專利名稱：提高的活性蛋白回收率的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白的處理和純化領域。
背景許多真核來源的蛋白的高水平表達已經(jīng)在原核表達宿主中獲得。這種真核蛋白常常錯折疊，并在原核宿主中累積成不可溶的包含體。為了獲得生物活性蛋白，在包含體中捕獲的蛋白必須是解折疊的，并在含有離液劑和還原硫醇的嚴格條件下重折疊。
真核來源的蛋白在真核宿主中表達可避免這些問題。如果能正確設計表達載體(例如，使用分泌信號肽等)，那么真核細胞系可傾向于正確加工并分泌可溶性產(chǎn)物形式的胞外真核蛋白。
然而，因為已經(jīng)對表達系統(tǒng)和載體作了改進，從而使真核宿主的表達水平達到最大，因此并不是由這些宿主表達和分泌的所有重組蛋白都具有所需的，最大活性的構象。設計本發(fā)明用來克服這種表達問題，并使生物活性蛋白的產(chǎn)率最大。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)，即，并不是由真核宿主細胞表達的所有重組蛋白制備物都折疊成天然的三級構象。此外，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組蛋白的區(qū)域或結構域可正確折疊，而其它區(qū)域或結構域則可能具有不需要的構象。因此，一方面，本發(fā)明提供一種方法，即，使重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸足以提高所需構象異構體的相對比例的時間，其中所述重組蛋白制備物含有重組蛋白的至少兩種異構體的混合物，然后測定混合物中所需構象異構體的相對比例。另一方面，本發(fā)明包括使哺乳動物細胞產(chǎn)生的重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑在約pH7-11下接觸，并分離具有所需構象的重組蛋白制備物的級分。優(yōu)選的重組蛋白是糖基化重組蛋白，例如，真核細胞產(chǎn)生的那些。本發(fā)明還涉及把所得制備物制劑化成無菌單位劑量形式的方法，及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的組合物。
附圖簡述

圖1.TNFR∶Fc的疏水相互作用層析(HIC)。如圖所示，該TNFR∶Fc制備物在HIC過程中洗脫為3個不同的峰，這3個峰收集成#2級分和#3級分。
圖2.#2和#3級分的圓二色性分析。以平均剩余(residue)橢圓率表示的近-UV圓二色性測量結果在圖2中給出。圖2A描述光譜數(shù)據(jù)；#3級分的線距離約270nM處，用箭頭突出顯示的負位移最近，這歸因于二硫鍵，#2級分的線是更深的實線。圖2B描述#2級分(小虛線)和#3級分(大虛線)的曲線擬合數(shù)據(jù)。
圖3.使用在線大小排阻層析(SEC)，紫外線(UV)，光散射(LS)，和折射率(RI)(在線SEC/UV/LS/RI)連續(xù)檢測，從而測定分子量。圖3A是#3級分，圖3B是#2級分。垂直的虛線表示評估主峰周圍區(qū)域的分子量測定的部分。
圖4.#2和#3級分的差示掃描量熱分析。圖4A是未校數(shù)據(jù)，圖4B是基線-校正數(shù)據(jù)。熱解鏈轉換由垂直的虛線標記。箭頭表示焓位移。圖4B中的水平虛線用作基線參照。
圖5.#2級分與結合活性的相互關系。測試了來源于6個不同細胞系的6個不同TNFR∶Fc制備物(用A-F表示)的#2級分(深色菱形)比例提高的百分比與TNFα結合單位(淺色菱形)提高的百分比之間的相互關系。
圖6.各種不同濃度的半胱氨酸對#3級分轉化成#2級分的影響。用各種濃度(0.25-5.0mM)的半胱氨酸處理蛋白樣品，利用HIC評估#3級分的改變。X-軸表示在指定的半胱氨酸濃度下，測試4批不同的TNFR∶Fc達18小時。每批中#3級分轉化成#2級分的百分比在y軸繪制。
圖7.半胱氨酸濃度對#3級分比例的影響。用各種濃度的半胱氨酸(0-50mM)處理4批不同的蛋白樣品，并通過HIC評估#3級分的所得水平。
圖8.溫度對二硫鍵交換的影響。室溫或4℃時，在有或沒有銅存在的條件下，處理蛋白級分不同的時間。圖8A描述6小時后，HIC#3級分的改變，圖8B描述18小時后，HIC#3級分的改變。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供提高活性重組蛋白回收率的方法。具體而言，本發(fā)明包括促進重組蛋白制備物中的所需蛋白構象。值得注意的是，本發(fā)明提供在無需進行嚴格的離液劑(例如，強變性劑，如SDS，鹽酸胍或尿素)處理的情況下，改變蛋白結構的溫和方法。對重組蛋白制備物使用本發(fā)明的方法可使制備物中具有所需構象的重組蛋白百分比較高，或相對比例更高。重組蛋白所需構象是蛋白的三維結構，它與天然存在的蛋白結構域的功能非常相似，和/或可復制它們的功能。當打算把重組蛋白用作體內藥物或生物制備物時，這種溫和的方法特別有利。
通常，當重組蛋白含有受體蛋白的結構域時，所需構象將對受體的相關配體具有較高的結合親和性(并，因此，具有較低的解離常數(shù))。例如，TNF-結合分子的所需構象將對TNF(例如，TNF-α)具有較高的結合親和性和較低的解離常數(shù)。
此外，重組蛋白所需構象優(yōu)選比不需要的構象更耐熱(在相同的溶液環(huán)境中測量)。耐熱性可以任何一種方式測量，例如，解鏈溫度轉換(Tm)。重組蛋白所需構象可能具有，或沒有不同的二硫鍵排列，雖然優(yōu)選所述構象含有天然的二硫鍵。重組蛋白所需構象還可具有其它三級結構特性。例如，所需構象可以是單體，二聚物，三聚物，四聚物，或某些蛋白的其它更高級形式。對于本發(fā)明而言，蛋白的“構象”是它的三維結構。當它們具有與能量最小值相應的不同構象，而且它們彼此之間僅僅是原子的空間定向不同時，具有相同一級氨基酸序列的多肽的兩種不同結構互為彼此的“構象異構體”。構象異構體可以相互轉化(是指圍繞著除斷裂鍵之外的鍵自由旋轉)。當具有與能量最小值相應的不同構象，它們彼此之間僅僅是原子的空間定向不同，而且它們不能在沒有共價鍵斷裂的條件下相互轉化時，具有相同一級氨基酸序列的多肽的兩種不同結構是“構型異構體”。在本發(fā)明的實際操作中，構型異構體可通過，例如，斷裂并任選重新形成二硫鍵而相互轉化。
因此，一方面，本發(fā)明包括使糖基化重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑充分接觸足以提高所需構型異構體的相對比例的時間，其中所述重組蛋白制備物含有重組蛋白的至少兩種構型異構體的混合物，然后測定混合物中所需構型異構體的相對比例。另一方面，本發(fā)明提供一種方法，即，使哺乳動物細胞產(chǎn)生的重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑在約pH7-11下接觸，并分離具有所需構象的重組蛋白制備物的級分。優(yōu)選的重組蛋白是糖基化重組蛋白，如真核細胞產(chǎn)生的那些。
本發(fā)明可用于處理幾乎任何一種蛋白，從而促進所需構象。蛋白通常被理解為是至少約10個氨基酸，更優(yōu)選至少約25個氨基酸，甚至更優(yōu)選至少約75個氨基酸，最優(yōu)選至少約100個氨基酸的多肽。本發(fā)明方法可特別用于處理具有至少約3個半胱氨酸殘基，更優(yōu)選至少約8個半胱氨酸殘基，更優(yōu)選至少約15個半胱氨酸殘基，更優(yōu)選至少約30個半胱氨酸殘基，甚至更優(yōu)選至少約50-150個半胱氨酸殘基的蛋白。
通常，本發(fā)明方法用于改進重組蛋白的生產(chǎn)過程。重組蛋白是通過基因工程過程產(chǎn)生的蛋白。術語“基因工程”是指用于產(chǎn)生宿主細胞的任何重組DNA或RNA方法，其中所述宿主細胞可高水平，低水平表達基因，和/或基因的突變形式。換句話說，細胞已經(jīng)用重組多核苷酸分子轉染，轉化或轉導，并由此改變，以便使細胞改變所需蛋白的表達。通過基因工程方法改造細胞和/或細胞系，從而表達目標蛋白的方法和載體是本領域那些技術人員熟知的；例如，各種技術在CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等，eds.(Wiley & Sons，New York，1988，每個季度更新一次)和Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press，1989)中列舉?；蚬こ碳夹g包括但不限制于表達載體，定向同源重組和基因激活(見，例如，美國專利第5,272,071，Chappel)及通過基因工程轉錄因子進行的反式激活(見，例如，Segal等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)2758-63)。
本發(fā)明可特別用于提高糖基化蛋白的產(chǎn)生。特別是，使真菌細胞系統(tǒng)(例如，酵母，絲狀真菌)和哺乳動物細胞系統(tǒng)分泌的蛋白糖基化。優(yōu)選，所述蛋白是由適于在細胞培養(yǎng)基中生長的哺乳動物生產(chǎn)細胞分泌的。通常用于工業(yè)中的這種細胞的例子是CHO，VERO，BHK，HeLa，CV1(包括Cos)，MDCK，293，3T3，骨髓瘤細胞系(特別是鼠的)，PC12和WI38細胞。特別優(yōu)選的宿主細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其廣泛用于生產(chǎn)一些復合重組蛋白，例如，細胞因子，凝血因子，和抗體(Brasel等，1996，Blood 882004-2012；Kaufman等，1988，J.Biol.Chem 2636352-6362；McKinnon等，1991，J Mol Endocrinol6231-239；Wood等，1990，J.Immunol 1453011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)-缺陷突變細胞系(Urlaub等，1980，ProcNatl AcadSci USA 774216-4220)，DXB11和DG-44是可選擇的CHO宿主細胞系，這是因為有效DHFR的可選擇及可擴增基因表達系統(tǒng)可使這些細胞中的重組蛋白高水平表達(Kaufman R.J.，1990，Meth Enzymol185527-566)。此外，這些細胞作為粘附或懸浮培養(yǎng)物而易于操縱，并顯示出相對較好的遺傳穩(wěn)定性。CHO細胞及在它們中表達的重組蛋白已經(jīng)被廣泛描述過，而且已經(jīng)被管理機構批準用于臨床生產(chǎn)。
人們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明對于改進蛋白的生產(chǎn)過程而言，是一種溫和而且有效的方法，其中所述蛋白可有多個構象和/或含有多于一個的結構域。“結構域”是多肽鏈的連續(xù)區(qū)，它具有特定的三級結構和/或特定的活性，并位于多肽鏈的區(qū)域中。例如，蛋白的一個結構域可對一個配體具有結合親和性，而且蛋白的一個結構域可對另一個配體具有結合親和性。在耐熱的意義上，結構域是指蛋白的協(xié)同解折疊單位。這種含有多于一個結構域的蛋白可作為一種蛋白天然存在，或作為融合蛋白而被基因工程改造過。此外，多肽的結構域還可具有亞結構域。
一方面，本發(fā)明方法可用于重組蛋白制備物，其中蛋白的至少一個結構域具有穩(wěn)定的構象，且蛋白的至少一個結構域具有不穩(wěn)定的構象。術語“穩(wěn)定”和“不穩(wěn)定”是相對的術語。當在相同溶液中測量時，具有穩(wěn)定構象的蛋白的結構域較之蛋白的不穩(wěn)定結構域具有更高的解鏈溫度(Tm)。在相同溶液中測量時，當Tm的差值至少約為2℃，更優(yōu)選約4℃，更優(yōu)選約7℃，更優(yōu)選約10℃，更優(yōu)選約15℃，更優(yōu)選約20℃，甚至更優(yōu)選約25℃，最優(yōu)選約30℃時，與另一個結構域相比，其中一個結構域是穩(wěn)定的。
本發(fā)明通常還適用于具有Fc結構域，和其它結構域的蛋白(例如，抗體，和Fc融合蛋白)。例如，在下面列舉的其中一個非限制性實施方案中，TNFR∶Fc，分子Fc部分的Tm為69.1℃和83.4℃，而分子TNFR部分的Tm為52.5℃(在更需要的構象中)至49.7℃(在不太需要的構象中)。
特別優(yōu)選的蛋白是基于蛋白的藥物，也稱作生物制備物。優(yōu)選，所述蛋白被表達為胞外產(chǎn)物。可使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白包括但不限制于flt3配體(在WO94/28391中描述，其全部引入此處作為參考)，CD40配體(在US6,087,329中描述，其全部引入此處作為參考)，紅細胞生成素，血小板生成素，降鈣素，F(xiàn)as配體，NF-κB受體激活劑的配體(RANKL)，腫瘤壞死因子(TNF)-相關的編程性細胞死亡-誘導配體(TRAIL，在WO97/01633中描述，其全部引入此處作為參考)，胸腺基質衍生的淋巴細胞生成素，粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，在澳大利亞專利第588819中描述，其全部引入此處作為參考)，肥大細胞生長因子，干細胞生長因子，表皮生長因子，RANTES，生長激素，胰島素，促胰島激素，胰島素樣生長因子，甲狀旁腺激素，干擾素，神經(jīng)生長因子，胰高血糖素，白介素1-18，集落刺激因子，淋巴細胞毒素-β，腫瘤壞死因子(TNF)，白血病抑制因子，制癌蛋白-M，和細胞表面分子ELK及Hek的各種配體(如，eph-相關激酶或LERKS的配體)。按照本發(fā)明方法純化的蛋白的描述見，例如，Human CytokinesHandhook for Basicand ClinicalResearch，Vol.II(Aggarwal和Gutterman，eds.BlackwellSciences，Cambridge，MA，1998)；Growth FactorsAPracticalApproach(Mckay和Leigh，eds.，Oxford University Press Inc.，New York，1993)；和The Cytokine Handbook(A.W.Thompson，ed.，Academic Press，San Diego，CA，1991)。
前述任何一種蛋白的受體，特別是可溶形式的受體制備物，都可使用本發(fā)明方法提高，包括兩種形式的TNFR(也稱為p55和p75)，I和II型白介素-1受體(在EP 0 460 846，US 4,968,607，和US5,767,064中描述，它們全部引入此處作為參考)，白介素-2受體，白介素-4受體(在EP 0 367 566和US 5,856,296中描述，它們全部引入此處作為參考)，白介素-15受體，白介素-17受體，白介素-18受體，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子受體，粒細胞集落刺激因子受體，制癌蛋白-M和白血病抑制因子，NF-κB受體激活劑(RANK，在US6,271,349中描述，其全部引入此處作為參考)的受體，TRAIL的受體(包括TRAIL受體1，2，3，和4)，及含有死亡結構域的受體，如Fas或編程性細胞死亡-誘導受體(AIR)。
可使用本發(fā)明方法改進其產(chǎn)生方法的其它蛋白包括分化抗原的簇(也稱為CD蛋白)，例如，在Leukocyte Typing VI(Proceedingsof the VIth International Workshop and Conference；Kishimoto，Kikutani等，eds.；Kobe，Japan，1996)中公開的那些，或在隨后討論會中公開的CD分子。這種分子的例子包括CD27，CD30，CD39，CD40；及其配體(CD27配體，CD30配體和CD40配體)。這些之中，有一些是TNF受體家族的成員，其還包括41BB和OX40；所述配體通常是TNF家族的成員(41BB配體和OX40配體)；因此，TNF和TNFR家族的成員也可使用本發(fā)明生產(chǎn)。
酶活性蛋白也可按照本發(fā)明制備。例子包括金屬蛋白酶-disintegrin家族的成員，各種激酶，葡糖腦苷脂酶，超氧化物歧化酶，組織纖溶酶原激活劑，因子VIII，因子IX，載脂蛋白E，載脂蛋白A-I，珠蛋白，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，TNF-α轉化酶，及很多其它酶。酶活性蛋白的配體也可通過應用本發(fā)明而被表達。
本發(fā)明的組合物和方法也可用于制備其它類型的重組蛋白，包括免疫球蛋白分子或其一部分，和嵌合抗體(例如，具有與鼠抗原結合區(qū)偶聯(lián)的人恒定區(qū)的抗體)或其片段。許多技術都是已知的，其中編碼免疫球蛋白的分子可被操作產(chǎn)生能夠表達重組蛋白，如單鏈抗體，具有較高親和性的抗體，或其它基于抗體的多肽的DNAs(見，例如，Larrick等，1989，Biotechnology 7934-938；Reichmann等，1988，Nature 332323-327；Roberts等，1987，Nature 328731-734；Verhoeyen等，1988，Science 2391534-1536；Chaudhary等，1989，Nature 339394-397)。完全的人類抗體制備物(如使用轉基因動物制備，并可任選進一步在體外修飾)，及人源化抗體也可用于本發(fā)明中。術語人源化抗體還包括單鏈抗體。見，例如，Cabilly等，美國專利第4,816,567；Cabilly等，歐洲專利第0,125,023B1；Boss等，美國專利第4,816,397；Boss等，歐洲專利第0,120,694B1；Neuberger，M.S.等，WO86/01533；Neuberger，M.S.等，歐洲專利第0,194,276B1；Winter，美國專利第5,225,539；Winter，歐洲專利第0,239,400B1；Queen等，歐洲專利第0451216B1；和Padlan，E.A.等，EP 0 519 596A1。本發(fā)明方法還可在制備含有抗體和細胞毒性或發(fā)光物質的偶聯(lián)物的過程中使用。這種物質包括美坦素衍生物(如DM1)；腸毒素(如葡萄球菌腸毒素)；碘同位素(如碘-125)；锝同位素(如Tc-99m)；菁熒光染料(如Cy5.5.18)；和核糖體-滅活蛋白(如bouganin，gelonin，或皂草素-S6)。
本發(fā)明考慮的抗體或抗體/細胞毒素或抗體/發(fā)光團偶聯(lián)物的例子包括識別上述任何一種蛋白或其組合和/或下列抗原的那些CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1α，IL-1β，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受體，IL-4受體，IL-6受體，IL-13受體，IL-18受體亞單位，PDGF-β，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-β1，EGF受體，VEGF受體，C5補體，IgE，腫瘤抗原CA125，腫瘤抗原MUC1，PEM抗原，LCG(它是一種被表達，并與肺癌有關的基因產(chǎn)物)，HER-2，腫瘤相關的糖蛋白TAG-72，SK-1抗原，以較高水平存在于結腸和/或胰腺癌患者血清中的腫瘤相關表位，在乳腺，結腸，鱗狀上皮細胞，前列腺，胰腺，肺，和/或腎癌細胞和/或黑素瘤，神經(jīng)膠質瘤，或成神經(jīng)細胞瘤細胞，腫瘤壞死核心上表達的癌癥-相關抗原決定部位或蛋白，整聯(lián)蛋白α4β7，整聯(lián)蛋白VLA-4，B2整聯(lián)蛋白，TRAIL受體1，2，3，和4，RANK，RANK配體，TNF-α，粘附分子VAP-1，上皮細胞粘附分子(EpCAM)，胞內粘附分子-3(ICAM-3)，白細胞整聯(lián)蛋白粘附素，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，心肌球蛋白的重鏈，甲狀旁腺激素，rNAPc2(它是VIIa因子-組織因子的抑制劑)，MHCI，癌胚抗原(CEA)，α-甲胎蛋白(AFP)，腫瘤壞死因子(TNF)，CTLA-4(它是細胞毒性T淋巴細胞-相關的抗原)，F(xiàn)c-γ-1受體，HLA-DR10β，HLA-DR抗原，L-選擇蛋白，IFN-γ，呼吸道合胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，乙肝病毒(HBV)，變異鏈球菌，和金黃色葡萄球菌。
各種融合蛋白制備物也可使用本發(fā)明方法制備。這種融合蛋白的例子包括表達為與免疫球蛋白分子的一部分的融合物的蛋白，表達為與拉鏈部分的融合物的蛋白，和新的多功能蛋白，如細胞因子和生長因子的融合蛋白(即，GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。WO93/08207和WO96/40918分別描述了CD40L分子的各種可溶性寡聚形式的制備物，包括免疫球蛋白融合蛋白，和拉鏈融合蛋白；其中討論的技術也適用于其它蛋白。上述任何一種分子均可被表達為融合蛋白，包括但不限制于細胞受體分子，酶，激素，細胞因子的胞外結構域，免疫球蛋白分子，拉鏈結構域，和抗原決定部位的一部分。
重組蛋白制備物可以是細胞培養(yǎng)物的上清液，細胞提取物，但優(yōu)選它們的部分純化級分。“部分純化”是指已經(jīng)進行了一些分級分離過程，但所存在的多肽種類比所需蛋白或蛋白構象還要多(至少10％)。本發(fā)明方法的其中一個優(yōu)點是重組蛋白制備物的濃度可以非常高，優(yōu)選濃度為0.1-20mg/ml，更優(yōu)選0.5-15mg/ml，更優(yōu)選1-10mg/ml。
重組蛋白制備物最初可通過在適于表達多肽的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)重組宿主細胞而制備。所述多肽還可被表達為轉基因動物的產(chǎn)物，例如，轉基因母牛，山羊，豬，或綿羊的奶成分，其特征在于含有編碼多肽的核苷酸序列的體細胞或生殖細胞。使用已知方法還可純化，或部分純化這種培養(yǎng)物或組分(例如，培養(yǎng)物或細胞提取物或體液)中的所得表達多肽。分級分離過程包括但不限制于一個或多個過濾，離心，沉淀，相分離，親和純化，凝膠過濾，離子交換層析，疏水相互作用層析(HIC；使用樹脂如苯醚，丁醚，或丙醚)，HPLC步驟，或上述一些步驟的結合。
例如，多肽的純化包括含有與多肽結合的試劑的親和柱；在這種親和樹脂，如伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖，肝素-toyopearl或Cibacrom藍3GA Sepharose上進行的一個或多個柱步驟；包括洗脫的一個或多個步驟；和/或免疫親和性層析。所述多肽可以促進純化的形式表達。例如，它可被表達成融合多肽，如麥芽糖結合多肽(MBP)，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)的那些。表達和純化這種融合多肽的試劑盒可分別從New England Biolab(Beverly，Mass.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和InVitrogen購得。所述多肽可用表位標記，隨后通過使用針對這種抗原決定部位的特異性抗體而純化。這種表位(FLAG)是從Kodak(New Haven，Conn.)購得的。還可利用含有多肽-結合多肽，如重組蛋白單克隆抗體，親和純化表達多肽的親和柱。其它類型的親和純化步驟可以是蛋白A或蛋白G柱，其中親和劑結合含有Fc結構域的蛋白。多肽可使用常規(guī)技術從親和柱上除去，例如，先放在高鹽洗脫緩沖液中，然后透析到低鹽緩沖液中，或根據(jù)所用親和基質改變pH或其它成分，或使用天然存在的親和部分的底物競爭除去。在下面所列的其中一個實施方案中，重組蛋白制備物已經(jīng)在蛋白A親和柱上被部分純化。
以各種形式組合的上述純化步驟的一些或全部還可用于制備重組蛋白的適宜制備物，從而用于本發(fā)明的方法中，和/或在使重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸之后，進一步純化重組多肽?；緵]有其它哺乳動物多肽的多肽被稱為“分離的多肽”。
所述多肽還可通過已知的常規(guī)化學合成產(chǎn)生。通過合成方式構造多肽的方法對于本領域那些技術人員而言是已知的。所述合成構建的多肽序列可在體外糖基化。
所需的最終純度取決于多肽的預定用途。例如，當多肽體內給藥時，需要相對較高的純度。在這種情況下，純化多肽，以便在通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析時，檢測不到與其它多肽相應的多肽帶。相關領域的技術人員應當認識到，由于糖基化作用不同，翻譯后加工不同等原因，與多肽相應的多個帶可通過SDS-PAGE顯示。最優(yōu)選，將本發(fā)明的多肽純化至基本均一，這可通過進行SDS-PAGE分析后的單一多肽帶表示。所述多肽帶可通過銀染色，考馬斯藍染色，和/或放射自顯影(如果多肽被放射性標記過)顯示。
“接觸”是指與溶液接觸，和/或暴露于溶液中?？墒沟鞍谆蚨嚯慕佑|，同時與固體支持物(例如，親和柱或層析基質)結合。優(yōu)選，溶液是緩沖的。為使具有所需構象的蛋白產(chǎn)率最大，應選擇可保護蛋白穩(wěn)定性，而且最適于二硫鍵交換的溶液pH值。在本發(fā)明的實際操作中，溶液pH優(yōu)選不是強酸性的。因此，優(yōu)選的pH值范圍大于pH5，優(yōu)選約pH6-pH11，更優(yōu)選約pH7-pH10，更優(yōu)選約pH7.6-pH9.6。在下面列舉的使用TNFR∶Fc的本發(fā)明其中一個非限制性實施方案中，最佳pH值約為pH8.6。然而，本發(fā)明具體實施方案的最佳pH值可由本領域那些技術人員通過實驗很容易地確定。
所述還原/氧化偶聯(lián)劑是還原劑的來源。優(yōu)選的還原劑是游離硫醇。所述還原/氧化偶聯(lián)劑優(yōu)選包括還原和氧化谷胱甘肽，二硫蘇糖醇(DTT)，2-巰基乙醇，二硫硝基苯甲酸鹽，半胱氨酸和胱氨酸。為了便于使用而且更經(jīng)濟，還可使用還原谷胱甘肽和/或還原半胱氨酸。
還原/氧化偶聯(lián)劑以足以提高所需構象相對比例的濃度存在。還原/氧化偶聯(lián)劑的最佳濃度取決于蛋白的濃度和蛋白中的二硫鍵數(shù)。例如，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用2mg/ml濃度(大約14μM蛋白或400μM二硫化物)，具有29個二硫鍵的蛋白(TNFR∶Fc)，具有2mM還原硫醇的還原/氧化偶聯(lián)劑可更好地作用，從而提高所需構象的相對比例。這與約35個游離硫醇對1個二硫鍵的比例相一致。然而，人們還發(fā)現(xiàn)20-400個游離硫醇/二硫化物的比例也可起作用。當然，特定濃度所用硫醇的量可根據(jù)硫醇還原能力的不同而改變，并可由本領域技術人員很容易地確定。
因此，通常，還原/氧化偶聯(lián)劑中游離硫醇的濃度約為0.05mM-50mM，更優(yōu)選約0.1mM-25mM，更優(yōu)選約0.2mM-20mM。
此外，還原/氧化偶聯(lián)劑可含有比還原硫醇成分大致更高，相等或更低濃度的氧化硫醇。例如，還原/氧化偶聯(lián)劑可以是還原谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽的組合。人們通過實際的操作發(fā)現(xiàn)，還原谷胱甘肽與氧化谷胱甘肽的比例約為1∶1-100∶1(還原硫醇∶氧化硫醇)時，可發(fā)揮同等作用?？蛇x擇地，在另一個實施方案中，還原/氧化偶聯(lián)劑可以是半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。因此，當原始還原/氧化偶聯(lián)劑中含有氧化硫醇時，還原硫醇與氧化硫醇的比例優(yōu)選約1∶10-1000∶1，更優(yōu)選約1∶1-500∶1，更優(yōu)選約5∶1-100∶1，甚至更優(yōu)選約10∶1。
使重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑充分接觸一段時間，從而提高所需構象的相對比例。任何比例的相對提高都是我們所期望的，但優(yōu)選至少有10％具有不需要構象的蛋白轉化成具有所需構象的蛋白。更優(yōu)選至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，甚至80％的蛋白從不需要的構象轉化成所需構象。用本發(fā)明方法獲得的一般產(chǎn)率為40-80％。如果接觸步驟是對部分或高度純化的重組蛋白制備物進行的，那么接觸步驟可進行短至約1-4小時，長至約6小時-4天。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約4-16小時或約18小時的接觸步驟都可很好地作用。所述接觸步驟還可在其它步驟，如固相或過濾或純化的任何其它步驟過程中進行。
本發(fā)明方法可在較寬的溫度范圍進行。例如，本發(fā)明方法可在約4℃-37℃成功進行，然而最好的結果是在低溫獲得的。使部分或完全純化的重組蛋白制備物接觸的典型溫度約為4℃-25℃(室溫)，但也可在更低和更高的溫度下進行。
重組蛋白制備物還可以各種適宜的體積與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸。例如，本發(fā)明方法已經(jīng)在分析實驗室規(guī)模(1-50mL)，制備規(guī)模(50mL-10L)和生產(chǎn)規(guī)模(10L或更多)成功進行。因此，本發(fā)明方法可小規(guī)模和大規(guī)模地重復進行。
在優(yōu)選方面，接觸步驟是在沒有大量離液劑，如SDS，尿素和鹽酸胍存在下進行的。需要大量離液劑是為了觀察看得見的解折疊。通常，存在小于1M的離液劑，更優(yōu)選小于0.5M，更優(yōu)選小于0.1M的離液劑。當不打算向溶液中加離液劑時，溶液基本上沒有離液劑(例如，SDS，尿素和鹽酸胍)，而且可能僅僅存在痕量水平(例如，小于10mM)(例如，來源于容器或細胞副產(chǎn)物)。
二硫鍵交換可以本領域那些技術人員已知的任何方式終止。例如，通過純化步驟除去還原/氧化偶聯(lián)劑或使其濃度降低，和/或通過，例如，將溶液酸化而化學滅活。通常，當通過酸化終止反應時，含有還原/氧化偶聯(lián)劑的溶液pH值降至低于7。優(yōu)選，pH值降至低于pH6。通常，pH值降至約pH2-pH7之間。
測定蛋白構象，及混合物中蛋白構象的相對比例可使用各種分析和/或定量技術的任何一種進行。如果蛋白構象間存在活性差異，那么可通過活性測定法(例如，與配體結合，酶活性，生物活性等)測定混合物中構象的相對比例。例如，在下面所述的其中一個非限制性實施方案中，可使用固相TNF結合測定法拆分TNFR∶Fc的至少2個不同構象。該測定法，基本上是對于IL-1R進行描述的(Slack等，1993，J.Biol.Chem.2682513-2524)，可通過配體-受體結合的締合常數(shù)，解離常數(shù)或抑制常數(shù)的改變來區(qū)分各種蛋白構象之間的相對比例?？蛇x擇地，結合結果以活性單位/mg蛋白g表示。
如果在層析，電泳，過濾或其它純化技術過程中，兩種構象不同拆分，那么可使用這種純化技術測定混合物中構象的相對比例。例如，在下面所述的非限制性實施方案中，TNFR∶Fc的至少兩種不同構象可通過疏水相互作用層析分離。此外，因為遠-UV圓二色性已經(jīng)用于評估蛋白的二級結構組成(Perczel等，1991，Protein Engrg.4669-679)，因此這種技術可確定是否存在選擇性的蛋白構象。用于測定構象的另一種技術是熒光光譜，它可用于確定歸因于色氨酸和酪氨酸熒光的三級結構的補充差異。可用于確定構象差異及構象相對比例的其它技術是測量聚集狀態(tài)的在線SEC，測量解鏈轉換(Tm’s)的差示掃描量熱法，及成分的焓，和離液劑解折疊。
術語“分離”是指混合物中至少一個成分自混合物中其它成分的物理分離。分離成分或特定的蛋白構象可使用任何能夠分離這種成分的純化方法獲得。因此，人們可進行一個或多個層析步驟，包括但不限制于HIC，羥磷灰石層析，離子交換層析，親和，及SEC。其它純化方法是過濾(例如，切向流過濾)，電泳技術(例如，電泳，電洗脫，等電點聚焦)，和相分離(例如，PEG-葡聚糖相分離)，這些不過是舉例說明。此外，可用本發(fā)明方法再次處理重組蛋白制備物的級分，從而進一步使具有所需構象的蛋白的產(chǎn)率最佳化，其中所述重組蛋白制備物的級分含有以不需要構象存在的蛋白。
例如，處理后，可通過下列方法制備蛋白樣品，并用于進行疏水相互作用層析(HIC)。將等體積的850mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5加入到處理過的樣品中，室溫平衡。過濾后(例如使用0.22μm過濾器)，在ToyopearlButyl 650-M樹脂(Tosoh Biosep LLC，Montgomeryville，PA)上進行HIC層析，流速150cm/hr，上樣量2.1mg·mL樹脂-1。柱子用3倍柱容積的425mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5預平衡，將樣品上樣，然后用3倍柱容積的425mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5洗滌。梯度洗脫可使用總共5倍柱容積中的425mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5，到0mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5進行。各級分在洗脫過程中收集。柱子可用3倍柱容積的水，然后是3倍柱容積的0.1M NaOH洗脫。因此使用本發(fā)明方法可獲得含有超過85％，超過90％，甚至超過95％TNFR∶Fc的TNFR∶Fc制備物，而且絕大多數(shù)都是以活性構象存在于的(#2級分)。因此本發(fā)明提供含有這種#2級分的TNFR∶Fc的組合物，包括藥物組合物。
本發(fā)明任選包括進一步制劑化所述蛋白。術語“制劑化”是指將所述蛋白緩沖交換，滅菌，批量包裝和/或相對于最終的使用者進行包裝。對于本發(fā)明而言，術語“無菌批量形式”是指制備物沒有，或基本上沒有微生物污染(食品和/或藥物能夠接受的程度)，而且制備物的組成和濃度是規(guī)定好的。術語“無菌單位劑量形式”是指適于消費者和/或患者給藥或消耗的形式。這種組合物含有與其它成分，如生理學上可接受的稀釋劑，載體，和/或賦形劑組合的有效量的蛋白。術語“藥學上可接受的”是指不會干擾活性成分生物活性有效性的非毒性材料。適于給藥的制劑包括含水和不含水的無菌注射液，其中可含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和使制劑與受體血液等滲的溶質；含水和不含水的無菌混懸液，其中含有懸浮劑和增稠劑。此外，無菌批量形式和無菌單位形式可含有小濃度(約1μM-10mM)的還原/氧化偶聯(lián)劑(例如，谷胱甘肽，半胱氨酸等)。多肽還可按照制備藥學上有效的組合物的已知方法制劑化。它們可以是唯一的活性物質，或與其它適于已知適應癥的已知活性物質，與藥學上可接受的稀釋劑(例如，鹽水，Tris-HCl，醋酸鹽，和磷酸鹽緩沖液)，防腐劑(例如，硫汞撒，苯甲醇，對羥基苯甲酸酯)，乳化劑，增溶劑，佐劑和/或載體混合。藥物組合物的適宜制劑包括在Remington’s PharmaceuticalSciences，16thed.1980，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的那些。此外，這種組合物還可與聚乙二醇(PEG)，金屬離子絡合，和/或摻入到高分子化合物，如聚乙酸，聚羥基乙酸，水凝膠，葡聚糖等中，或摻入到脂質體，微乳劑，膠束，單層或多層的囊泡，紅細胞影或球芽中。用于脂質體制劑中的適宜脂類包括但不限制于，甘油單酯，甘油二酯，硫苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，膽汁酸等。這種脂質體制劑的制備在本領域技術人員的水平之內，公開于，例如，美國專利第4,235,871；美國專利第4,501,728；美國專利第4,837,028；和美國專利第4,737,323。這種組合物可影響物理狀態(tài)，溶解性，穩(wěn)定性，體內釋放速率，體內清除速率，因此可根據(jù)預定的應用選擇，這樣載體的特性將取決于所選擇的給藥途徑。適于使用的持續(xù)釋放形式包括，但不限制于，將多肽密封在緩慢溶解的生物相容性聚合物中(如美國專利第6,036,978中所述的藻酸鹽微顆粒)，與這種聚合物(包括局部使用的水凝膠)混合，和/或嵌入到生物相容性半滲透植入物中。
上面已經(jīng)描述了本發(fā)明，下列實施例是為舉例說明而提出的，不是對本發(fā)明的限制。
實施例1TNFR∶Fc#2和#3級分的生物物理評估通過疏水相互作用柱(HIC)將TNFR∶Fc洗脫為三個不同的峰，它們被稱為#1級分，#2級分和#3級分(見圖1)。#2級分是所需級分。#3級分是特別感興趣的，因為它含有20-60％的樣品，而且已經(jīng)顯示出與#2級分相比，較低的TNF結合活性及A375生物活性。因此，為了解這兩種級分之間的差異，并確定是什么因素導致#3級分活性的損失，例如它與結構和構象有關，進行了生物物理研究。在這個實施例中，我們使用圓二色性，熒光，在線SEC/UV/LS/RI，和差示掃描量熱法分析了#2級分和#3級分。
材料和方法材料起始材料是TMS緩沖液(10mM Tris，4％甘露糖醇，1％蔗糖)中的TNFR∶Fc。為了進行下面描述的實驗性研究，將該材料通過HIC洗脫的級分分離成#2級分和#3級分。
圓二色性研究是在近(250-340nm)和遠-UV(190-250nm)區(qū)進行的。進行近-UV研究是為了說明三級結構的差異，而遠-UV研究則是用于描述二級結構的差異。
近-UV圓二色性測量是在下列濃度的TMS溶液中進行的。起始材料被稀釋到6.25mg/ml，而#2和#3級分則分別是在它們現(xiàn)有的9.4和5.4mg/ml濃度評估的。使用具有0.1cm徑長的圓二色性細胞，并在340-250nm進行掃描。
遠-UV圓二色性測量是用交換到10mM磷酸鈉(pH7.0)中的蛋白緩沖液進行的，隨后用0.1cm徑長，在250-190nm掃描進行評估。二級結構組合物是使用凸約束(convex constraint)分析(CCA)評估的(Perczel等，1991，Protein Engrg.4669-679)。
熒光光譜用兩種不同的激發(fā)波長檢測稀釋到約50微克/ml的樣品。酪氨酸和色氨酸的熒光是用270nm的激發(fā)波長檢測的，而色氨酸的熒光是使用295nm的激發(fā)波長專門評估的(Lakowicz，J.R.in“Principles of Fluorescence Spectroscopy”，Plenum Press，1983.New York，N.Y.，342-343)。270nm激發(fā)波長的熒光掃描是從300-440nm，295nm激發(fā)波長的熒光掃描是從310-440nm。求每個光譜4次連續(xù)掃描的信號平均值。報告標準化的數(shù)據(jù)以評估樣品產(chǎn)生的頻率的差異。
在線-SEC/UV/LS/RI使用大小排阻層析洗脫下來的成分的分子量是使用紫外線(UV@280nm)，光散射(90)，折射率(RI)連續(xù)檢測確定的。該方法已被很好地記載(見Arakawa等，1992，Anal.Biochem.20353-57和Wen等，1996，Anal.Biochem.240155-166)，而且具有測量糖基化肽和蛋白的未糖基化分子量的優(yōu)點。使用具有BioSil-400-5柱(來自BioRad)的Integral HPLC系統(tǒng)(PerSeptiveBiosystems，Inc.)，流速1ml/min，采集SEC和UV數(shù)據(jù)。洗脫緩沖液由100mM磷酸鹽(pH6.8)和100mM NaCl組成。DAWN DSP多角度光散射檢測器和Optilab DSP折射計都是從Wyatt Technology，Inc.購買的。測定儀器常數(shù)的校準標準包括BSA二聚物，BSA單體和卵清蛋白(圖2)。
差示掃描量熱法(DSC)解折疊的物理性質是使用向上掃描(upscan)模式的MicroCal MC-2 DSC儀器測量的。樣品通過緩沖交換到pH7.4的相同TMS緩沖液中制備。樣品含有約4mg/ml的蛋白，并與作為參照的緩沖液(沒有蛋白)對照評估。掃描速率67℃/hr，溫度20℃-90℃。集合掃描隨后轉化成濃度標準化掃描，從而更好地比較解折疊轉換的焓行為，同時考慮濃度差異(數(shù)據(jù)以千卡/摩爾表示)。結果圓二色性.以平均剩余橢圓率表示的近-UV圓二色性測量結果在圖2給出。正如#3級分光譜較大比例的負橢圓率所示，#2與#3級分之間，在近270nm處的廣泛特征的改變很明顯(如圖2A中的箭頭所示)。值得注意的是，起始材料的光譜行為與#2級分的非常匹配，但在270nm周圍的相同區(qū)中，沒有顯示出敏銳的負位移。這個結果似乎與構成起始材料一小部分的#3級分相一致，并可顯著降低該區(qū)中的全部橢圓率，但位移方向相同。#3級分光譜的再現(xiàn)性證實了所觀察到的該樣品的位移是真實的。知道并了解二硫鍵可在圓二色性光譜該區(qū)中產(chǎn)生顯著的負橢圓率特征(見Kahn，P.C.，1978，MethodsEnzymol.61339-378和Kosen等，1981，Biochemistry 205744-5754)，近-UV圓二色性光譜是曲線擬合的，用于評估在該區(qū)中觀察到的什么變化與三級結構有關。曲線擬合數(shù)據(jù)的結果在圖2B中給出，并顯示出較小的紅移(3nm)，而且提高了負位移，這些與比較#3和#2級分時，含有二硫鍵的三級結構的改變相一致。
遠-UV圓二色性用于評估蛋白的二級結構組成(Perczel等，1991，Protein Engrg.4669-679)。使用CCA進行二級結構排布。將二級結構元件總和組成的計算光譜與實驗觀察到的光譜進行比較，顯示出良好的適合性。在實驗精確度的范圍之內(10％之內)，兩個級分的二級結構是可比較的。因此，本實驗不能區(qū)分這兩個級分任何一個的二級結構的任何差異。
熒光光譜.已知在近-UV圓二色性區(qū)觀察到了顯著的差異，應用熒光光譜可確定歸因于色氨酸和酪氨酸熒光的三級結構的補充差異。使用兩種激發(fā)波長，可確定考慮的全部三個例子(SM，#2級分和#3級分)的光譜，而使用近338nm的熒光最大值時，則被認為是絕不可能的。因為已知蛋白的三維結構是造成天然蛋白發(fā)射最大值的原因，因此這些結果表明，含有內在熒光團，色氨酸和酪氨酸的平均結構沒有被擾亂。
在線SEC/UV/LS/RI.光散射研究是使用SEC產(chǎn)生的主要洗脫峰的分子量在線進行的，其中主要洗脫峰的分子量與TNFR∶Fc的未糖基化多肽的分子量一致(例如，102kD)。雖然使用這種技術評估的洗脫種類的組成存在著明顯的差異，當比較#3級分和#2級分的洗脫曲線時(圖3A和B)，所測量的含有絕大多數(shù)成分的主峰分別為102.5±1.6kD(保留體積＝8.4mL)和101.9±2.1kD(保留體積＝8.3mL)。精確度以圖3中的垂直虛線范圍內，洗脫峰23個部分的標準差表示。值得注意的是，#3級分下降肩狀部分的大量信號可確定多肽的分子量為78.1±3.7kD(該評估包括在8.85mL標記的峰周圍的8個部分)。因為是通過與該成分分子量測定有關的精確度表示，因此該峰顯示出較高的不均一性，并因此懷疑比主峰具有更高的多分散性。#3級分還含有大量高分子量種類，與TNFR∶Fc主要二聚形式的洗脫體積相一致(接近7.5)。因此，確定#3級分是由若干種類組成的，包括聚集物和分子的片段部分。
差示掃描量熱法.對兩個級分進行的DSC測量在TNFR∶Fc分子TNFR級分的解折疊方面產(chǎn)生了顯著的差異(圖4)。從基線校正數(shù)據(jù)可更清楚地看出(圖4B)，當比較52.5℃的Tm(#2級分)和49.7℃的Tm(#3級分)時，解鏈轉換(Tm)下降了2.8℃。與具有6.5℃半-寬度的#2級分相比，半-寬度為8℃轉換最大值一半的#3級分的轉換更顯著一些。這種低溫轉換已經(jīng)從TNFR∶Fc單體的熱解折疊實驗鑒定，這是由于分子的TNFR結構域。69.1℃和83.4℃的熱轉換是由于分子的Fc部分。這后兩種解折疊轉換良好排列，而且可比較它們的Tm’s和成分的焓。
討論在試驗過的方法中，在近-UV圓二色性和DSC測量中觀察到了差異。差示掃描量熱法的數(shù)據(jù)可支持結構的疏松，而結構疏松則歸因于Fc的區(qū)域中幾乎沒有觀察到改變的分子受體部分。近-UV圓二色性結果表明，二硫鍵涉及與#3級分相關的三級結構的改變。這些改變可能是由于隱蔽二硫鍵更暴露于溶劑，并且通過在#3級分HIC洗脫中觀察到的保留時間的稍稍提高解釋了疏水性提高的原因。有趣的是，可指示構象結構改變的熒光數(shù)據(jù)沒有可識別的差異。如果根據(jù)酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的分布考慮TNFR∶Fc的一級結構，那么可明顯看出，從TNFR結構域第104個殘基的C-末端部分解延伸到FcN-末端部分第296個殘基的區(qū)缺乏這些內在熒光團。因此，與數(shù)據(jù)相一致的一個可能解釋是距離Fc鉸鏈區(qū)較遠的三級結構相對未改變，而殘基C115-C281在構象上可能有一些改變。分子該區(qū)含有10個可能的半胱氨酸，它們可能受結構改變的短暫結果影響，其中所述結構改變可影響酪氨酸和色氨酸的局部結構。值得注意的是，目前還不知道該分子是如何折疊的，而且似乎構成距離任何已知色氨酸或酪氨酸殘基更遠的二硫鍵的半胱氨酸是對三級結構改變的合理懷疑，其中所述三級結構的改變產(chǎn)生所觀察到的近-UV圓二色性結果，但對含有酪氨酸和色氨酸的鄰位結構影響較小。這個意見不排除在一個或兩個TNFR臂內，存在著結構的某些不常見改變，所述TNFR臂不會導致酪氨酸和色氨酸引起的熒光凈作用的顯著改變。熒光數(shù)據(jù)(對二硫鍵不敏感)沒有變化和近-UV(對二硫鍵，酪氨酸和色氨酸敏感)顯示出與二硫鍵結構修飾相一致的少量負位移的事實意味著二硫鍵在#2和#3級分間的差異中發(fā)揮了作用。
在總結#3級分產(chǎn)生的剩余數(shù)據(jù)時，人們發(fā)現(xiàn)它與#2級分在有關分子量和二級結構方面不能區(qū)別。
實施例2使用谷胱甘肽對TNFR∶Fc的#3級分進行二硫鍵交換實驗該試驗被設計用來評估在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，促進TNFR∶Fc的#3級分轉化成#2級分構象的各種處理方法。
材料和方法材料.起始材料是蛋白A洗脫物TNFR∶Fc，#3級分的純HIC洗脫物，及#2級分和#3級分HIC洗脫物的50∶50混合物。緩沖液是0.1M枸櫞酸鹽或0.1M Tris/甘氨酸，pH7.6，pH8.6，或pH9.6。TNFR∶Fc的蛋白濃度為0.2-4.5mg/mL。還原谷胱甘肽和谷胱甘肽(GSH/GSSG的比例為10∶1)的氧化還原偶聯(lián)系統(tǒng)以0.1-5mM GSH加入。孵育溫度為4℃，22℃，或31℃。
方法.二硫鍵交換是通過用1M醋酸將樣品酸化至pH6而終止的。處理過的重組蛋白制備物是通過分析型HIC，SEC(保留時間，集合物濃度)和固相TNF結合測定法描述的，然后測定#2級分的百分比和產(chǎn)率。
結果和討論處理效率是pH和GSH濃度的函數(shù)。當使用0.1mM GSH/pH7.6和0.1mM GSH/pH8.6進行處理時，#3級分中的蛋白轉化成#2級分的百分比較高(至少10％)。然而，當使用0.1mM GSH/pH9.6；1mMGSH/pH7.6；1mM GSH/pH8.6；和1mM GSH/pH9.6進行處理時，效率大大提高(從45％-幾乎70％)。因此，雖然處理效率對pH和游離硫醇的濃度敏感，但也可在這些變量的較寬范圍內有效進行。
溫度的影響.#3級分是在3個不同的溫度，4℃，22℃，或31℃下處理的。GSH濃度保持在1mM，pH8.6。16小時后，處理組全部顯示出從#3級分到#2級分的顯著轉化，但這種轉化似乎在兩個較低的溫度下更有效。
克隆作用.根據(jù)上述結果，按照標準方案試驗了6個不同的細胞系克隆，它們全部產(chǎn)生TNFR∶Fc。具體而言，使用1M Tris/甘氨酸(最終濃度0.1M Tris/甘氨酸)將含有0.4-0.7mg/mL TNFR∶Fc(約pH4)的蛋白A洗脫物調節(jié)至pH8.6。把這些溶液調節(jié)至1mM EDTA和2.5mMGSH/0.25mM GSSG，室溫孵育16小時。二硫鍵交換是通過上述酸化終止的。
6個不同的克隆全部顯示出#2級分產(chǎn)量和產(chǎn)率的提高。在各個克隆中，處理導致的HIC#3級分的減少分別為64％，72％，77％，78％，78％和83％。相同克隆中HIC#2級分的提高分別為37％，64％，78％，70％，44％和54％。如圖5所示，HIC#2級分百分比的提高與結合單位的提高％相互關聯(lián)。因此，該方法似乎可普遍用于所有進行試驗的克隆。
結合測定法.在固相TNF結合測定法中測定3個不同的TNFR∶Fc制備物。樣品11-6和12是蛋白A柱的洗脫物。樣品8085-47也是從蛋白A柱洗脫下來的，然后經(jīng)歷附加的HIC純化步驟；該樣品僅含有#3級分。如上所述，在進行二硫鍵交換之前和之后，在結合測定法中檢測樣品。下面表1給出的結果顯示出在用谷胱甘肽處理所有的樣品之后，配體的結合活性提高。
表1二硫鍵交換之前和之后的TNFR∶Fc的TNF結合活性樣品交換前 交換后 改變％(活性/m蛋白G)11-6 4.16×1075.73×10727％12 4.36×1076.13×10729％8085-471.90×1076.75×10772％實施例3L-半胱氨酸處理過的TNFR∶Fc的二硫鍵交換實驗該實驗被設計用來評估作為TNFR∶Fc還原/氧化偶聯(lián)劑的半胱氨酸/胱氨酸。該方法可評估在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，HIC#3級分到#2級分構象的改變。該過程可對純化的#3級分，#2和#3級分的混合物進行，和/或接著使用其它分離技術，如蛋白A層析，具有相似的結果。
材料和方法起始材料是作為#3級分純HIC洗脫物的TNFR∶Fc或含有#2和#3級分的蛋白A洗脫的TNFR∶Fc。緩沖液是0.1M枸櫞酸鹽或0.2M Tris，pH8.5。TNFR∶Fc的蛋白濃度是2.5-3mg/mL。
使用L-半胱氨酸(0-50mM)的氧化還原偶聯(lián)系統(tǒng)。該過程還評估了+/-L-半胱氨酸(0.025-0.5mM)和+/-1mM EDTA。孵育溫度為4℃，15℃，和22℃，時間為6，18和48小時。二硫鍵交換是通過用NaH2PO4或0.85M枸櫞酸鹽將樣品酸化至pH7而終止的。處理過的重組蛋白制備物是通過分析型HIC和SEC(保留時間，集合濃度)描述的，然后測定#2級分和#3級分的百分比和產(chǎn)率，半胱氨酰和游離硫醇測定法。
結果和討論處理效率是L-半胱氨酸濃度(0-5mM)的函數(shù)。在沒有L-半胱氨酸或EDTA的條件下，當用0.25mM L-半胱氨酸處理4份重復樣品時，HIC#3級分中，有顯著百分比的TNFR∶Fc蛋白轉化成#2級分。然而，當用1mM L-半胱氨酸或5mM L-半胱氨酸進行處理時，效率大大提高(從45％-幾乎70％)(圖6)。胱氨酸在這些反應條件中的作用根據(jù)EDTA的存在而變化(見下面)。對于已知細胞的分批培養(yǎng)而言(處理來源于4次不同細胞分批培養(yǎng)的樣品)，處理過程是可再現(xiàn)的。
處理效率是更高L-半胱氨酸濃度(5-50mM)的函數(shù)。用于處理TNFR∶Fc的更高濃度的L-半胱氨酸(5，15，和50mM L-半胱氨酸)導致各種情況下，來源于起始材料的HIC#3級分的減少，但5mM L-半胱氨酸對于促進#2級分的積累最有效(圖7)。據(jù)估計，較高濃度的L-半胱氨酸或者顯著減少分子中的半胱氨酰部分，或需要太長時間以致不能再氧化。
處理效率是額外L-半胱氨酸補料的函數(shù)。為了嘗試提高二硫鍵交換的效率，用5mM L-半胱氨酸處理TNFR∶Fc，并在4℃孵育18小時。然后加入額外的L-半胱氨酸(0-5mM)，4℃再孵育樣品2天。在這些條件下，通過額外L-半胱氨酸的補料注意到對HIC#3級分與#2級分的比例沒有顯著影響。
EDTA，胱氨酸和L-半胱氨酸的影響。胱氨酸(0-0.4mM)與L-半胱氨酸(5mM)組合對TNFR∶Fc的影響是在有或沒有1mM EDTA的條件下評估的。1mM EDTA存在情況下的最佳結果是使用0.1-0.2mM濃度的半胱氨酸達到的。
銅，溫度和時間的影響。4℃和22℃時，用5mM L-半胱氨酸處理TNFR∶Fc 6或18小時。處理后的TNFR∶Fc是通過銅的加入，然后是HIC評估的。孵育6小時后，4℃時的二硫鍵交換比22℃時更完全，而且在4℃處理18小時后，明顯更完全(圖8A和8B)。
分析規(guī)模與制備規(guī)模的L-半胱氨酸處理效率的比較。以小規(guī)模的最佳處理條件為基礎，用5mM L-半胱氨酸(沒有胱氨酸或EDTA)處理3mL或20L量的TNFR∶Fc(在0.2M Tris，pH8.5中為2.5mg/mL)，4℃孵育18小時，用等體積的850mM枸櫞酸鈉，50mM磷酸鈉，pH6.5稀釋，從而終止處理，并進行HIC層析。制備和分析規(guī)模的TNFR∶Fc對照樣品分別具有63％和68％的#3級分。用上述條件處理后，制備和分析規(guī)模中的#3級分都降至28％。因此，對于制備型和分析型樣品而言，處理效率分別為56％和59％(表2)。該實驗證實了該方法適于大規(guī)模處理。
表2分析與制備規(guī)模的二硫鍵交換過程制備 分析#2級分#3級分#2級分#3級分對照 37％ 63％ 32％ 68％交換 72％ 28％ 72％ 28％交換“效率”56％59％因此，雖然處理的氧化還原效率受游離硫醇的濃度，溫度和時間的影響，但它也可在較寬范圍的變量條件下有效最佳化并進行。該處理方案還可再現(xiàn)性地的，小規(guī)模和大規(guī)模地進行。
本發(fā)明的范圍不受此處所述具體實施方案的限制，具體實施方案僅僅是為了舉例說明本發(fā)明的各個方面，而且功能等同的方法和組合物也在本發(fā)明的范圍之內。事實上，除了此處所示和描述的那些外，根據(jù)前面的描述和附圖對本發(fā)明進行的各種改進對于本領域那些技術人員來說是顯而易見的。這種改進也落在權利要求的保護范圍內。
權利要求
1.一種方法，包括使哺乳動物細胞產(chǎn)生的重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑在約pH 7-11時接觸，并分離具有所需構象的重組蛋白制備物的級分。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述重組蛋白含有至少兩個結構域。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述蛋白的至少一個結構域具有穩(wěn)定的構象，且所述蛋白的至少一個結構域具有不穩(wěn)定的構象。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述重組蛋白含有受體的胞外結構域。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述重組蛋白是TNF-受體的可溶形式。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述重組蛋白是Fc融合蛋白。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述重組蛋白制備物是從蛋白A或蛋白G柱純化的。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述重組蛋白選自可溶性IL-4受體，可溶性IL-1 II型受體，可溶性Flt3配體，可溶性CD40配體，CD39，CD30，CD27，TEK/Ork，IL-15，可溶性IL-15受體，0x40配體，GM-CSF，RANKL，RANK，TRAIL，可溶性TRAIL受體，組織纖溶酶原激活劑，因子VIII，因子IX，載脂蛋白E，載脂蛋白A-I，IL-2受體，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，降鈣素，生長激素，胰島素，促胰島激素，胰島素樣生長因子，甲狀旁腺激素，干擾素，超氧化物歧化酶，胰高血糖素，紅細胞生成素，抗體，葡糖腦苷脂酶，F(xiàn)c-融合蛋白，珠蛋白，神經(jīng)生長因子，白介素，和集落刺激因子。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述pH約為7-10。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述pH約為7.6-9.6。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述pH約為8.6。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑包括谷胱甘肽。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述還原谷胱甘肽與氧化谷胱甘肽的比例約為1∶1-100∶1。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑包括半胱氨酸。
15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述接觸步驟進行約4-16小時。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述接觸步驟是在約25℃時進行的。
17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述接觸步驟是在約4℃時進行的。
18.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述接觸步驟是通過酸化終止的。
19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述分離步驟包括一個或多個層析步驟。
20.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述蛋白的濃度約為0.5-10mg/ml。
21.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑中的還原硫醇與蛋白中的二硫鍵的比例約為320∶1-64,000∶1(還原硫醇∶二硫鍵)。
22.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括以無菌批量形式制劑化具有所需構象的重組蛋白制備物的級分。
23.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括以無菌單位劑量形式制劑化具有所需構象的重組蛋白制備物的級分。
24.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所需構象對受體的相關配體具有較高的結合親和性。
25.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所需構象對TNF具有較高的結合親和性。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述TNF是TNF-α。
27.一種促進糖基化重組蛋白的所需構象的方法，該方法包括使糖基化重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸足以提高所需構型異構體的相對比例的時間，所述糖基化重組蛋白制備物含有糖基化重組蛋白的至少兩種構型異構體的混合物，并且測定混合物中所需構型異構體的相對比例。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白含有至少兩個結構域。
29.根據(jù)權利要求28所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白的至少一個結構域具有穩(wěn)定的構象，且所述糖基化重組蛋白的至少一個結構域具有不穩(wěn)定的構象。
30.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白含有受體的胞外結構域。
31.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白是TNF-受體的可溶形式。
32.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白是Fc融合蛋白。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白制備物是從蛋白A或蛋白G柱純化的。
34.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述糖基化重組蛋白選自可溶性IL-4受體，可溶性IL-1 II型受體，可溶性Flt3配體，可溶性CD40配體，CD39，CD30，CD27，TEK/Ork，IL-15，可溶性IL-15受體，0x40，GM-CSF，RANKL，RANK，TRAIL，可溶性TRAIL受體，組織纖溶酶原激活劑，因子VIII，因子IX，載脂蛋白E，載脂蛋白A-I，IL-2受體，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，降鈣素，生長激素，胰島素，促胰島激素，胰島素樣生長因子，甲狀旁腺激素，干擾素，超氧化物歧化酶，胰高血糖素，紅細胞生成素，抗體，葡糖腦苷脂酶，F(xiàn)c-融合蛋白，珠蛋白，神經(jīng)生長因子，白介素，和集落刺激因子。
35.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述pH約為7-10。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中所述pH約為8.6。
37.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑選自谷胱甘肽，半胱氨酸，DTT(二硫蘇糖醇)，2-巰基乙醇和二硫硝基苯甲酸鹽。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑包括還原谷胱甘肽。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述還原谷胱甘肽的濃度約為1mM-10mM。
40.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述還原/氧化偶聯(lián)劑包括還原半胱氨酸。
41.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中還原/氧化偶聯(lián)劑中的還原硫醇與蛋白中的二硫鍵的比例約為320∶1-64,000∶1(還原硫醇∶二硫鍵)。
42.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述蛋白的濃度約為0.5-10mg/ml。
43.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述接觸步驟進行約4-16小時。
44.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述接觸步驟是在約25℃時進行的。
45.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述接觸步驟是在約4℃時進行的。
46.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述接觸步驟是通過酸化終止的。
47.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述測定步驟包括一個或多個層析步驟。
48.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述測定步驟包括結合反應。
49.根據(jù)權利要求27所述的方法，包括分離具有所需構型異構體的糖基化重組蛋白制備物的級分。
50.根據(jù)權利要求49所述的方法，包括以無菌單位劑量形式制劑化所需的構型異構體。
51.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所需構型異構體對受體的相關配體具有較高的結合親和性。
52.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中所需構型異構體對TNF具有較高的結合親和性。
53.根據(jù)權利要求52所述的方法，其中所述TNF是TNF-α。
54.一種方法，包括將哺乳動物細胞產(chǎn)生的重組蛋白制劑化為無菌單位劑量形式，與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸，并將其從具有不需要構象的蛋白級分中分離出來。
55.一種通過權利要求54的方法產(chǎn)生的TNFR∶Fc的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提高所需蛋白構象的產(chǎn)率的方法。在具體實施方案中，本發(fā)明包括使重組蛋白制備物與還原/氧化偶聯(lián)劑接觸足以提高所需構型異構體的相對比例的時間。
文檔編號C07K14/525GK1547586SQ02805444
公開日2004年11月17日 申請日期2002年2月22日 優(yōu)先權日2001年2月23日
發(fā)明者H·M·薩森菲爾德, R·L·小雷梅勒, R·E·麥克科伊, H M 薩森菲爾德, 小雷梅勒, 麥克科伊 申請人:免疫檢查公司