專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤的免疫治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人用藥品，特別是治療疫苗，其可引起對(duì)過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤的免疫反應(yīng)。
現(xiàn)有技術(shù)神經(jīng)節(jié)苷脂是大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)膜的組分。由于在細(xì)胞惡變期間的表達(dá)形式，即使當(dāng)這些鞘糖脂在正常組織中表達(dá)時(shí)，它們也是免疫療法非常有吸引力的目標(biāo)。(Hakomori，S.Ann.Rev.Biochem.50；1981733-764；Hakomori，Cancer Res.45；19852405-2414；Irie，R.F.，等人治療用單克隆抗體(Therapeuticmonoclonal antibodies).Borrebaeck，C.A.K.，和Larrick，J.W.(Eds.).M Stockton Press，1990，pp.75-94)神經(jīng)節(jié)苷脂的糖類(lèi)特性，與其是自身抗原的事實(shí)一起，使其成為極低免疫原性的分子。某些策略已經(jīng)應(yīng)用于提高該抗原的免疫原性。它們是基于將神經(jīng)節(jié)苷脂在不同分子環(huán)境中暴露于免疫系統(tǒng)。策略之一是共軛疫苗的應(yīng)用，其中糖類(lèi)抗原與載體蛋白共價(jià)相連，該載體對(duì)于T細(xì)胞的免疫原性是很強(qiáng)的。這使得獲得強(qiáng)烈而持久的抗體免疫反應(yīng)成為可能。采用此方法有提高抗神經(jīng)節(jié)苷脂的IgG抗體的可能，盡管在再免疫接種之后獲得的滴度比與抗胸腺非依賴抗原的經(jīng)典免疫反應(yīng)中所獲得的滴度要小。(Helling，F(xiàn)等人Cancer Res.54；1994197-203；Helling，F(xiàn)等人Cancer Res.55；19952783-2788；Livingston PO等人Cancer Immunol Immunother 45；199710-19)新的疫苗組合物已見(jiàn)報(bào)道，其可誘導(dǎo)抗N-乙?；蚇-乙醇?；?N-glycolylated)的神經(jīng)節(jié)苷脂的免疫反應(yīng)。該疫苗是基于神經(jīng)節(jié)苷脂和極小尺寸的蛋白脂質(zhì)體(VSSP)之間的疏水共軛物(神經(jīng)節(jié)苷脂/VSSP)，VSSP由從腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、革蘭氏陰性菌中獲得的外膜蛋白復(fù)合體(OMPC)與神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行的結(jié)合而獲得。(Estévez F.等人Vaccine 18；1999190-197；美國(guó)專(zhuān)利US5,788,985和US 6,149,921)由GM3神經(jīng)節(jié)苷脂/VSSP或(NeuGcGM3)神經(jīng)節(jié)苷脂/VSSP組成的疫苗，可以提高抗GM3和NeuGcGM3的特異性IgM和IgG抗體滴度。
另外，接種GM3/VSSP提高了帶有黑素瘤B16的小鼠的生存，也減小腫瘤體積并且提高了對(duì)腫瘤的皮下移植的排斥率。(Alonso等人Int.J Oncology 15；199959-66；Car，A.等人Melanoma Research，出版中)Jerne 1974年提出了獨(dú)特型(idiotype)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)(Jerne，N.K.Ann.Immunol.125C；1974373-389)，指出免疫系統(tǒng)是有著它們和若干自然抗原之間的復(fù)雜相互作用模式構(gòu)成的一種抗體網(wǎng)絡(luò)，其相互作用通過(guò)可變區(qū)或獨(dú)特型(Id)而發(fā)生，并且免疫系統(tǒng)通過(guò)獨(dú)特型-抗獨(dú)特型的相互反應(yīng)而被調(diào)節(jié)。Jerne的學(xué)說(shuō)支持基于應(yīng)用抗獨(dú)特型疫苗的腫瘤主動(dòng)免疫療法(AI)的新策略。用一種識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體(Ab1)進(jìn)行接種，以誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體(Ab2)。該抗獨(dú)特型抗體模擬名義上的抗原并且反過(guò)來(lái)產(chǎn)生抗抗獨(dú)特型抗體(Ab3)來(lái)對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原(Schmolling J，等人Hybridoma14；1995183-186)。另一方面，在用抗獨(dú)特型抗體(Ab2)接種之后，抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)已經(jīng)有報(bào)道。(Raychauhuri，s.等人J.Immunol.137；19861743-1749；Raychauhuri，s.等人J.Immunol.139；19873902-3910；Bhattacharya-Chatterjee，M.等人J.Immunol.139；19871354-1360；Bhattacharya-Chatterjee，M.等人J.Immunol.141；19881398-1403；Herlyn，D.等人Intern.Rev.Immuno1.4；1989347-357；Chen，Z-J.等人Cell.Imm.Immunother.Cancer；1990351-359；Herlyn，D.等人In Vivo 5；1991615-624；Furuya，A.等人Anticancer Res.12；199227-32；Mittelman，A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89；1992466-470；Durrant，LG.等人Cancer Res.54；19944837-4840；Mittelman，A.等人Cancer Res.54；1994415-421；Schmitt，H.等人Hybridoma13；1994389-396；Chakrobarty，M.等人J.Immunother.18；199595-103；Chakrobarty，M.等人Cancer Res.55；19951525-1530；Foon，KA.等人Clin.Cancer Res.1；19951285-1294；Herlyn，D.等人Hybridoma 14；1995159-166；Sclebusch，H.等人Hybridoma 14；1995167-174；Herlyn，D.等人Cancer Immunol.Immunother；43；199665-76關(guān)于Ab2抗體的應(yīng)用和為了提高糖類(lèi)殘基的免疫原性，其他選擇涉及在抗體分子上的蛋白表位可以代表糖類(lèi)表位的可能性。實(shí)際上，許多這樣的抗獨(dú)特型抗體已經(jīng)被獲得，它們模擬在癌細(xì)胞中大量表達(dá)的神經(jīng)節(jié)苷脂，如GM3、GD3和GD2。(Yamamoto，S.等人J.Natl.Cancer Inst.82；19901757-1760；Chapman，P.B.等人J.Clin.Invest 88；1991186-192；Cheung N-K V，等人Int J Cancer 54；1993499-505；Saleh MN.等人J.Immunol.151；19933390-3398；SenG.等人J.Immunotherapy 21；199875-83)在癌癥患者中用BCG或QS21作為佐劑與Ab2抗體同時(shí)應(yīng)用的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)獲得初步成果。(McCaffery M.等人Clin.Cancer Res.2；1996679-686.；Foon，KA.等人Clin.Cancer Res.4；19981117-1124)從現(xiàn)有技術(shù)已知的單克隆抗體P3(保藏號(hào)ECACC 94113026)，其特異性識(shí)別在含有N-乙醇?；?glycolyl)的單唾液酸和二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂中的唾液酸。此Mab Ab1識(shí)別在人乳腺腫瘤和黑素瘤上的抗原。(美國(guó)專(zhuān)利US 5,788,985；Vázquez AM.等人Hybridoma 14；1995551-556；Moreno E.等人Glycobiology 8；1998695-705；Marquina G.等人Cancer Res.56；19965165-5171；Carr，A.等人Hybridoma 19(3)；2000241-247)用MAb P3免疫接種獲得的抗獨(dú)特型抗體1E10(Ab2 MAb 1E10)(保藏號(hào)ECACC 97 112901)是一種γ型抗體(非內(nèi)部映像)。Ab2MAb 1E10顯示出了對(duì)生長(zhǎng)的乳腺腫瘤和黑素瘤的抗腫瘤作用。(美國(guó)專(zhuān)利US 6,063,379；Vázquez等人Hybridoma 14；1995183-186；Vázquez等人Oncology Reports 7；2000751-756)在現(xiàn)有技術(shù)中不存在關(guān)于含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗和含有抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體(Ab1)或抗獨(dú)特型抗體(Ab2)的藥物組合物(其被稱(chēng)為獨(dú)特型疫苗)的組合應(yīng)用的證據(jù)；也沒(méi)有獨(dú)特型疫苗Ab1與獨(dú)特型疫苗Ab2一起組合應(yīng)用的證據(jù)。
本發(fā)明涉及所述全部可能的疫苗的組合應(yīng)用，以加強(qiáng)其每一個(gè)分別產(chǎn)生的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種藥物組合物或藥物組合物的組合物，其可應(yīng)用于癌的免疫療法，特別是應(yīng)用于過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤，其含有至少兩種下述化合物(A)一種獨(dú)特型疫苗，其含有抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體(Ab1)；(B)一種獨(dú)特型疫苗，其含有針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的抗獨(dú)特型抗體(Ab2)；和(C)一種含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗。
藥物組合物，或藥物組合物的組合物可以含有A加B，或A加C，或B加C。
優(yōu)選的藥物組合物，或藥物組合物的組合物，其中A可以是含有保藏號(hào)ECACC 94113026的鼠MAb P3的獨(dú)特型疫苗；B可以是含有保藏號(hào)ECACC 97112901的鼠抗獨(dú)特型抗體1E10的獨(dú)特型疫苗；C可以是含有N-乙醇酰基化GM3(NeuGcGM3)或N-乙?；疓M3(NeuAcGM3)神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗。
在本發(fā)明中的A加B，或A加C，或B加C可以以同時(shí)的或交替的方式給藥。
本發(fā)明的組合物可以在癌的治療中應(yīng)用，尤其是那些過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的癌，以及肺、乳腺、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、黑素瘤、肉瘤以及從神經(jīng)外胚層組織來(lái)源的那些腫瘤。
本發(fā)明也敘述了其藥物組合物，或藥物組合物的組合物治療哺乳動(dòng)物的給藥方案。
在本發(fā)明中還敘述了一種方法，其包括將前述的藥物組合物，或藥物組合物的組合物對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，以預(yù)防或治療乳腺腫瘤、肺腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)的腫瘤、黑素瘤、肉瘤和從神經(jīng)外胚層起源的腫瘤。
1.含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗的制備含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗是根據(jù)Estevez和Col在《疫苗》(Vaccines)18，1999190-197和美國(guó)專(zhuān)利US 5,788,985和US 6,149,921中的詳述來(lái)獲得。極小尺寸的蛋白脂質(zhì)體(VSSP)VSSP由從革蘭氏陰性菌腦膜炎奈瑟球菌中獲得的外膜蛋白復(fù)合體(OMPC)與已整合入其中的合成的或天然的神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行的結(jié)合而獲得(VSSP-G)。神經(jīng)節(jié)苷脂可以是(NeuGcGM3)、GD3或(NeuAcGM3)。
2.獨(dú)特型疫苗的制備藥物組合物根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利US 5,817,513和US 6,063,379的詳述來(lái)獲得。該疫苗含有鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體，這種抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體如MAb P3，或含有鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體，如Mab 1E10，它能識(shí)別抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體。
3.免疫療法組合物，其加強(qiáng)神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗和獨(dú)特型疫苗在動(dòng)物模型中的免疫反應(yīng)和抗腫瘤作用所涉及的方法可應(yīng)用于小鼠或任何其他種類(lèi)的哺乳動(dòng)物。組合物的組分是神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗和獨(dú)特型疫苗；它們可用不同的方法組合。
在一種組合中，可給動(dòng)物用25μg～1mg鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體接種3～10次；給藥的時(shí)間間隔可以是7和14天。在這期間讓動(dòng)物接受3～10次60～1000μg的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗，給藥的時(shí)間間隔可以是7～14天。
在另一種組合中，可給動(dòng)物用25μg～1mg針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的特異性的鼠抗獨(dú)特型抗體接種3～10次；給藥的時(shí)間間隔可以是7～14天。在這期間讓動(dòng)物接受3～10次60～1000μg的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗，給藥的時(shí)間間隔可以是7～14。
兩種類(lèi)型疫苗的給藥都可以是同時(shí)或交替進(jìn)行。當(dāng)以同時(shí)的方式給藥時(shí)，疫苗可以作為單獨(dú)的產(chǎn)品或作為一種疫苗組合物來(lái)配制。當(dāng)以交替的方式給藥時(shí)，每一類(lèi)型的疫苗之間的間隔可為3～7天。疫苗在一種佐劑中被給藥時(shí)，其佐劑可以是氫氧化鋁(62.5μg～2.5mg)、Montanide ISA 51(0.1～1.2ml/劑)或任何其它合適的佐劑。每一劑量的總體積可為10μl～2ml。含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗可以用皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜內(nèi)的方法或它們的組合來(lái)給藥。相同的給藥方法可以應(yīng)用于含有抗體的疫苗。
免疫治療組合物在治療動(dòng)物時(shí)提高抗體免疫反應(yīng)，以及細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
用接受治療的被試者的局部腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間、腫瘤的體積和生存期與對(duì)照組的相同參數(shù)比較，以評(píng)價(jià)免疫治療組合物的效力。在進(jìn)行治療組和對(duì)照組之間這些參數(shù)的比較時(shí)，可以看到，使用本發(fā)明治療組合物的治療組的局部腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間較短、腫瘤體積減小并且存活增加。對(duì)照組不僅是那些用佐劑治療的動(dòng)物，而且還有僅用一種疫苗而不是其組合物治療的那些組。
4.免疫治療組合物，其增強(qiáng)神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗和獨(dú)特型疫苗在人類(lèi)患者中的免疫反應(yīng)和抗腫瘤作用前面涉及的方法亦可以應(yīng)用于不同臨床階段的癌癥患者。尤其是那些過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤，以及肺、乳房、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、黑素瘤、肉瘤以及從神經(jīng)外胚層組織產(chǎn)生的那些腫瘤。
在一種組合中，可給患者用0.1～5mg鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體的劑量接種3～10次；用藥的時(shí)間間隔可以是7和14天。在這期間讓患者接受60～1000μg的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗3～10次，給藥的時(shí)間間隔可以是7～14天。
在第二種組合中，可給患者用0.1～5mg針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的特異性的鼠抗獨(dú)特型抗體接種3～10次；給藥的時(shí)間間隔可以是7～14天。在這期間讓患者接受60～1000μg的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗4～6次，給藥的時(shí)間間隔可以是7～14天。
在第三種組合中，可給患者用鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體免疫接種；劑量、頻率和時(shí)間間隔可以如前面所述。在這期間讓患者接受3～10次0.1～2mg針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的特異性的鼠抗獨(dú)特型抗體。
兩種類(lèi)型疫苗的給藥都可以同時(shí)或交替進(jìn)行。當(dāng)以同時(shí)的方式給藥時(shí)，疫苗可以作為單獨(dú)的產(chǎn)品或作為一種疫苗組合物來(lái)配制。當(dāng)以交替的方式給藥時(shí)，每一類(lèi)型的疫苗之間的間隔可為3～7天。疫苗在一種佐劑中被給藥時(shí)，其佐劑可以是氫氧化鋁(1mg～5mg/劑)、Montanide ISA 51(0.6～1.2ml/劑)或任何其它合適的佐劑。每一劑量的總體積可為10μl～2ml。
含有神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗可以用皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜內(nèi)的方法或它們的組合來(lái)給藥。相同的給藥方法可以應(yīng)用于含有抗體的疫苗。
在接種期間，通過(guò)血液中的測(cè)量監(jiān)控某些生物化學(xué)參數(shù)和抗體的滴度。其頻率可為1星期至3個(gè)月。細(xì)胞免疫是通過(guò)從患者中采集的淋巴細(xì)胞來(lái)研究的。采集是以一星期到三個(gè)月的波動(dòng)的頻率進(jìn)行。
最后，患者用兩種疫苗以前述濃度再次免疫接種，給藥的時(shí)間間隔可以是1～6個(gè)月。他們可以用同時(shí)的或不同時(shí)的方式在1～2年的時(shí)間內(nèi)用藥。
本接種方案誘導(dǎo)患者抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，并因此減小腫瘤負(fù)荷。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)用鼠MAB P3免疫接種誘導(dǎo)在同基因模型中的抗獨(dú)特型T2和抗抗獨(dú)特型T3細(xì)胞的激活。
雌性6-8周大的相同遺傳背景的Balb/c裸鼠，給其皮下免疫接種100μg鼠MAb P3(抗-N-乙醇?；窠?jīng)節(jié)苷脂，保藏號(hào)ECACC94113026；Vázquez等人Hybridoma 14；1995551-558；Moreno等人Glycobiology 8；1998695-705)和完全弗氏佐劑(CFA)。七天后給鼠再次接種不完全弗氏佐劑(IFA)中的抗體50μg。在第10天，采集引流淋巴結(jié)并通過(guò)按壓注射器得到淋巴細(xì)胞。在細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中使用細(xì)胞懸液，該實(shí)驗(yàn)用摻入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷來(lái)測(cè)定。體外淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定是通過(guò)在提高濃度(25到150μg/ml)的鼠MAb P3和它的Ab2 MAb 1E10(保藏號(hào)ECACC 97112901)存在的情況下培養(yǎng)淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行的。對(duì)照組使用相匹配的同種型(isotype)的鼠MAb。刺激指數(shù)等于或高于3被認(rèn)為是陽(yáng)性。用P3 MAb給Balb/c鼠免疫接種之后獲得的淋巴細(xì)胞，在此MAb存在的情況下特異性地增殖，并且在鼠對(duì)照MAB A3(IgM)存在的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)未觀察到這種增殖。(Alfonso M.和col.Hybridoma 14；1995209-216)這種增殖依賴于T細(xì)胞的存在，因?yàn)橛脧腜3免疫接種的無(wú)胸腺nu/nu鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞沒(méi)有獲得此增殖。用鼠MAb P3免疫接種，不僅誘導(dǎo)針對(duì)Ab1 Mab(T2)的獨(dú)特型的T細(xì)胞的增殖，而且也誘導(dǎo)特異性抗鼠Ab2 MAb 1E10(IgG1)而不對(duì)抗Mab C5的同種型(IgG1)的抗抗獨(dú)特型T細(xì)胞(T3)的增殖(

圖1)。
實(shí)施例2用嵌合抗體P3免疫接種，誘導(dǎo)抗獨(dú)特型(T2)和抗抗獨(dú)特型(T3)的激活。
將嵌合抗體P3(其重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列分別見(jiàn)圖8和圖9)用于6-8周大的雌性Balb/c小鼠的免疫接種。對(duì)于第一次皮下用藥，使用100μg用ACF乳化的抗體。七天后給動(dòng)物再免疫接種50μg用AIF乳化的抗體。在第10天，采集引流淋巴結(jié)(LN)，并且通過(guò)在抗體P3和Ab2 1E10的鼠嵌合變體存在的情況下培養(yǎng)分析LN細(xì)胞的淋巴增殖能力，其可變區(qū)的序列見(jiàn)圖13(重鏈)和圖14(輕鏈)。用C5鼠MAb及其嵌合變體作為相匹配的同種型對(duì)照(專(zhuān)利申請(qǐng)WO 97/33916 A1)。在該抗體或嵌合1E10 MAb存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，從用嵌合抗體P3免疫接種的鼠中得到的淋巴細(xì)胞特異性地增殖，在這些鼠抗體變體存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，其亦特異性地增殖。用相匹配的同種型對(duì)照MAbs證明了增殖的特異性。因此，嵌合P3 MAb保留了鼠變體誘導(dǎo)抗獨(dú)特型(T2)和抗抗獨(dú)特型(T3)T細(xì)胞的特異性增殖的能力(圖2)。
實(shí)施例3GM3-VSSP/Montanide ISA 51疫苗通過(guò)與吸附在氫氧化鋁上的鼠MAb 1E10組成的疫苗結(jié)合，增強(qiáng)抗腫瘤效果。
給一組6-8周大的C57BL/6雌性小鼠在第0、14、28和42天用50μg吸附在氫氧化鋁上的鼠1E10 MAb進(jìn)行皮下免疫接種。在第7、21、35和49天，小鼠接受120μg GM3-VSSP/Montanide ISA 51的肌內(nèi)給藥。另一組小鼠以類(lèi)似方法被免疫接種，但開(kāi)始時(shí)用含有GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗制劑免疫接種。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用了分別在相同時(shí)間間隔并且與每種疫苗給藥次數(shù)相同的或僅用磷酸緩沖的鹽溶液接種的對(duì)照組。在第63天，用10 000個(gè)鼠腫瘤B16細(xì)胞對(duì)所有組的小鼠進(jìn)行皮下接種。評(píng)價(jià)所有組的腫瘤生長(zhǎng)情況。
應(yīng)用混合直線模型(Mixed Lineal Pattern)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析比較所有組和僅接受PBS的對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)情況。單獨(dú)使用1E10 MAb疫苗接種不能保護(hù)小鼠使其免受10,000黑素瘤B16細(xì)胞的挑戰(zhàn)。VSSP-GM3疫苗使腫瘤生長(zhǎng)放慢(p＜0.05)。GM3-VSSP和1E10 MAb疫苗的組合物導(dǎo)致在單獨(dú)使用GM3-VSSP疫苗時(shí)觀察到的保護(hù)效果有所提高(p＜0.05)(圖3)。
實(shí)施例4用Montanide ISA 51作為佐劑的NeuGc-GM3/VSSP神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗對(duì)癌癥患者的免疫接種方案。
臨床試驗(yàn)在20名患晚期惡性黑素瘤(不符合其他任何腫瘤特異性治療的條件)的患者中進(jìn)行，給其接種該疫苗，目的在于證明以用Montanide ISA 51為佐劑(美國(guó)專(zhuān)利US 5,788,985和US 6,149,921)的NeuGc-GM3/VSSP的免疫接種的安全性和免疫源性。
患者接受9次含有200μg GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗制劑。在第0、14、28、42、56、84、112、140及168天給藥。根據(jù)醫(yī)師的標(biāo)準(zhǔn)，在第六個(gè)月之后患者每28天接受額外的劑量，直到他們完成一年的治療。
在第0、14、28、56、112、168、224、280及332天，采血樣做常規(guī)生物化學(xué)測(cè)定和測(cè)定抗NeuGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的血清滴度。
抗體滴定度用ELISA測(cè)定。當(dāng)抗神經(jīng)節(jié)苷脂的OD值等于或高于0，1時(shí)血清稀釋液被認(rèn)為是陽(yáng)性(參照抗甲醇OD)。
疫苗NeuGcGM3-VSSP/Montanide ISA 51的毒性在于在注射部位的紅斑、局部疼痛、硬化和發(fā)熱，根據(jù)OMS規(guī)范這屬允許的輕微毒性級(jí)別，為I/II級(jí)。
患者提高了抗NeuGcGM3的特異性抗體的滴度(1∶80～1∶2560)。檢測(cè)出的同種型抗體包括IgG和IgM(全部患者)和IgG(75％患者；表I)。
就患者01而論，其以晚期惡性黑素瘤(進(jìn)展的轉(zhuǎn)移疾病(Evolutionary Metastatic Disease)，EMD)的診斷參加本試驗(yàn)，在治療兩個(gè)月后觀察到，某些皮膚的病灶的消退和穩(wěn)定，這些病灶周?chē)袩o(wú)色暈輪，在其活檢組織中用病理解剖學(xué)研究證明有炎性浸潤(rùn)和壞死存在(圖4)。
就患者02而論，診斷為晚期惡性黑素瘤，在至少4個(gè)月期間，觀察到在右肺尖18-20mm的肺部轉(zhuǎn)移病灶的穩(wěn)定(圖5)。
表I在晚期惡性黑素瘤患者中用NeuGcGM3/VSSP/Montanide ISA 51疫苗免疫接種后，抗NeuGcGM3抗體的滴度。

實(shí)施例5用含有1E10 Ab2 Mab氫氧化鋁沉淀的獨(dú)特型疫苗在癌癥患者中進(jìn)行免疫接種的方案。
臨床試驗(yàn)在20名患晚期惡性黑素瘤(不符合其他任何腫瘤特異性治療的條件)的患者中進(jìn)行，目的在于證明含有鼠抗獨(dú)特型MAb 1E10(美國(guó)專(zhuān)利US 5,817,513和US 6,063,379)和作為佐劑的氫氧化鋁的獨(dú)特型疫苗的安全性和免疫源性。
患者接受4次含有2mg 1E10 MAb的疫苗。在治療前和每次接種后14天采血樣，做常規(guī)生物化學(xué)測(cè)定和測(cè)定抗1E10 MAb獨(dú)特型和NeuGc-GM3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體的血清滴度。抗體滴度用ELISA試驗(yàn)測(cè)定，等于或高于0,15時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性。
疫苗的使用給患者帶來(lái)輕微毒性，根據(jù)OMS分類(lèi)為I和II級(jí)。
在接受2或3次疫苗后，在有價(jià)值的17名患者中有16名可檢測(cè)到被誘導(dǎo)出的強(qiáng)烈的IgG Ab3抗體反應(yīng)。對(duì)該Ab3特異性的分析顯示，在與其他相匹配的同種型的對(duì)照MAb比較時(shí)，它被患者1E10 MAb血清優(yōu)先識(shí)別，表明在對(duì)1E10 MAb的抗體反應(yīng)中誘導(dǎo)出獨(dú)特型特異的成分。這被抗該MAb的F(ab′)2片段的強(qiáng)血清反應(yīng)所證實(shí)，其滴度的中位數(shù)為1∶15000(滴度為從1∶10000到大于1∶100000)，作為對(duì)照的對(duì)照MAbs的F(ab′)2片段很少或沒(méi)有識(shí)別。(圖6)在大多數(shù)情況，對(duì)抗NeuGcGM3產(chǎn)生的抗體是IgM和IgG兩種，其滴度分別為1∶4000和1∶800(圖7)。
臨床試驗(yàn)包括一名診斷為惡性黑素瘤和肝轉(zhuǎn)移的患者，在治療后顯示病情穩(wěn)定8個(gè)月并且患者生存期為15個(gè)月。
實(shí)施例6用含有Ab2 MAb 1E10的抗獨(dú)特型疫苗和NeuGcGM3-VSSP神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗組合免疫接種。
一名轉(zhuǎn)移的黑素瘤患者，診斷后已經(jīng)接受了每月一次的外科治療，在第0、14、28、42、56天接受6次含有Ab2 MAb1E10和氫氧化鋁凝膠的獨(dú)特型疫苗(每劑2mgMAb)。在這期間，在第7、21、35、49、63天也給患者施用含有200ug NeuGcGM3-VSSP神經(jīng)節(jié)苷脂和作為佐劑的Montanide ISA 51的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗。在患者接受此免疫接種方案后，對(duì)其在兩個(gè)月內(nèi)同時(shí)用兩種疫苗每月再免疫接種一次。疫苗接種期間，沒(méi)有新的病灶出現(xiàn)并且患者狀況良好。
實(shí)施例7用MAb 14F7識(shí)別腫瘤組織。
用MAb 14F7來(lái)識(shí)別NeuGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂(專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/40119)。顯示了用抗體識(shí)別腫瘤組織。
將以福爾馬林固定的組織包埋在石蠟中。對(duì)蘇木素-伊紅(hematoxillin-eosin)染色的切片進(jìn)行組織學(xué)檢查。
這些切片用生物素-鏈霉親和素(estreptavidin)-過(guò)氧化物酶復(fù)合物進(jìn)行免疫染色。(Hsu，S.M.和Raine，L.1981，J.HistochemCytochem.，291349-1353)簡(jiǎn)單地說(shuō)，去除石蠟并將濕切片用3％H2O2(在甲醇溶液中)處理30分鐘，以降低其內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。在室溫下與MAb 14F7(純的)溫育1小時(shí)后，在室溫下加入(Dakopatts)生物素化抗小鼠免疫球蛋白和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物；在各次溫育之間，用Tris-HCl緩沖液洗滌切片。反應(yīng)(POD)由5ml Tris-HCl、0,005ml含有30％H2O2的緩沖液和3-3二氨基聯(lián)苯胺3mg引發(fā)。
用蘇木素-對(duì)照(hematoxillin-contrasted)水(Mayer)洗滌之后，切片用樹(shù)膠(balm)覆蓋并封片。酶反應(yīng)使其呈現(xiàn)褐色。
病理組織的新鮮活檢標(biāo)本是在手術(shù)后一小時(shí)獲得。全部組織用鹽溶液洗滌，并且立刻在液氮中冷凍，并在-80℃冷凍保藏。
在-25℃用Leica低溫保持器將冰凍的片段切片。得到5um系列切片，之后用空氣干燥并立刻使用，或者用鋁箔包裝保藏在-20℃；之后，將切片用4％的低聚甲醛固定20分鐘。
在表II中顯示了若干人的腫瘤用MAb 14F7免疫染色的情況。在50％以上的腫瘤細(xì)胞中，觀察到很強(qiáng)的細(xì)胞膜和胞質(zhì)染色。在結(jié)腸癌、子宮癌、卵巢癌、肉瘤、乳腺癌的淋巴結(jié)和腦轉(zhuǎn)移瘤中，以及在黑色素轉(zhuǎn)移瘤中，染色非常強(qiáng)。
表II用MAb 14F7進(jìn)行腫瘤免疫染色。

*大于50％的細(xì)胞顯示出細(xì)胞膜和胞質(zhì)被很強(qiáng)地免疫染色。
附圖簡(jiǎn)述圖1給胸腺機(jī)能正常的Balb/c小鼠和無(wú)胸腺的小鼠，皮下免疫接種100μg在CFA中的鼠MAb P3，接著用50μg在IFA中的乳化MAb再免疫接種。三天后，采集淋巴結(jié)細(xì)胞并且對(duì)其用不同濃度的MAb P3、A3、1E10和C5進(jìn)行增殖試驗(yàn)。
圖2給Balb/c小鼠皮下免疫接種100μg在CFA中的嵌合抗體P3，接著用50μg在IFA中乳化的抗體再免疫接種。三天后，采集淋巴結(jié)細(xì)胞，并且對(duì)其用不同濃度的抗體進(jìn)行增殖試驗(yàn)，鼠嵌合抗體作為對(duì)照。
圖3如實(shí)施例3中敘述的，在用免疫治療組合物，特別是含有Ab2 MAb 1E10的獨(dú)特型疫苗和GM3-VSSP神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗，免疫接種小鼠時(shí)，鼠B16腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。
圖4黑素瘤患者中皮膚轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。用疫苗NeuGcGM3/VSSP/ISA 51免疫接種前、在治療后2和4個(gè)月時(shí)拍下照片?？捎^察到某些病灶周?chē)袩o(wú)色暈輪，病灶穩(wěn)定，在一個(gè)病灶中觀察到其尺寸減小，而在一個(gè)病灶看到增大。
圖5黑素瘤患者中肺轉(zhuǎn)移瘤的進(jìn)展。用計(jì)算機(jī)輔助軸向斷層照相觀察右肺尖，用疫苗NeuGcGM3/VSSP/ISA 51免疫接種前，病灶尺寸為18×20mm，而免疫接種后4個(gè)月觀察到病灶穩(wěn)定。
圖6用從接種了含有Ab2 MAb 1E10和作為佐劑的氫氧化鋁凝膠獨(dú)特型疫苗的患者中獲得的血清，從Ab2 MAb1E10和含有相同同種型的其他MAb中識(shí)別F(ab′)2片段。
圖7用從接種了含有Ab2 MAb1E10和作為佐劑的氫氧化鋁凝膠獨(dú)特型疫苗的患者中獲得的血清，識(shí)別GM3(NeuGc)和GM3(NeuAc)神經(jīng)節(jié)苷脂。
權(quán)利要求
1.一種免疫治療組合物，其用于過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂腫瘤的免疫療法，該組合物含有至少兩種下述組分(A)一種獨(dú)特型疫苗，其含有鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體(Ab1)；(B)一種獨(dú)特型疫苗，其含有針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體的特異性鼠抗獨(dú)特型單克隆抗體(Ab2)；(C)一種神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫治療組合物，其中所述組合物含有A加B或A加C或B加C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的免疫治療組合物，其中所述疫苗A含有鼠抗神經(jīng)節(jié)苷脂MAb P3(保藏號(hào)ECACC 94113026)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的免疫治療組合物，其中所述疫苗B含有鼠抗獨(dú)特型抗體1E10(保藏號(hào)ECACC 97112901)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的免疫治療組合物，其中所述疫苗C含有NeuGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的免疫治療組合物，其中所述疫苗C含有NeuAcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的免疫治療組合物，其中將A和B或A和C或B和C同時(shí)或交替用藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的免疫治療組合物中任意一種在過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤治療中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其為在乳腺、肺、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、黑素瘤、肉瘤以及從神經(jīng)外胚層組織產(chǎn)生的那些腫瘤治療中的應(yīng)用。
10.一種控制過(guò)度表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤生長(zhǎng)和/或細(xì)胞增殖的方法，包括把權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的免疫治療組合物給哺乳動(dòng)物用藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更確切地說(shuō)是涉及應(yīng)用于控制腫瘤生長(zhǎng)和/或細(xì)胞增殖的免疫治療組合物。借助于本發(fā)明，通過(guò)將含有以抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體(Ab1)為有效成分的獨(dú)特型疫苗和以針對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體獲得的抗獨(dú)特型抗體(Ab2)為有效成分的獨(dú)特型疫苗，或者有效成分是一種或多種神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗混合，觀察到了對(duì)腫瘤的治療作用。敘述了這些疫苗組合物導(dǎo)致的對(duì)腫瘤的協(xié)同治療作用。涉及的組合物可以應(yīng)用于處于不同臨床情況下的表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤患者。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1507452SQ02808433
公開(kāi)日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2002年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者L·E·費(fèi)爾南德茲莫林納, A·M·瓦克茲洛佩茲, R·佩勒茲羅德里戈茲, A·佩勒茲岡薩雷茲, A·卡爾佩勒茲, Y·迪亞茲羅德里格茲, M·A·阿爾方索費(fèi)爾南德茲, A·M·羅扎斯德?tīng)柨栁? L E 費(fèi)爾南德茲莫林納, 親嚷薜呂鋦褡, 兆嚷薜呂鋦曜, 兆雀勻 鬃, 瓦克茲洛佩茲, 羅扎斯德?tīng)柨栁? 謇兆, 阿爾方索費(fèi)爾南德茲 申請(qǐng)人:分子免疫中心