專利名稱：編碼rpsl基因的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了來自棒狀細菌(coryneform bacteria)的編碼rpsL基因的核苷酸序列，及用細菌經(jīng)發(fā)酵制備氨基酸的方法，所述細菌中rpsL基因是增強的。
現(xiàn)有技術(shù)氨基酸，尤其L-甲硫氨酸，用于人用藥及制藥工業(yè)，食品工業(yè)，但尤為用于動物營養(yǎng)。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)，由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施。如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物有抗性或調(diào)節(jié)重要性代謝物是營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。
一些年以來，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于棒桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良，其通過擴增各個氨基酸生物合成基因，并研究對氨基酸生產(chǎn)的作用而進行改良。
發(fā)明目的本發(fā)明人目的在于為改良發(fā)酵氨基酸的生產(chǎn)而提供新措施。
發(fā)明概述當下文提及L-氨基酸或氨基酸時，是指一或多種選自以下一組的氨基酸，包括其鹽，所述的組由L-天冬氨酸，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸組成。優(yōu)選L-賴氨酸。
當下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時，不僅指堿還指鹽，例如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了衍生自棒狀細菌的分離的多核苷酸，包括選自如下一組的編碼rpsL基因的多核苷酸序列a)與編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，所述多肽優(yōu)選具有核糖體蛋白S12活性。
本發(fā)明還提供了上面提及的多核苷酸，其優(yōu)選是能復制的DNA，包含(i)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中的中性功能有義突變，其不改變所述蛋白質(zhì)/多肽的活性。
最后，本發(fā)明還提供了選自以下一組的多核苷酸a)包含選自SEQ ID NO1核苷酸序列第1-499位之間的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，b)包含選自SEQ ID NO1核苷酸序列第500-883位之間的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，c)包含選自SEQ ID NO1核苷酸序列第884-1775位之間的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，尤其DNA，其能復制并包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列；
一種多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；一種載體，其含有本發(fā)明多核苷酸序列，特別是穿梭載體或質(zhì)粒載體，以及含有該載體或其中rpsL基因是增強的棒狀細菌。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上包含一多核苷酸序列，其可通過用包含相應于SEQ ID NO1的本發(fā)明多核苷酸序列或其片段的探針與一棒狀細菌基因文庫雜交，并分離所述的多核苷酸序列來篩選獲得，所述文庫包括所述完整基因或其部分。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA，cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼核糖體蛋白S12的全長核酸或多核苷酸或基因，或分離與rpsL基因具有高度序列相似性的那些核酸或多核苷酸或基因。它們也可以用作所謂“陣列”、“微陣列”或“DNA芯片”上的探針，以檢測及確定相應多核苷酸或衍生自其中的序列，例如RNA或cDNA。
包含本發(fā)明序列的多核苷酸還適用作引物，借助于其通過聚合酶鏈反應(PCR)可以制備編碼核糖體蛋白S12的基因的DNA。
作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少25，26，27，28，29或30個，優(yōu)選至少20，21，22，23或24個，特別優(yōu)選至少15，16，17，18或19個連續(xù)核苷酸。具有至少31，32，33，34，35，36，37，38，39或40個，或至少41，42，43，44，45，46，47，48，49或50個核苷酸的寡核苷酸也是合適的。具有至少100，150，200或300個核苷酸的寡核苷酸任選地也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
本發(fā)明的多核苷酸包括SEQ ID NO1的多核苷酸或從中制備的片段，及與SEQ ID NO1的多核苷酸具有至少70％-80％，優(yōu)選至少81％-85％，特別優(yōu)選至少86％-90％，尤其優(yōu)選至少91％，93％，95％，97％或99％相同性的那些多核苷酸或從中制備的片段。
“多肽”應理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有核糖體蛋白S12生物學活性的多肽。以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％-80％，優(yōu)選至少81％-85％，特別優(yōu)選至少86％-90％，尤其優(yōu)選至少91％，93％，95％，97％或99％相同并具有所述活性的那些多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)氨基酸的棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的方法，在該棒狀細菌中編碼rpsL基因的優(yōu)選內(nèi)源性核苷酸序列是增強的，尤其是過表達的，生產(chǎn)的氨基酸選自以下一組L-天冬氨酸，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。
文中術(shù)語“增強”是指微生物中由相應的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或用強啟動子或編碼高活性相應酶或蛋白質(zhì)的基因，及任選地組合使用這些方法。
通過增強措施，尤其過表達，相應蛋白的活性或濃度基于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒狀菌屬中尤其應提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌的合適菌株特別是以下已知野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032
醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC 17965黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和擴展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌株，如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P 6464谷氨酸棒桿菌DM58-1谷氨酸棒桿菌DG52-5谷氨酸棒桿菌DSM5715和谷氨酸棒桿菌DSM12866。
本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼核糖體蛋白S12的新rpsL基因。
為分離谷氨酸棒桿菌的rpsL基因或其它谷氨酸棒桿菌基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chamie，Weinhein，德國，1990)，或Sambrook等所著手冊分子克隆實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，1989)。一非常熟知的基因文庫是由Kohara等(細胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學，252，255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，美國科學院院報84，2160-2164)在大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。
Bormann等(分子微生物學6(3)，317-316)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。
為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivan，生命科學25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259～268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學院院報7(1990)4645～4649)所述。借助于粘?？寺〉拈LDNA片段隨后可亞克隆并用適于測序的通用載體測序，如Sanger等(美國科學院院報745463-5467，1977))所述。
所得DNA序列然后可以用已知的算法或序列分析程序研究，例如Staden所述程序(核酸研究14，217-232(1986))，Marck所述程序(核酸研究16，18291836(1988))，或Butler所述GCG程序(生物化學分析方法39，74-97(1998))。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼rpsL基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，其示作SEQ ID NO1，是本發(fā)明的一部分。另外，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得rpsL基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ ID NO2表示。已知宿主中內(nèi)源酶可以斷裂所形成的蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，保守氨基酸置換，如在蛋白質(zhì)中用甘氨酸置換蛋白質(zhì)丙氨酸，或用天冬氨酸置換谷氨酸，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)任何功能的改變，即是中性的。這種突變也稱為中性取代。另外已知蛋白質(zhì)N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至穩(wěn)定其功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細菌學雜志169751-757(1987))，O’Regan等(基因77237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學3240-247(1994))，和Hochuli等(生物/技術(shù)61321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學的教材。以相應方式得自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15個核苷酸的長度。
通過雜交鑒別DNA序列的指導可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)，以及Liebl等(國際系統(tǒng)細菌學雜志(1991)41255～260)。雜交在嚴格條件下發(fā)生，即只有這樣的雜交子形成，其中探針和靶序列即用所述探針處理的多核苷酸是至少70％相同的。已知雜交的嚴格性包括洗滌步驟，通過改變緩沖液組分，溫度和鹽濃度而影響或確定。雜交反應優(yōu)選在與洗滌步驟相比相對較低嚴格條件下進行(Hybaid HybridisationGuide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如一種5×SSC緩沖液在大約50℃-68℃可以用于雜交反應。探針也可以和與探針序列相同性低于70％的多核苷酸雜交。這種雜交子穩(wěn)定性較差，通過在嚴格條件下洗滌除去。這可以通過例如將鹽濃度降低至2×SSC及任選隨后為0.5×SSC(濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導，Boehringer Mannheim，德國曼海姆，1995)，在設(shè)定溫度大約50℃-68℃實現(xiàn)。任選可以將鹽濃度降低至0.1×SSC。與所用探針序列例如至少70％或至少80％或至少90％-95％相同的多核苷酸，可以通過將雜交溫度以大約1-2℃的幅度從50℃逐步提高至68℃而分離。關(guān)于雜交的進一步指導可以所謂試劑盒形式在市場上獲得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，德國曼海姆，目錄號No.1603558)。
用聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA序列的指導參見Gait的手冊寡核苷酸合成實用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在rpsL基因增強后，棒狀細菌以改良方式生產(chǎn)氨基酸。
為獲得過表達，可提高相應基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過可誘導啟動子，在氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強表達也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改良表達。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因構(gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴增?；蛘撸ㄟ^改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過表達。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))，Reischeid等(應用及環(huán)境微生物學60，126-132(1994))，LaBarre等(細菌學雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58,191-195(1998))，Makrides(微生物學綜述60512-538(1996)及已知關(guān)于遺傳及分子生物學的教材。
例如，本發(fā)明的rpsL基因已借助于附加型質(zhì)粒被過表達。適當?shù)馁|(zhì)粒是那些在棒狀細菌中復制的質(zhì)粒。許多已知質(zhì)粒載體例如pZl(Menkel等，應用及環(huán)境微生物學(1989)64，549-554)，pEKExl(Eikamanns等，基因102，93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107,69-74，(1991))，是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它質(zhì)粒載體，例如那些基于pCG4(US-A-4,489,160)，pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學信息66，119-124(1990)或pAG1(US-A-5,158,891)的質(zhì)粒載體，可以相同方式使用。
其它適當?shù)馁|(zhì)粒載體是借助于其可以使用通過整合入染色體中進行基因擴增的那些載體，例如Reinscheid等(應用和環(huán)境微生物學60，126-132(1994))闡述了hom-thrB操縱子的復制或擴增。在這個方法中，將完整基因克隆入在宿主中(典型在大腸桿菌中)能復制的質(zhì)粒載體中，但所述載體在谷氨酸棒桿菌中不能復制?？赡艿妮d體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,6973(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美國)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學雜志26932678-84；US-A5,487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物學雜志，234534-541(1993))，pEM1(Schrumpft等，1991，細菌學雜志1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41337-342)。然后通過接合或轉(zhuǎn)化將含有要擴增的基因的質(zhì)粒載體移至所需谷氨酸棒桿菌菌株中。接合方法例如Schafer等所述(應用和環(huán)境微生物學60，756-759(1994))。轉(zhuǎn)化方法例如Thierbach等(應用微生物學和生物技術(shù)29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學信息123，343-347(1994))所述。在通過“交換”事件進行同源重組后，所得菌株含有所述基因的至少兩個拷貝。
另外發(fā)現(xiàn)在SEQ ID NO2所示核糖體蛋白S12的氨基酸序列的第38-48位之間進行氨基酸置換會改良棒狀細菌生產(chǎn)賴氨酸的能力。
優(yōu)選地，在第43位的L-賴氨酸用除了L-賴氨酸之外任何其他蛋白中存在的氨基酸置換，優(yōu)選用L-組氨酸或L-精氨酸置換。非常優(yōu)選用L-精氨酸置換。
菌株DM1545中含有的等位基因rpsL-1545的堿基序列示于SEQID NO3。所述rpsL-1545等位基因編碼一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列示于SEQ ID NO4。所述蛋白質(zhì)在第43位含有L-精氨酸。rspL-1545等位基因的DNA序列(SEQ ID NO3)在編碼區(qū)(CDS)的第128位含有堿基鳥嘌呤，其相當于SEQ ID NO3所示序列中的第627位。野生型基因的DNA序列(SEQ ID NO1)在此位置含有腺嘌呤。
針對誘變，可以使用常規(guī)的誘變方法，使用誘變物質(zhì)例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍或紫外線。可以進一步使用體外方法進行誘變，例如用羥胺處理(Miller，J.H.細菌遺傳短期課程，針對大腸桿菌和相關(guān)細菌的實驗指導和手冊，冷泉港實驗室出版，冷泉港，1992)，或用誘變寡核苷酸處理(T.A.Brown遺傳工程入門，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或用聚合酶鏈反應(PCR)處理，如Newton和Graham所著手冊所述(PCR，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1994)。
本發(fā)明的rpsL等位基因還可以通過基因置換方法移至合適的菌株中，如Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)學9，84-87(1991))或Peters-Wendisch等(微生物學144，915-927(1998))所述。將相應的rpsL等位基因克隆入在谷氨酸棒桿菌中不復制的載體中，例如pK18mobsacB(Jager等，細菌學雜志1745462-65(1992))或pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物學雜志，234534-541(1993))，然后通過轉(zhuǎn)化或綴合將該載體移至所需谷氨酸棒桿菌宿主中。在通過實現(xiàn)整合的第一次“交換”同源重組及實現(xiàn)在靶基因和靶序列中進行切割的合適的第二次“交換”后，使得突變得以摻入。
另外，除rpsL基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，回補作用，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的增強尤其過表達，對L-氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。一般優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
“內(nèi)源基因”或“內(nèi)源核苷酸序列”應理解為一個物種群體中存在的基因或核苷酸序列及其等位基因。
因此，除了增強rpsL基因之外，例如選自以下一組的一或多個基因可被增強尤其被過表達以生產(chǎn)L-賴氨酸·編碼二氫二羧酸合酶的dapA基因(EP-B 0197335)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼葡糖6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學雜志254，395-403(1998))，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子微生物學5(5)，1197-204(1991))，·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·編碼Zwal蛋白的zwal基因(DE19959328.0，DSM 13115)，·編碼SEQ ID NO5和6所示RNA聚合酶B的β亞單位的rpoB基因。
文中術(shù)語“弱化”是指降低或消除微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性，通過使用弱啟動子或使用編碼具有低活性的相應酶(蛋白質(zhì))的基因或等位基因，或滅活相應基因或酶(蛋白質(zhì))，及任選地組合使用這些方法。
通過弱化措施，相應蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)活性或濃度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
除增強rpsL基因之外，對選自以下一組的一或多個基因弱化尤其降低其表達對L-氨基酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.I，DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM 13114)，·編碼Zwa2蛋白的zwa2基因(DE19959327.2，DSM 13113)。
除增強rpsL基因之外，排除非所需的二級反應對氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學術(shù)出版社，倫敦英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)或非連續(xù)地通過分批法，補料分批法或重復補料發(fā)批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)氨基酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術(shù)學1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(美國華盛頓D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當補加。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內(nèi)達到。
本領(lǐng)域已知確定L-氨基酸的方法。因此可例如Spackman等所述通過離子交換層析隨后茚三酮衍生化作用(分析化學，30(1958)，1190)進行該分析，或者通過反相HPLC進行，如Lindroth等所述(分析化學(1979)511167-1174)。
谷氨酸棒桿菌菌株DM1545的純化培養(yǎng)物根據(jù)布達佩斯條約于2001年1月16日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號DSM13992。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸。
本發(fā)明借助于以下實施例得以更詳細闡述。
質(zhì)粒DNA從大腸桿菌中的分離，所有限制技術(shù)，Klenow及堿性磷酸酶處理均通過Sambrook等所述方法進行(分子克隆實驗手冊(1989)，冷泉港實驗室出版，冷泉港，NY，美國)。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法也見于該手冊。
常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基如LB或TY培養(yǎng)基的成分也可見于Sambrook等所著的該手冊。
實施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸烊鏣auch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體Super Cosl(Wahl等，(1987)美國科學院院報842160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理混合物。連接混合物然后用GigapackII XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。
為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液等份混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組的各個克隆。
實施例2rpsL基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離一個菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau 3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。
將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學院院報874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。
重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)，在帶有購自PE應用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism 377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中，進行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數(shù)據(jù)然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行進一步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，對該核苷酸序列的分析顯示一383堿基對的開放讀框，其被稱為rpsL基因。rpsL基因編碼127個氨基酸的蛋白質(zhì)。
以同樣方式鑒別了位于SEQ ID NO1上游的DNA節(jié)段，該節(jié)段示于SEQ ID NO7。由SEQ ID NO7延伸的rpsL基因區(qū)域示于SEQ IDNO8。
實施例3菌株DM1545的rpsL等位基因DNA的擴增和測序谷氨酸棒桿菌菌株DM1545通過多重非定向誘變、選擇及突變選擇從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中制備。該菌株是甲硫氨酸敏感的。
從菌株DM1545中通過常規(guī)方法分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應，擴增攜帶rpsL基因或等位基因的DNA節(jié)段?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌rpsL基因序列，選擇以下引物寡核苷酸進行PCRrpsL-1(SEQ ID No10)5’cag ctc tac aag agt gtc ta 3’rpsL-2(SEQ ID No11)5’tgg tcg tgg tct tac cag ca 3’所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，通過Innis等所述方法進行PCR(PCR方案，方法與應用指導，1990，學術(shù)出版社)。用所述引物擴增出長度為大約1.78kb的一DNA節(jié)段，其攜帶rpsL等位基因。
攜帶菌株DM1545的rpsL等位基因的長度為大約1.78kb的擴增的DNA片段，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別，從凝膠中分離并通過常規(guī)方法純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
擴增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)測序確定。PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ ID NO3。借助于Patentin程序獲得的相關(guān)核糖體蛋白S12的氨基酸序列示于SEQID NO4。
在菌株DM1545的rpsL等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第128位，即SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第627位，是堿基鳥嘌呤。在野生型基因(SEQ ID NO1)的相應位置是堿基腺嘌呤。
在菌株DM1545的核糖體蛋白S12的氨基酸序列的第43位是氨基酸精氨酸(SEQ ID NO4)。在野生型蛋白質(zhì)的相應位置是氨基酸賴氨酸(SEQ ID NO2)。
實施例4用rpsL-1545等位基因置換菌株DSM5715的rpsL野生型基因4.1分離攜帶rpsL-1545等位基因的DNA片段通過常規(guī)方法從菌株DM1545中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應擴增一個攜帶rpsL-1545等位基因的DNA節(jié)段，其在編碼區(qū)(CDS)的第128位含有堿基鳥嘌呤，在野生型基因中該位置含有的是堿基腺嘌呤?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌rpsL基因的序列，選擇以下引物寡核苷酸進行聚合酶鏈反應rpsL-XL-A1(SEQ ID NO12)5’gatct aga-ggt tgc cgg taa tcc tgt tg3’rpsL-XL-E1(SEQ ID NO13)5’gatct aga-cgc agg ctg cca gct tat tc3’所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，并通過Innis等所述標準PCR方法進行PCR(PCR方案，方法與應用指導，1990，學術(shù)出版社)。用所述引物擴增出攜帶rpsL-1545等位基因的長度為大約1.59kb的一DNA節(jié)段(SEQ ID NO9)。該引物還含有限制性內(nèi)切酶XbaI的切割位點序列，在上述核苷酸序列中以下劃線示出。
將攜帶rpsL-1545等位基因的長度為大約1.59kb的擴增的DNA片段用限制性內(nèi)切酶XbaI切割，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別，然后從該凝膠中分離并通過常規(guī)方法純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
4.2構(gòu)建置換載體pK18mobsacB_rpsL-1545將實施例4.1中描述的含有rpsL-1545等位基因并用限制性內(nèi)切酶XabI切割的長度為大約1.58kb的DNA片段，借助于Schafer等所述sacB系統(tǒng)(基因14，69-73(1994))，通過置換誘變摻入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715的染色體中。這個系統(tǒng)能產(chǎn)生并選擇通過同源重組發(fā)生的等位基因置換。
將能動的克隆載體pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，用堿性磷酸酶將末端去磷酸化(堿性磷酸酶，德國曼海姆Boehringer)。以此方式制備的載體與大小為大約1.58kb的rpsL-1545片段混合，并將此混合物用DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)。
然后將大腸桿菌菌株S17-1(Simon等，生物/技術(shù)1784-791，1993)用連接混合物(Hanahan，DNA克隆實踐方案，第1卷，ILR出版社，冷泉港，紐約，1989)轉(zhuǎn)化。攜帶質(zhì)粒的細胞通過將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989)上進行選擇。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒，從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用酶PstI限制酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳而檢測。該質(zhì)粒稱為pK18mobsacB_rpsL-1545，并示于

圖1。
4.3DSM5715中載體pK18mobsacB_rpsL-1545的整合及等位基因置換通過Schafer等所述方法(微生物學雜志1721663-1666(1990))，將實施例4.2中所述載體pK18mobsacB_rpsL-1545通過接合轉(zhuǎn)移至谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中。該載體在DSM5715中不能獨立復制，只有由于重組而整合在染色體中的情況下才保留在細胞中。通過將接合混合物鋪板于補加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989)上選擇轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33℃溫育24小時。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子稱為DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545。通過載體的整合，除了rpsL野生型基因之外，其在染色體中攜帶rpsL-1545等位基因。
為選擇其中由于第二次重組事件而發(fā)生質(zhì)粒切除的突變體，將菌株DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545的細胞在LB液體培養(yǎng)基中非選擇性培養(yǎng)30小時，然后鋪板于具有10％蔗糖的LB瓊脂上，溫育16小時。
與起始質(zhì)粒pK18mobsacB相似，質(zhì)粒pK18mobsacB_rpsL-1545除了卡那霉素抗性基因之外，還含有一個拷貝的編碼得自Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶的sacB基因?？梢杂烧崽钦T導的表達導致果聚糖蔗糖酶形成，其催化對谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖產(chǎn)物合成。因此只有其中整合的pK18mobsacB-rpsL-1545由于第二次重組已經(jīng)被切除的那些克隆在LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組相對于突變位點的位置，等位基因置換或突變的摻入隨切除而發(fā)生，或者原始拷貝保留在宿主染色體中。
對大約40-50個菌落測試表型“在存在蔗糖情況下生長”和“在存在卡那霉素的情況下不生長”。在顯示出表型“在存在蔗糖情況下生長”和“在存在卡那霉素的情況下不生長”的4個菌落中，通過GATCBiotechAG(Constance，德國)，從測序引物rL-1(SEQ ID NO14)開始對跨越rpsL-1545突變的rpsL基因區(qū)域進行測序，以證實rpsL-1545等位基因突變存在于染色體中。通過GATC合成為此所用引物rL-1rL-1(SEQ ID NO14)5’atg agg ttg tcc gtg aca tg 3’以此方式鑒別一個克隆，其在rpsL基因的編碼區(qū)(CDS)第128位含有堿基鳥嘌呤，并因此具有rpsL-1545等位基因。這個克隆稱為菌株DSM5715_rpsL-1545。
實施例5制備賴氨酸將實施例4中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pK18mobsacB_rpsL-1545和DSM5715rpsL-1545在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃將菌株在瓊脂板上溫育24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MM培養(yǎng)基。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物24小時。在每種情況中，從這些預培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始光密度(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM也用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL 5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和所述鹽溶液的pH調(diào)節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表1。
表1
序列表<110>德古薩股份公司<120>編碼rpsL基因的核苷酸序列<130>DEDEG0199<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1775<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(500)..(880)<223>rpsL野生型基因<400>1cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly1 5 10cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser15 20 25cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct aag 628Pro Gln Arg Arg Gly Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Lys30 35 40aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser45 50 55ggc atc gag gtt tcc gct tac atc cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724Gly Ile Glu Val Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln60 65 70 75
gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca772Glu His Ser Met Val Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro80 85 90ggt gtc cgt tac aag atc gtc cgt ggc gca ctg gat acc cag ggt gtt820Gly Val Arg Tyr Lys Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val95 100 105aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata868Lys Asp Arg Lys Gln Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile110 115 120att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct920Ile Lys Asn Ala125gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca ctcgagatct gccgtgagaa gaccggcacc 1040gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt 1100tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca 1160aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg 1220atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag 1280cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg 1340tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt 1400cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt 1460aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta 1520aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt 1580aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac 1640cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag 1700aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg 1760gtaagaccac gacca 1775<210>2<211>127<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser1 5 10 15Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gln Arg Arg Gly20 25 30Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Lys Lys Pro Asn Ser Ala
35 40 45Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Val Ser50 55 60Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln Glu His Ser Met Val65 70 75 80Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro Gly Val Arg Tyr Lys85 90 95Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val Lys Asp Arg Lys Gln100 105 110Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala115 120 125<210>3<211>1775<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(500)..(880)<223>rpsL-1545等位基因<220>
<221>mutation<222>(627)..(627)<223>腺嘌呤交換為鳥嘌呤<400>3cagctctaca agagtgtcta agtggcgggc attccatgct ttggaggagc gatcttcaaa 60ttcctccaaa gtgagttgac ctcgggaaac agctgcagaa agttcatcca cgacttggtt 120tcggttaagg tcagtggcga gcttctttgc tggttcgttt ccttgaggaa cagtcatggg 180aaccattcta acaagggatt tggtgttttc tgcggctagc tgataatgtg aacggctgag 240tcccactctt gtagttggga attgacggca cctcgcactc aagcgcggta tcgcccctgg 300ttttccggga cgcggtggcg catgtttgca tttgatgagg ttgtccgtga catgtttggt 360cgggccccaa aaagagcccc cttttttgcg tgtctggaca ctttttcaaa tccttcgcca 420tcgacaagct cagccttcgt gttcgtcccc cgggcgtcac gtcagcagtt aaagaacaac 480tccgaaataa ggatggttc atg cca act att cag cag ctg gtc cgt aag ggc 532Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly1 5 10cgc cac gat aag tcc gcc aag gtg gct acc gcg gca ctg aag ggt tcc 580Arg His Asp Lys Ser Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser15 20 25cct cag cgt cgt ggc gta tgc acc cgt gtg tac acc acc acc cct agg 628Pro Gln Arg Arg Gly Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Arg30 35 40
aag cct aac tct gct ctt cgt aag gtc gct cgt gtg cgc ctt acc tcc 676Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser45 50 55ggc atc gag gtt tcc gct tac atc cct ggt gag ggc cac aac ctg cag 724Gly Ile Glu Val Ser Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln60 65 70 75gag cac tcc atg gtg ctc gtt cgc ggt ggt cgt gtt aag gac ctc cca 772Glu His Ser Met Val Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro80 85 90ggt gtc cgt tac aag atc gtc cgt ggc gca ctg gat acc cag ggt gtt 820Gly Val Arg Tyr Lys Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val95 100 105aag gac cgc aag cag gct cgt tcc ccg cta cgg cgc gaa gag ggg ata 868Lys Asp Arg Lys Gln Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile110 115 120att aaa aat gcg taaatcagca gctcctaagc gtccagtagt tcaggaccct 920Ile Lys Asn Ala125gtatacaagt ccgagctcgt tacccagctc gtaaacaaga tcctcatcgg tggcaagaag 980tccaccgcag agcgcatcgt ctacggtgca ctcgagatct gccgtgagaa gaccggcacc1040gatccagtag gaaccctcga gaaggctctc ggcaacgtgc gtccagacct cgaagttcgt1100tcccgccgtg ttggtggcgc tacctaccag gtgccagtgg atgttcgccc agagcgcgca1160aacaccctcg cactgcgttg gttggtaacc ttcacccgtc agcgtcgtga gaacaccatg1220atcgagcgtc ttgcaaacga acttctggat gcagccaacg gccttggcgc ttccgtgaag1280cgtcgcgaag acacccacaa gatggcagag gccaaccgcg ccttcgctca ctaccgctgg1340tagtactgcc aagacatgaa agcccaatca cctttaagat caacgcctgc cggcgccctt1400cacatttgaa taagctggca gcctgcgttt cttcaaggcg actgggcttt tagtctcatt1460aatgcagttc accgctgtaa gatagctaaa tagaaacact gtttcggcag tgtgttacta1520aaaaatccat gtcacttgcc tcgagcgtgc tgcttgaatc gcaagttagt ggcaaaatgt1580aacaagagaa ttatccgtag gtgacaaact ttttaatact tgggtatctg tcatggatac1640cccggtaata aataagtgaa ttaccgtaac caacaagttg gggtaccact gtggcacaag1700aagtgcttaa ggatctaaac aaggtccgca acatcggcat catggcgcac atcgatgctg1760gtaagaccac gacca1775<210>4<211>127<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum
<400>4Met Pro Thr Ile Gln Gln Leu Val Arg Lys Gly Arg His Asp Lys Ser1 5 10 15Ala Lys Val Ala Thr Ala Ala Leu Lys Gly Ser Pro Gln Arg Arg Gly20 25 30Val Cys Thr Arg Val Tyr Thr Thr Thr Pro Arg Lys Pro Asn Ser Ala35 40 45Leu Arg Lys Val Ala Arg Val Arg Leu Thr Ser Gly Ile Glu Val Ser50 55 60Ala Tyr Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gln Glu His Ser Met Val65 70 75 80Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro Gly Val Arg Tyr Lys85 90 95Ile Val Arg Gly Ala Leu Asp Thr Gln Gly Val Lys Asp Arg Lys Gln100 105 110Ala Arg Ser Pro Leu Arg Arg Glu Glu Gly Ile Ile Lys Asn Ala115 120 125<210>5<211>5099<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(702)..(4196)<223>rpoB基因<400>5acaatgtgac tcgtgatttt tgggtggatc agcgtaccgg tttggttgtc gatctagctg 60aaaatattga tgatttttac ggcgaccgca gcggccagaa gtacgaacag aaattgcttt 120tcgacgcctc cctcgacgat gcagctgtct ctaagctggt tgcacaggcc gaaagcatcc 180ctgatggaga tgtgagcaaa atcgcaaata ccgtaggtat tgtgatcggt gcggtattgg 240ctctcgtggg cctggccggg tgttttgggg cgtttgggaa gaaacgtcga gaagcttaac 300ctgctgttca aatagatttt ccctgtttcg aattgcggaa accccgggtt tgtttgctag 360ggtgcctcgt agaaggggtc aagaagattt ctgggaaacg cgcccgtgcg gttggttgct 420aatagcacgc ggagcaccag atgaaaaatc tcccctttac tttcgcgcgc gattggtata 480ctctgagtcg ttgcgttgga attcgtgact ctttttcgtt cctgtagcgc caagaccttg 540atcaaggtgg tttaaaaaaa ccgatttgac aaggtcattc agtgctatct ggagtcgttc 600agggggatcg ggttcctcag cagaccaatt gctcaaaaat accagcggtg ttgatctgca 660cttaatggcc ttgaccagcc aggtgcaatt acccgcgtga g gtg ctg gaa gga ccc 716
Met Leu Glu Gly Pro1 5atc ttg gca gtc tcc cgc cag acc aag tca gtc gtc gat att ccc ggt 764Ile Leu Ala Val Ser Arg Gln Thr Lys Ser Val Val Asp Ile Pro Gly10 15 20gca ccg cag cgt tat tct ttc gcg aag gtg tcc gca ccc att gag gtg812Ala Pro Gln Arg Tyr Ser Phe Ala Lys Val Ser Ala Pro Ile Glu Val25 30 35ccc ggg cta cta gat ctt caa ctg gat tct tac tcc tgg ctg att ggt 860Pro Gly Leu Leu Asp Leu Gln Leu Asp Ser Tyr Ser Trp Leu Ile Gly40 45 50acg cct gag tgg cgt gct cgt cag aag gaa gaa ttc ggc gag gga gcc 908Thr Pro Glu Trp Arg Ala Arg Gln Lys Glu Glu Phe Gly Glu Gly Ala55 60 65cgc gta acc agc ggc ctt gag aac att ctc gag gag ctc tcc cca atc 956Arg Val Thr Ser Gly Leu Glu Asn Ile Leu Glu Glu Leu Ser Pro Ile70 75 80 85cag gat tac tct gga aac atg tcc ctg agc ctt tcg gag cca cgc ttc 1004Gln Asp Tyr Ser Gly Asn Met Ser Leu Ser Leu Ser Glu Pro Arg Phe90 95 100gaa gac gtc aag aac acc att gac gag gcg aaa gaa aag gac atc aac 1052Glu Asp Val Lys Asn Thr Ile Asp Glu Ala Lys Glu Lys Asp Ile Asn105 110 115tac gcg gcg cca ctg tat gtg acc gcg gag ttc gtc aac aac acc acc 1100Tyr Ala Ala Pro Leu Tyr Val Thr Ala Glu Phe Val Asn Asn Thr Thr120 125 130ggt gaa atc aag tct cag act gtc ttc atc ggc gat ttc cca atg atg 1148Gly Glu Ile Lys Ser Gln Thr Val Phe Ile Gly Asp Phe Pro Met Met135 140 145acg gac aag gga acg ttc atc atc aac gga acc gaa cgc gtt gtg gtc 1196Thr Asp Lys Gly Thr Phe Ile Ile Asn Gly Thr Glu Arg Val Val Val150 155 160 165agc cag ctc gtc cgc tcc ccg ggc gtg tac ttt gac cag acc atc gat 1244Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Gly Val Tyr Phe Asp Gln Thr Ile Asp170 175 180aag tca act gag cgt cca ctg cac gcc gtg aag gtt att cct tcc cgt 1292Lys Ser Thr Glu Arg Pro Leu His Ala Val Lys Val Ile Pro Ser Arg185 190 195ggt gct tgg ctt gag ttt gac gtc gat aag cgc gat tcg gtt ggt gtt 1340Gly Ala Trp Leu Glu Phe Asp Val Asp Lys Arg Asp Ser Val Gly Val200 205 210cgt att gac cgc aag cgt cgc cag cca gtc acc gta ctg ctg aag gct 1388Arg Ile Asp Arg Lys Arg Arg Gln Pro Val Thr Val Leu Leu Lys Ala215 220 225
ctt ggc tgg acc act gag cag atc acc gag cgt ttc ggt ttc tct gaa 1436Leu Gly Trp Thr Thr Glu Gln Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Ser Glu230 235 240 245atc atg atg tcc acc ctc gag tcc gat ggt gta gca aac acc gat gag 1484Ile Met Met Ser Thr Leu Glu Ser Asp Gly Val Ala Asn Thr Asp Glu250 255 260gca ttg ctg gag atc tac cgc aag cag cgt cca ggc gag cag cct acc 1532Ala Leu Leu Glu Ile Tyr Arg Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gln Pro Thr265 270 275cgc gac ctt gcg cag tcc ctc ctg gac aac agc ttc ttc cgt gca aag 1580Arg Asp Leu Ala Gln Ser Leu Leu Asp Asn Ser Phe Phe Arg Ala Lys280 285 290cgc tac gac ctg gct cgc gtt ggt cgt tac aag atc aac cgc aag ctc 1628Arg Tyr Asp Leu Ala Arg Val Gly Arg Tyr Lys Ile Asn Arg Lys Leu295 300 305ggc ctt ggt ggc gac cac gat ggt ttg atg act ctt act gaa gag gac 1676Gly Leu Gly Gly Asp His Asp Gly Leu Met Thr Leu Thr Glu Glu Asp310 315 320 325atc gca acc acc atc gag tac ctg gtg cgt ctg cac gca ggt gag cgc 1724Ile Ala Thr Thr Ile Glu Tyr Leu Val Arg Leu His Ala Gly Glu Arg330 335 340gtc atg act tct cca aat ggt gaa gag atc cca gtc gag acc gat gac 1772Val Met Thr Ser Pro Asn Gly Glu Glu Ile Pro Val Glu Thr Asp Asp345 350 355atc gac cac ttt ggt aac cgt cgt ctg cgt acc gtt ggc gaa ctg atc 1820Ile Asp His Phe Gly Asn Arg Arg Leu Arg Thr Val Gly Glu Leu Ile360 365 370cag aac cag gtc cgt gtc ggc ctg tcc cgc atg gag cgc gtt gtt cgt 1868Gln Asn Gln Val Arg Val Gly Leu Ser Arg Met Glu Arg Val Val Arg375 380 385gag cgt atg acc acc cag gat gcg gag tcc att act cct act tcc ttg 1916Glu Arg Met Thr Thr Gln Asp Ala Glu Ser Ile Thr Pro Thr Ser Leu390 395 400 405atc aac gtt cgt cct gtc tct gca gct atc cgt gag ttc ttc gga act 1964Ile Asn Val Arg Pro Val Ser Ala Ala Ile Arg Glu Phe Phe Gly Thr410 415 420tcc cag ctg tct cag ttc atg gtc cag aac aac tcc ctg tct ggt ttg 2012Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Val Gln Asn Asn Ser Leu Ser Gly Leu425 430 435act cac aag cgt cgt ctg tcg gct ctg ggc ccg ggt ggt ctg tcc cgt 2060Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg440 445 450gag cgc gcc ggc atc gag gtt cga gac gtt cac cca tct cac tac ggc 2108Glu Arg Ala Gly Ile Glu Val Arg Asp Val His Pro Ser His Tyr Gly455 460 465
cgt atg tgc cca att gag act ccg gaa ggt cca aac att ggc ctg atc 2156Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu Gly Pro Asn Ile Gly Leu Ile470 475 480 485ggt tcc ttg gct tcc tat gct cga gtg aac cca ttc ggt ttc att gag 2204Gly Ser Leu Ala Ser Tyr Ala Arg Val Asn Pro Phe Gly Phe Ile Glu490 495 500acc cca tac cgt cgc atc atc gac ggc aag ctg acc gac cag att gac 2252Thr Pro Tyr Arg Arg Ile Ile Asp Gly Lys Leu Thr Asp Gln Ile Asp505 510 515tac ctt acc gct gat gag gaa gac cgc ttc gtt gtt gcg cag gca aac 2300Tyr Leu Thr Ala Asp Glu Glu Asp Arg Phe Val Val Ala Gln Ala Asn520 525 530acg cac tac gac gaa gag ggc aac atc acc gat gag acc gtc act gtt 2348Thr His Tyr Asp Glu Glu Gly Asn Ile Thr Asp Glu Thr Val Thr Val535 540 545cgt ctg aag gac ggc gac atc gcc atg gtt ggc cgc aac gcg gtt gat 2396Arg Leu Lys Asp Gly Asp Ile Ala Met Val Gly Arg Asn Ala Val Asp550 555 560 565tac atg gac gtt tcc cct cgt cag atg gtt tct gtt ggt acc gcg atg 2444Tyr Met Asp Val Ser Pro Arg Gln Met Val Ser Val Gly Thr Ala Met570 575 580att cca ttc ctg gag cac gac gat gct aac cgt gca ctg atg ggc gcg 2492Ile Pro Phe Leu Glu His Asp Asp Ala Asn Arg Ala Leu Met Gly Ala585 590 595aac atg cag aag cag gct gtg cca ctg att cgt gcc gag gct cct ttc 2540Asn Met Gln Lys Gln Ala Val Pro Leu Ile Arg Ala Glu Ala Pro Phe600 605 610gtg ggc acc ggt atg gag cag cgc gca gca tac gac gcc ggc gac ctg 2588Val Gly Thr Gly Met Glu Gln Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Gly Asp Leu615 620 625gtt att acc cca gtc gca ggt gtg gtg gaa aac gtt tca gct gac ttc 2636Val Ile Thr Pro Val Ala Gly Val Val Glu Asn Val Ser Ala Asp Phe630 635 640 645atc acc atc atg gct gat gac ggc aag cgc gaa acc tac ctg ctg cgt 2684Ile Thr Ile Met Ala Asp Asp Gly Lys Arg Glu Thr Tyr Leu Leu Arg650 655 660aag ttc cag cgc acc aac cag ggc acc agc tac aac cag aag cct ttg 2732Lys Phe Gln Arg Thr Asn Gln Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Pro Leu665 670 675gtt aac ttg ggc gag cgc gtt gaa gct ggc cag gtt att gct gat ggt 2780Val Asn Leu Gly Glu Arg Val Glu Ala Gly Gln Val Ile Ala Asp Gly680 685 690cca ggt acc ttc aat ggt gaa atg tcc ctt ggc cgt aac ctt ctg gtt 2828Pro Gly Thr Phe Asn Gly Glu Met Ser Leu Gly Arg Asn Leu Leu Val
695 700 705gcg ttc atg cct tgg gaa ggc cac aac tac gag gat gcg atc atc ctc 2876Ala Phe Met Pro Trp Glu Gly His Asn Tyr Glu Asp Ala Ile Ile Leu710 715 720 725aac cag aac atc gtt gag cag gac atc ttg acc tcg atc cac atc gag 2924Asn Gln Asn Ile Val Glu Gln Asp Ile Leu Thr Ser Ile His Ile Glu730 735 740gag cac gag atc gat gcc cgc gac act aag ctt ggc gcc gaa gaa atc 2972Glu His Glu Ile Asp Ala Arg Asp Thr Lys Leu Gly Ala Glu Glu Ile745 750 755acc cgc gac atc cct aat gtg tct gaa gaa gtc ctc aag gac ctc gac 3020Thr Arg Asp Ile Pro Asn Val Ser Glu Glu Val Leu Lys Asp Leu Asp760 765 770gac cgc ggt att gtc cgc atc ggt gct gat gtt cgt gac ggc gac atc 3068Asp Arg Gly Ile Val Arg Ile Gly Ala Asp Val Arg Asp Gly Asp Ile775 780 785ctg gtc ggt aag gtc acc cct aag ggc gag acc gag ctc acc ccg gaa 3116Leu Val Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Glu Thr Glu Leu Thr Pro Glu790 795 800 805gag cgc ttg ctg cgc gca atc ttc ggt gag aag gcc cgc gaa gtt cgc 3164Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ile Phe Gly Glu Lys Ala Arg Glu Val Arg810 815 820gat acc tcc atg aag gtg cct cac ggt gag acc ggc aag gtc atc ggc 3212Asp Thr Ser Met Lys Val Pro His Gly Glu Thr Gly Lys Val Ile Gly825 830 835gtg cgt cac ttc tcc cgc gag gac gac gac gat ctg gct cct ggc gtc 3260Val Arg His Phe Ser Arg Glu Asp Asp Asp Asp Leu Ala Pro Gly Val840 845 850aac gag atg atc cgt atc tac gtt gct cag aag cgt aag atc cag gac 3308Asn Glu Met Ile Arg Ile Tyr Val Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gln Asp855 860 865ggc gat aag ctc gct ggc cgc cac ggt aac aag ggt gtt gtc ggt aaa 3356Gly Asp Lys Leu Ala Gly Arg His Gly Asn Lys Gly Val Val Gly Lys870 875 880 885att ttg cct cag gaa gat atg cca ttc ctt cca gac ggc act cct gtt 3404Ile Leu Pro Gln Glu Asp Met Pro Phe Leu Pro Asp Gly Thr Pro Val890 895 900gac atc atc ttg aac acc cac ggt gtt cca cgt cgt atg aac att ggt 3452Asp Ile Ile Leu Asn Thr His Gly Val Pro Arg Arg Met Asn Ile Gly905 910 915cag gtt ctt gag acc cac ctt ggc tgg ctg gca tct gct ggt tgg tcc 3500Gln Val Leu Glu Thr His Leu Gly Trp Leu Ala Ser Ala Gly Trp Ser920 925 930gtg gat cct gaa gat cct gag aac gct gag ctc gtc aag act ctg cct 3548
Val Asp Pro Glu Asp Pro Glu Asn Ala Glu Leu Val Lys Thr Leu Pro935 940 945gca gac ctc ctc gag gtt cct gct ggt tcc ttg act gca act cct gtg 3596Ala Asp Leu Leu Glu Val Pro Ala Gly Ser Leu Thr Ala Thr Pro Val950 955 960 965ttc gac ggt gcg tca aac gaa gag ctc gca ggc ctg ctc gct aat tca 3644Phe Asp Gly Ala Ser Asn Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Asn Ser970 975 980cgt cca aac cgc gac ggc gac gtc atg gtt aac gcg gat ggt aaa gca 3692Arg Pro Asn Arg Asp Gly Asp Val Met Val Asn Ala Asp Gly Lys Ala985 990 995acg ctt atc gac ggt cgc tcc ggt gag cct tac ccg tac ccg gtt 3737Thr Leu Ile Asp Gly Arg Ser Gly Glu Pro Tyr Pro Tyr Pro Val100010051010tcc atc ggc tac atg tac atg ctg aag ctg cac cac ctc gtt gac 3782Ser Ile Gly Tyr Met Tyr Met Leu Lys Leu His His Leu Val Asp101510201025gag aag atc cac gca cgt tcc act ggt cct tac tcc atg att acc 3827Glu Lys Ile His Ala Arg Ser Thr Gly Pro Tyr Ser Met Ile Thr103010351040cag cag cca ctg ggt ggt aaa gca cag ttc ggt gga cag cgt ttc 3872Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln Phe Gly Gly Gln Arg Phe104510501055ggc gaa atg gag gtg tgg gca atg cag gca tac ggc gct gcc tac 3917Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Met Gln Ala Tyr Gly Ala Ala Tyr106010651070aca ctt cag gag ctg ctg acc atc aag tct gat gac gtg gtt ggc 3962Thr Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser Asp Asp Val Val Gly107510801085cgt gtc aag gtc tac gaa gca att gtg aag ggc gag aac atc ccg 4007Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys Gly Glu Asn Ile Pro109010951100gat cca ggt att cct gag tcc ttc aag gtt ctc ctc aag gag ctc 4052Asp Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val Leu Leu Lys Glu Leu110511101115cag tcc ttg tgc ctg aac gtg gag gtt ctc tcc gca gac ggc act 4097Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu Ser Ala Asp Gly Thr112011251130cca atg gag ctc gcg ggt gac gac gac gac ttc gat cag gca ggc 4142Pro Met Glu Leu Ala Gly Asp Asp Asp Asp Phe Asp Gln Ala Gly113511401145gcc tca ctt ggc atc aac ctg tcc cgt gac gag cgt tcc gac gcc 4187Ala Ser Leu Gly Ile Asn Leu Ser Arg Asp Glu Arg Ser Asp Ala115011551160
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<221>misc_feature<223>上游區(qū)<400>7ggttgccggt aatcctgttg cggacaatat ttacaggatc tgacacattg ggcatcgctg 60ggggagtggt ctcgtaggcc gccggcgcat aggaggcgcc gggaaattgc tgaccaagca 120gagtgtaggg attgtcgttc acatcagaga t151<210>8<211>1926<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<400>8ggttgccggt aatcctgttg cggacaatat ttacaggatc tgacacattg ggcatcgctg 60ggggagtggt ctcgtaggcc gccggcgcat aggaggcgcc gggaaattgc tgaccaagca 120gagtgtaggg attgtcgttc acatcagaga tcagctctac aagagtgtct aagtggcggg 180cattccatgc tttggaggag cgatcttcaa attcctccaa agtgagttga cctcgggaaa 240cagctgcaga aagttcatcc acgacttggt ttcggttaag gtcagtggcg agcttctttg 300ctggttcgtt tccttgagga acagtcatgg gaaccattct aacaagggat ttggtgtttt 360ctgcggctag ctgataatgt gaacggctga gtcccactct tgtagttggg aattgacggc 420
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<221>misc_feature
<222>(1)..(1594)<223>人工序列的描述含有rpsL-1545等位基因的PCR產(chǎn)物<220>
<221>allele<222>(659)..(1039)<223>rpsL-1545等位基因<220>
<221>mutation<222>(786)..(786)<223>腺嘌呤交換為鳥嘌呤<400>9gatctagagg ttgccggtaa tcctgttgcg gacaatattt acaggatctg acacattggg 60catcgctggg ggagtggtct cgtaggccgc cggcgcatag gaggcgccgg gaaattgctg 120accaagcaga gtgtagggat tgtcgttcac atcagagatc agctctacaa gagtgtctaa 180gtggcgggca ttccatgctt tggaggagcg atcttcaaat tcctccaaag tgagttgacc 240tcgggaaaca gctgcagaaa gttcatccac gacttggttt cggttaaggt cagtggcgag 300cttctttgct ggttcgtttc cttgaggaac agtcatggga accattctaa caagggattt 360ggtgttttct gcggctagct gataatgtga acggctgagt cccactcttg tagttgggaa 420ttgacggcac ctcgcactca agcgcggtat cgcccctggt tttccgggac gcggtggcgc 480atgtttgcat ttgatgaggt tgtccgtgac atgtttggtc gggccccaaa aagagccccc 540ttttttgcgt gtctggacac tttttcaaat ccttcgccat cgacaagctc agccttcgtg 600ttcgtccccc gggcgtcacg tcagcagtta aagaacaact ccgaaataag gatggttcat 660gccaactatt cagcagctgg tccgtaaggg ccgccacgat aagtccgcca aggtggctac 720cgcggcactg aagggttccc ctcagcgtcg tggcgtatgc acccgtgtgt acaccaccac 780ccctaggaag cctaactctg ctcttcgtaa ggtcgctcgt gtgcgcctta cctccggcat 840cgaggtttcc gcttacatcc ctggtgaggg ccacaacctg caggagcact ccatggtgct 900cgttcgcggt ggtcgtgtta aggacctccc aggtgtccgt tacaagatcg tccgtggcgc 960actggatacc cagggtgtta aggaccgcaa gcaggctcgt tccccgctac ggcgcgaaga1020ggggataatt aaaaatgcgt aaatcagcag ctcctaagcg tccagtagtt caggaccctg1080tatacaagtc cgagctcgtt acccagctcg taaacaagat cctcatcggt ggcaagaagt1140ccaccgcaga gcgcatcgtc tacggtgcac tcgagatctg ccgtgagaag accggcaccg1200atccagtagg aaccctcgag aaggctctcg gcaacgtgcg tccagacctc gaagttcgtt1260cccgccgtgt tggtggcgct acctaccagg tgccagtgga tgttcgccca gagcgcgcaa1320acaccctcgc actgcgttgg ttggtaacct tcacccgtca gcgtcgtgag aacaccatga1380
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<221>引物<222>(1)..(20)<223>rpsL-1<400>10cagctctaca agagtgtcta20<210>11<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>引物<222>(1)..(20)<223>rpsL-2<400>11tggtcgtggt cttaccagca 20<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>rpsL_XL-A1<400>12gatctagagg ttgccggtaa tcctgttg28<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>rpsL_XL-E1<400>13gatctagacg caggctgcca gcttattc 28
<210>14<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>引物<222>(1)..(20)<223>rL-1<400>14atgaggttgt ccgtgacatg20
權(quán)利要求
1.來自棒狀細菌的一種分離的多核苷酸，其包含選自如下一組的編碼rpsL基因的多核苷酸序列a)與編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，所述多肽優(yōu)選具有核糖體蛋白S12的活性。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細菌中復制的一種優(yōu)選是重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，包含如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.權(quán)利要求2的能復制的DNA，包含(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中的中性功能的有義突變。
6.權(quán)利要求5的能復制的DNA，特征在于雜交在相當于最高2×SSC的嚴格條件下進行。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
8.一種棒狀細菌，其中所述rpsL基因是增強的，尤其是過表達的。
9.谷氨酸棒桿菌菌株DM1545，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號DSM13992。
10.一種發(fā)酵制備L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，包括進行以下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)所需L-氨基酸的棒狀細菌，其中至少rpsL基因或編碼其的核苷酸序列是增強的，尤其是過表達的；b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L-氨基酸，及c)分離L-氨基酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所用細菌中，所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因被額外增強。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所用細菌中，降低所需的L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分關(guān)閉。
13.權(quán)利要求10的方法，其中使用經(jīng)一質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼rpsL基因的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求10的方法，其中編碼rpsL基因的多核苷酸的表達是增強的，尤其是過表達的。
15.權(quán)利要求10的方法，其中多核苷酸rpsL編碼的多肽(酶蛋白)的調(diào)節(jié)/催化性質(zhì)被提高。
16.權(quán)利要求10的方法，其中為制備L-氨基酸，發(fā)酵這樣的棒狀微生物，該微生物中選自以下一組的一或多種基因是同時增強或過表達的16.1編碼二氫二羧酸合酶的dapA基因16.2編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因16.3編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因16.4編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因16.5編碼葡糖6-磷酸脫氫酶的zwf基因16.6編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因16.7編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因16.8編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因16.9編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因16.10編碼Zwal蛋白的zwal基因16.11編碼RNA聚合酶B的rpoB基因。
17.權(quán)利要求10的方法，其中為制備L-氨基酸，發(fā)酵這樣的棒狀微生物，該微生物菌中選自以下一組的一或多種基因是同時弱化的17.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因17.2編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因17.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因17.4編碼Zwa2蛋白的zwa2基因。
18.一種棒狀細菌，其含有攜帶權(quán)利要求1的多核苷酸的一種載體。
19.權(quán)利要求10-17任一項的方法，其中應用谷氨酸棒桿菌菌種的微生物。
20.一種揭示RNA，cDNA和DNA以分離編碼核糖體蛋白S12或與rpsL基因的序列具有高度相似性的核酸或多核苷酸或基因的方法，包括應用權(quán)利要求1，2，3或4的多核苷酸序列作為雜交探針。
21.權(quán)利要求20的方法，其中應用陣列，微陣列或DNA芯片。
22.源自棒狀細菌并編碼核糖體S12蛋白的一種DNA，其中SEQID NO2序列第38-48位之間的相關(guān)氨基酸序列通過氨基酸置換而修改。
23.源自棒狀細菌并編碼核糖體S12蛋白的一種DNA，其中在SEQID NO2序列第43位的相關(guān)氨基酸序列含有除L-賴氨酸之外的任何其它來自于蛋白質(zhì)的氨基酸。
24.源自棒狀細菌并編碼核糖體S12蛋白的一種DNA，其中在SEQID NO2序列第43位的相關(guān)氨基酸序列含有L-組氨酸或L-精氨酸。
25.權(quán)利要求24的DNA，其編碼核糖體S12蛋白，其氨基酸序列示于SEQ ID NO4，在第43位含有L-精氨酸。
26.、權(quán)利要求25的DNA，其在相當于SEQ ID NO3所示序列第627位的編碼區(qū)第128位含有核酸堿基鳥嘌呤。
27.一種棒狀細菌，其含有權(quán)利要求22，23，24，25或26的DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包含選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明還涉及使用其中至少rpsL基因是增強形式的棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L－氨基酸的方法，還涉及包含本發(fā)明序列的多核苷酸序列作為雜交探針的應用。
文檔編號C07K14/34GK1524089SQ02804971
公開日2004年8月25日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月16日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 布麗吉特·巴特, 斯特凡·漢斯, 卡羅琳·克羅伊策, 托馬斯·赫爾曼, 瓦爾特·普費弗勒, 米夏埃爾·賓德爾, 克羅伊策, 普費弗勒, 漢斯, 赫爾曼, 爾 賓德爾, 特 巴特, 貝蒂娜 默克爾 申請人:德古薩股份公司