專(zhuān)利名稱(chēng)：丹參丹酚酸b的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹參丹酚酸B的制備方法。丹酚酸B的結(jié)構(gòu)式如下
最近幾年，許多專(zhuān)家用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法，結(jié)合化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)手段，對(duì)丹參進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，取得了大量的新的認(rèn)識(shí)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。丹參水溶性有效成分是丹參的重要活性成分，受到醫(yī)學(xué)界極大的重視。水溶性成分包括原兒茶醛、丹參素、和丹酚酸A、B、C、D、E等，其中酚酸類(lèi)的成分活性最強(qiáng)，尤以丹酚酸B的作用顯著，經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它具有顯著的抗脂質(zhì)過(guò)氧化，清除自由基和抗血栓的作用。
心血管系統(tǒng)疾病為中老年人的高發(fā)病。成功的開(kāi)發(fā)出丹酚酸B系列產(chǎn)品將會(huì)為人類(lèi)防治心血管病做出具大的貢獻(xiàn)。
近幾年來(lái)，關(guān)于丹參的提取及丹參復(fù)方制劑臨床應(yīng)用的報(bào)道很多。丹參單獨(dú)應(yīng)用的制劑較少，一般是與其它藥物組成復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床。出現(xiàn)了很多劑型，如復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參沖劑、復(fù)方丹參膠囊、復(fù)方丹參顆粒劑、復(fù)方丹參氣霧劑、復(fù)方丹參注射液、復(fù)方丹參口服液等。這些產(chǎn)品的研制成功為丹參的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了更為廣闊的前景。但這些產(chǎn)品多是采用水煮醇沉法或醇提取的舊工藝，提取過(guò)程中丹參的水溶性有效成分大部分丟失或被破壞，而脂溶性雜質(zhì)含量較高甚至大多保留了其脂溶性成分，其中以二萜醌類(lèi)的丹參酮為主。部分產(chǎn)品保留了較多的水溶性成分，但也主要是原兒茶醛、丹參素，因其兩種成分較易從藥材中分離獲得，這兩種成分很可能是丹酚酸類(lèi)的分解產(chǎn)物，其中原兒茶醛的毒副作用較大。另外傳統(tǒng)的提取工藝所得產(chǎn)品原生藥中非活性成份含量很高，提取物重量一般為原生藥的20％左右，其中大部分為非活性物質(zhì)。
傳統(tǒng)的丹參制劑多采用醇提法。如根據(jù)《中國(guó)藥典》(2000年版一部)復(fù)方丹參片中丹參需提取三次，第一次加乙醇回流1.5小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.30；第二次加50％乙醇回流1.5小時(shí)，濾過(guò)；第三次加水回流2小時(shí)，濾過(guò)。合并第二、三次濾液，回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.40，與第一次的濃縮液合并，混勻，制成清膏。這種醇提工藝所制成的復(fù)方丹參片中的丹參有效成分以二萜醌類(lèi)的丹參酮為主，水溶性成分基本丟失。
《藥物制劑注解》(人民衛(wèi)生出版社1983.402)公開(kāi)的復(fù)方丹參注射液采用水煮醇沉法，丹參洗凈后用水煎煮提取三次，過(guò)濾，合并三次煎液，濃縮至每ml含藥材1.5～2g。加入95％乙醇使藥液含醇量達(dá)75％，放置40小時(shí)后過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至每ml含藥材3g，最后加95％乙醇使藥液含醇量達(dá)85％，放置4小時(shí)過(guò)濾，濾液回收乙醇濃縮至每ml含藥材3～5g，沖入13倍的蒸餾水，放置24小時(shí)后過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味。丹酚酸B為二分子丹參素與一分子原紫草酸縮合而成的四聚咖啡酸類(lèi)化合物，在攝氏100度極不穩(wěn)定，易降解成單體丹參素與寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產(chǎn)物，或氧化成原兒茶醛、原兒茶酸，水煮三次后有效成份丹酚酸B已大部分被破壞。不同的醇沉濃度對(duì)丹參的有效成分含量影響也較大，因酚酸類(lèi)成份在植物中多以鎂、鉀、氨等鹽的形式存在，在水中易溶而在醇中溶解性差，70％醇沉淀在除去雜質(zhì)的同時(shí)，水溶性酚酸類(lèi)有效成份損失量可達(dá)50％以上。
本發(fā)明丹參丹酚酸B的制備方法，其工藝步驟為1.水提取在0～99℃的溫度下用水提取丹參中的水溶性成份。
所用水可為常水、蒸餾水，去離子水，反滲透水等。水中可含有微量的酸、堿、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)鹽、醇類(lèi)等。
提取的方法可以采用浸漬法，也可以采用滲濾法、超聲提取法或微波萃取法。
上述浸漬法可以為一次浸漬提取，也可為多次浸漬提取?，F(xiàn)以兩次浸漬提取的方法為例進(jìn)行說(shuō)明。
第一次浸漬，取丹參原藥材制成飲片，或用其它適當(dāng)方法粉碎，加水適量，加水量一般為藥材量的6～15倍，低溫或保溫浸漬?？上扔?0℃以下浸泡(本文中浸泡即浸漬，兩者為同一意義)，然后再加熱至40～99℃保溫浸泡。推薦方案為加水量為丹參量的10倍左右，先常溫浸泡1～4小時(shí)，然后加熱至40～70℃，浸泡2～6小時(shí)。分離第一次提取液。
第二次浸漬，加水適量，加水量一般為藥材量的4～10倍。在40～99℃保溫浸泡一定時(shí)間后，分離得到第二批提取液。推薦方案為加水量為丹參量的8倍，加熱至40～70℃，浸泡2～6小時(shí)。
合并兩次提取液，采用過(guò)濾、自然沉淀或離心法的方法，初步除去提取液中的固體雜質(zhì)。
上述滲濾法具體方法是取丹參飲片或用其它方法粉碎后的丹參，裝于一有機(jī)玻璃制成的滲濾柱或桶中，邊裝邊適當(dāng)壓實(shí)，滲濾柱或桶上端留出約1/5體積。加水至所有藥材浸沒(méi)，靜止浸泡4小時(shí)。打開(kāi)滲濾柱下端閥門(mén)，使?jié)B濾液緩緩流出，每小時(shí)流出滲濾液的量約為丹參干重的一倍，同時(shí)不斷注入水至滲濾柱上端。以FeCl3點(diǎn)樣觀察滲濾液中丹酚酸B的含量，至顯色反應(yīng)較弱時(shí)停止?jié)B濾。
上述超聲法具體方法是在浸漬法的基礎(chǔ)上，提取過(guò)程在超聲波下完成。超聲提取技術(shù)主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)，加機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散。擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，利于提取。
上述微波法具體方法是在浸漬法的基礎(chǔ)上，提取過(guò)程在微波下完成。微波是利用微波能來(lái)提高提取率的一種最新發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。它的原理是在微波場(chǎng)中，吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被提取物質(zhì)從基體或體系中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對(duì)差的溶劑中。
2.酸化提取液將上述浸漬液中加入無(wú)機(jī)或有機(jī)酸調(diào)pH，使浸漬液pH值為1～6，采用過(guò)濾、自然沉淀或離心法的方法，除去酸化后出現(xiàn)的固體雜質(zhì)。其中所用酸可為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等。最佳為鹽酸或硫酸。
酸化的目的如下(1)丹參中的丹酚酸類(lèi)成分主要以鹽的形式存在，有鎂鹽，也有鉀鹽、氨鹽等，其成分較復(fù)雜。加酸酸化后，可變成單一的丹酚酸B，有利于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制。(2)浸漬液中含有大量膠質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)，通過(guò)酸化，可沉淀除去大部分這類(lèi)雜質(zhì)。(3)丹酚酸B為弱酸性類(lèi)物質(zhì)，其在酸性條件下易被大孔樹(shù)脂吸附，提高分離純化效果。
以上水提取和酸化也可通過(guò)用稀酸水溶液提取的方法一步實(shí)現(xiàn)丹參飲片或粉碎后的丹參直接用稀酸水溶液提取，稀酸的pH值為1～6，酸的種類(lèi)可選有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，方法可用浸漬法或滲濾法等。
3.柱層析法分離、純化丹酚酸B(1)采用特選填料制備色譜柱；(2)色譜柱活化；(3)將上述丹參的水提液加至色譜柱，用水、稀醇水溶液或水-丙酮溶劑洗脫，除去雜質(zhì)；(4)以醇類(lèi)、乙腈或適當(dāng)濃度的醇-水溶液、水-丙酮或乙腈-水溶液洗脫，得到高純度的丹酚酸B溶液。
在上述步驟(1)中，特選填料是指大孔樹(shù)脂類(lèi)、離子交換樹(shù)脂、MCIGEL-CHP-20P、Sephadex LH-20凝膠、或C18、C8鍵合相等色譜柱填料，推薦方案為用非極性或弱極性的大孔樹(shù)脂做色譜柱填料。
上述步驟(2)中，色譜柱活化的方法可用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈有機(jī)溶劑或其與水的混合物，也可用堿-水溶液，或堿-醇溶液活化。
上述步驟(3)中，洗脫用水中可含微量的酸或無(wú)機(jī)鹽。
上述步驟(3)中，可以單用水洗脫除雜質(zhì)，或單用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水溶劑洗脫除雜質(zhì)；也可先用水洗脫然后再用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水溶劑洗脫除雜質(zhì)。
上述步驟(3)中，稀醇水溶液等溶劑可以為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇的水溶液，也可采用乙腈的水溶液，或它們的混合物。
上述步驟(3)中，稀醇水溶液等溶劑的濃度一般在50％以下，常用為10％-40％，最好用20％-30％的濃度，低濃度的丙酮-水溶液常用丙酮含量一般在60％以下，常用為10％～50％，最好用20％～30％的濃度。洗脫過(guò)程也可以采用梯度的方法，即先用低濃度醇或低濃度的丙酮-水溶液洗脫，然后再用較高濃度醇或丙酮溶液等溶劑洗脫。
上述步驟(4)中，適當(dāng)濃度的丙酮-水、醇-水溶液或乙腈-水溶液中，有機(jī)相所占比例一般大于10％，常用為20％-90％，最好用40％-70％的濃度。
4.干燥洗脫液的干燥可采用一步法，也可采用兩步法。兩步法為先在減壓或加熱的條件下將藥液濃縮，然后采用噴霧干燥，或真空干燥，薄膜蒸發(fā)等方法干燥；一步法則是采用噴霧干燥，薄膜蒸發(fā)等方法直接將上述步驟3所得洗脫液干燥，得到丹酚酸B成品。
洗脫液的干燥除上述方法外，也可根據(jù)劑型需要，采用真空冷凍干燥；或直接噴灑在固體粉狀藥用輔料上，再進(jìn)一步干燥。
本發(fā)明丹參丹酚酸B的制備方法，由于用水提取，避免了丹參酮等非水溶性成份的出現(xiàn)；提取時(shí)采用低于100℃的溫度，可避免丹酚酸B的破壞；加酸酸化可將丹酚酸B的不同鹽類(lèi)轉(zhuǎn)化為單一的丹酚酸B，同時(shí)可以沉淀除去從丹參原藥材中提取出的雜質(zhì)，另外在酸性條件下丹酚酸B的柱層析分離效果較好；由于在洗脫去雜質(zhì)的過(guò)程中采用了水和低濃度醇等溶劑，使提取液中的雜質(zhì)得到進(jìn)一步除去；在有效成份丹酚酸B的洗脫過(guò)程中，由于采用了適當(dāng)濃度的丙酮-水、醇-水溶液或乙腈-水溶液，使丹酚酸B與丹參其它成份間得到了較好的分離。最終制得了純度較高的丹酚酸B，可使提取物中丹酚酸B的含量達(dá)到90％以上，且質(zhì)量穩(wěn)定、工藝成熟、可以大規(guī)模生產(chǎn)。與其它含丹參制劑的傳統(tǒng)制備方法相比，避免了丹參中主要有效成分丹酚酸B的流失，對(duì)提高丹參療效，充分利用中藥材資源等具有很重要的意義。
實(shí)施例一丹參酚酸B的制備方法，其工藝步驟為1.水提取(浸漬法)取丹參飲片，稱(chēng)量，按其重量的10倍量加水，室溫浸泡4小時(shí)，然后60℃保溫3小時(shí)(可適當(dāng)攪拌)，分離提取液；殘?jiān)丛嬈亓康?倍加水，60℃保溫2小時(shí)(可適當(dāng)攪拌)，分離提取液，將兩次提取液合并，用過(guò)濾方法除去提取液中的固體雜質(zhì)。
2.提取液酸化在濾液中加入濾液量1～2％的鹽酸調(diào)pH，邊加邊攪拌，至濾液的pH值為1，然后靜置約兩小時(shí)，使析出物充分沉降，離心或抽濾，保留上清液，棄去沉淀。
3.柱層析法分離、純化丹酚酸B濾液上D101型(天津農(nóng)藥廠生產(chǎn))大孔樹(shù)脂柱，上柱樣品(以原藥材干重計(jì)算)與樹(shù)脂量之比為1∶4(W∶W)，先用約30倍柱體積的水洗脫除雜質(zhì)，再用約20倍柱體積的濃度為30％的乙醇水溶液洗脫除雜質(zhì)。最后用濃度為50％的乙醇水溶液洗脫，以FeCl3點(diǎn)樣監(jiān)測(cè)洗脫液中丹酚酸B的含量，結(jié)合高效液相，至丹酚酸B完全洗脫下來(lái)，收集洗脫液。
4.洗脫液在溫度60℃、真空度-0.1Mpa的條件下進(jìn)行真空濃縮，回收乙醇至濃縮液中含藥量5％左右，濃縮液再經(jīng)噴霧干燥，制得丹參丹酚酸B。
實(shí)施例二與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，水提取過(guò)程為滲濾法。具體方法如下取丹參飲片，稱(chēng)量，裝于一有機(jī)玻璃制成的滲濾柱或桶中，邊裝邊適當(dāng)壓實(shí)，滲濾柱或桶上端留出約1/5體積。加40℃溫水至所有藥材浸沒(méi)，靜止浸泡4小時(shí)。打開(kāi)滲濾柱下端閥門(mén)，使?jié)B濾液緩緩流出，每小時(shí)流出滲濾液的量約為丹參飲片干重的一倍，同時(shí)不斷注入約40℃溫水至滲濾柱上端。以FeCl3點(diǎn)樣觀察滲濾液中丹酚酸B的含量，至顯色反應(yīng)較弱時(shí)停止?jié)B濾。
實(shí)施例三與實(shí)施例一基本相同，所不同的是水提取過(guò)程以0.01mol/L稀鹽酸提取，提取和酸化一次完成。
實(shí)施例四與實(shí)施例二基本相同，所不同的是水提取過(guò)程以0.01mol/L稀硫酸提取，提取和酸化一次完成。
實(shí)施例五與實(shí)施例一基本相同，所不同的是提取過(guò)程采用超聲提取法，超聲波能量為0.1瓦。
實(shí)施例六與實(shí)施例一基本相同，所不同的是提取過(guò)程采用微波萃取法，微波能量為1瓦。
實(shí)施例七與實(shí)施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質(zhì)時(shí)，是用硫酸調(diào)濾液的pH值為1～4。
實(shí)施例八與實(shí)施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質(zhì)時(shí)，是用醋酸調(diào)濾液的pH值為1～4。
實(shí)施例九與實(shí)施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質(zhì)時(shí)，是用磷酸調(diào)濾液的pH值為1～4。
實(shí)施例十與實(shí)施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質(zhì)時(shí)，是用甲酸調(diào)濾液的pH值為1～4。
實(shí)施例十一與實(shí)施例一、二、三、四、五或六基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過(guò)程中，采用的是甲醇水溶液。
實(shí)施例十二與實(shí)施例十一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過(guò)程中，采用的是丙醇水溶液。
實(shí)施例十三與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過(guò)程中，采用的是乙腈水溶液。
實(shí)施例十四與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過(guò)程中，采用的是丙酮水溶液。
實(shí)施例十五與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過(guò)程中，采用的是MCI-GEL CHP-20P作色譜柱填料。
實(shí)施例十六與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過(guò)程中，采用的是C18鍵合相作色譜柱填料。
實(shí)施例十七與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過(guò)程中，采用的是離子交換樹(shù)脂作色譜柱填料。
實(shí)施例十八與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過(guò)程中，采用的是C8鍵合相作色譜柱填料。
實(shí)施例十九與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過(guò)程中，采用的是Sephadex LH-20作色譜柱填料。
本發(fā)明所要求保護(hù)的具體技術(shù)方案，不限于上述實(shí)施例所表達(dá)的技術(shù)方案的具體組合。
權(quán)利要求
1.一種丹參丹酚酸B的制備方法，其工藝步驟為步驟一、水提取水提取過(guò)程為將丹參飲片或粉碎的丹參采用浸漬法、滲濾法、超聲法或微波萃取法提取，分離出主要含有丹參水溶性成分的提取液；采用過(guò)濾、自然沉淀或離心方法初步除去提取液中的固體雜質(zhì)；步驟二、酸化提取液在提取液中加入無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)PH值，使浸漬液PH值為1～6，采用過(guò)濾、自然沉淀或離心法除去酸化后出現(xiàn)的固體雜質(zhì)；步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸Ba、采用填料制備色譜柱，所采用的填料為大孔樹(shù)脂類(lèi)、離子交換樹(shù)脂、MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C8鍵合相色譜柱填料；b、色譜柱活化；c、將提取液加至色譜柱，用水、稀醇水溶液或水－丙酮溶劑洗脫，除去雜質(zhì)；d、用醇類(lèi)、丙酮、乙腈、醇水溶液、水－丙酮溶液或乙腈－水溶液洗脫，得到高純度的丹酚酸B溶液；步驟四、干燥。
2.權(quán)利要求1所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是水提取和酸化提取液可以通過(guò)用稀酸水溶液提取的方法一步實(shí)現(xiàn)，即丹參飲片或粉碎后的丹參直接用稀酸水溶液提取，稀酸的PH值為1～6，酸的種類(lèi)為無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸；提取的方法可以是浸漬法、滲濾法、超聲法或微波萃取法，分離出提取液，用過(guò)濾、自然沉淀或離心法除去提取液中的固體雜質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸B的步驟C為，先用水洗脫除雜質(zhì)，然后再用稀醇水溶液或丙酮－水溶劑洗脫，除雜質(zhì)。
4.權(quán)利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸B的步驟C為先用水洗脫除雜質(zhì)，然后用低濃度醇或低濃度的丙酮溶液洗脫，再用較高濃度醇或丙酮溶液洗脫除雜質(zhì)。
5.權(quán)利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用一步干燥法或兩步干燥法；一步干燥法是采用噴霧干燥，薄膜蒸發(fā)方法直接將上述步驟3所得的洗脫液干燥；兩步法為先在減壓或加熱的條件下蒸發(fā)，藥液濃縮，然后采用噴霧干燥。
6.權(quán)利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用真空冷凍干燥。
7.權(quán)利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用直接噴灑在固體粉狀藥用輔料上，再進(jìn)一步干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種丹參丹酚酸B的制備方法。其工藝步驟為1.水提?。?.酸化提取液；3.柱層析法分離、純化丹酚酸B；4.干燥。用本發(fā)明方法制備丹酚酸B提取率高、純度高，提取物中丹酚酸B的含量可達(dá)到90％以上，且質(zhì)量穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D307/00GK1425659SQ0216077
公開(kāi)日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者張鳳俠, 王家平, 談學(xué)兵 申請(qǐng)人:南京虹橋醫(yī)藥技術(shù)研究所