專(zhuān)利名稱(chēng)：多聯(lián)免疫粘附的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多聯(lián)蛋白(concatameric proteins)，更具體地涉及生物活性蛋白結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中生物活性蛋白的胞外可溶性結(jié)構(gòu)域C末端與生物活性蛋白的相同或其它胞外可溶性結(jié)構(gòu)域N末端相融合，以及兩個(gè)多聯(lián)體通過(guò)與免疫球蛋白Fc片段鉸鏈區(qū)相偶聯(lián)而形成二聚體，以及多聯(lián)蛋白的糖基化形式。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子的活性與針對(duì)各種抗原刺激的炎癥和/或免疫應(yīng)答的病理嚴(yán)重程度相關(guān)。目前，許多能夠識(shí)別細(xì)胞因子的抗原特異性抗體和可溶性受體都被用于抑制細(xì)胞因子的功能，以達(dá)到治療目的(WO93/016184，WO96/02576，WO96/023067，WO1997/03682，和US5,434,131，5,656,272，5,977,318，6,210,661，6,225,117)?？贵w和可溶性受體是通過(guò)干擾細(xì)胞因子和細(xì)胞表面上細(xì)胞因子受體之間的相互作用而抑制細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
Capon等人公開(kāi)了將可溶性受體用作細(xì)胞因子的功能抑制劑，該可溶性受體與人免疫球蛋白的重鏈相融合(Nature 3375254，1989)，此后，公開(kāi)許多專(zhuān)利，這些發(fā)明均涉及可溶性受體與免疫球蛋白的融合蛋白(US專(zhuān)利5,521,288，5,844,095，6,046,310，6,090,914，6,100,383，6,225,448)。
通常，可溶性受體和免疫球蛋白的融合蛋白具有下述優(yōu)點(diǎn)(Capon等，Nature 3375254，1989)1.通過(guò)二聚化形成二價(jià)而增加對(duì)配體的總體親合力2.延長(zhǎng)蛋白的血液半衰期，也就是提高了分子穩(wěn)定性3.通過(guò)免疫球蛋白重鏈Fc片段激活效應(yīng)細(xì)胞4.可利用親和柱如利用蛋白A簡(jiǎn)便地純化多數(shù)受體胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白重鏈的融合蛋白由不含CH1結(jié)構(gòu)域的重鏈組成，這樣二聚體就不會(huì)與輕鏈結(jié)合。對(duì)于參與免疫應(yīng)答的蛋白和受體的功能，更加期望利用該結(jié)構(gòu)。例如，WO94/06476和US 5,447,851中公開(kāi)的TNFR(WO92/16221，WO95/34326)-免疫球蛋白融合蛋白已被用于抑制TNF-介導(dǎo)的炎癥。眾所周知，TNFR-免疫球蛋白融合蛋白比原始的單體分子具有更高的親合性(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.212883，1991；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.8810535，1991；Peppe等，J.Exp.Med.1741483，1991；Mohler等，J.Immunol.1511548，1993)。
為增強(qiáng)對(duì)TNF介導(dǎo)的反應(yīng)的抑制，可通過(guò)TNFR，CD2和CTLA-4的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聚化來(lái)提高效力。例如，當(dāng)將分別與免疫球蛋白重鏈(重鏈融合蛋白)及輕鏈(輕鏈融合蛋白)相結(jié)合的TNFR胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白在相同細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)時(shí)，通過(guò)重鏈與重鏈和輕鏈相連，我們可以得到四聚體形式的融合蛋白。如Scallon等所示，該四聚體顯示出比單體或二聚體形式強(qiáng)得多的效力(Cytokine 7759，1995)。
但是，該方法用于商業(yè)應(yīng)用還存在許多困難，例如在相同細(xì)胞系內(nèi)同時(shí)表達(dá)兩種不同的融合蛋白，多聚體形式的產(chǎn)量極低；難以純化高分子量的多聚體形式。因此，目前所用的免疫球蛋白融合蛋白僅為重鏈融合形式。
所以，非?？释l(fā)展產(chǎn)量高、純化效力高的生產(chǎn)多聚蛋白治療劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人利用DNA重組技術(shù)，通過(guò)將生物活性蛋白可溶性結(jié)構(gòu)域的C末端與相同或其它生物活性蛋白的可溶性結(jié)構(gòu)域N末端相融合，從而制得了多聯(lián)蛋白。另外，本發(fā)明人通過(guò)將其與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相連而使該多聯(lián)體成為二聚體，并使用DNA誘變技術(shù)而加入更多糖基化。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)多聯(lián)蛋白二聚體及其糖基化形式比常規(guī)的單體融合蛋白顯示出更高的效力和穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明一方面提供多聯(lián)蛋白，其中生物活性蛋白可溶性結(jié)構(gòu)域的C末端與相同或其它生物活性蛋白可溶性結(jié)構(gòu)域的N末端相融合。
另一方面，本發(fā)明還提供二聚體蛋白，其由兩個(gè)單體蛋白通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接而成，所述單體蛋白的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體，所述單體融合蛋白的多聯(lián)結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供含有編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體的DNA質(zhì)粒，所述單體融合蛋白的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供由重組DNA質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述質(zhì)粒包括編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體，所述單體融合蛋白的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)融合。
本發(fā)明還提供一種方法用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞用重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒包括編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體，所述單體融合蛋白的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合，所述培養(yǎng)在適于表達(dá)DNA構(gòu)建體的條件下進(jìn)行，所述構(gòu)建體編碼與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)偶聯(lián)的多聯(lián)融合蛋白，并生產(chǎn)二聚多聯(lián)體，所述二聚多聯(lián)體是通過(guò)如上所述的兩個(gè)單體多聯(lián)體在鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連而形成，包括從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化上述蛋白的過(guò)程。
本發(fā)明還提供在適于表達(dá)DNA構(gòu)建體的最佳條件下，所述DNA構(gòu)建體編碼單體融合蛋白，該單體融合蛋白的免疫功能的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合，培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞用重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒包含編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體，所述單體融合蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合，并且其中插入了糖基化基序，還提供生產(chǎn)糖基化二聚體的方法，該二聚體是通過(guò)如上所述的兩個(gè)單體蛋白的鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連而成，包括從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化上述糖基化蛋白的過(guò)程。
本發(fā)明另一方面還提供用于將糖基化基序插入編碼單體融合蛋白的DNA構(gòu)建體中的DNA引物，所述單體融合蛋白的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供糖基化二聚體，該二聚體是通過(guò)兩個(gè)單體蛋白在鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連而成，所述單體蛋白中參與免疫應(yīng)答的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供含有藥學(xué)有效量的二聚體以及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，所述二聚體通過(guò)兩個(gè)單體融合蛋白在鉸鏈區(qū)的二硫鍵而形成，所述單體蛋白中參與免疫應(yīng)答的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。
本發(fā)明還提供含有藥學(xué)有效量的糖基化二聚體以及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，所述糖基化二聚體通過(guò)兩個(gè)單體蛋白在鉸鏈區(qū)的二硫鍵而形成，所述單體蛋白中參與免疫應(yīng)答的多聯(lián)部分與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相融合。


通過(guò)以下具體的描述并結(jié)合附圖，可更加清楚地理解本發(fā)明上述目的和其它目的，特征和其它優(yōu)點(diǎn)，附圖為圖1顯示利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備DNA構(gòu)建體的方法示意圖，該構(gòu)建體編碼常規(guī)簡(jiǎn)單融合單體蛋白；圖2顯示利用PCR制備DNA構(gòu)建體的方法示意圖，該構(gòu)建體編碼本發(fā)明的多聯(lián)融合單體蛋白；圖3a顯示[TNFR/Fc]2，[CD2/Fc]2或[CTLA4/Fc]2融合蛋白的結(jié)構(gòu)，這些都是在細(xì)胞中利用TNFR/Fc，CD2/Fc或CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反應(yīng)而形成的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白，作為常規(guī)簡(jiǎn)單融合單體蛋白的實(shí)例。
圖3b顯示[TNFR-TNFR/Fc]2，[CD2-CD2/Fc]2或[CTLA4-CTLA4/Fc]2融合蛋白的結(jié)構(gòu)，這些都是在細(xì)胞中利用TNFR-TNFR/Fc，CD2-CD2/Fc或CTLA4-CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反應(yīng)而形成的多聯(lián)融合二聚蛋白，作為本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的實(shí)施方案。
圖4a顯示[TNFR1-TNFR1/Fc]2的結(jié)構(gòu)，作為本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的實(shí)施方案。
圖4b顯示[TNFR2-TNFR2/Fc]2的結(jié)構(gòu)，作為本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案。
圖4c顯示[CD2-CD2/Fc]2的結(jié)構(gòu)，作為本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案。
圖4d顯示[CTLA4-CTLA4/Fc]2的結(jié)構(gòu)，作為本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案。
圖5顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-Top10′的構(gòu)建過(guò)程圖，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的TNFR1-TNFR1/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖6顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig的構(gòu)建過(guò)程圖，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的CD2-CD2/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖7是重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-Top10′的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的TNFR1-TNFR1/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖8是重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-Top10′的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的TNFR1-TNFR1/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖9是重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的CD2-CD2/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖10是重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的CTLA4-CTLA4/Fc多聯(lián)融合單體蛋白。
圖11是重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-MG的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明mgTNFR1-TNFR1/Fc多聯(lián)融合單體蛋白，該蛋白含有四個(gè)糖基化基序肽。
圖12是重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-MG的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明mgTNFR2-TNFR2/Fc多聯(lián)融合單體蛋白，該蛋白含有2個(gè)糖基化基序肽。
圖13是重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig-MG的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的mgCD2-CD2/Fc多聯(lián)融合單體蛋白，該蛋白含有2個(gè)糖基化基序肽。
圖14是重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig-MG的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)本發(fā)明的mgCTLA4-CTLA4/Fc多聯(lián)融合單體蛋白，該蛋白含有3個(gè)糖基化基序肽。
圖15顯示在還原或非還原條件下，純化的多聯(lián)融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2的SDS-PAGE結(jié)果；圖16顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●)和[TNFR2/Fc]2(○)以及本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2()和[TNFR2-TNFR2/Fc]2()對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒性的抑制效果。
圖17顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●)和[TNFR2/Fc]2(○)以及本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2()和[TNFR2-TNFR2/Fc]2()對(duì)TNF-β的細(xì)胞毒性的抑制效果。
圖18顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[CD2/Fc]2(●)，已知的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A()和本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[CD2-CD2/Fc]2(○)對(duì)活性T淋巴細(xì)胞增殖的抑制效果。
圖19顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[CTLA4/Fc]2(●)，已知的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A()和本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)對(duì)活性T淋巴細(xì)胞增殖的抑制效果。
圖20顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(●)，本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2(○)和糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2()的血液半衰期。
圖21顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[CD2/Fc]2(●)，本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[CD2-CD2/Fc]2(○)和糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白[mgCD2-CD2/Fc]2()的血液半衰期。
圖22顯示常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[CTLA4/Fc]2(●)，本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2(○)和糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2()的血液半衰期。
圖23顯示作為對(duì)照的PBS(●)，常規(guī)的簡(jiǎn)單融合二聚蛋白[TNFR1/Fc]2(■)和[TNFR2/Fc]2(▲)，以及本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白[TNFR1-TNFR1/Fc]2(×)和[TNFR2-TNFR2/Fc]2(△)在DBA/1小鼠中對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的抑制效果。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明總地涉及多聯(lián)蛋白，更具體地涉及免疫粘附分子。典型地，免疫粘附分子通過(guò)免疫球蛋白(Ig)的Fc片段與受體或粘附分子的配體結(jié)合區(qū)相融合而形成，這樣就獲得了一個(gè)類(lèi)似于抗體的結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域已知的典型粘附分子具有抗體的結(jié)構(gòu)，其中可變區(qū)被受體的配體結(jié)合區(qū)所替代，而保留Fc片段。文獻(xiàn)中已經(jīng)提出了許多免疫粘附分子。但是，本發(fā)明的免疫粘附分子與常規(guī)的免疫粘附分子結(jié)構(gòu)不同，而現(xiàn)有技術(shù)也沒(méi)有預(yù)測(cè)或描述本發(fā)明免疫粘附分子的制備。
術(shù)語(yǔ)定義為全面地理解本發(fā)明免疫粘附分子的特征性結(jié)構(gòu)，下文給出了本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)的確切定義。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中沒(méi)有額外定義的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)按本領(lǐng)域中通常的含義理解。盡管具有本發(fā)明通常的含義，但是仍如下定義以下各術(shù)語(yǔ)，以便能夠更加清楚地理解其含義，明確地限定本發(fā)明的范圍。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”指B細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白分子，作為抗原受體能夠特異性地識(shí)別大量的抗原。該分子具有Y形結(jié)構(gòu)，由兩條相同的輕鏈(L鏈)和兩條相同的重鏈(H鏈)構(gòu)成，這四條鏈之間通過(guò)一些二硫鍵結(jié)合在一起，包括H鏈之間在鉸鏈區(qū)的二硫鍵橋。L和H鏈含有可變區(qū)和恒定區(qū)。L鏈的可變區(qū)與H鏈的可變區(qū)相連，這樣就產(chǎn)生了兩個(gè)相同的抗原結(jié)合區(qū)。根據(jù)H鏈恒定區(qū)的特征，可將免疫球蛋白分為五種同種型A(IgA)，D(IgD)，E(IgE)，G(IgG)和M(IgM)。每種亞型都具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。例如，與其它同種型相比，IgG的Fc結(jié)構(gòu)略微有所不同。另外，IgG和IgA還具有一些亞型。例如，人IgG同種型具有四種亞型，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，其分別具有γ1，γ2，γ3和γ4H鏈。免疫球蛋白分子的生物學(xué)功能，如補(bǔ)體活化，F(xiàn)c受體介導(dǎo)的吞噬作用以及抗原依賴(lài)性細(xì)胞毒性，都是通過(guò)H鏈的Fc區(qū)中的結(jié)構(gòu)決定簇(互補(bǔ)性決定區(qū))介導(dǎo)的。這種H鏈的Fc區(qū)被用于構(gòu)建本發(fā)明的二聚蛋白，并可衍生自上述免疫球蛋白的所有同種型和亞型。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白分子的Fc片段”指沒(méi)有抗原結(jié)合活性且容易結(jié)晶的片段，其含有鉸鏈區(qū)和CH2及CH3區(qū)，以及負(fù)責(zé)使抗體結(jié)合到效應(yīng)物質(zhì)和細(xì)胞上的部分。所以，本發(fā)明提及的Fc片段可與一些文獻(xiàn)中描述的不同，但包括鉸鏈區(qū)。這種關(guān)于Fc片段的描述為本發(fā)明的描述提供便利，參照本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以充分理解這種描述。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性蛋白”指通常具有生理或藥學(xué)活性的蛋白，肽或多肽，在形成了多聯(lián)體或免疫粘附分子之后仍保留其部分天然活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”含義不限于生理或藥學(xué)活性。例如，一些多聯(lián)體，如含有酶的多聯(lián)體可以在有機(jī)溶劑內(nèi)催化反應(yīng)。類(lèi)似地，一些含有伴刀豆球蛋白A或免疫球蛋白分子的高分子量融合分子可用作實(shí)驗(yàn)室診斷試劑。
所述蛋白，肽或多肽的非限定性實(shí)例包括血紅蛋白，血清蛋白(如血液因子包括因子VII，VIII和因子IX)，免疫球蛋白，細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素)，α-，β-和γ-干擾素，集落刺激劑(如G-CSF和GM-CSF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，和磷脂酶激活蛋白(PLAPs)。其它典型的生物或治療蛋白包括胰島素，植物蛋白(如凝集素和蓖麻毒蛋白)，腫瘤壞死因子(TNF)以及其相關(guān)的等位基因，生長(zhǎng)因子(如組織生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子如TGFα或TGFβ)，激素(如促卵泡激素，甲狀腺刺激激素，抗利尿激素，色素沉著或分散激素和甲狀旁腺激素，促黃體生成素釋放激素及其衍生物，降鈣素，降鈣素基因相關(guān)多肽(CGRP)，合成腦啡肽，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，促紅細(xì)胞生成素，下丘腦釋放因子，催乳素，慢性促性腺激素，組織纖溶酶原激活劑，生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)，胸腺體液因子(THF)。免疫球蛋白包括IgG，IgE，IgM，IgA，IgD及其片段。一些蛋白，如白細(xì)胞介素，干擾素或集落刺激因子可使用DNA重組技術(shù)以非糖基化形式產(chǎn)生。這種非糖基化的蛋白可用作本發(fā)明的生物活性材料。
另外，本發(fā)明所用生物活性材料包括任何在體內(nèi)具有生物活性的多肽。生物活性材料的實(shí)例包括肽或多肽，抗體的片段，單鏈結(jié)合蛋白(參見(jiàn)US Patent No.4,946,778)，結(jié)合分子包括抗體或其片段，多克隆抗體，單克隆抗體，和催化抗體的融合多肽。生物活性材料的其它例子包括過(guò)敏原蛋白，如豚草，抗原E，蜜蜂毒液，或螨類(lèi)過(guò)敏原。
另外，本發(fā)明所用生物活性材料包括酶。例舉的酶可包括糖類(lèi)特異性酶，蛋白酶，氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶和連接酶。具體地說(shuō)，非限制性地例舉酶可包括天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶，過(guò)氧化物歧化酶，內(nèi)毒素酶，過(guò)氧化氫酶，胰凝乳蛋白酶，脂酶，尿酸酶，腺苷脫磷酸酶(adenosinedephosphatase)，酪氨酸酶，和膽紅素氧化酶。糖類(lèi)特異性酶的實(shí)例包括葡糖氧化酶，glucodase，半乳糖苷酶，葡糖腦苷脂酶，和葡糖醛酸酶。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“參與免疫應(yīng)答的蛋白”指所有在細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答期間介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而激活或抑制免疫應(yīng)答的蛋白。免疫是保護(hù)“自身”不受“非自身”如細(xì)菌或病毒侵害的過(guò)程。免疫應(yīng)答大致可分為細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，T和B淋巴細(xì)胞在其中起到最為重要的作用。T細(xì)胞，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，直接攻擊并殺死感染病毒的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，或者通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)幫助其它免疫細(xì)胞，所述細(xì)胞因子發(fā)揮功能誘導(dǎo)或激活免疫應(yīng)答或炎癥反應(yīng)。B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的非自身的外來(lái)物質(zhì)(抗原)例如細(xì)菌或病毒的抗體，這種免疫應(yīng)答被稱(chēng)為細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答中都是必需的基本過(guò)程，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，信號(hào)分子，也就是配體，與細(xì)胞表面受體之間發(fā)生相互作用，所述細(xì)胞表面受體可以將特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明的參與免疫應(yīng)答的蛋白的代表性實(shí)例包括細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，粘附分子，腫瘤壞死因子受體(TNFR)，酶，受體酪氨酸激酶，趨化因子受體，其它細(xì)胞表面蛋白和可溶性配體。非限制性地例舉細(xì)胞因子可包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-17，TNF，TGF，IFN，GM-CSF，G-CSF，EPO，TPO和M-CSF。細(xì)胞因子受體的實(shí)例包括，但不限于生長(zhǎng)激素受體(GHRs)，IL-13R，IL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R，IL-6R，IL-7R，IL-9R，IL-15R，TNFR，TGFR，IFNR(如IFN-γRα鏈和IFN-γRβ鏈)，干擾素-αR，-βR，和-γR，GM-CSFR，G-CSFR，EPOR，cMpl，gp130和Fas(Apo 1)。非限制性例舉的酶可包括流行性感冒C血凝素酯酶和尿激酶。例舉趨化因子受體可包括CCR1和CXCR1-4。受體酪氨酸激酶的實(shí)例包括，但不限于TrkA，TrkB，TrkC，Htk，REK7，Rse/Tyro-3，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子R，血小板衍生生長(zhǎng)因子R，和Flt-1。其它細(xì)胞表面蛋白的實(shí)例包括CD2，CD4，CD5，CD6，CD22，CD27，CD28，CD30，CD31，CD40，CD44，CD100，CD137，CD150，LAG-3，B7，B61，β-neurexin，CTLA-4，ICOS，ICAM-1，補(bǔ)體R-2(CD21)，IgER，溶酶體膜gp-1，α2-微球蛋白受體相關(guān)蛋白，和鈉釋放肽R?？扇苄耘潴w的非限定性實(shí)例包括IL-10，heregulin，和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明參與免疫應(yīng)答的蛋白的配體及其應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，將其總結(jié)如下表1-7。
表1參與免疫應(yīng)答的蛋白粘附分子

表2參與免疫應(yīng)答的蛋白酶

表3參與免疫應(yīng)答的蛋白細(xì)胞因子受體

表4參與免疫應(yīng)答的蛋白腫瘤壞死因子受體

表5參與免疫應(yīng)答的蛋白受體酪氨酸激酶

表6參與免疫應(yīng)答的蛋白其它細(xì)胞表面蛋白

表7參與免疫應(yīng)答的蛋白可溶性配體

本文所用的術(shù)語(yǔ)“可溶性胞外結(jié)構(gòu)域”指穿透含磷脂的細(xì)胞膜的膜內(nèi)在蛋白中暴露于細(xì)胞外區(qū)域的部分，其中膜內(nèi)在蛋白含有一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)，該跨膜區(qū)主要由疏水氨基酸構(gòu)成。這種胞外結(jié)構(gòu)域主要含有親水氨基酸，其通常位于蛋白折疊結(jié)構(gòu)的表面，因而可溶于含水環(huán)境中。大多數(shù)細(xì)胞表面受體蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域作用為結(jié)合特異性配體，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聯(lián)體連接的”指生物活性蛋白的兩個(gè)可溶性結(jié)構(gòu)域相連從而形成長(zhǎng)多肽的狀態(tài)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聯(lián)蛋白”指多聯(lián)體連接的蛋白。例如，參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的N末端與該參與免疫應(yīng)答的蛋白的相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域C末端相連，其中前者可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的C末端與免疫球蛋白分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相連。這樣，參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域就形成了一個(gè)長(zhǎng)的多肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)單融合單體蛋白”指具有單體結(jié)構(gòu)的融合蛋白，該單體結(jié)構(gòu)由參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白分子Fc片段鉸鏈區(qū)相連而形成的簡(jiǎn)單多肽構(gòu)成，在本發(fā)明中為便于描述，可將簡(jiǎn)單融合單體蛋白命名為“蛋白名稱(chēng)/Fc”。例如，由參與免疫應(yīng)答的蛋白TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白分子Fc片段相連而形成的簡(jiǎn)單融合單體蛋白可命名為“TNFR1/Fc”。如果需要的話，F(xiàn)c片段的來(lái)源也可在命名中指出。例如，如果Fc片段來(lái)源于IgG1，單體蛋白就稱(chēng)為T(mén)NFR1/IgG1Fc。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)單融合二聚蛋白”指具有二聚結(jié)構(gòu)的融合蛋白，其中兩個(gè)簡(jiǎn)單融合單體蛋白通過(guò)在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而連接到一起。在本發(fā)明中為便于描述，將這種簡(jiǎn)單融合二聚蛋白命名為“[蛋白名稱(chēng)/Fc]2”。例如，將TNFR1蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白分子Fc片段相連而形成簡(jiǎn)單融合單體蛋白，當(dāng)我們將兩個(gè)這樣的簡(jiǎn)單融合單體蛋白通過(guò)在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而融合到一起時(shí)，這樣獲得的融合蛋白具有二聚結(jié)構(gòu)，將其稱(chēng)之為[TNFR1/Fc]2。另外，如果需要的話，還可在名稱(chēng)中指出Fc片段的來(lái)源。例如，如果Fc片段來(lái)自IgG1，該二聚蛋白就可稱(chēng)為[TNFR1/IgG1Fc]2。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聯(lián)融合單體蛋白”指具有單體結(jié)構(gòu)的融合蛋白，該單體結(jié)構(gòu)由單一多肽構(gòu)成，該單一多肽中參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的N末端與該參與免疫應(yīng)答的蛋白的相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的C末端相連，其中前者可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的C末端與免疫球蛋白分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相連。在本發(fā)明中，為便于描述，可將這種多聯(lián)融合單體蛋白稱(chēng)為“蛋白名稱(chēng)-蛋白名稱(chēng)/Fc”。例如，參與免疫應(yīng)答的蛋白TNFR1蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白分子Fc片段相連形成了簡(jiǎn)單融合單體蛋白，將該簡(jiǎn)單融合單體蛋白的TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與TNFR1的相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域相連，獲得的多聯(lián)融合單體蛋白就稱(chēng)為T(mén)NFR1-TNFR1/Fc。如果需要，可以在命名中指出Fc片段的來(lái)源。例如，如果Fc片段是來(lái)自IgG1，那么該單體蛋白可稱(chēng)為T(mén)NFR1-TNFR1/IgG1Fc。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聯(lián)融合二聚蛋白”指具有二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白，其中兩個(gè)多聯(lián)融合單體蛋白通過(guò)在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而融合在一起。為便于本發(fā)明的描述，多聯(lián)融合二聚蛋白可命名為“[蛋白名稱(chēng)-蛋白名稱(chēng)/Fc]2”。例如，通過(guò)連接簡(jiǎn)單融合單體蛋白的TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與參與免疫應(yīng)答的蛋白TNFR1的相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域而形成多聯(lián)融合單體蛋白，將兩個(gè)這樣的多聯(lián)融合單體蛋白通過(guò)在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵融合到一起，得到的具有二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白就命名為[TNFR1-TNFR1/Fc]2，其中簡(jiǎn)單融合單體蛋白是通過(guò)連接TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白分子的Fc片段而形成的。如果需要的話，可以在命名中指出Fc片段的來(lái)源。例如，如果Fc片段是來(lái)自IgG1，那么該融合蛋白可稱(chēng)為[TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指作為一種載體能夠穩(wěn)定地將外源基因攜帶運(yùn)送至宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA分子。為進(jìn)行應(yīng)用，載體應(yīng)能夠復(fù)制，具有將其自身導(dǎo)入宿主細(xì)胞的系統(tǒng)，并具有可選擇標(biāo)記。外源基因可包括例如編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)質(zhì)粒”指攜帶有待在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外源基因的環(huán)狀DNA分子，所述外源基因與其可操作連接。當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，重組表達(dá)質(zhì)粒能夠不依賴(lài)宿主染色體DNA而進(jìn)行復(fù)制，以高拷貝數(shù)復(fù)制其本身，并產(chǎn)生異源DNA。正如本領(lǐng)域公知的為增加轉(zhuǎn)染基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，該基因應(yīng)該與轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)節(jié)序列可操作連接，所述調(diào)節(jié)序列在被選作表達(dá)體系的宿主細(xì)胞中有功能。優(yōu)選地，該表達(dá)調(diào)節(jié)序列和外源基因可由單一表達(dá)載體攜帶，該載體含有細(xì)菌-可選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。如果使用真核細(xì)胞作為表達(dá)體系，該表達(dá)載體應(yīng)該進(jìn)一步含有在該真核宿主細(xì)胞中有用的表達(dá)標(biāo)記。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指載體中元件的排列，其中每個(gè)元件都能夠行使其先天的功能。所以，與編碼序列可操作連接的調(diào)控序列能夠影響編碼序列的表達(dá)。作用于誘導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)控序列不必與編碼序列相鄰。例如，當(dāng)啟動(dòng)子序列和編碼序列之間存在間插序列時(shí)，啟動(dòng)子序列可仍與編碼序列“可操作連接”。
本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。另外，通?？墒褂媚軌蚋咝?dǎo)入外源DNA以及能夠高水平表達(dá)導(dǎo)入基因的宿主細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞包括原核和真核細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)，假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)，真菌或酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)，動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或小鼠細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞如COS1，COS7，人胚腎細(xì)胞，BSC1，BSC40或BMT10，以及組織培養(yǎng)的人類(lèi)細(xì)胞。當(dāng)克隆編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA構(gòu)建體時(shí)，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。當(dāng)使用COS細(xì)胞時(shí)，由于SV40大T抗原在COS細(xì)胞中表達(dá)，攜帶有SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)?？勺鳛槎嗫截愑坞x體存在，從而能夠高表達(dá)外源基因。導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA序列對(duì)于宿主細(xì)胞可以是同源或異源，或者是含有同源或異源DNA序列的雜交DNA序列。
為表達(dá)編碼本發(fā)明多聯(lián)融合蛋白的DNA序列，可使用作為表達(dá)體系的宿主細(xì)胞和載體的多種組合?？捎糜谵D(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體含有表達(dá)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列可來(lái)自例如SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，巨細(xì)胞病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？捎糜诩?xì)菌宿主細(xì)胞的表達(dá)載體包括來(lái)自大腸桿菌的細(xì)菌質(zhì)粒，例如pBluescript，pGEX2T，pUC，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，可用于廣泛宿主細(xì)胞的質(zhì)粒，如RP4，噬菌體DNA，例如多種λ噬菌體衍生物，包括λgt10，λgt11和NM989，以及其它DNA噬菌體，例如絲狀單鏈DNA噬菌體如M13?？捎糜诮湍讣?xì)胞的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物?？捎糜诶ハx(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體包括pVL 941。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將DNA導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，從而使該DNA可作為染色體外元件，或者通過(guò)染色體整合而復(fù)制。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”指合適的宿主細(xì)胞對(duì)表達(dá)載體的攝入，無(wú)論實(shí)際上是否表達(dá)任何編碼序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”指介導(dǎo)將表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外的氨基酸序列，還稱(chēng)為“前導(dǎo)序列”。細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，其N(xiāo)末端序列通常被細(xì)胞膜中的信號(hào)肽酶切除。這樣的N末端序列就稱(chēng)為信號(hào)序列或信號(hào)肽，或前導(dǎo)序列或前導(dǎo)肽。分泌(或轉(zhuǎn)運(yùn)的)蛋白或所有存在于細(xì)胞膜外的蛋白或所有存在于細(xì)胞外環(huán)境的蛋白都具有特定的信號(hào)序列。這些信號(hào)序列之間沒(méi)有特異同源性，并且根據(jù)其來(lái)源不同，相同的蛋白具有不同的信號(hào)序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)或非極性和帶電殘基的分布對(duì)于信號(hào)序列的正確功能而言，比其初級(jí)結(jié)構(gòu)更加重要。盡管沒(méi)有特異同源性，但是信號(hào)序列還是具有如下的幾個(gè)共同特征。信號(hào)序列在其N(xiāo)端含有N結(jié)構(gòu)域，這是一個(gè)親水性區(qū)域，包含一個(gè)或多個(gè)帶正電的殘基，N結(jié)構(gòu)域后為H結(jié)構(gòu)域，H結(jié)構(gòu)域是一個(gè)稍長(zhǎng)的疏水性區(qū)域。在大腸桿菌中，信號(hào)序列含有約18-30個(gè)氨基酸。其N(xiāo)結(jié)構(gòu)域含有許多陽(yáng)離子氨基酸，如Lys或Arg，這樣就具有凈正電荷。在H結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了許多疏水性氨基酸如Ala或Leu，而極性或帶電荷的氨基酸如Pro，Lys，Arg，Asn或Glu在H結(jié)構(gòu)域很少見(jiàn)。大量氨基酸如Ala和Leu殘基形成了α螺旋結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)膜穿透。C結(jié)構(gòu)域位于H結(jié)構(gòu)域和蛋白實(shí)際分泌部分之間。這個(gè)C結(jié)構(gòu)域的疏水性較小，含有能夠被信號(hào)肽酶如LebB或LspA識(shí)別的序列。沒(méi)有關(guān)于信號(hào)肽酶切割的精確位點(diǎn)的報(bào)道，但是已知信號(hào)肽酶通常在C結(jié)構(gòu)域中在Ala-X-Ala序列之后進(jìn)行切割。含有上述信號(hào)序列的蛋白前體(preproteins)通過(guò)與幾種蛋白相互作用而到達(dá)細(xì)胞膜，并通過(guò)切割信號(hào)肽的特定區(qū)域而折疊為其成熟形式。這樣的信號(hào)序列對(duì)于在細(xì)胞表面或胞外環(huán)境中表達(dá)目的蛋白的策略十分重要。外源蛋白和融合蛋白應(yīng)該被穩(wěn)定高效地運(yùn)送到胞外環(huán)境。典型地，具有優(yōu)異分泌能力的細(xì)胞表面蛋白可用于在細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白或融合蛋白，其通常具有分泌信號(hào)序列，能夠提供優(yōu)秀的分泌效率。
制備本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白通常如下制備(a)使用編碼免疫球蛋白分子Fc片段的基因和編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的基因，制備編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體；(b)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分別向制備的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體以及與所述編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的基因相同的基因中插入限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列；(c)利用識(shí)別該識(shí)別序列的限制性?xún)?nèi)切酶切割編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體以及編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的基因中限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列；(d)使用連接酶連接被切割的DNA片段，以產(chǎn)生編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體(參見(jiàn)圖2)；(e)將制備的編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體與載體可操作連接以產(chǎn)生重組表達(dá)質(zhì)粒；(f)用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；以及(g)在適于編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染子，并分離純化所感興趣的多聯(lián)融合二聚蛋白。
可利用含有特定限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列以及編碼前導(dǎo)序列的序列的引物，和含有編碼可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端以及免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域5’端部分區(qū)域的反義序列的引物，通過(guò)PCR制備編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段。
可利用具有編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域的序列以及編碼免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域5’端的序列的引物以及具有編碼特定限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列及免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域3’段的反義序列的另一引物，通過(guò)PCR制備編碼免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域的DNA片段。
將如上所述的編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段、以及編碼免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域的DNA片段混合在試管中。變性后，將DNA重退火。然后使用DNA聚合酶在各雜交DNA的3’段聚合，形成完整的雙鏈DNA片段。利用獲得的雙鏈DNA片段，并使用具有編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的序列的引物，以及編碼免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域3’端的引物，進(jìn)行另一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以此擴(kuò)增免疫球蛋白融合基因，該基因含有相應(yīng)于編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段的序列以及相應(yīng)于編碼免疫球蛋白分子Fc片段特定區(qū)域的DNA片段的序列。
通過(guò)PCR將限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列導(dǎo)入擴(kuò)增的免疫球蛋白融合基因和具有編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的序列的DNA片段中。然后用限制性?xún)?nèi)切酶切割識(shí)別序列，切割的區(qū)域用連接酶相連接，這樣就產(chǎn)生了多聯(lián)免疫球蛋白融合基因。
免疫球蛋白融合基因還可進(jìn)一步含有信號(hào)序列，以促進(jìn)其編碼的蛋白向細(xì)胞外分泌。例如，CTLA-4分子含有獨(dú)特的前導(dǎo)序列，該序列在其N(xiāo)端具有高度親水性的豐余序列，并且其異常地長(zhǎng)，且具有高度水溶性(Harper，K等，J.Immunol.1471037-1044；及Brunet，J.F.Nature 328267-270，1987)。通常，大多數(shù)細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白具有前導(dǎo)序列，該序列在其N(xiāo)末端含有20-24個(gè)高疏水性的氨基酸。但是，本發(fā)明所用的CTLA-4分子含有總共37個(gè)殘基其N(xiāo)端16個(gè)親水氨基酸，和通常在其跨膜區(qū)的21個(gè)高疏水性的氨基酸。在制備CTLA4Ig融合蛋白的常規(guī)方法中，CTLA-4分子的前導(dǎo)序列被制瘤素M的前導(dǎo)序列(Linsley，P.S.等，J.Exp.Med.174561-569，1991)或IL-6的前導(dǎo)序列(Yamada，A等，Microbiol.Immunol.40513-518，1996)所替代。本發(fā)明人證明了包含具有”MRTWPCTLLFFIPVFCKA”序列的前導(dǎo)序列的CTLA-4分子是優(yōu)選的，而不是由”ACLGFQRHKAQKNLAA”這16個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，并可容易地實(shí)現(xiàn)將表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外環(huán)境，如國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為WO98/31820中所公開(kāi)的。
通過(guò)將免疫球蛋白融合基因插入載體來(lái)制備重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染子?？赏ㄟ^(guò)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞并分離純化多聯(lián)融合蛋白而獲得所感興趣的多聯(lián)融合二聚蛋白。
可用于制備本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白的宿主細(xì)胞優(yōu)先選自骨髓細(xì)胞系，CHO細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，人胚腎293細(xì)胞，以及桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞。在這種表達(dá)體系中產(chǎn)生的目的多肽作為包含體被分泌到培養(yǎng)基中。然后可使用蛋白A或蛋白G柱，通過(guò)親和層析純化多聯(lián)融合二聚蛋白。實(shí)際上，有效的哺乳動(dòng)物表達(dá)體系及這種純化系統(tǒng)非常適用于表達(dá)二聚形式的參與免疫應(yīng)答的蛋白以及分離這種蛋白。
制備本發(fā)明的糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白通過(guò)糖基化作用修飾以真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的分泌蛋白。已知糖基化作用可影響蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性、功能以及物理屬性。所以，本發(fā)明優(yōu)選的方面包括利用重組DNA技術(shù)以及上述動(dòng)物細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞，向參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域上連接額外的糖鏈，來(lái)促進(jìn)目的多聯(lián)融合二聚蛋白的產(chǎn)生。
已知兩種糖基化作用模式。一種是O-連接的糖基化作用，其中寡糖連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上，另一種是N-連接的糖基化作用，其中寡糖連接到天冬酰胺殘基上。N-連接的糖基化作用發(fā)生在特定氨基酸序列中，特別是Asn-X-Ser/Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)不同于O-連接的寡糖結(jié)構(gòu)，并且在N-連接類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)的糖基化殘基也不同于O-連接類(lèi)型。例如，在O-連接的寡糖中，N-乙酰半乳糖胺總是連接到絲氨酸或蘇氨酸上，而在所有N-連接的寡糖中，N-乙酰葡糖胺與天冬酰胺相連。O-連接的寡糖通常只含有1-4個(gè)糖殘基。相比之下，N-連接的寡糖含有5個(gè)或更多糖殘基，本質(zhì)上包括N-乙酰葡糖胺和甘露糖。
在本發(fā)明中，為實(shí)現(xiàn)額外的O-連接或N-連接的糖基化作用，編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被改變，得到的DNA在合適的動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)，以使用宿主系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)糖基化作用。另一方面，本發(fā)明的糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白可如下制備改變編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA序列，通過(guò)加入Asn-X-Ser/Thr序列來(lái)誘導(dǎo)或增加N-連接的糖基化作用。
可根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法來(lái)改變DNA序列，以引入糖基化作用。本發(fā)明優(yōu)選的一方面在于為保護(hù)多聯(lián)融合蛋白特別是兩個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域免受細(xì)胞間蛋白酶的攻擊，以此延長(zhǎng)其在血清中的半衰期，可使用PCR制備編碼多糖基化多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體將多糖基化位點(diǎn)導(dǎo)入兩個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域之間的相連區(qū)域。在本發(fā)明一特定方面中，按如下操作可將糖基化基序肽序列導(dǎo)入多聯(lián)融合蛋白內(nèi)。使用編碼可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的前導(dǎo)序列和EcoRI限制酶切位點(diǎn)的引物以及反義引物進(jìn)行PCR制備DNA片段，所述反義引物中編碼第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域以及第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域的核苷酸序列的一部分被糖基化基序序列所替代。另一DNA片段可利用引物和反義引物通過(guò)PCR制備，所述引物中，編碼第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域以及第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域的核苷酸序列的一部分被糖基化基序序列所替代，所述反義引物編碼IgG1 Fc部分的3’端以及XbaI限制酶切位點(diǎn)。然后，使用這兩種DNA片段在試管中進(jìn)行第二次PCR。
在本發(fā)明實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域包括TNFR1，TNFR2，CD2和CTLA-4的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。參照附圖，序列表和實(shí)施例將更具體地描述它們的應(yīng)用。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)已知為激素惡液質(zhì)素，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)也已知為淋巴毒素，這兩種因子都是多功能細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥、細(xì)胞免疫應(yīng)答、敗血癥、細(xì)胞毒性、惡液質(zhì)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥相關(guān)疾病(Tartaglia，L.A.等，Immunol.Today 13151，1992)，和抗病毒反應(yīng)(Butler，P.，Peptide Growth Factor II，1990，Springer-Verlag，Berlin，39-70頁(yè))。TNF-α和TNF-β的這些作用，包括細(xì)胞毒性，都源自其與三聚體形式的TNF受體的結(jié)合(Eck，M.J等，J.Biol.Chem.2672119，1992)。作為T(mén)NF受體，55kDa的I型(TNFR1或p55)以及約75kDa的II型(TNFR2或p75)是已知的(Smith，C.A.等，Science 2481019，1990；Loetscher H等，Cell 61351，1990；和Schall等，Cell 61361，1990)。這兩種受體對(duì)TNF-α和TNF-β的親合性類(lèi)似(Schall等，Cell 61361，1990)。通過(guò)抑制TNF-α和TNF-β結(jié)合其在細(xì)胞表面上的受體(已知這可有效減輕TNF依賴(lài)性炎癥)，這兩種可溶性受體的免疫球蛋白融合蛋白對(duì)TNF-α和TNF-β的作用有抑制效果。
在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞表面抗原中，共刺激分子CD2和CTLA-4，誘導(dǎo)二級(jí)刺激以充分激活T細(xì)胞，當(dāng)其為可溶性形式時(shí)，也可根據(jù)與TNF受體相同的方法，將其用于治療各種免疫學(xué)疾病。免疫應(yīng)答是通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的細(xì)胞表面抗原分子與T淋巴細(xì)胞的特異性受體(也就是說(shuō)，T淋巴細(xì)胞與APC的白細(xì)胞功能抗原分子)結(jié)合而完成的，當(dāng)在抗原呈遞期間不產(chǎn)生共刺激信號(hào)作為二級(jí)信號(hào)時(shí)，T淋巴細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡或抑制克隆活化而被去除。CD2是T淋巴細(xì)胞上的白細(xì)胞功能抗原，與APC上的LFA-3結(jié)合，并參與白細(xì)胞的粘附和共刺激，以及通過(guò)與CD28的共刺激而促進(jìn)T細(xì)胞活化。CTLA-4在T淋巴細(xì)胞活化后表達(dá)，其表達(dá)水平在靜止期增加。CTLA-4對(duì)APC的B7分子的親合性比CD28高20倍以上，并在結(jié)合B7后，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)抑制T淋巴細(xì)胞活化。
本發(fā)明一特定方面提供多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc，如SEQ ID NO6所示；還提供多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc，如SEQ ID NO8所示；還提供多聯(lián)融合單體蛋白CD2-CD2/Fc，如SEQ ID NO18所示；以及多聯(lián)融合單體蛋白CTLA4-CTLA4/Fc，如SEQ ID NO20所示。
本發(fā)明另一特定方面提供編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體(TNFR1-TNFR1-IgG)，如SEQ IDNO5所示；編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體(TNFR2-TNFR2-IgG)，如SEQ ID NO7所示；編碼多聯(lián)融合單體蛋白CD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體(CD2-CD2-IgG)，如SEQ ID NO17所示；編碼多聯(lián)融合單體蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體(CTLA4-CTLA4-IgG)，如SEQ ID NO19所示。
本發(fā)明還提供重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-Top10′，其與編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ IDNO5所示；重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-Top10′，其與編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO7所示；重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig，其與編碼多聯(lián)融合單體蛋白CD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO17所示；以及重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig，其與編碼多聯(lián)融合單體蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO19所示。所述重組表達(dá)質(zhì)粒保藏在Korean Culture Center ofMicroorganisms(KCCM)，保藏號(hào)分別為KCCM-10288，KCCM-10291，KCCM-10402，和KCCM-10400。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的條款，將維持KCCM保藏。
本發(fā)明還提供用重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-Top10′轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(如TR11Ig-CHO)，所述質(zhì)粒與編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO5所示；用重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-Top10′轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(如TR22Ig-CHO)，所述質(zhì)粒與編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO7所示；用重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述質(zhì)粒與編碼多聯(lián)融合單體蛋白CD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO17所示；以及用重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述質(zhì)粒與編碼多聯(lián)融合單體蛋白CTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO19所示。用重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-Top10′轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系TR11Ig-CHO以及用重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-Top10′轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系TR22Ig-CHO被保藏在KCCM，其保藏號(hào)分別為KCLRF-BP-00046和KCLRF-BP-00049。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapesttreaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的條款，將維持KCCM保藏。
本發(fā)明還提供含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc，如SEQ ID NO10所示；含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc，如SEQ ID NO12所示；含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCD2-CD2/Fc，如SEQ IDNO22所示；含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc，如SEQ ID NO24所示.
本發(fā)明還提供編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體，如SEQ ID NO9所示；編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體，如SEQ ID NO11所示；編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體，如SEQ ID NO21所示；編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體，如SEQ ID NO23所示。為產(chǎn)生糖基化基序肽，設(shè)計(jì)引物對(duì)(正向和反向引物)這些引物與相應(yīng)于多聯(lián)融合蛋白TNFR/Fc，CD2/Fc和CTLA4/Fc可溶性胞外結(jié)構(gòu)域之間連接區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)，并含有編碼天冬酰胺(N)的密碼子(ATT和AAC)或者編碼絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的密碼子(分別為T(mén)CC；和ACC，ACG和ACA)，多聯(lián)融合蛋白基因中的任何密碼子均可被其替代。當(dāng)設(shè)計(jì)引物時(shí)，可根據(jù)允許核苷酸序列發(fā)生最小替代的條件和每條引物的解鏈溫度(Tw)，從多個(gè)氨基酸序列中選擇其中一個(gè)。
本發(fā)明還提供重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-MG，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO9所示；重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-MG，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO11所示；重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig-MG，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO21所示；以及重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig-MG，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO23所示。所述重組表達(dá)質(zhì)粒保藏在Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)，保藏號(hào)分別為KCCM-10404，KCCM-10407，KCCM-10401，和KCCM-10399。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest treaty on theInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurposes of Patent Procedure)的條款，將維持KCCM保藏。
本發(fā)明還提供由重組表達(dá)質(zhì)粒pTR11Ig-MG轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO9所示；由重組表達(dá)質(zhì)粒pTR22Ig-MG轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgTNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO11所示；由重組表達(dá)質(zhì)粒pCD22Ig-MG轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCD2-CD2/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO21所示；以及由重組表達(dá)質(zhì)粒pCT44Ig-MG轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，該質(zhì)粒與編碼含有糖基化基序肽的多聯(lián)融合單體蛋白mgCTLA4-CTLA4/Fc的DNA構(gòu)建體可操作連接，如SEQ ID NO23所示。
本發(fā)明的多聯(lián)融合二聚蛋白可在培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)染子后從培養(yǎng)基中分離。所述多聯(lián)融合二聚蛋白可參與免疫應(yīng)答，如上表1所示，這樣就可根據(jù)蛋白種類(lèi)將其用作治療劑，診斷試劑以及實(shí)驗(yàn)室工具，其應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。特別地，當(dāng)用作治療劑時(shí)，可按本領(lǐng)域通常的治療有效量應(yīng)用所述多聯(lián)融合二聚蛋白，可以理解可以視多種不同的因素來(lái)改變?cè)摿?，所述因素包括所用化合物的活性，患者的年齡，體重，健康狀況，性別和飲食，給藥時(shí)間、給藥途徑、藥物的組合，以及所預(yù)防或治療的特定疾病的致病狀態(tài)。另外，當(dāng)作為治療劑使用時(shí)，應(yīng)該理解本發(fā)明多聯(lián)融合二聚蛋白可按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的施用參與免疫應(yīng)答的蛋白的常規(guī)方法和途徑應(yīng)用。
參照以下實(shí)施例并結(jié)合附圖，將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。但是，以下實(shí)施例僅為說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。為便于描述本發(fā)明，根據(jù)下述實(shí)施例所制備的DNA構(gòu)建體、重組表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的信息，以及所用引物和保藏號(hào)都總結(jié)在下面的表8和表9中。
表8DNA構(gòu)建體的信息和保藏號(hào)

表9引物信息

實(shí)施例1人TNFRA.制備編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體(圖1和圖5)a.編碼TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段按現(xiàn)有技術(shù)所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法(Holten等，Biotechniques 8528，1990)，構(gòu)建編碼I型人TNF受體(TNFR1，p55)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白G1 Fc片段的融合基因。
使用引物(SEQ ID NO25的核苷酸序列)和反義引物(SEQ IDNO26的核苷酸序列)，通過(guò)PCR構(gòu)建編碼TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段，所述引物具有EcoRI限制酶切位點(diǎn)以及編碼前導(dǎo)序列(SEQ ID NO2的1-20位的氨基酸序列)的序列，所述反義引物具有編碼所述TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(TNFR1-ED)3’端部分區(qū)域以及免疫球蛋白G1(IgG1)鉸鏈區(qū)5’端的序列。該反應(yīng)所用模板cDNA用從健康成人單核細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)提取的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來(lái)構(gòu)建。
健康成人血液抽取后，用RPMI-1640(Gibco BRL，USA)稀釋至1∶1，使用Ficoll-hypaque(Amersham，USA)進(jìn)行密度梯度離心，獲得在頂部形成的T淋巴細(xì)胞層。為得到5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度，用RPMI-1640洗滌細(xì)胞3次，加入含10％胎牛血清(FBS，Gibco BRL，USA)的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入白細(xì)胞凝集素(Pharmacia，USA)，使其濃度為3.5ug/ml，再在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。
使用Tri-Reagent(MRC，USA)mRNA純化試劑盒純化mRNA。首先，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)洗滌2×107的人T淋巴細(xì)胞3次，然后與1ml Tri-Reagent混合幾次，使RNA溶解。向該試管中加入0.2ml氯仿并徹底混合后，將該試管在室溫下(RT)孵育15分鐘，然后在4℃，15000rpm離心15分鐘。將溶液的上部轉(zhuǎn)到1.5ml試管中，加入0.5ml異丙醇，然后在4℃，15000rpm離心15分鐘。棄去上清后，用1ml經(jīng)75％乙醇-25％DEPC(Sigma，USA)處理過(guò)的三蒸水重懸沉淀，然后在4℃，15000rpm離心15分鐘。徹底去除上清并在空氣中干燥去除乙醇?xì)堄嗪?，?0μl經(jīng)DEPC處理的三蒸水重懸RNA。
將2μg純化的mRNA與1μl的oligo dT(dT30，Promega，USA)引物在1.5ml試管中混合為10μM，在70℃加熱2min，冰上冷卻2min，合成初級(jí)cDNA。然后，向該混合物中加入200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promeg，USA)，10μl 5x反應(yīng)緩沖液(250mM Tris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2，和50mM DTT)，1μl dNTP(各10mM，Takara，Japan)和經(jīng)DEPC處理的三蒸水，使總體積為50μl，然后在42℃反應(yīng)1小時(shí)。
b.編碼免疫球蛋白Fc片段的DNA片段使用引物(SEQ ID NO27的核苷酸序列)和反義引物(SEQ IDNO28的核苷酸序列)，通過(guò)PCR構(gòu)建編碼免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段，所述引物具有編碼所述TNFR可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域以及免疫球蛋白G1(IgG1)鉸鏈區(qū)5’端的序列，所述反義引物具有XbaI限制酶切位點(diǎn)以及編碼IgG1 Fc 3’端的序列。該反應(yīng)所用模板cDNA用從恢復(fù)期的未明原因發(fā)熱患者的外周血液細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)抽提的mRNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)構(gòu)建。
c.編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體將如上制備的編碼TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段和編碼免疫球蛋白Fc片段的DNA片段混合在同一試管內(nèi)，誘導(dǎo)共同序列(該序列包括TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端和IgG1鉸鏈區(qū)5’端)間的互補(bǔ)結(jié)合。將該混合物作為模板，使用具有編碼TNFR1 5’端序列的引物(SEQ ID NO25所示序列)和具有編碼IgG1 Fc 3’端序列的另一條引物(SEQ ID NO28所示序列)，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增包括編碼TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段及編碼IgG1 Fc片段的DNA片段的DNA構(gòu)建體。構(gòu)建的基因包括前導(dǎo)序列，以促進(jìn)蛋白在表達(dá)后分泌。
d.克隆編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體將上述的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體用EcoRI和XbaI限制酶切，并將其插入到市售的克隆載體pBluescriptKS II(+)(Stratagene，USA)的EcoRI/XbaI位點(diǎn)進(jìn)行克隆。通過(guò)DNA測(cè)序測(cè)定總編碼區(qū)的序列(SEQ ID NO1)。這樣制備的融合蛋白為簡(jiǎn)單融合單體蛋白，命名為T(mén)NFR1/Fc，圖1所示的橢圓形代表融合基因初級(jí)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。推定的該簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2。
B.制備編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體(圖1和圖5)a.編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段按構(gòu)建TNFR1/Fc的相同方法，構(gòu)建編碼II型人TNF受體(TNFR2，p75)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白G1 Fc片段的融合基因。
使用引物(SEQ ID NO29的核苷酸序列)和反義引物(SEQ IDNO30的核苷酸序列)，通過(guò)PCR構(gòu)建編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段，所述引物具有EcoRI限制酶切位點(diǎn)以及編碼前導(dǎo)序列的序列，所述反義引物具有編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(TNFR2-ED)3’端部分區(qū)域以及免疫球蛋白G1(IgG1)鉸鏈區(qū)5’端的序列。該反應(yīng)所用模板cDNA用從健康成人單核細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)抽提的mRNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)構(gòu)建。
b.編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體將如上所述制備的編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段和編碼免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段混合在同一試管內(nèi)后，誘導(dǎo)共同序列(該序列包括TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端和IgG1鉸鏈區(qū)5’端)間的互補(bǔ)結(jié)合。將該混合物作為模板，使用具有編碼TNFR2 5’端的序列的引物(SEQ ID NO29所示核苷酸序列)和具有編碼IgG1Fc 3’端的序列的另一條引物(SEQ ID NO28所示核苷酸序列)，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增包括編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段及編碼IgG1 Fc片段的DNA片段的DNA構(gòu)建體。構(gòu)建的基因包括前導(dǎo)序列，以促進(jìn)蛋白在表達(dá)后分泌。
c.克隆編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體將上述的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體用EcoRI和XbaI限制酶切，并將其插入到市售的克隆載體pBluescriptKS II(+)(Stratagene，USA)的EcoRI/XbaI位點(diǎn)進(jìn)行克隆。通過(guò)DNA測(cè)序測(cè)定總編碼區(qū)的序列(SEQ ID NO3)。這樣制備的融合蛋白為簡(jiǎn)單融合單體蛋白，命名為T(mén)NFR2/Fc，圖1所示的橢圓形代表融合基因初級(jí)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。推定的該簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4。
C.制備編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體(圖2和圖5)為制備含有多聯(lián)形式的TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合基因，即編碼TNFR1-TNFR1/Fc多聯(lián)融合單體蛋白的構(gòu)建體，利用PCR，將BamHI限制酶切位點(diǎn)分別插入到TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列以及如上構(gòu)建的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體中，然后用連接酶連接BamHI限制酶切產(chǎn)生的每條片段區(qū)域。將如上制備的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體，用作本次反應(yīng)的模板。
分別利用相應(yīng)于SEQ ID NO25核苷酸序列的引物和相應(yīng)于SEQID NO33核苷酸序列的另一條引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增3’端帶有BamHI限制酶切位點(diǎn)的TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的片段；利用相應(yīng)于SEQID NO28核苷酸序列的引物和相應(yīng)于SEQ ID NO32核苷酸序列的另一條引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增5’端帶有BamHI限制酶切位點(diǎn)的TNFR1/Fc簡(jiǎn)單融合單體蛋白的另一片段。加入1μl初級(jí)cDNA，2U Pfu DNA聚合酶(Stratagene，USA)，10μl 10X反應(yīng)緩沖液[200mM Tris-HCl，pH8.75，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgCl2]，1％TritonTMX-100，1mg/ml BSA，3μl引物1(10μM)，3μl引物2(10μM)，2μl dNTP(每種10mM)，補(bǔ)加三蒸水使總體積為100μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下94℃ 5min；95℃ 1min；58℃ 1.5min；72℃ 1min，31個(gè)循環(huán)；并72℃ 15min，使PCR產(chǎn)物延伸完全末端補(bǔ)齊。
在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳后，用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen，USA)純化PCR產(chǎn)物。該純化的PCR產(chǎn)物用BamHI限制酶切，并用苯酚-氯仿抽提方法抽提。然后，用連接酶連接BamHI限制酶切產(chǎn)生的兩種DNA片段。
D.制備編碼TNFR2-TNFR2/Fc多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體(圖2和圖5)當(dāng)利用PCR，將BamHI限制酶切位點(diǎn)分別插入到TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列及上述制備的編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體中后，用連接酶連接BamHI限制酶切產(chǎn)生的每條片段區(qū)域，得到編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體。
利用相應(yīng)于SEQ ID NO34核苷酸序列的引物和相應(yīng)于SEQ IDNO35核苷酸序列的引物，擴(kuò)增3’端帶有BamHI限制酶切位點(diǎn)的TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的片段。如同TNFR1一樣進(jìn)行PCR，只是將如上制備的、編碼SEQ ID NO3的簡(jiǎn)單融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體作為模板。PCR產(chǎn)物用如TNFR1相同的方法純化。
E.編碼帶有糖基化基序的多聯(lián)融合單體蛋白TNFR1-TNFR1/Fc的DNA構(gòu)建體使用反義引物(SEQ ID NO37的核苷酸序列)和另一引物(SEQID NO25的核苷酸序列)，通過(guò)PCR制備DNA片段，所述反義引物具有編碼第一個(gè)TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域(SEQ ID NO5的565-591位核苷酸序列)的序列，但除外TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域連接區(qū)的疏水性多肽區(qū)域的序列(SEQ ID NO6的197-216位氨基酸序列)，還具有編碼第二個(gè)TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域(SEQ ID NO5的649-681位核苷酸序列)的序列，所述另一引物具有編碼EcoRI限制酶切位點(diǎn)以及前導(dǎo)序列的序列。
另外，通過(guò)制備上述引物(SEQ ID NO36和37的核苷酸序列)，插入編碼糖基化位點(diǎn)的總共四條氨基酸序列(SEQ ID NO10的189-191，192-194，198-200和204-206位氨基酸序列)，相應(yīng)于SEQ IDNO5的565-567位核苷酸(CTG，Leu)，574-576(ACG，Thr)，652-654(CTA，Leu)和670-672(AGA，Arg)被核苷酸AAC(Asn，N)替代；SEQ ID NO5的571-573位(TGC，Cys)和580-582(TTG，Leu)位核苷酸被核苷酸ACC(Thr，T)替代；658-660位核苷酸(GAC，Asp)被TCC(Ser，S)替代。
在該反應(yīng)中，編碼多聯(lián)形式的TNFR1-TNFR1/Fc的基因(SEQ IDNO5的核苷酸)被用作模板。在一級(jí)PCR過(guò)程中，反義引物只有一半被誘導(dǎo)與用作模板的、編碼多聯(lián)形式TNFR1-TNFR1/Fc的基因結(jié)合，并且，隨著鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，未與模板結(jié)合的部分在聚合酶的作用下，被誘導(dǎo)形成完整的雙鏈DNA，這樣就能夠產(chǎn)生編碼第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域的5’端序列與編碼TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域包括前導(dǎo)序列的3’端序列之間相連狀態(tài)的DNA片段。所以，編碼第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的5’端序列部分區(qū)域就能夠結(jié)合下述的第二個(gè)DNA片段。
第二個(gè)DNA片段是使用引物(SEQ ID NO36的核苷酸序列)和反義引物(SEQ ID NO28的核苷酸序列)，通過(guò)PCR制備，所述引物具有編碼第一個(gè)TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域(SEQ IDNO5的565-591位核苷酸序列)以及第二個(gè)TNFR1可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域(SEQ ID NO5的649-681位核苷酸序列)的序列，所述反義引物具有編碼XbaI限制酶切位點(diǎn)以及IgG1 Fc 3’端的序列。該反應(yīng)也如上進(jìn)行，即，反義引物僅有一半被誘導(dǎo)與模板結(jié)合，于是象上述一樣DNA片段就具有了編碼TNFR1胞外結(jié)構(gòu)域的5’端包括第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域的序列。
接下來(lái)，將上述PCR制備的兩種DNA片段混合在同一試管內(nèi)，使共同序列之間結(jié)合，并利用引物(SEQ ID NO25和28的核苷酸序列)通過(guò)PCR進(jìn)行融合，所述引物編碼每個(gè)多聯(lián)基因的5’和3’端，產(chǎn)物命名為mgTNFR1-TNFR1-IgG。
F.編碼帶有糖基化基序的多聯(lián)融合單體蛋白TNFR2-TNFR2/Fc的DNA構(gòu)建體使用反義引物(SEQ ID NO39的核苷酸序列)和另一引物(SEQID NO29的核苷酸序列)，通過(guò)PCR制備DNA片段，所述反義引物具有編碼第一個(gè)TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域(SEQ ID NO7的586-606位核苷酸序列)的序列，但除外TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域連接區(qū)的疏水性多肽區(qū)域的序列(SEQ ID NO8的203-263位氨基酸序列)，還具有編碼第二個(gè)TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域(SEQ ID NO7的790-807位核苷酸序列)的序列，所述另一引物具有編碼EcoRI限制酶切位點(diǎn)以及前導(dǎo)序列的序列。
另外，通過(guò)制備上述引物(SEQ ID NO38和39的核苷酸序列)，插入編碼糖基化位點(diǎn)的總共兩條氨基酸序列(SEQ ID NO12的199-201和206-208位氨基酸序列)，相應(yīng)于SEQ ID NO7的595-597位核苷酸(GTC，Val)和799-801位核苷酸(GGG，Gly)被核苷酸AAC(Asn，N)替代。
在該反應(yīng)中，編碼多聯(lián)形式的TNFR2-TNFR2/Fc的基因(SEQ IDNO7的核苷酸)被用作模板。在一級(jí)PCR過(guò)程中，反義引物只有一半被誘導(dǎo)與用作模板的、編碼多聯(lián)形式TNFR2-TNFR2/Fc的基因結(jié)合，并且，隨著鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，未與模板結(jié)合的部分在聚合酶的作用下，被誘導(dǎo)形成完整的雙鏈DNA，這樣就能夠產(chǎn)生編碼第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域部分區(qū)域的5’端序列與編碼TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域包括前導(dǎo)序列的3’端序列之間相連狀態(tài)的DNA片段。所以，編碼第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的5’端序列的部分區(qū)域就能夠結(jié)合下述的第二個(gè)DNA片段。
第二個(gè)DNA片段是使用引物(SEQ ID NO38的核苷酸序列)和反義引物(SEQ ID NO28的核苷酸序列)通過(guò)PCR制備的，所述引物具有編碼第一個(gè)TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域(SEQ IDNO7的586-606位核苷酸序列)以及第二個(gè)TNFR2可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域(SEQ ID NO7的790-807位核苷酸序列)的序列，所述反義引物具有編碼XbaI限制酶切位點(diǎn)以及IgG1 Fc 3’端的序列。該反應(yīng)如上進(jìn)行，即，反義引物僅有一半被誘導(dǎo)與模板結(jié)合，于是象上述一樣的DNA片段就具有了編碼TNFR2胞外結(jié)構(gòu)域的5’端，包括第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分區(qū)域的序列。
接下來(lái)，將上述PCR制備的兩種DNA片段混合在同一試管內(nèi)，使共同序列之間結(jié)合，并利用引物(SEQ ID NO29和28的核苷酸序列)通過(guò)PCR進(jìn)行融合，所述引物編碼每個(gè)多聯(lián)基因的5’和3’端，產(chǎn)物命名為mgTNFR2-TNFR2-IgG。
G.克隆編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR-TNFR/Fc及其糖基化形式的DNA構(gòu)建體將如上所述的編碼多聯(lián)融合單體蛋白TNFR-TNFR/Fc及其糖基化形式的DNA構(gòu)建體插入到pBluescript KS II(+)(Stratagen，USA)的EcoRI/XbaI位點(diǎn)而進(jìn)行克隆。這樣獲得的融合蛋白中，多聯(lián)融合單體蛋白被命名為T(mén)NFR1-TNFR1/Fc和TNFR2-TNFR2/Fc，其糖基化形式被命名為mgTNFR1-TNFR1/Fc和mgTNFR2-TNFR2/Fc。推定的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO6，8，10和12。
將10μg用作載體的pBluescript KS II(+)(Stratagen，USA)與15UEcoRI，15U XbaI，5μl 10X反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.5，100mM MgCl2，10mM DTT，500nM NaCl)，5μl 0.1％的BSA(Takara，Japan)混合，加入三蒸水補(bǔ)足體積到50μl，在37℃下孵育2小時(shí)，對(duì)DNA進(jìn)行限制酶切。在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳后，用Qiaex II凝膠抽提試劑盒(Qiagen，USA)純化PCR產(chǎn)物。
將100ng經(jīng)過(guò)了EcoRI和XbaI限制酶切的pBluescript KS II(+)(Stratagen，USA)與20ng經(jīng)過(guò)所述限制酶切的PCR產(chǎn)物，0.5U T4DNA連接酶(Amersham，USA)，1μl 10X反應(yīng)緩沖液(300mMTris-HCl，pH7.8，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP)混合，加入三蒸水補(bǔ)足體積到10μl，在16℃水浴孵育混合物16小時(shí)。用氯化銣(RbCl，Sigma，USA)方法將E.coli Top10(Novex，USA)制備成感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素(Sigma，USA)的固體LB培養(yǎng)基上，并在37℃孵育16小時(shí)。將形成的菌落接種到4ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，并在37℃孵育16小時(shí)。根據(jù)Sambrook等人(Molecular cloning，Cold SpringHarbor Laboratory出版，p1.25-1.31，p1.63-1.69，p7.26-7.29，1989)的堿裂解法，從1.5ml上述孵育培養(yǎng)液純化質(zhì)粒，用EcoRI和XbaI限制酶切證實(shí)克隆的存在。
如下所述，用雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，745483，1977)鑒定總編碼區(qū)的序列。使用上述堿裂解法純化的質(zhì)粒和SequenaseTMver 2.0(Amersham，USA)，根據(jù)手冊(cè)進(jìn)行DNA測(cè)序反應(yīng)。當(dāng)上述的反應(yīng)混合物被加樣到6％的聚丙烯酰胺凝膠上后，以1800-2000V的恒定電壓，在50℃電泳2小時(shí)，凝膠變干后，通過(guò)曝光于X-射線底片(Kodak，USA)鑒定DNA序列。
實(shí)施例2和3CD2和CTLA4通過(guò)PCR，使用引物[CD2(SEQ ID NO40的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO43的核苷酸序列)]和反義引物[CD2(SEQ IDNO41的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO44的核苷酸序列)]，構(gòu)建編碼CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段，其中所述引物具有EcoRI限制酶切位點(diǎn)及編碼前導(dǎo)序列[CD2(SEQ ID NO14的1-24位氨基酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO16的1-21位氨基酸序列)]的編碼序列[CD2(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ IDNO15的核苷酸序列)]，所述反義引物具有PstI限制酶切位點(diǎn)和編碼上述蛋白可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端的序列[CD2(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO15的核苷酸序列)]。該反應(yīng)的模板cDNA用從健康成人單核細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)抽提的mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)制備。
同樣，使用帶有PstI限制酶切位點(diǎn)以及IgG1恒定區(qū)5’端編碼序列的引物(SEQ ID NO42的核苷酸序列)，和帶有XbaI限制酶切位點(diǎn)以及IgG1 Fc 3’端編碼序列的反義引物(SEQ ID NO28的核苷酸序列)，通過(guò)PCR來(lái)構(gòu)建編碼免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA構(gòu)建體。該反應(yīng)所用模板cDNA用從恢復(fù)期的未明原因發(fā)熱患者的外周血液細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)抽提的mRNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)制備。
接下來(lái)，用PstI對(duì)如上述制備的編碼CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段以及編碼免疫球蛋白G1 Fc片段的DNA片段進(jìn)行限制酶切，然后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建簡(jiǎn)單二聚形式的CD2/Fc和CTLA4/Fc基因。構(gòu)建的基因含有前導(dǎo)序列以促進(jìn)蛋白在表達(dá)后分泌。
上述的DNA構(gòu)建體用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XbaI進(jìn)行限制酶切，并插入到市售克隆載體pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)的EcoRI/XbaI位點(diǎn)，進(jìn)行克隆。進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)鑒定整個(gè)編碼區(qū)的序列(SEQ ID NO13和15)。這些所產(chǎn)生的融合蛋白被命名為CD2/Fc和CTLA4/Fc，其推定的氨基酸序列相應(yīng)于SEQ ID NO14和16。
加入1μl初級(jí)cDNA，2U Pfu DNA聚合酶 (Stratagene，USA)，10μl 10X反應(yīng)緩沖液[200mM Tris-HCl，pH8.75，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgCl2]，1％TritonTMX-100，1mg/ml BSA，3μl引物1(10μM)，3μl引物2(10μM)，2μl dNTP(每種10mM)，補(bǔ)加三蒸水使總體積為100μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下94℃ 5min；95℃ 1min；58℃ 1.5min；72℃ 1min，31個(gè)循環(huán)；并72℃ 15min，使PCR產(chǎn)物延伸完全末端補(bǔ)齊。
多聯(lián)形式的CD2-CD2/Fc和CTLA4-CTLA4/Fc融合基因如下構(gòu)建。
為制備含有多聯(lián)形式的CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合基因，利用連接酶進(jìn)行平頭末端連接，使用PstI限制性?xún)?nèi)切酶和T4DNA連接酶，將CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域序列插入到帶有平頭末端的簡(jiǎn)單二聚體形式融合基因的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白之間的連接區(qū)。具體而言，通過(guò)PCR，使用引物[CD2(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO48的核苷酸序列)]和反義引物[CD2(SEQ ID NO46)和CTLA4(SEQ ID NO48)]，構(gòu)建DNA構(gòu)建體，其中所述引物具有編碼可溶性胞外結(jié)構(gòu)域前導(dǎo)序列末端[CD2(SEQ ID NO14的25位氨基酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO16的22位氨基酸序列)]的編碼序列[CD2(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO15的核苷酸序列)]，所述反義引物具有編碼上述可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端的序列[CD2(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4(SEQ ID NO15的核苷酸序列)]。將上述的簡(jiǎn)單融合單體基因[CD2/Fc(SEQ ID NO13的核苷酸序列)和CTLA4/Fc(SEQ ID NO15的核苷酸序列)]用作該反應(yīng)的模板。
此外，CD2/Fc和CTLA4/Fc，以簡(jiǎn)單單體形式被插入到pBluescript KS II(+)中，使用限制性?xún)?nèi)切酶PstI將其制備成具有3’突出端。用T4 DNA聚合酶處理，使3’突出端的切頭端部分缺失，以形成平頭末端。為制備可溶性胞外結(jié)構(gòu)域多聯(lián)體形式的融合基因，將上述PCR制備的CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域插入處理成平頭末端的簡(jiǎn)單單體基因的切頭中，進(jìn)行克隆。這些所產(chǎn)生的融合蛋白被命名為CD2-CD2/Fc和CTLA4-CTLA4/Fc，為多聯(lián)融合單體蛋白的形式，其推定的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO18和20。
多糖基化形式的多聯(lián)融合基因如下構(gòu)建。
使用引物(該引物包括EcoRI限制酶切位點(diǎn)和帶前導(dǎo)序列的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域)，以及反義引物(該反義引物具有編碼多聯(lián)形式融合基因第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分和帶有糖基化基序替代核苷酸的第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分的序列)，通過(guò)PCR制備得到DNA片段；再使用引物(該引物具有編碼多聯(lián)形式融合基因第一個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域3’端部分和帶有糖基化基序替代核苷酸的第二個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域5’端部分區(qū)域的序列)，以及反義引物(該反義引物具有編碼免疫球蛋白G1 Fc片段3’端的序列和XbaI限制酶切位點(diǎn))，通過(guò)PCR制備得到另一DNA片段，將上述得到的兩種DNA片段混合在同一試管內(nèi)，通過(guò)二級(jí)PCR插入糖基化基序。
至于多聯(lián)融合基因CD2/Fc和CTLA4/Fc，是根據(jù)上述TNFR/Fc相同的方法，使用修飾的引物，通過(guò)PCR插入糖基化基序，但是其與TNFR/Fc的差別在于與CD2和CTLA4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的氨基酸序列保持不變。
在CD2/Fc和CTLA4/Fc多聯(lián)融合蛋白的多糖基化過(guò)程中，CD2/Fc是使用制備的引物，通過(guò)插入總共2個(gè)糖基化基序肽區(qū)域(SEQ ID NO22的200-202和206-208位氨基酸序列)而完成，所述制備的引物中SEQ ID NO17的598-600(CCT，Pro)和616-618(GAG，Glu)位核苷酸被AAT(Asn，N)替代，而CTLA4/Fc是使用制備的引物(SEQ IDNO51和52)，通過(guò)插入總共3個(gè)糖基化基序肽區(qū)域(SEQ ID NO24的136-138，142-144，和147-149位氨基酸序列)而完成，所述制備的引物中SEQ ID NO19的403-405(GTA，Val)和424-426(CCA，Pro)位核苷酸被AAT(Asn，N)替代；409-411(GAT，Asp)和445-447(GTG，Val)位核苷酸被ACA(Thr，T)和ACG(Thr，T)替代。這樣產(chǎn)生的融合蛋白被命名為mgCD2-CD2/Fc和mgCTLA4-CTLA4/Fc，為多聯(lián)融合單體蛋白，其推定的氨基酸序列分別相應(yīng)于SEQ ID NO22和24。
實(shí)施例4TNFR/Fc簡(jiǎn)單/多聯(lián)融合二聚蛋白的表達(dá)和純化為在CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCL-61，卵巢，中國(guó)倉(cāng)鼠，灰倉(cāng)鼠(Cricetulus griseus))中表達(dá)融合蛋白，從轉(zhuǎn)化的E.coli中純化含有TNFR/Fc融合基因的pBluescript KS II(+)質(zhì)粒DNA，將利用EcoRI和XbaI限制酶切作用產(chǎn)生的TNFR/Fc片段插入動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCRTM3(Invitrogen，USA)質(zhì)粒的EcoRI/XbaI位點(diǎn)中，構(gòu)建動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。將其命名為質(zhì)粒pTR11-Top 10’和質(zhì)粒pTR22-Top 10’，并于2001年7月10日保藏在Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)，保藏號(hào)分別為KCCM 10288和KCCM 10291。
將含有上述TNFR/Fc融合基因的質(zhì)粒pTR11-Top 10’或質(zhì)粒pTR22-Top 10’DNA與LipofenctaminTM試劑(Gibco BRL，USA)混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1-3×105細(xì)胞/孔的CHO-K1細(xì)胞被接種在6孔組織培養(yǎng)板(Nunc，USA)上，在10％FBS-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至50-80％，然后將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體和2-25μl LipofenctaminTM試劑(GibcoBRL，USA)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中不含血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，所述復(fù)合體與1-2μg含有上述TNFR/Fc融合基因的質(zhì)粒pTR11-Top 10’或質(zhì)粒pTR22-Top 10’DNA反應(yīng)了15-45min。培養(yǎng)5小時(shí)后，加入帶有20％血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞18-24小時(shí)。初次轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在含1.5mg/ml Geneticin(G418，Gibco BRL，USA)的10％FBS-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，篩選形成的菌落，用于擴(kuò)增培養(yǎng)。使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(KPL，USA)，利用ELISA分析融合蛋白的表達(dá)。
ELISA如下進(jìn)行。首先，用0.1M碳酸氫鈉將1mg/ml過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(KPL，USA)稀釋到1∶2000，然后向96孔柔性板(Falcon，USA)中等份加入100μl該稀釋液，并用塑料膜密封，然后在4℃孵育超過(guò)16小時(shí)，使其包被到板的表面。然后，用洗滌緩沖液(0.1％Tween-20在1×PBS中)和稀釋緩沖液(48.5ml1×PBS，1.5mlFBS，50ul Tween-20)洗滌3次，再將其等分為180l。向第一個(gè)孔中滴入20μl培養(yǎng)上清液后，使用微量移液管將其連續(xù)稀釋?zhuān)瑢?.01μg/μl的人免疫球蛋白G(Sigma，USA)作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染CHO K-1細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，將其同樣稀釋。稀釋后，用鋁箔包裹96孔ELISA板(Falcon，USA)，并在37℃孵育1.5小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌三次。用稀釋緩沖液以1∶5000稀釋結(jié)合過(guò)氧化物酶的山羊抗人IgG(KPL，USA)，等分100μl，用鋁箔包裹，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，將板洗滌三次，使用TMB微孔過(guò)氧化物酶底物體系(KPL，USA)顯色，使用微板讀板器(Bio-Rad，Model 550，Japan)測(cè)定655nm波長(zhǎng)下的吸光度，以檢驗(yàn)是否存在表達(dá)。
上述制備的轉(zhuǎn)染子被命名為T(mén)R11Ig-CHO和TR22Ig-CHO，并于2001年7月7日保藏在Korea Cell Line Research Foundation(KCLRF)，保藏號(hào)分別為KCLRF-BP-00046和KCLRF-BP-00049。為純化上述轉(zhuǎn)染子所產(chǎn)生的蛋白，使這些轉(zhuǎn)染子適應(yīng)一種不含血清的培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(Gibco BRL，USA)，具體過(guò)程如下。將3×105細(xì)胞接種到6孔板上，在5％CO2，37℃下培養(yǎng)超過(guò)16小時(shí)，使其粘附，在顯微鏡下檢查，約有30-50％的板面積被細(xì)胞覆蓋，然后將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由10％FBS DMEM和CHO-S-SFM II構(gòu)成，比例為8∶2。當(dāng)以該比例培養(yǎng)連續(xù)傳代3次后，以6∶4的比例培養(yǎng)3次；以4∶6培養(yǎng)3次；3∶7培養(yǎng)3次，以2∶8培養(yǎng)3次；1∶9培養(yǎng)3次；最終在100％的CHO-S-SFM II培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)ELISA檢測(cè)表達(dá)水平。
當(dāng)在CHO-S-SFM II中大規(guī)模培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，200Xg離心含各種融合蛋白的上清液12分鐘，以去除細(xì)胞碎屑，通過(guò)使用HiTrap蛋白A柱(Amersham，USA)的方法，如下所述純化蛋白。將20mM磷酸鈉(pH7.0，Sigma，USA)以1ml/min的速度過(guò)柱2min，將10ml上清以相同的速度過(guò)柱，使融合蛋白與蛋白A結(jié)合。將20mM磷酸鈉(pH7.0)以相同的速度過(guò)柱2min，進(jìn)行洗滌，然后將0.1M檸檬酸(pH3.0，Sigma，USA)以相同的速度過(guò)柱3min，將500μl提取物連續(xù)分部收集到1.5ml試管中。使用1M Tris(pH11.0，USB，USA)將其調(diào)節(jié)至pH7.0，按上述的ELISA檢驗(yàn)試管中是否存在融合蛋白。用Centricon 30(Amicon，USA)，以2000Xg在4℃離心30min，使純化蛋白濃縮。
實(shí)施例5純化的TNFR1-TNFR1/Fc和TNFR2-TNFR2/Fc的SDS-PAGE(圖15)利用SDS-PAGE方法，在加入還原劑(其破壞二硫鍵)DTT而形成的還原條件以及不含DTT的非還原條件下，將利用蛋白A柱純化的蛋白進(jìn)行電泳。表10中顯示了SDS-PAGE上分子量的估算結(jié)果?？梢宰C實(shí)TNFR/Fc蛋白是以二聚體的形式存在于細(xì)胞中。從TNFR1-TNFR1-Ig的氨基酸序列推導(dǎo)出的分子量為約70kDa，而在SDS-PAGE中估計(jì)為約102kDa?？蓪⑦@種差異視為糖蛋白電泳所產(chǎn)生的普通現(xiàn)象，該特征似乎是糖基化位點(diǎn)降低了電泳遷移率而致。
表10.SDS-PAGE中TNFR-TNFR/Fc的分子量

實(shí)施例6簡(jiǎn)單/多聯(lián)融合二聚TNFR/Fc融合蛋白對(duì)TNFα和TNFβ細(xì)胞毒性的中和作用實(shí)驗(yàn)L929細(xì)胞[ATCC，Mus musculus(小鼠)，NCTC克隆929(來(lái)自L株；L-929；L細(xì)胞)用于測(cè)試TNFR/Fc融合蛋白對(duì)TNFα和TNFβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用。該分析是基于TNFR具有抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的活性(Scallon等，Cytokine 7759，1995)。
將L929以3×104細(xì)胞/孔的量接種在96孔板內(nèi)，并在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24小時(shí)。然后加入放線菌素D(Sigma，USA)使其濃度為3μg/ml，將細(xì)胞與TNFα和TNFβ以及連續(xù)10次稀釋的TNFR試樣共同孵育16-18小時(shí)，其中TNFα和TNFβ的濃度為表達(dá)100％細(xì)胞毒性(0.5-2ng/ml)。然后，用染色試劑結(jié)晶紫(Wako Pure ChemicalIndustries，Japan)染色96孔板內(nèi)的細(xì)胞，使用分光光度計(jì)(Bio-Rad，Model-550，Japan)，利用在595nm波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)估算細(xì)胞活性。
表11顯示了每種TNFR/Fc融合蛋白的IC50，多聯(lián)融合蛋白(TNFR1-TNFR1/Ig和TNFR2-TNFR2/Ig)顯示出對(duì)兩種TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用比簡(jiǎn)單二聚融合蛋白(TNFR1/Ig和TNFR2/Ig)的抑制作用強(qiáng)。同樣，比較現(xiàn)有的簡(jiǎn)單融合二聚體和本發(fā)明多聯(lián)形式TNFR/Fc融合蛋白二聚體對(duì)TNFα(圖16)和TNFβ(圖17)細(xì)胞毒性的抑制作用，更清楚地顯示出本發(fā)明多聯(lián)形式TNFR/Fc融合蛋白二聚體顯著地抑制TNFα和TNFβ的細(xì)胞毒性。
表11.對(duì)細(xì)胞毒性抑制作用的IC50

實(shí)施例7簡(jiǎn)單/多聯(lián)融合二聚體CD2/Fc融合蛋白和CTLA4/Fc融合蛋白對(duì)活性免疫細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)WT100B1S，一種B淋巴細(xì)胞系，是通過(guò)用Ebstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染不明原因發(fā)熱患者B淋巴細(xì)胞而制備得到，將該細(xì)胞接種在補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640中，用作T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞。2000rpm離心2min使其沉淀后，將該細(xì)胞重懸在補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640中，使?jié)舛冗_(dá)到5.0×105細(xì)胞/ml，然后接受3000rd γ-射線照射。
使用Ficoll-hypaque(Amersham，USA)從健康成人血液中分離T淋巴細(xì)胞，然后培養(yǎng)在補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640中，使其濃度達(dá)到2.0×106細(xì)胞/ml。
為進(jìn)行初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，將各15ml的WT100B1S和T淋巴細(xì)胞混合到150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天，然后加入15ml補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)3天。經(jīng)過(guò)了總共6天的培養(yǎng)后，使用上述的Ficoll-hypaque(Amersham，USA)純化活T淋巴細(xì)胞，用含有45％FBS，45％RPMI 1640和10％DMSO的培養(yǎng)基，將純化的T淋巴細(xì)胞冷凍后保藏在液氮中。
初次MLR反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞被解凍以進(jìn)行二次MLR，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，并用補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640將其制備成細(xì)胞濃度為3.0×105細(xì)胞/ml的懸液。
用上述方法重新培養(yǎng)用作為抗原呈遞細(xì)胞的WT100B1S，然后接受3000rd γ-射線的照射，用補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640制備成7.5×104細(xì)胞/ml的懸液。向96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μl制備的WT100B1S，并與CD2/Fc和CTLA4/Fc融合蛋白混合，所述蛋白終濃度為10，1，10-1，10-2，10-3和10-4μg/ml，加入100μl上述初次MLR反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞。在5％CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2天后，加入100μl補(bǔ)充10％FBS的RPMI 1640并繼續(xù)孵育2天。在總共6天孵育的最后6個(gè)小時(shí)內(nèi)，加入1.2μCi/ml3H-胸苷(Amersham，USA)與細(xì)胞共同孵育。
培養(yǎng)結(jié)束后，將96孔板在4℃，110Xg離心10min，沉淀T淋巴細(xì)胞，去除上清，并用200μl 1XPBS洗滌沉淀。在相同的條件下離心，去除PBS，然后加入200μl冰冷的三氯乙酸(TCA，Merck，USA)，混合2min，然后在4℃下反應(yīng)5min以去除3H-胸苷殘余。
上述相同條件下離心后，去除上清，加入200μl冰冷的70％乙醇，在4℃孵育5min，使T淋巴細(xì)胞固定。離心后去除上清，用上述相同的10％TCA處理方法徹底去除3H-胸苷(Amersham，USA)殘余。
與100μl 2％ SDS(pH8.0)和0.5N NaOH在37℃反應(yīng)30min，進(jìn)行細(xì)胞溶解，在25℃，110Xg離心10min，沉淀T淋巴細(xì)胞，然后將50μl上清轉(zhuǎn)移到96孔樣品板(Wallac，USA)。向上清中加入1.5體積的OptiPhase SuperMix(Wallac，USA)，并混合5min，使用1450MicroBeta TriLux微量板液體閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac，USA)，測(cè)定3H的cpm值，檢驗(yàn)是否存在T淋巴細(xì)胞增殖。
實(shí)施例8小鼠中糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白對(duì)延長(zhǎng)血漿半衰期的作用實(shí)驗(yàn)將5μg純化的融合蛋白腹腔內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)(ICR，Samtako，Korea)，并以最大周期120小時(shí)(5天)的定時(shí)間隔抽取血液，通過(guò)ELISA測(cè)定蛋白的濃度，測(cè)定糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白[mgTNFR1-TNFR1/Fc]2，[mgTNFR2-TNFR2/Fc]2，[mgCD2-CD2/Fc]2，和[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2的血漿半衰期。如圖20，圖21和圖22所示，可以看出糖基化多聯(lián)融合二聚蛋白的血漿半衰期高于相應(yīng)的天然形式簡(jiǎn)單融合二聚蛋白，從而可預(yù)期持續(xù)的作用會(huì)提高其效力。
實(shí)施例9簡(jiǎn)單/多聯(lián)TNFR/Fc融合蛋白二聚體對(duì)DBA/1小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的作用實(shí)驗(yàn)給每只DBA/1小鼠尾部注射100μg以2mg/ml濃度溶解在0.05M醋酸中的II型膠原和Arthrogen-CIA佐劑(Chondrex，USA)，使其形成膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)。使用不完全弗氏佐劑(Difco，USA)在3周后進(jìn)行加強(qiáng)。
用100μgII型膠原免疫DBA/1小鼠后3-4周形成關(guān)節(jié)炎。發(fā)病后3-5天觀察到小鼠紅腫腳爪，炎性關(guān)節(jié)炎持續(xù)超過(guò)3-4周。盡管最終炎癥有所緩解，損傷的關(guān)節(jié)永久保持僵硬。在表12的基礎(chǔ)上，每周測(cè)定2-3次關(guān)節(jié)炎的程度，表12顯示關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的主觀指數(shù)(每次實(shí)驗(yàn)測(cè)定平均5只小鼠)。為測(cè)定簡(jiǎn)單和多聯(lián)融合二聚TNFR/Fc對(duì)CIA的作用，將TNFR/Fc或PBS腹腔內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)。每次實(shí)驗(yàn)中，將TNFR/Fc以每2天10μg的量在19-45天注射5只小鼠(圖23中的箭頭)。向5只小鼠注射PBS作為對(duì)照。如圖7所示，可看出，對(duì)小鼠注射現(xiàn)有的簡(jiǎn)單二聚形式TNFR/Fc融合蛋白的效果比作為對(duì)照的PBS注射的小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低約26-38％，而注射了多聯(lián)形式二聚體[TNFR1-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2的小鼠則降低了42-55％。所以，可以看出多聯(lián)融合二聚TNFR/Fc融合蛋白相比于現(xiàn)有的簡(jiǎn)單融合二聚TNFR/Fc融合蛋白，顯著地降低小鼠關(guān)節(jié)炎。
表12.關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度評(píng)分

以上的結(jié)果顯示多聯(lián)形式的二聚TNFR/Fc融合蛋白對(duì)降低CIA的發(fā)展速度比現(xiàn)有的簡(jiǎn)單融合蛋白更加有效，所以，在應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)炎方面，多聯(lián)形式的蛋白組合物會(huì)比現(xiàn)有的蛋白組合物更加有效。
本發(fā)明的多聯(lián)蛋白，多聯(lián)融合二聚蛋白及其糖基化蛋白能夠提高效力，并具有高穩(wěn)定性，能夠高產(chǎn)量地生產(chǎn)。
工業(yè)實(shí)用性序列表<110>MeDexGen Inc.
CHUNG，Yong HoonHAN，Ji WoongLEE，Hye JaCHOI，Eun YongKIM，Jin MiYIM，Soo Bin<120>通過(guò)多聯(lián)體化制備Ig-融合蛋白的方法，由該方法制備的TNFR/Fc、CD2/Fc、CTLA4/Fc融合蛋白，編碼所述蛋白的DNA，包括所述DNA的載體，和由載體TOR轉(zhuǎn)化的細(xì)胞<160>52<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1335<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1332)<223>TNFR1-IgG<220>
<221>C_region<222>(634)..(1335)<223>鉸鏈，CH2，CH3區(qū)<220>
<221>misc_signal<222>(160)..(168)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)
<220>
<221>misc_signal<222>(433)..(441)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(451)..(459)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(15)<223>PCR引物SEQ ID25結(jié)合位點(diǎn)<220>
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<221>sig_peptide<222>(1)..(60)<223>信號(hào)肽
<400>1atg ggc ctc tcc acc gtg cct gac ctg ctg ctg ccg ctg gtg ctc ctg 48Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu1 5 10 15gag ctg ttg gtg gga ata tac ccc tca ggg gtt att gga ctg gtc cct 96Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro20 25 30cac cta ggg gac agg gag aag aga gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa 144His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys35 40 45tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa 192Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys50 55 60gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac 240Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp65 70 75 80tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc ttc acc gct tca gaa aac cac ctc 288Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu85 90 95aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa atg ggt cag gtg 336Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val100 105 110gag atc tct tct tgc aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg 384Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg115 120 125aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe130 135 140aat tgc agc ctc tgc ctc aat ggg acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag 480
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu145 150 155 160aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc cat gca ggt ttc ttt cta aga gaa 528Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu165 170 175aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg 576Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr180 185 190aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc act gag gac tca 624Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser195 200 205ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca 672Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro210 215 220ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc 720Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe225 230 235 240ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 768Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 816Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe260 265 270aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 864Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc 912Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 960
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc 1008Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala325 330 335aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 1056Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 1104Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 360 365ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 1152Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1200Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1248Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1296Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Mst His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1335Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440<210>2<211>444<212>PRT<213>智人
<400>2Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu1 5 10 15Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro20 25 30His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys35 40 45Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys50 55 60Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp65 70 75 80Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu85 90 95Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val100 105 110Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg115 120 125Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe130 135 140Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu145 150 155 160Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu165 170 175Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr180 185 190Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser195 200 205
Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro210 215 220Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe225 230 235 240Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255Thr Cys Val Val Val Asp Val Sar His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe260 265 270Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala325 330 335Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 360 365Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430Tyr Thr Gln Lye Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys435 440<210>3<211>1473<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1470)<223>TNFR2-IgG<220>
<221>C_region<222>(772)..(1473)<223>鉸鏈，CH2，CH3區(qū)<220>
<221>misc_signal<222>(511)..(519)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(577)..(585)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
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<220>
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Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys50 55 60gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac 240Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp65 70 75 80agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt 288Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys85 90 95ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg 336Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg100 105 110gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg 384Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu115 120 125agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc 432Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg130 135 140ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg 480Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val145 150 155 160tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr165 170 175gat att tgc agg ccc cac cag atc tgt aac gtg gtg gcc atc cct ggg 576Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly180 185 190aat gca agc atg gat gca gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt 624Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser195 200 205atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser210 215 220caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser225 230 235 240ttc ctg ctc cca atg ggc ccc agc ccc cca gct gaa ggg agc act ggc 768Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly245 250 255gac gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 816Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys260 265 270cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 864Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro275 280 285aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 912Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys290 295 300gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 960Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp305 310 315 320tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 1008Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu325 330 335gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1056Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu340 345 350cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1104His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn355 360 365aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 1152
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly370 375 380cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 1200Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu385 390 395 400ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1248Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr405 410 415ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1296Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn420 425 430aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tcc ttc 1344Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe435 440 445ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1392Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn450 455 460gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cactac acg 1440Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr465 470 475 480cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1473Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490<210>4<211>490<212>PRT<213>智人<400>4Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr20 25 30Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln35 40 45Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys50 55 60Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp65 70 75 80Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys85 90 95Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg100 105 110Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu115 120 125Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg130 135 140Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val145 150 155 160Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr165 170 175Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly180 185 190Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser195 200 205Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser225 230 235 240Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly245 250 255Asp Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys260 265 270Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro275 280 285Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys290 295 300Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp305 310 315 320Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu325 330 335Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu340 345 350His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn355 360 365Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly370 375 380Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu385 390 395 400Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr405 410 415Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn420 425 430Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe
435 440 445Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn450 455 460Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr465 470 475 480Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490<210>5<211>1887<212>DNA<213>智人<220>
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<221>C_region<222>(1716)..(1887)<223>鉸鏈，CH2，CH3區(qū)<220>
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<220>
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acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe35 40 45caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa aaa act tca gac 192Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp50 55 60aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag act ttc aag gaa 240Lys Lys Lys Ils Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu65 70 75 80aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg aaa att aag cat 288Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His85 90 95ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr100 105 110aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu115 120 125agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu130 135 140acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln145 150 155 160gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp165 170 175acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val180 185 190
agc aag gaa tcc agt gtc gag aat gtc agc tgt cct aaa aat att acg 624Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Asn Val Ser Cys Pro Lys Asn Ile Thr195 200 205aat gcc ttg gaa acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac 672Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp210 215 220att cct agt ttt caa atg agt gat gat att gac gat ata aaa tgg gaa 720Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu225 230 235 240aaa act tca gac aag aaa aag att gca caa ttc aga aaa gag aaa gag 768Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu245 250 255act ttc aag gaa aaa gat aca tat aag cta ttt aaa aat gga act ctg 816Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu260 265 270aaa att aag cat ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca 864Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser275 280 285ata tat gat aca aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg 912Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu290 295 300aag att caa gag agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc 960Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile305 310 315 320aac aca acc ctg acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta 1008Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu325 330 335aac ctg tat caa gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc 1056Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile340 345 350
aca cac aag tgg acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca 1104Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala355 360 365ggg aac aaa gtc agc aag gaa tcc agt gtc gag cct gtc agc tgt cct 1152Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro370 375 380gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 1200Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro385 390 395 400gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 1248Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys405 410 415ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 1296Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val420 425 430gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 1344Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr435 440 445gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 1392Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu450 455 460cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac 1440Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His465 470 475 480cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 1488Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys485 490 495gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 1536Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln500 505 510
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 1584Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu515 520 525acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 1632Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro530 535 540agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 1680Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn545 550 555 560tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1728Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu565 570 575tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1776Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val580 585 590ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1824Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln595 600 605aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1854Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys610 615<210>22<211>617<212>PRT<213>智人<400>22Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn1 5 10 15Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe35 40 45Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp50 55 60Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu65 70 75 80Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His85 90 95Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr100 105 110Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu115 120 125Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu130 135 140Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln145 150 155 160Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp165 170 175Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val180 185 190Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Asn Val Ser Cys Pro Lys Asn Ile Thr195 200 205Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp210 215 220Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu225 230 235 240
Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu245 250 255Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu260 265 270Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser275 280 285Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu290 295 300Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile305 310 315 320Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu325 330 335Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile340 345 350Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala355 360 365Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro370 375 380Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro385 390 395 400Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys405 410 415Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val420 425 430Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr435 440 445
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu450 455 460Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His465 470 475 480Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys485 490 495Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln500 505 510Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu515 520 525Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro530 535 540Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn545 550 555 560Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu565 570 575Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val580 585 590Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln595 600 605Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys610 615<210>23<211>1509<212>DNA<213>智人<220>
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<221>misc_signal<222>(385)..(393)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(403)..(411)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(424)..(432)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(439)..(447)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)
<220>
<221>misc_signal<222>(664)..(672)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>misc_signal<222>(760)..(768)<223>N-連接的糖基化位點(diǎn)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(15)<223>PCR引物SEQ ID43結(jié)合位點(diǎn)<220>
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<221>primer_bind<222>(397)..(460)<223>PCR引物SEQ ID51結(jié)合位點(diǎn)<220>
<221>primer_bind<222>(784)..(813)<223>PCR引物SEQ ID44(反義)結(jié)合位點(diǎn)<220>
<221>primer_bind<222>(805)..(826)
<223>PCR引物SEQ ID42結(jié)合位點(diǎn)<220>
<221>primer_bind<222>(1486)..(1509)<223>PCR引物SEQ ID28(反義)結(jié)合位點(diǎn)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(63)<223>信號(hào)肽<400>23atg agg acc tgg ccc tgc act ctc ctg ttt ttt ctt ctc ttc atc cct 48Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro1 5 10 15gtc ttc tgc aaa gca atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc 96Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala20 25 30agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc 144Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly35 40 45aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag 192Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln A la Asp Ser Gln50 5560gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr65 70 75 80ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val85 90 95
aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile100 105 110tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly115 120 125aac gga acc cag att tat gta aat gat aca gaa ccg tgc aat gat tcg 432Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Asn Asp Thr Glu Pro Cys Asn Asp Ser130 135 140gat aac aat cac acg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc agc agc cga 480Asp Asn Asn His Thr Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg145 150 155 160ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc aaa gcc act 528Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr165 170 175gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag gtg act gaa 576Glu Val Arg Va1 Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu180 185 190gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc ttc cta gat 624Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp195 200 205gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg aac ctc act 672Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr210 215 220atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg 720Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val225 230 235 240gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc 768Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr245 250 255
cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct gca gag ccc 816Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro260 265 270aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 864Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu275 280 285ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 912Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp290 295 300acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 960Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp305 310 315 320gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 1008Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly325 330 335gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 1056Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn340 345 350agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac cag gac tgg 1104Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp355 360 365ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1152Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro370 375 380gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1200Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu385 390 395 400cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1248Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn405 410 415
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1296Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile420 425 430gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1344Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr435 440 445acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1392Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys450 455 460ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1440Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys465 470 475 480tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1488Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu485 490 495tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1509Ser Leu Ser Pro Gly Lys500<210>24<211>502<212>PRT<213>智人<400>24Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro1 5 10 15Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala20 25 30Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly35 40 45
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln50 55 60Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr65 70 75 80Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val85 90 95Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile100 105 110Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly115 120 125Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Asn Asp Thr Glu Pro Cys Asn Asp Ser130 135 140Asp Asn Asn His Thr Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg145 150 155 160Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr165 170 175Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu180 185 190Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp195 200 205Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr210 215 220Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val225 230 235 240Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr245 250 255Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro
260 265 270Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu275 280 285Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp290 295 300Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp305 310 315 320Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly325 330 335Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn340 345 350Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp355 360 365Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro370 375 380Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu385 390 395 400Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn405 410 415Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile420 425 430Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr435 440 445Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys450 455 460Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu485 490 495Ser Leu Ser Pro Gly Lys500<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR1-EDF-EcoRI<400>25ccggaattcc ggtctggcat gggcctctcc acc 33<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR1-EDR-IgGh<400>26cacaagattt gggctctgct gtggtgcctg agtcctc 37<210>27<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸IgG1-T1F<400>27gaggactcag gcaccacagc agagcccaaa tcttgtg 37<210>28<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸IgG1-R-XbaI<400>28gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR2-EDF-EcoRI<400>29ccggaattcc gggcacccat ggcgcccgtc gcc 33<210>30<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR2-EDR-IgGh
<400>30cacaagattt gggctctgcg tcgccagtgc tcccttc 37<210>31<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸IgG-T2F<400>31gaagggagca ctggcgacgc agagcccaaa tcttgtg 37<210>32<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR1-CF-BamHI<400>32cgcggatccg ggaacatttc actggtccct cacctag 37<210>33<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR1-NR-BamHI
<400>33cgcggatccg tcctcagtgc ccttaacatt ctcaatctg 39<210>34<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR2-CF-BamHI<400>34cgcggatcca acgcaactac accctacgcc ccggag 36<210>35<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸TNFR2-NR-BamHI<400>35cgcggatccg ctcccttcag ctggggggct g 31<210>36<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgTNFR1-TNFR1-IgG-F
<400>36aaaagcaacg agaccaacaa gacctgccta cacaacgggt ccagggagaa gaacgatagt 60gtg 63<210>37<211>62<212>
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgTNFR1-TNFR1-IgG-R<400>37ctccctggac ccgttgtgta ggcaggtctt gttggtctcg ttgcttttct tacagttact 60ac62<210>38<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgTNFR2-TNFR2-IgG-F<400>38atggatgcaa actgcacgtc cccggagccc aacagcacat gccgg45<210>39<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgTNFR2-TNFR2-IgG-R<400>39gcatgtgctg ttgggctccg gggacgtgca gtttgcatcc at 42<210>40<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CD2F-EcoRI<400>40ccggaattca tgagctttcc atgtaaattt gtagcc 36<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CD2R-PstI<400>41ctctgcagga cagctgacag gctcgacact 30<210>42<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸IgG-F-PstI
<400>42atctgcagag cccaaatctt gtgac 25<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CTLA4F-EcoRI<400>43ccggaattca tgaggacctg gccc24<210>44<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CTLA4R-PstI<400>44ctctgcagaa tctgggcacg gttcaggatc 30<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CD2-NT-F
<400>45taaagagatt acgaatgcc 19<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CD2-CT-R<400>46tgcaggacag ctgacagg 18<210>47<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CTLA4-NT-F<400>47ggataatcat gcacgtggcc cag 23<210>48<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸CTLA4-CT-R
<400>48tgcagaatct gggcacgg 18<210>49<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgCD2-CD2-IgG-F<400>49cagtgtcgag aatgtcagct gtcctaaaaa tattacgaat gcc 43<210>50<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸 mgCD2-CD2-IgG-R<400>50ggcattcgta atatttttag gacagctgac attctcgaca ctg 43<210>51<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgCTLA4-CTLA4-IgG-F<400>51
atttatgtaa acgatacaga accgtgcaat gattcggata acaaccacac agcccagcct60gctg 64<210>52<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物，寡核苷酸mgCTLA4-CTLA4-IgG-R<400>52aggctgggct gtgtggttgt tatccgaatc attgcacggt tctgtatcgt ttacataaat60ctg 6權(quán)利要求
1.包含兩個(gè)可溶性結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)蛋白，其中生物活性蛋白的一個(gè)可溶性結(jié)構(gòu)域的N末端與生物活性蛋白的相同可溶性結(jié)構(gòu)域或不同可溶性結(jié)構(gòu)域的C末端相連。
2.包含兩個(gè)單體蛋白的多聯(lián)融合二聚蛋白，該單體蛋白是通過(guò)將參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相連而形成的，其中所述單體蛋白通過(guò)在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接到一起，并且該二聚蛋白具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和治療效果。
3.權(quán)利要求2的多聯(lián)融合二聚蛋白，其中所述免疫球蛋白分子是IgG。
4.權(quán)利要求2的多聯(lián)融合二聚蛋白，其中所述參與免疫應(yīng)答的蛋白選自細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，粘附分子，腫瘤壞死因子受體，受體酪氨酸激酶，趨化因子受體，以及含有可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的其它細(xì)胞表面蛋白。
5.權(quán)利要求4的多聯(lián)融合二聚蛋白，其中所述蛋白選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-17，TNF，TGF，IFN，GM-CSF，G-CSF，EPO，TPO，M-CSF，GHR，IL-13R，IL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R，IL-6R，IL-7R，IL-9R，IL-15R，TNFR，TGFR，IFNR，干擾素-αR，-βR，和-γR，GM-CSFR，G-CSFR，EPOR，cMpl，gp130，F(xiàn)as(Apo 1)，CCR1，CXCR1-4，TrkA，TrkB，TrkC，Htk，REK7，Rse/Tyro-3，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子R，血小板衍生生長(zhǎng)因子R，F(xiàn)lt-1，CD2，CD4，CD5，CD6，CD22，CD27，CD28，CD30，CD31，CD40，CD44，CD100，CD137，CD150，LAG-3，B7，B61，β-neurexin，CTLA-4，ICOS，ICAM-1，補(bǔ)體R-2(CD21)，IgER，溶酶體膜gp-1，α2-微球蛋白受體相關(guān)蛋白，和鈉釋放肽R。
6.權(quán)利要求2的多聯(lián)融合二聚蛋白，其中所述單體蛋白含有SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
7.編碼單體蛋白的DNA構(gòu)建體，該單體蛋白是通過(guò)將參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白分子Fc片段鉸鏈區(qū)相連而形成的。
8.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中所述免疫球蛋白分子是IgG。
9.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中所述參與免疫應(yīng)答的蛋白選自細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，粘附分子，腫瘤壞死因子受體，受體酪氨酸激酶，趨化因子受體，以及含有可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的其它細(xì)胞表面蛋白。
10.權(quán)利要求9的DNA構(gòu)建體，其中所述蛋白選自IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-17，TNF，TGF，IFN，GM-CSF，G-CSF，EPO，TPO，M-CSF，GHR，IL-13R，IL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R，IL-6R，IL-7R，IL-9R，IL-15R，TNFR，TGFR，IFNR，干擾素-αR，-βR，和-γR，GM-CSFR，G-CSFR，EPOR，cMpl，gp130，F(xiàn)as(Apo 1)，CCR1，CXCR1-4，TrkA，TrkB，TrkC，Htk，REK7，Rse/Tyro-3，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子R，血小板衍生生長(zhǎng)因子R，F(xiàn)lt-1，CD2，CD4，CD5，CD6，CD22，CD27，CD28，CD30，CD31，CD40，CD44，CD100，CD137，CD150，LAG-3，B7，B61，β-neurexin，CTLA-4，ICOS，ICAM-1，補(bǔ)體R-2(CD21)，IgER，溶酶體膜gp-1，α2-微球蛋白受體相關(guān)蛋白，和鈉釋放肽R。
11.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體含有SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO17或SEQ ID NO19的核苷酸序列。
12.包含權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述構(gòu)建體與其可操作連接。
13.權(quán)利要求12的重組表達(dá)質(zhì)粒，其中所述重組表達(dá)質(zhì)粒是pTR11-rop10′質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10288)，pTR22-Top10′質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10289)，pCD22Ig質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10402)，或pCT44Ig質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10400)。
14.由權(quán)利要求12的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
16.權(quán)利要求14或15的宿主細(xì)胞，其中所述重組表達(dá)質(zhì)粒是pTR11-Top10′質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10288)，pTR22-Top10′質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10289)，pCD22Ig質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10402)，或pCT44Ig質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10400)。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是TR11Ig-CHO細(xì)胞系(保藏號(hào)KCLRF-BP-00046)或TR22Ig-CHO細(xì)胞系(保藏號(hào)KCLRF-BP-00049)。
18.制備多聯(lián)融合二聚蛋白的方法，在所述蛋白中兩個(gè)單體蛋白的鉸鏈區(qū)之間形成二硫鍵，該方法包括以下步驟在適于表達(dá)DNA構(gòu)建體的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求14的經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體編碼多聯(lián)融合單體蛋白，所述單體蛋白中，參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相連；以及從培養(yǎng)基中分離并純化由產(chǎn)生的單體蛋白二聚化作用而形成的二聚蛋白。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體的制備如下通過(guò)將編碼免疫球蛋白分子Fc片段的DNA片段與編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA相連，形成編碼簡(jiǎn)單融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體；再將制備的DNA構(gòu)建體和與編碼參與免疫應(yīng)答的蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段相同的第二個(gè)DNA片段相連。
20.權(quán)利要求19的方法，其中編碼多聯(lián)融合單體蛋白的DNA構(gòu)建體含有糖基化基序序列。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述糖基化基序序列被插入兩個(gè)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域相連接處的區(qū)域。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述多聯(lián)融合單體蛋白含有前導(dǎo)序列。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述多聯(lián)融合單體蛋白是CTLA-4，所述前導(dǎo)序列具有MACLGFQRHKAQKNLAARTWPCTLLFFIPVFCKA的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述前導(dǎo)序列具有去除了ACLGFQRHKAQKNLAA的MRTWPCTLLFFIPVFCKA氨基酸序列。
25.權(quán)利要求18-24任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
26.包含兩個(gè)單體蛋白的多聯(lián)融合二聚蛋白，該單體蛋白是將參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白分子Fc片段的鉸鏈區(qū)相連而形成的，其中所述單體蛋白是通過(guò)在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而連接到一起，并糖基化，該二聚蛋白具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和治療效果。
27.權(quán)利要求26的多聯(lián)融合二聚蛋白，其中所述單體蛋白含有SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO22或SEQ ID NO24的氨基酸序列。
28.編碼單體蛋白的DNA構(gòu)建體，該單體蛋白是將參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū)相連接而形成，并含有糖基化基序肽。
29.權(quán)利要求28的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體含有SEQID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列。
30.可操作連接至權(quán)利要求28的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)質(zhì)粒。
31.權(quán)利要求30的重組表達(dá)質(zhì)粒，其中所述重組表達(dá)質(zhì)粒是pTR11Ig-MG質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10404)，pTR22Ig-MG質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10407)，pCD22Ig-MG質(zhì)粒(保藏號(hào)KCCM-10401)，或pCT44Ig-MG質(zhì)粒(KCCM-10399)。
32.由權(quán)利要求30的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
34.包含權(quán)利要求2的二聚蛋白的藥物或診斷組合物。
35.包含權(quán)利要求26的糖基化二聚蛋白的藥物或診斷組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了包含兩個(gè)可溶性結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)蛋白，其中生物活性蛋白的一個(gè)可溶性結(jié)構(gòu)域的C末端與生物活性蛋白的相同可溶性結(jié)構(gòu)域或不同可溶性結(jié)構(gòu)域的N末端相連。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了二聚蛋白，其通過(guò)在兩個(gè)單體蛋白的鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而形成，所述單體蛋白是通過(guò)將參與免疫應(yīng)答的蛋白的兩個(gè)相同可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體與免疫球蛋白Fc片段相連而形成，還公開(kāi)了二聚蛋白的糖基化蛋白，編碼該單體蛋白的DNA構(gòu)建體，含有該DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)質(zhì)粒，由該重組表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞制備該二聚蛋白的方法。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了包含該二聚蛋白或其糖基化形式的藥物或診斷組合物。
文檔編號(hào)C07K14/715GK1524092SQ02804341
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者鄭用勳, 韓志雄, 李惠子, 崔恩英, 金真美, 鄭用 申請(qǐng)人:梅德克斯金株式會(huì)社