專利名稱：三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物成分的提取方法，特別是涉及一種天然抗癌藥物——三尖杉酯堿與高三杉酯堿的提取方法。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)許多原來(lái)是不治之癥的疾病都找到了治療的方法。一種極其稀有的樹種——三尖杉(CephalotaxusLanceolata K.M.Feng)，經(jīng)臨床醫(yī)學(xué)測(cè)定，其樹皮及其他部位內(nèi)含有的生物堿——三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿，是天然的抗白血病的良藥，這種生物制劑的問(wèn)世，給許多瀕于死亡的白血病患者帶來(lái)了生命的希望。
傳統(tǒng)的提取工藝是以三尖杉樹皮為原料，采用酒精滲漉，回收酒精，經(jīng)多次反復(fù)酸堿處理，氯仿萃取，再經(jīng)中性氧化鋁吸附柱層析，硅膠分配柱層析，得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿。
上述方法的不足之處在于生產(chǎn)工藝復(fù)雜，周期長(zhǎng)，可操作性差，生產(chǎn)量極小，環(huán)境污染較嚴(yán)重，回收率低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化連續(xù)操作，且極大破壞珍稀樹種資源，不利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
中國(guó)專利局公布了申請(qǐng)?zhí)枮?9806044.5的“新的三尖杉烷衍生物及其制備方法”的發(fā)明(申請(qǐng)日期為1999.03.17)，該發(fā)明公布了一種采用側(cè)鏈前體構(gòu)成的?；镏苯吁セ烊坏娜馍?jí)A的方式，提供了一種通過(guò)化學(xué)合成來(lái)生成三尖杉酯堿的方法。
該方法投資成本較大，且仍需采用天然三尖杉?jí)A作為原料，同樣具有前述傳統(tǒng)工藝的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，合理使用珍稀樹種資源，減少?gòu)U物排放，并能有效提高制劑產(chǎn)量的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了含量較樹皮低但可再生的三尖杉小枝葉為原料，經(jīng)過(guò)打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO2流體萃取→分離回收三尖杉總生物堿→吸附樹脂連續(xù)柱層析→回收三尖杉混合酯堿→制備高速逆流色譜并經(jīng)紫外檢測(cè)得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿單體和少量的二者混合物→分別重結(jié)晶純化得到供制劑用的純品。
所述原料打粉粉粒度為0.5-3mm，物料堆積密度為228kg/m3。
所述超臨界CO2流體以乙醇為夾帶劑，流量為180-190kg/h；所述超臨界萃取的工藝條件是萃取時(shí)間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；所述吸附樹脂連續(xù)柱層析由四個(gè)過(guò)程組成一次大孔吸附樹脂柱層析→一次離子交換柱層析→二次大孔吸附樹脂柱層析→二次離子交換柱層析。
所述大孔吸附樹脂為AB8大孔吸附樹脂，一次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為6％檸檬酸-甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶15-20比例計(jì)算，流速為0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計(jì)算，流速為0.5-5ml/cm2/min。所述離子交換樹脂為100*7#陽(yáng)離子交換樹脂，一次離子交換樹脂柱層析所采用的解吸劑為不同pH濃度的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min；二次離子交換樹脂柱層析采用的解吸劑為pH9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min。
所述高速逆流色譜按如下方法制備柱體積為1000ml，溶劑系統(tǒng)為氯仿，0.07mol/L磷酸鈉-0.04mol/L檸檬酸組成的pH值為5.0的緩沖液，保留值80％，轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/min，流速200ml/h，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，每2分鐘自動(dòng)收集每管檢測(cè)。
由于采用上述工藝，使本發(fā)明具有了如下優(yōu)點(diǎn)(1)使用了含量較樹皮低但可易再生且資源遠(yuǎn)比樹皮豐富的三尖杉小枝葉代替樹皮作為原料，解決了三尖杉樹皮的稀缺問(wèn)題，保護(hù)了物種資源；(2)使用了來(lái)源廣泛且能回收的CO2代替有毒溶劑，可在近常溫條件下進(jìn)行操作，利于生物活性物質(zhì)的提取，且減少了工藝步驟，降低污染和能耗；(3)使用吸附樹脂連續(xù)柱層析的技術(shù)，既可以降低能耗，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，又能減少有機(jī)溶劑的排放，保護(hù)人類的生態(tài)環(huán)境，且吸附樹脂可以再生反復(fù)利用，極大地降低了生產(chǎn)成本；(4)采用逆流色譜不用固態(tài)支撐體，完全排除了支撐體對(duì)樣品組分的吸附、玷染、變性、失活等不良影響，能避免不可逆吸附所造成的溶質(zhì)色譜峰拖尾現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)很高的回收率；本發(fā)明的提出簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，減少了對(duì)環(huán)境的污染，提高了生產(chǎn)效率，滿足了日益增長(zhǎng)的天然抗癌藥物的市場(chǎng)需求，保護(hù)了珍貴的自然資源和生態(tài)環(huán)境，使得人與自然能夠協(xié)調(diào)發(fā)展。


附圖所示是本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的最佳實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
原料先用破碎機(jī)打成粗粉，粉粒度為0.5-3mm。粉狀物料用10％稀氨水堿化后，裝入1000升料筐內(nèi)，堆積密度為228kg/m3。
把裝有物料的料筐吊入萃取釜內(nèi)，關(guān)閉并鎖緊卡箍，將以85％乙醇為夾帶劑的液體CO2，經(jīng)預(yù)熱器加熱后，打入萃取釜，對(duì)物料進(jìn)行正向超臨界萃取，CO2流量為180-190kg/h，萃取時(shí)間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；攜帶有效成份的超臨界流體，經(jīng)截流閥減壓、降溫后，進(jìn)入分離器中分離，其中有效成份經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定收集，即得總生物堿，CO2氣體經(jīng)冷凝器液化后，流入回收罐，再經(jīng)高壓泵加壓循環(huán)使用。
選擇AB8大孔吸附樹脂和100*7#陽(yáng)離子交換樹脂為柱層析的載體，樹脂需預(yù)先處理，以乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次，至洗滌液加適量水無(wú)白色渾濁(1ml乙醇液加5ml水)時(shí)，然后以大量的蒸餾水洗去乙醇，備用。上樣液經(jīng)預(yù)先沉淀，PH值調(diào)節(jié)至7.5-8.0，過(guò)濾，乙醇濕法裝柱，開啟蠕動(dòng)泵，以干膏和樹脂的比例為1∶15-20上樣，以6％檸檬酸-甲醇緩沖液體系作為洗脫液解吸，流速為0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色譜儀測(cè)定。
繼續(xù)進(jìn)行離子交換樹脂柱層析，將備好的陽(yáng)離子交換樹脂裝柱，以干膏和樹脂的比例為1∶10-15上樣，以氫氧化鈉-甲醇體系按不同pH值制成的梯度洗脫液連續(xù)不斷地流過(guò)柱體洗脫，流速為0.5-3ml/cm2/min，分段收集，用高效液相色譜儀測(cè)定。
選擇pH7-8流份，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮體積的六分之一，第二次上大孔吸附樹脂柱，以pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系作為洗脫液連續(xù)不斷地流過(guò)柱體，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計(jì)算，流速仍為0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色譜儀測(cè)定。
第二次上離子交換樹脂柱層析，以干膏和樹脂的比例為1∶20上樣，以pH值為9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系的洗脫液連續(xù)不斷地流過(guò)柱體，流速仍為0.5-3ml/cm2/min，收集流份，用高效液相色譜儀測(cè)定，蒸干，即得混合酯堿。
制備高速逆流色譜，選擇溶劑系統(tǒng)為氯仿、0.07mol/L磷酸鈉-0.04mol/L檸檬酸組成的pH值為5.0緩沖液，將選好的兩相互不相溶的溶劑在分液漏斗中充分振搖后靜置分層。取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，先將固定相注滿管柱，柱體積為1000ml，再將流動(dòng)相以200ml/h的流速泵入，待流動(dòng)相從管柱出口流出，基線穩(wěn)定后，將樣品由進(jìn)樣器注入，進(jìn)樣量為15ml，此時(shí)按800r/min的轉(zhuǎn)動(dòng)速度啟動(dòng)主機(jī)，管柱流出物經(jīng)UV(紫外線)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為284mm，收集峰I、II、III，每2分鐘自動(dòng)收集每管檢測(cè)；洗脫液收集300ml后，以下相溶劑反向洗脫，按如上述方式又收集峰a、b、c，即得三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿和少量二者混合物。
二種單體經(jīng)不同的溶劑重結(jié)晶純化，可得到供制劑用的純品。
通過(guò)以上工藝方式得到的二種單體，其純度可達(dá)98％以上，比原工藝純度提高約3％左右，回收率達(dá)80％，比原工藝提高了20％左右。
權(quán)利要求
1.一種提取三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的方法，其特征在于采用含量較低的可再生的三尖杉小枝葉為原料，以如下加工工藝過(guò)程制備而成打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO2流體萃取→分離回收三尖杉總生物堿→吸附樹脂連續(xù)柱層析→回收三尖杉混合酯堿→制備高速逆流色譜并經(jīng)紫外檢測(cè)得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿單體和少量的二者混合物→分別重結(jié)晶純化得到供制劑用的純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，原料打粉粉粒度為0.5-3mm，物料堆積密度為228kg/m3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，超臨界CO2流體加以乙醇為夾帶劑，流量為180-190kg/h；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，超臨界萃取的工藝條件是萃取時(shí)間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，吸附樹脂連續(xù)柱層析由四個(gè)過(guò)程組成一次大孔吸附樹脂柱層析→一次離子樹脂交換柱層析→二次大孔吸附樹脂柱層析→二次離子交換樹脂柱層析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，所采用的大孔吸附樹脂為AB8大孔吸附樹脂，一次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為6％檸檬酸-甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶15-20比例計(jì)算，流速為0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計(jì)算，流速為0.5-5ml/cm2/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，所采用的離子交換樹脂為100*7#陽(yáng)離子交換樹脂，一次離子交換樹脂柱層析所采用的解吸劑為不同pH濃度的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min；二次離子交換樹脂柱層析采用的解吸劑為pH9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，高速逆流色譜按如下方法制備柱體積為1000ml，溶劑系統(tǒng)為氯仿，0.07mol/L磷酸鈉-0.04ml/L檸檬酸組成的pH值為5.0的緩沖液，保留值80％，轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/min，流速200ml/h，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，每2分鐘自動(dòng)收集每管檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，合理使用珍稀樹種資源，減少?gòu)U物排放，并能有效提高制劑產(chǎn)量的方法。本發(fā)明采用了含量較低的可再生的三尖杉小枝葉為原料，經(jīng)過(guò)打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO
文檔編號(hào)C07D491/00GK1493572SQ0215032
公開日2004年5月5日 申請(qǐng)日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月1日
發(fā)明者李國(guó)平, 吳雪平 申請(qǐng)人:福建廣生堂藥業(yè)有限公司