通過強(qiáng)酸性(Fractogel EMDS03-)離子交換樹脂，得到純化了128倍的MTG，酶活的平均回收率達(dá)60％。離子交換的方法雖然分離效果好，酶活收率較高，酶較為穩(wěn)定，但由于其操作復(fù)雜、成本高昂，只適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的應(yīng)用，卻不能滿足大規(guī)模的工業(yè)提取及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
(1)所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取MTG的方法。發(fā)酵液不需經(jīng)過離子交換處理，操作簡便，高效，費(fèi)用低，成品純度高，節(jié)約能耗，對環(huán)境污染小，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
(2)技術(shù)方案將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液經(jīng)壓濾、超濾濃縮、溶劑沉析、離心分離、真空干燥、成品包裝而制得成品谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，在溶劑沉析、真空干燥、成品包裝前可加入輔料參與工藝進(jìn)行。
本發(fā)明的具體操作步驟如下壓濾將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液直接進(jìn)行板框壓濾，去除菌體，壓濾得到的濾液進(jìn)行超濾等下道工序。對于濾渣菌體，進(jìn)行收集菌體，機(jī)械破碎，釋放胞內(nèi)酶，加入適量清水得到酶液。按照與濾液相同的方法，單獨(dú)重復(fù)進(jìn)行提取MTG，以提高酶的提取率。
超濾濃縮將壓濾得到的濾液通過超濾膜進(jìn)行超濾濃縮。濾液通過截留分子量為10,000的超濾膜超濾濃縮，用冰塊或循環(huán)水控制酶液溫度在10℃以下。至此，酶活收率平均在86.5％左右，較好的批次收率可達(dá)90％以上。
溶劑沉析將得到的超濾濃縮液添加一種輔料，在低溫下加入一種有機(jī)溶劑進(jìn)行沉析操作。將超濾濃縮得到的濃縮液預(yù)冷至10℃以下，置于貯罐中按濃縮液重量的1％(w/w)加入輔料，充分?jǐn)嚢瑁徛尤?.5～2倍(v/v)于濃縮液體積的有機(jī)溶劑乙醇進(jìn)行沉析。輔料采用大豆蛋白或酪蛋白。
離心分離將得到的酶乙醇沉析液于10℃以下，3000r/min離心8分鐘。上清液含有約60％的乙醇，可回收利用，沉淀物即為酶泥。
真空干燥適當(dāng)分散酶泥以增大其比表面積，按酶泥的8～9倍(w/w)加入輔料，然后進(jìn)行真空干燥，真空干燥溫度為35℃以下，真空度為-700mmHg～-760mmHg。輔料采用大豆蛋白或酪蛋白和復(fù)合磷酸鹽。
成品包裝將粗酶粉碎，按需要添加輔料至成品酶制劑活力為50～100u/g，抽真空包裝得到成品，10℃以下保存。輔料采用大豆蛋白或酪蛋白和復(fù)合磷酸鹽。
(3)有益效果本發(fā)明不僅可以在實(shí)驗(yàn)室中方便的實(shí)施，而且極易在工業(yè)生產(chǎn)中運(yùn)用。本發(fā)明中各工序采用的添加輔料，可以降低酶活的損失，保持酶活，從而提高酶的提取收率和純度，提高質(zhì)量，降低成本。輔料主要包括大豆蛋白或酪蛋白和復(fù)合磷酸鹽。其中大豆蛋白或酪蛋白本身可以作為酶的底物，保持酶的活性；而復(fù)合磷酸鹽的存在有助于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的催化反應(yīng)。添加輔料進(jìn)行真空干燥，與直接真空干燥相比，可以縮短干燥的時間，減少能耗，減少干燥過程中酶活的損失。成品添加輔料還有利于保護(hù)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性，延長酶的保存期。同時真空干燥所采用的設(shè)備簡單，占地面積小，操作方便，成本低廉，效率突出，易于實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的放大。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1發(fā)酵得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液，發(fā)酵酶活3.0u/ml。經(jīng)過板框壓濾、超濾、添加1％的輔料(w/w)充分?jǐn)嚢韬?，緩慢加?.5倍(v/v)于濃縮液體積的乙醇進(jìn)行沉析，離心，酶泥進(jìn)行真空干燥，溫度35℃，真空度-740mmHg。粗酶粉碎后按需加入大豆蛋白和復(fù)合磷酸鹽。酶活收率63.8％。
實(shí)施例2改變?yōu)橛靡掖歼M(jìn)行沉析時不添加輔料，其它操作同實(shí)施例1。結(jié)果酶活收率57.9％。
實(shí)施例3真空干燥前加入0.2％的淀粉，其它操作同實(shí)施例1。結(jié)果酶活收率40.4％。
實(shí)施例4真空干燥前按酶泥的8～9倍(w/w)加入大豆蛋白和復(fù)合磷酸鹽輔料，其它操作同實(shí)施例1。結(jié)果酶活收率70.4％。
以實(shí)施例4和前3例相比較，顯然真空干燥前添加一定量的蛋白輔料可以獲得較高的酶活收率。
權(quán)利要求
1.一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是發(fā)酵液經(jīng)壓濾、超濾濃縮、溶劑沉析、離心分離、真空干燥、成品包裝而制得成品谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，在溶劑沉析、真空干燥、成品包裝前加入輔料參與工藝進(jìn)行；壓濾將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液進(jìn)行板框壓濾；超濾濃縮將壓濾得到的濾液通過超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，膜截留分子量為10,000，控制酶液溫度在10℃以下；溶劑沉析將得到的超濾濃縮液加1％(w/w)輔料，充分?jǐn)嚢?，緩慢加?.5～2倍(v/v)于濃縮液體積的溶劑進(jìn)行沉析，溫度10℃以下；離心分離對上清液回收再利用有機(jī)溶劑，沉淀物即為酶泥；真空干燥按酶泥的8～9倍(w/w)加入輔料，然后進(jìn)行真空干燥；成品包裝將粗酶粉碎，按需要添加輔料至成品酶制劑活力為50～100u/g，抽真空包裝得到成品，10℃以下保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是板框壓濾后的濾渣菌體，進(jìn)行收集菌體，機(jī)械破碎，釋放胞內(nèi)酶，加入清水得到酶液，單獨(dú)重復(fù)進(jìn)行提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是溶劑沉析所用溶劑為乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是在溶劑沉析之前所加輔料為大豆蛋白或酪蛋白；在真空干燥和成品包裝前所加輔料為大豆蛋白或酪蛋白和復(fù)合磷酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是離心分離溫度控制在10℃以下，3000r/min離心8分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，其特征是真空干燥溫度為35℃以下，真空度-700mmHg～-760mmHg。
全文摘要
一種從谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，特別是用有機(jī)溶劑沉析的方法，屬于微生物發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明解決了發(fā)酵液不需經(jīng)過離子交換處理，易于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)問題。本發(fā)明中，發(fā)酵液經(jīng)壓濾、超濾濃縮、溶劑沉析、離心分離、真空干燥、成品包裝而制得成品谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，在溶劑沉析、真空干燥、成品包裝前加入輔料參與工藝進(jìn)行。添加輔料對于提高酶活收率有顯著效果。壓濾后收集濾渣菌體，機(jī)械破碎，加適量清水配成酶液后，以相同的方法單獨(dú)重復(fù)進(jìn)行提取，以提高酶的提取率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是工藝合理、設(shè)備簡單、操作方便、成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/00GK1417327SQ0214852
公開日2003年5月14日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月10日
發(fā)明者陳堅(jiān), 堵國成, 燕國梁, 倫世儀 申請人:江南大學(xué)