專利名稱：生長抑素全合成新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種生長抑素全合成方法。
背景技術(shù)：
生長抑素(somatostatin)化學(xué)名丙氨酰-甘氨酰-半胱氨酰-賴氨酰-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-賴氨酰-蘇氨酰-苯丙氨酰-蘇氨酰-絲氨酰-半胱氨酸(3，14)二硫環(huán)(Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cysteine Cydic(3→14)disulphide
化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
分子式C76H104N18O19S2
分子量1638
本品是人工合成的14肽環(huán)狀化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然生長抑素(生長素釋放抑制素，growth hormone release inhibitory hormone)是完全相同的。人工合成本品的報(bào)道有化學(xué)合成法和生物合成法，其中化學(xué)合成法又有液相多肽合成法和固相多肽合成法，生物合成法是近年發(fā)展起來的新合成方法，但生物表達(dá)技術(shù)尚不成熟。同時(shí)，產(chǎn)品的純化和產(chǎn)率方面離產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)尚有較大距離。目前，上市產(chǎn)品的來源主要采用化學(xué)合成方法制備。我們改進(jìn)的合成方法，采用新型2-氯-三苯甲基樹脂進(jìn)行固相合成本品。
縮寫表
液相多肽合成法地報(bào)道
美國專利USP.4,337,194；3,862,295；3,917,578和德國L.Moroder等；加拿大Hans U.Immer等分別于1973年至1981年報(bào)道了采用液相多肽合成法制備本品的方法。在L.Moroder等和HansU.Immer等報(bào)道的液相法合成本品的方法中，采用Z保護(hù)氨基酸進(jìn)行縮肽反應(yīng)，需多步驟進(jìn)行H2/Pd反應(yīng)，在實(shí)際操作中難度較大，且難以大批量制備。在USP3,862,925報(bào)道中，采用氟化氫去保護(hù)基，工藝中試驗(yàn)條件和氟化氫的貯運(yùn)等均難以實(shí)現(xiàn)。USP3,917,578采用在14肽線肽合成后，需先形成二硫鍵環(huán)，然后去保護(hù)基的方法，使二硫鍵環(huán)形成位阻收率降低。因此這些報(bào)道均難以選作大批量制備本品的方法。
USP4,337,194報(bào)道的合成路線較適合于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。但該液相法存在(1)反應(yīng)步驟多，路線冗長。(2)中間體不易純化分離，實(shí)際操作中溶劑蒸除難度較大。(3)試劑和所用氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基的來源和制備難度較大，使成本優(yōu)勢降低，難以適合于大批量生產(chǎn)。
固相多肽法合成本品的報(bào)道
1974年.Jean E.F.Rivier報(bào)道了采用氯甲基化樹脂固相多肽法合成本品的方法。
該方法的主要特點(diǎn)是采用了常規(guī)的固相合成方法。使合成操作簡單方便，時(shí)間大大縮短，克服了液相法操作步驟長，需中間體純化等不足。最終線肽純化方法采用交聯(lián)葡聚糖常壓柱分離。但是該方法仍存在(1)合成過程易消旋，使產(chǎn)品旋光性降低。(2)合成中去除側(cè)鏈保護(hù)基須使用氟化氫(HF)。需要有特殊的合成設(shè)備和去除氟化氫裝置。生產(chǎn)時(shí)氟化氫的來源，存放和操作等問題均不易解決，難以用于生產(chǎn)。
固相-液相混合法合成本品的文獻(xiàn)報(bào)道
1978年美國專利USP4,093,609公開了美國家用產(chǎn)品公司申請的專利，采用固相-液相混合法合成本品。該方法還需采用氟化氫等條件，沒有改變上述固相法和液相法中不足。
通過對報(bào)道的固相法合成路線方法進(jìn)行研究和對試劑材料的調(diào)研，認(rèn)為采用固相法合成多肽技術(shù)發(fā)展很快。隨著近年各種新型號樹脂和保護(hù)氨基酸的研究開發(fā)成功，逐步可以解決固相法合成中影響大批量生產(chǎn)肽的三項(xiàng)技術(shù)難點(diǎn)，(1)路線中可以不使用氟化氫。(2)較長肽鏈的縮肽過程中的消旋化影響大大降低。(3)樹脂的取代值和強(qiáng)度都有較大的提高。(4)通過手工方法可以大大方便地完成縮肽過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，設(shè)計(jì)操作簡便，反應(yīng)過程消旋化低、產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高的合成方法。
本發(fā)明提供了一種生長抑素全合成方法，該方法包括以下步驟
1.程序反應(yīng)
生長抑素線肽合成采用程序反應(yīng)，步驟如下
2.切割反應(yīng)
合成生長抑素樹脂線肽采用K試劑切割，方法如下
將K試劑加入到樹脂中(約10ml-30ml/g樹脂)，樹脂立即變?yōu)樽霞t色，冰水浴下機(jī)械攪拌反應(yīng)5小時(shí)后，過濾，并用K試劑洗滌樹脂，加入大量冷乙醚，即析出大量白色固體，過濾，收集白色固體，余渣用10％醋酸洗滌后，合并，冷凍干燥；
K試劑由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水組成。
3.氧化環(huán)合與純化工藝
對得到的線形肽按照1mg/1.5ml的濃度進(jìn)行室溫氧化環(huán)合，氧化溶劑為0.01-1％雙氧水或0.1-5％二甲亞砜/水；≥5小時(shí)后，氧化環(huán)合完全；直接上C18填料的中壓色譜柱，5-500mg/g填料；先用蒸餾水將雙氧水或二甲亞砜從色譜柱上洗脫，然后用0-80％MeOH/H2O0.1-10％AcOH將產(chǎn)品從色譜柱洗脫，濃縮后，冷凍干燥，一次性可得到除去雙氧水或二甲亞砜的產(chǎn)品。提高純度，按一定梯度(MeOH/H2O/AcOH體系)進(jìn)行二次純化。冷凍干燥后，冰箱冷凍室保存。生長抑素合成工藝
本發(fā)明全合成方法的產(chǎn)品質(zhì)量控制如下
1.中間體質(zhì)量控制
(1)產(chǎn)物的檢測及反應(yīng)終點(diǎn)的跟蹤用茚三酮定性顯色測試法
(2)顯色反應(yīng)為陽性結(jié)果的洗脫液為樣品溶液
(3)生長抑素含量≥94％
2.中間體控制方法
取少量樹脂(3-6mg)，放置于試管中，依次加入Kaiser試劑，混合后，將試管置于沸水浴中3-10分鐘，觀察顏色。
結(jié)果判斷
當(dāng)樹脂中有游離的伯胺基(-NH2-)存在時(shí)，該氨基可與茚三酮試劑形成蘭色化合物，使反應(yīng)混合物呈蘭色，溶液中藍(lán)色的深淺與樹脂上的游離氨基的濃度成正比，若反應(yīng)混合物呈蘭色，表示聯(lián)接不完全，如混合物呈無色淡黃色則表明游離氨基幾乎或已不存在聯(lián)接反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)。
當(dāng)樹脂僅載有仲胺基(NH-)時(shí)，該游離仲氨基僅與茚三酮試劑顯紫色，如游離仲氨基幾乎或全部被?；?，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為無色或淡黃色。
上述茚三酮定性實(shí)驗(yàn)需重復(fù)一次，并用反應(yīng)前的樹脂和空白試劑作對照。
3.線肽的檢測方法HPLC方法，含量＞50％。(檢測結(jié)果見附

圖1)
4.氧化環(huán)合反應(yīng)的質(zhì)量控制方法HPLC方法，含量＞95％。(檢測結(jié)果見附圖2)
5.原輔材料名稱、規(guī)格
本發(fā)明的方法是一種生長抑素全合成的新方法，為固相法，一次完成側(cè)鏈保護(hù)的生長抑素線肽，有以下特點(diǎn)(1)采用Fmoc-保護(hù)氨基酸，配比為1-3摩爾；采用2-氯三苯甲基樹脂作固相合成載體；采用取代值為0.2-0.8mmol/克樹脂優(yōu)選0.5mmol/克樹脂；(2)采用三氟乙酸切割生長抑素線肽，同時(shí)完成對線肽肽側(cè)鏈保護(hù)基的去除，切割試劑由三氟乙酸、苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水組成；(3)采用雙氧水和二甲基亞砜氧化環(huán)合，雙氧水濃度為0.01％-1％，優(yōu)選0.1％(W/V)，二甲基亞砜濃度為0.1％-10％，優(yōu)選1％(W/V)，氧化液濃度為0.01％-1％(W/V)，優(yōu)選0.06％(W/V)，氧化溫度為0-40℃，雙氧水氧化優(yōu)選20℃，二甲基亞砜氧化優(yōu)選35℃，氧化時(shí)間為5-120小時(shí)，雙氧水氧化優(yōu)選15小時(shí)，二甲基亞砜氧化優(yōu)選24小時(shí)；(4)采用非高壓液相色譜方法進(jìn)行純化分離，采用反相C18鍵合硅膠裝填層析柱，層析分離裝載量為5-100mg/克C18鍵合硅膠，優(yōu)選20mg/克，采用水作為洗脫氧化劑流動(dòng)相，采用水/醇/有機(jī)酸作層析流動(dòng)相，優(yōu)選水/甲醇/乙酸，采用水/甲醇梯度洗脫方法；(5)采用醋酸離子交換樹脂去除三氟醋酸。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
Na-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-絲氨酰-Nmin-三苯甲基一半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
操作(1)將Fmoc-Cys(Trt)-_樹脂置于多肽合成器中，用DCM、MeOH各30ml×2交替洗2次，2min/次，抽干，加20％哌啶/DMF溶液50ml×2室溫.攪拌20min，2次(去Fmoc)，抽干，樹脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。Kasier試劑檢測，結(jié)果呈陽性，F(xiàn)moc已去，若顯陰性，繼續(xù)去FmocII至呈陽性。
(2)將含有Fmoc-Ser(tBu)-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入樹脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)。
(3)抽干，樹脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。
(4)用Kaiser試劑進(jìn)行顯色，檢測偶聯(lián)反應(yīng)。
(5)若反應(yīng)4小時(shí)后仍顯陽性，重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)，直至檢測顯陰性，反應(yīng)結(jié)束。
(1)得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例2
Na-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作(1)向樹脂中加入20％哌啶/DMF溶液50ml×2，室溫?cái)嚢?0min，2次(去Fmoc)，抽干，樹脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干Kaiser試劑。檢測，結(jié)果呈陽性，F(xiàn)moc已去，若顯陰性，繼續(xù)去Fmoc直至呈陽性。
(2)將含有Fmoc-Thr(tBu)-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入樹脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)。
(3)抽干，樹脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。
(4)用Kaiser試劑，檢測偶聯(lián)反應(yīng)。
(5)若反應(yīng)4小時(shí)后仍顯陽性，重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)，直至檢測顯陰性，反應(yīng)結(jié)束。
(2)得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例3
Na-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作(1)向樹脂中加入20％哌啶/DMF溶液50ml×2，室溫?cái)嚢?0min，2次(去Fmoc)，抽干，樹脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干Kaiser試劑。檢測結(jié)果顯陽性，F(xiàn)moc已去。
(2)將含有Fmoc-Phe-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入樹脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)。
(3)抽干，樹脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。
(4)用Kaiser試劑，檢測偶聯(lián)反應(yīng)。
(5)若反應(yīng)4小時(shí)后仍顯陽性，重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)，直至檢測顯陰性，反應(yīng)結(jié)束。
(6)得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例4
Na-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例5
Na-9-芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例6
Na-9-芴甲氧羰基-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得FmoL-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例7
Na-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例8
Na-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同.3
得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(trt)-_
實(shí)施例9
Na-9-芴甲氧羰基-Nim-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Fmoc-Asn(trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例10
Na-9-芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-賴氨酰-Nim-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例11
Na-9-芴甲氧羰基-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-Nim-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得
Fmoc-cys(trt)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-cys(Trt)-_
實(shí)施例12
叔丁氧羰基-丙氨酰-甘氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰Nim-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-賴氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-蘇氨酰-O-叔丁基-絲氨酰-Nim-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基樹脂的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作固相合成方法，中間體控制同3
得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-ser(tBu)-Cys(Trt)-_
實(shí)施例13
將樹脂干燥(真空)稱重得5.982g淡黃色樹脂。
脫離反應(yīng)丙氨酰-甘氨酰-半胱氨酰-賴氨酰-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-賴氨酰-蘇氨酰-苯丙氨酰-蘇氨酰-絲氨酰-半胱氨酸的制備
反應(yīng)式
投料量及摩爾比
操作將K試劑加入樹脂中，冰水浴冷卻攪拌5小時(shí)，過濾，樹脂用40mlK試劑洗滌。合并濾液。向?yàn)V液中加入大量乙醚，析出大量白色固體，過濾，濾餅用乙醚洗滌，收集白色固體。干燥，得線肽(粗品)(TFA鹽)1.68g。
實(shí)施例14
氧化環(huán)合反應(yīng)
反應(yīng)式
操作方法
將線肽1.68g投入2520m15％DMSO/H2O溶液中，振蕩溶解后，室溫放置24小時(shí)(避光)后點(diǎn)樣。展開劑n-BuOH∶AcOH∶Py∶H2O＝9∶2∶3∶4
氧化環(huán)合完全后直接上樣得
實(shí)施例15
分離純化
除雙氧水或二甲亞砜
裝置
操作方法
(3)將生長抑素/DMSO/H2O溶液上柱
(4)用蒸餾水進(jìn)行洗脫，直至將DMSO除去
(5)用80％MeOH/H2O1mlAcOH進(jìn)行洗脫
(6)收集洗脫液，濃縮冷凍干燥
(7)得生長抑素粗品1.44g
純化
裝置C18制備柱(22×300mm)
操作(1)生長抑素粗品用15ml水溶解后上柱；
(2)收集洗脫液；
(3)濃縮，冷凍干燥；
(4)其他低于98％洗脫液合并，冷凍干燥，重新純化；
(5)得生長抑素，TFA白色固體560mg。
RP-CC純化
條件洗脫液A0.2％AcOH/MeOH
洗脫液B0.2％AcOH/H2O
層析柱C18制備柱(22×300mm)
洗脫梯度 時(shí)間(分)
流速2ml/min
紫外檢測波長220nm
實(shí)施例16
交換反應(yīng)(醋酸生長抑素制備)
投料量
裝置離子交換樹脂柱(25×300mm)
操作
(1)將生長抑素三氟醋酸鹽溶于10％醋酸中
(2)將此溶液加入到盛有強(qiáng)堿性離子交換樹脂柱上(25×300mm)
(3)用10％醋酸水溶液洗脫樣品
(4)收集洗脫液
(5)用茚三酮顯色反應(yīng)進(jìn)行跟蹤
(6)合并樣品洗脫液
(7)濃縮、冷凍干燥得醋酸生長抑素白色固體450mg。
權(quán)利要求
1.一種生長抑素全合成方法，其特征在于該方法包括下列步驟
I.程序反應(yīng)
生長抑素線肽合成采用程序反應(yīng)，步驟如下
II.切割反應(yīng)
合成生長抑素樹脂線肽采用K試劑切割，方法如下
將K試劑加入到樹脂中(約10ml-30ml/g樹脂)，樹脂立即變?yōu)樽霞t色，冰水浴下機(jī)械攪拌反應(yīng)5小時(shí)后，過濾，并用K試劑洗滌樹脂，加入大量冷乙醚，即析出大量白色固體，過濾，收集白色固體，K試劑由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水組成；余渣用10％醋酸洗滌后，合并，冷凍干燥得線肽；
III.氧化環(huán)合與純化工藝
對得到的線形肽按照1mg/1.5ml的濃度進(jìn)行室溫氧化環(huán)合，氧化溶劑為0.01-1％雙氧水或0.15％二甲亞砜/水；≥5小時(shí)后，氧化環(huán)合完全；直接上C18填料的中壓色譜柱，5-500mg/g填料；先用蒸餾水將雙氧水或二甲亞砜從色譜柱上洗脫，然后用0-80％MeOH/H2O0.1-10％AcOH將產(chǎn)品從色譜柱洗脫，濃縮后，冷凍干燥，一次性可得到除去雙氧水或二甲亞砜的產(chǎn)品，提高純度，按一定梯度(MeOH/H2O/AcOH體系)進(jìn)行二次純化，冷凍干燥得純化產(chǎn)品；
反應(yīng)式
操作方法
將線肽1.68g投入2520m15％DMSO/H2O溶液中，振蕩溶解后，室溫放置24小時(shí)(避光)后點(diǎn)樣，展開劑n-BuOH∶AcOH∶Py∶H2O＝9∶2∶3∶4
氧化環(huán)合完全后直接上樣得
分離除雙氧水或二甲亞砜
裝置
操作方法
(1)將生長抑素/DMSO/H2O溶液上柱
(2)用蒸餾水進(jìn)行洗脫，直至將DMSO除去
(3)用80％MeOH/H2O1mlAcOH進(jìn)行洗脫
(4)收集洗脫液，濃縮冷凍干燥
(5)得生長抑素粗品1.44g
純化
裝置C18制備柱(22×300mm)
操作(1)生長抑素粗品用15ml水溶解后上柱；
(2)收集洗脫液；
(3)濃縮，冷凍干燥；
(4)其他低于98％洗脫液合并，冷凍干燥，重新純化；
(5)得生長抑素，TFA白色固體560mg。RP-CC純化條件洗脫液A0.2％AcOH/MeOH
洗脫液B0.2％AcOH/H2O層析柱C18制備柱(22×300mm)
洗脫梯度時(shí)間(分)
流速 2ml/min
紫外檢測波長220nm
IV.交換反應(yīng)(醋酸生長抑素制備)
投料量
裝置離子交換樹脂柱(25×300mm)
操作
(1)將生長抑素三氟醋酸鹽溶于10％醋酸中
(2)將此溶液加入到盛有強(qiáng)堿性離子交換樹脂柱上(25×300mm)
(3)用10％醋酸水溶液洗脫樣品
(4)收集洗脫液
(5)用茚三酮顯色反應(yīng)進(jìn)行跟蹤
(6)合并樣品洗脫液
(7)濃縮、冷凍干燥得醋酸生長抑素白色固體450mg。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種生長抑素全合成方法，其特征在于所述的程序反應(yīng)步驟中生長抑素線肽的合成采用固相法一次完成側(cè)鏈保護(hù)線肽的合成，并且采用Fmoc-保護(hù)氨基酸，配比為1-3摩爾比；采用2-氯三苯甲基樹脂作固相合成載體；采用取代值為0.2-0.8mmol/克樹脂；采用三氟乙酸切割生長抑素肽，同時(shí)完成對線肽側(cè)鏈保護(hù)基的去除，切割試劑由三氟乙酸、苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水組成。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一種生長抑素全合成方法，其特征在于其中所述的氧化環(huán)合步驟采用雙氧水和二甲基亞砜，并且雙氧水濃度為0.01-1％；氧化溫度為0-40℃；氧化時(shí)間為5-120小時(shí)。
4.一種如權(quán)利要求1所述的一種生長抑素全合成方法，其特征在于其中所述的純化分離的步驟采用非高壓液色譜方法，并且采用反相C18鍵合硅膠裝填層析柱；層析分離裝載量為5-100mg/克C18鍵合硅膠；采用水作為洗脫氧化劑流動(dòng)相；采用水/醇/有機(jī)酸作層析流動(dòng)相；采用水/甲醇梯度洗脫方法。
5.一種如權(quán)利要求1所述的一種生長抑素全合成方法，其特征在于其中所述的交換反應(yīng)步驟采用醋酸離子交換樹脂去除三氟醋酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了生長抑素(14肽)的固相合成新方法。本方法采用2－氯三苯甲基樹脂作固相載體，在該樹脂首先連接保護(hù)半胱氨酰基(Fmoc－Cys(Trt)－)，采用Fmoc保護(hù)氨基酸的程序接肽法完成生長抑素線肽的合成，用三氟醋酸一次脫除線肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，并切割樹脂，得到生長抑素線肽的三氟醋酸。該中間產(chǎn)物在雙氧水或二甲基亞砜水溶液中氧化環(huán)合，得到生長抑素三氟醋酸鹽粗制品。該粗制品經(jīng)C18鍵合硅膠中壓柱，用甲醇－水梯度洗脫方法分離純化，得生長抑素三氟醋酸精制產(chǎn)品。該產(chǎn)品用醋酸離子交換樹指交換，并冷凍干燥得最終產(chǎn)品。本方法制備生長抑素具有產(chǎn)率高，合成快，不易消旋，可分子內(nèi)選擇性氧化環(huán)合，純度好，方法簡便等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诖笈可a(chǎn)制備。
文檔編號C07K7/00GK1508152SQ02155189
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月17日
發(fā)明者嚴(yán)益民, 屠永銳, 孫永強(qiáng), 馬亞平, 鄧金根 申請人:常州市第四制藥廠有限公司