專利名稱：連續(xù)或分批加料方法中l(wèi)-苯丙氨酸甲酯和n-芐氧基羰基-l-天冬氨酸的酶促偶合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在反應混合物中、通過N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)和L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)的高轉(zhuǎn)化酶促偶合制備N-芐氧基羰基-α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯(Z-APM)的方法，所述反應混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物。
N-保護的α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯、尤其比如Z-APM是“強甜味劑”天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(以下稱之為APM)的重要前體，所述強甜味劑是一種具有約比蔗糖甜200倍的甜化能力，并且具有優(yōu)異的味道性能，而且沒有例如其它強甜味劑比如糖精和環(huán)己磺酸鹽的苦回味的產(chǎn)品。強甜味劑天冬氨酰苯丙氨酸甲酯可應用于寬范圍的產(chǎn)品比如可用于軟飲料、糖果、“日常甜味劑”、藥品等。
該申請中所提及的Z-還應理解為是指非極性質(zhì)的與Z-有關的任何保護基團，比如例如是苯環(huán)被一個或多個烷基、烷氧基、?；螓u素取代的芐氧基羰基化合物。
在制備天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的已知方法中，酶促制備方法非常重要的原因主要是因為以立體選擇性和區(qū)域選擇性方式發(fā)生酶促偶合。所討論的酶促偶合反應是控制平衡的反應。在現(xiàn)有的該酶促偶合反應技術中，當形成沉積物使平衡向合成側(cè)移動時通常會實現(xiàn)高程度的轉(zhuǎn)化。
例如在US4165311A中解釋了平衡控制，通過N-保護的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、尤其是Z-APM的沉淀加成化合物的形成，可控制偶合反應平衡向右側(cè)移動，其中反應混合物中存在D-或L-苯丙氨酸甲酯。天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前體的該加成化合物也可分別表示為Z-APM·D-PM或Z-APM·L-PM。
但是，該方法有許多缺點。在現(xiàn)有技術中，為了形成加成化合物，理想的是進行Z-Asp和L-PM的偶合反應時L-PM的摩爾量至少是Z-Asp摩爾量的兩倍，或者是D-PM至少以等量存在。反應后必須除去過量的成分，導致了額外的處理并且成本易變化。另一個缺點是，為了得到最終理想APM而進行的對沉淀的加成化合物的處理和進一步加工是費力的。
EP-A-664338避免使用大量過量的L-PM或至少等量的D-PM，在該文獻所描述的酶促偶合反應中，從開始即使用了為化學計量或幾乎為化學計量的Z-Asp和L-PM·HCl，并且其中也形成了大體上由Z-APM組成的沉積物。所述反應在攪拌或搖動條件下進行，在作為酶的中性蛋白酶作用下進行，反應的初始pH值是4.5-6.0，并且在存在濃度約為3-25wt％的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的批處理反應器或半連續(xù)條件下進行。如果工藝在半連續(xù)條件下進行，則僅可以連續(xù)地分離形成的沉積物，并且事實上以化學計量比以及與分離的沉積物之摩爾量相等的總量來供應更多的原材料。
EP-A-664338所描述的工藝的缺點是盡管使用了化學計量或幾乎為化學計量的Z-Asp和L-PM·HCl，當反應在相對較高的pH、即例如5.8或更高的pH條件下進行時，反應最初形成了其量僅次于Z-APM的大量加成化合物Z-APM·L-PM，盡管該量小于施加大過量L-PM時的工藝所產(chǎn)生的量。反應混合物中的Z-APM·L-PM形成了(共)沉淀物。由于形成加成化合物Z-APM·L-PM需要兩摩爾的L-PM與每摩爾的Z-Asp反應，因此L-PM遠比Z-Asp消耗的多，以致于在反應過程中，溶液中Z-Asp∶L-PM的摩爾比可能明顯高于1∶1。已發(fā)現(xiàn)該高比率的Z-AspL-PM對Z-Asp的最大轉(zhuǎn)化率和反應速率有負面影響。
當反應在較低的pH、例如約為5的pH下進行反應時，確實一定程度上避免了Z-APM·L-PM的形成，但是，在大多數(shù)情況下這并非是一個有吸引力的選擇，因為在如此低的pH下由于低酶活性和高酶減活也會導致反應速度相對低。因此，很難在這樣的條件即a)Z-APM作為(幾乎是)唯一的沉淀物立即形成和b)得到合理的反應速度下進行。
本發(fā)明的目的是提供一種具有商業(yè)吸引力的Z-Asp和L-PM的酶促偶合方法，該方法可以以高的Z-Asp和L-PM轉(zhuǎn)化率直接得到Z-APM沉淀物，并且其具有高酶活性和低的酶減活，從而得到了有利的反應速度。
令人驚訝的是，根據(jù)本發(fā)明，通過在連續(xù)或分批加料工藝中、在5.0-6.5的pH下、以1∶1-2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比并且其中Z-Asp和L-PM的實際摩爾比高于平均加料摩爾比的條件下進行Z-Asp和L-PM的酶促偶合，由此實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
特別令人驚訝的是，與EP-A-664338所述的批處理工藝的發(fā)現(xiàn)相反，Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低至例如1.1∶1-1.6∶1之間時，立即形成了基本上全部由Z-APM組成的沉淀物，并且?guī)缀跬耆苊饬薢-APM·L-PM加成化合物(共)沉淀的形成，即使偶合反應在相對高的pH例如高于5.8但低于6.5的pH下進行亦如此。在如此高pH下進行偶合反應的可能性為得到高反應速度和高原料轉(zhuǎn)化率提供了獨特的條件，而且直接形成Z-APM沉淀物也免去了如果形成Z-APM·L-PM時所必需的其它工藝步驟。
另外，應指出的是，以本發(fā)明連續(xù)或分批加料工藝而進行的反應導致驚人低的酶減活。
JP-A-97248197描述了用于Z-Asp和L-PM偶合的批處理工藝，該工藝利用了過量的Z-Asp、即Z-Asp∶L-PM摩爾比為2∶1-8∶1，優(yōu)選約4∶1。根據(jù)上述專利申請的描述，在Z-Asp過量的條件下進行反應可提供直接形成Z-APM的優(yōu)勢，而且反應后需要回收的L-PM少并且在反應過程中由于水解而損失的L-PM少。
盡管該實施方式確實導致了少的L-PM消耗，但是此時需要回收大量的過量Z-Asp，由此導致為了得到高Z-Asp生產(chǎn)量而進行的其它附加反應步驟。與此相反的是，本發(fā)明利用了低于2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比，并且由此顯著減少了待回收的過量Z-Asp的量。
本申請上下文所用的術語“Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比”是指在酶促偶合反應過程中加入的Z-Asp的總量(摩爾)與酶促偶合反應過程中加入的L-PM總量(摩爾)之間的比率。
術語“Z-Asp和L-PM的加料摩爾比”是指在某一時間或反應過程中的某一段時間內(nèi)加入的Z-Asp量(摩爾)與L-PM量(摩爾)之間的比率。尤其是在反應初始階段，加料摩爾比變化范圍可以很寬，但是在連續(xù)(或分批加料)工藝的連續(xù)加料階段通常其范圍處于所述平均加料摩爾比范圍內(nèi)，只要在工藝結(jié)束時，平均加料摩爾比亦在1∶1-2∶1之間。
術語“Z-Asp和L-PM的實際摩爾比”是指在某一時間或反應過程中的某一段時間內(nèi)反應混合物中存在的“游離”Z-Asp量(摩爾)與“游離”L-PM量(摩爾)之比。
本申請中所用的連續(xù)工藝的定義是至少一種反應物被連續(xù)地加入反應器并且反應混合物被連續(xù)地排出反應器的工藝。本申請所用的連續(xù)工藝也可包括酶促偶合反應不連續(xù)進行的時間段，例如利用不排出反應混合物的批處理或分批加料過程。利用批處理和/或分批加料過程作為連續(xù)工藝的一部分特別有利于啟動工藝初始階段的反應，并且有利于在反應結(jié)束時完成轉(zhuǎn)化。申請人已發(fā)現(xiàn)使系統(tǒng)運轉(zhuǎn)的多種裝置和設備特性形式均可用于實施本發(fā)明的連續(xù)工藝。該反應可在由不會對酶促偶合反應產(chǎn)生不利影響的各種材料比如玻璃、不銹鋼等制成的反應器中進行。設備的尺寸可在大范圍內(nèi)變化。因此反應可以以任何所需要的規(guī)模進行。為了得到均勻的反應混合物，在整個反應混合物中Z-Asp和L-PM的實際濃度大致保持一致，優(yōu)選使用至少一個可實現(xiàn)充分混合的反應器。充分混合的反應器的例子是ContinuouslyStirredTankReactor(連續(xù)攪拌釜反應器)(CSTR)和反應混合物在其中進行循環(huán)的塔?；诮?jīng)濟原因特別使用一個或兩個充分混合的反應器。使用三個或多個充分混合的反應器可提供甚至更高的Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率，但是另一方面會導致高的投資成本并且使操作更費力。最優(yōu)選使用兩個串聯(lián)的充分混合的反應器，其優(yōu)于一個充分混合的反應器之處在于使用較低的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比可得到相同的總持續(xù)時間和轉(zhuǎn)化率。當利用至少一個充分混合的反應器進行反應時，優(yōu)選工藝的進行方式是在整個充分混合的反應器中，產(chǎn)物濃度基本上一致并且約等于被排出的反應混合物的產(chǎn)物濃度。例如為了完成轉(zhuǎn)化，可在(串聯(lián)的)充分混合的反應器之后使用具有塞流行為的反應器比如柱狀反應器。如果使用兩個或多個反應器，則反應器可具有不同的反應器體積。
本申請中所用的分批加料工藝的定義是至少一種反應物被加入分批反應器并且其中反應混合物不被連續(xù)排出的工藝。優(yōu)選在反應開始之前將至少一種反應物加入反應器，以便在反應的初始階段產(chǎn)生大量過量的該反應物。如果使用不止一個分批加料反應器，此時它們被平行地操作。與連續(xù)工藝相反的是，在分批加料工藝中，反應混合物的量(體積)隨著時間的增加而增加直至反應停止。申請人已發(fā)現(xiàn)使系統(tǒng)運轉(zhuǎn)的多種裝置和設備特性形式均可用于實施本發(fā)明的分批加料工藝。該反應可在由不會對酶促偶合反應產(chǎn)生不利影響的各種材料比如玻璃、不銹鋼等制成的反應器中進行。設備的尺寸可在大范圍內(nèi)變化。因此反應可以在任何所需要的規(guī)模下進行。優(yōu)選分批加料反應的進行利用了高度反混工藝，更優(yōu)選在至少一個攪拌的分批反應器中進行。
在本申請范圍內(nèi)，術語“連續(xù)加料階段”是指及時地向反應混合物中加入至少一種反應物的階段，它可指連續(xù)和分批加料工藝。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，Z-Asp和L-PM的實際摩爾比高于平均加料摩爾比。但是需要順便提及的是，特別是在反應結(jié)束時，在相對短的時間段內(nèi)可出現(xiàn)Z-Asp和L-PM的實際摩爾比低于加料平均摩爾比，而不會明顯影響反應速度和/或產(chǎn)品質(zhì)量。優(yōu)選反應過程的早期、即達到連續(xù)加料階段之前，Z-Asp和L-PM的實際摩爾比至少例如比平均加料摩爾比高10％，優(yōu)選至少高25％，最優(yōu)選至少高40％。
反應組分的加料速度可在寬范圍內(nèi)變化。基于經(jīng)濟原因應避免非常低的加料速度，因為低加料速度會導致低產(chǎn)量。另一方面，也當然應該避免過高的加料速度、即超出反應器容量的加料速度。也應避免高的加料速度，因為由于攪拌能力不足會導致潛在的不均勻效果(被稱為熱點)。
反應器中所用的攪拌速度并不是很關鍵，本領域技術人員很容易使其最佳化。應該避免太高的攪拌速度，因為特別是在相當高的漿液濃度下，該高攪拌速度可能會導致酶減活。另一方面，也應該避免太低的攪拌速度，因為如此低的攪拌速度會導致反應混合物的不均勻性例如pH熱點，從而也導致了酶減活。
連續(xù)反應的持續(xù)時間或批加料反應的反應時間并不是很關鍵并且其可在寬范圍內(nèi)變化。任何本領域技術人員均可使其最佳化。當連續(xù)反應中利用不止一個充分混合的反應器時，對于每個獨立的充分混合的反應器而言，可調(diào)整使其持續(xù)時間不同。
根據(jù)本發(fā)明，利用1∶1-2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比來進行反應。平均加料摩爾比低于1∶1可能會促進形成過量的具有上述缺點的Z-APM·L-PM加合物。當平均加料摩爾比高于2∶1時，在偶合反應之后從反應混合物回收的過量Z-Asp會不利地更高。在1∶1-2∶1的范圍內(nèi)時，過量的Z-Asp在轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率方面會導致最好的結(jié)果，而且當在1∶1的情況下，一種或兩種未反應原料的任何所需循環(huán)是最少的。優(yōu)選反應在1.1∶1-1.6∶1之間的平均加料摩爾比下進行反應。
在本發(fā)明的一個實施方式中，利用一個CSTR進行連續(xù)反應，首先在批處理或批加料工藝中，以顯著高于2∶1的Z-Asp和L-PM的初始實際摩爾比使Z-Asp和L-PM反應足夠長的時間直至達到連續(xù)進料階段，從而形成Z-APM。當已達到適當水平的轉(zhuǎn)化并且工藝可穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為連續(xù)工藝時、即當Z-Asp和L-PM首先達到向Z-APM的轉(zhuǎn)化率約為55％或更大并且優(yōu)選游離Z-Asp和游離L-PM的實際摩爾比仍高于2∶1時，以1∶1-2∶1的平均加料摩爾比將Z-Asp和L-PM連續(xù)加入CSTR，并且持續(xù)該加料直至Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低于2∶1，優(yōu)選低于6∶1為止。
在本發(fā)明的另一實施方式中，利用多于一個CSTR(串聯(lián))進行相似的反應。串聯(lián)使用的每一個CSTR中Z-Asp和L-PM的加料摩爾比不一定要相同。當二個CSTR串聯(lián)使用時，優(yōu)選以相對高的[Z-Asp]/[L-PM]比將Z-Asp和L-PM加入第一反應器。優(yōu)選將LPM與反應器1的反應混合物一起加入第二反應器中，反應器2的Z-Asp和L-PM的加料摩爾比應使整個工藝的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低于2∶1，優(yōu)選低于6∶1。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用一個分批反應器以批加料反應形式進行反應。將Z-Asp和L-PM加入分批反應器中，以使平均加料摩爾比為1∶1-2∶1并且至少在工藝的初始階段Z-Asp和L-PM的實際摩爾比高于2∶1，優(yōu)選至少直至已首次達到至少55％的轉(zhuǎn)化率為止。不同反應物的加入方法可不同，并且可在反應初始和/或反應過程中同時加入部分材料，或在反應過程中加入小部分材料，或逐步加入材料。優(yōu)選在反應初期加入大量Z-Asp并且接著在反應過程中分批加入L-PM。
反應過程中pH是5.0-6.5。可短時超出所述pH范圍而不會對結(jié)果有不良影響。但優(yōu)選使偶合過程中的pH維持在低于6.5的水平。更優(yōu)選pH維持在低于6.2并且最優(yōu)選低于6.0。pH低于5.0時，由于低酶活性，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量降低。優(yōu)選使用高于5.2的pH，更優(yōu)選pH高于5.5。在使用不止一個充分混合的反應器的連續(xù)工藝時，在下一個反應器中可使用不同的pH值。順便提及的是，應指出pH的下限也可在有限程度上降低，這取決于所使用的酶。因此，例如當使用低pH下比野生型酶性能佳的突變異種酶時，可實現(xiàn)更低的pH范圍下限例如3-5。
在偶合反應過程中，可利用pKa在-10-+8之間、優(yōu)選pKa在-2-+7.5之間的酸來調(diào)整反應混合物的pH。優(yōu)選在利用的反應條件下，酸的使用僅導致極少或不導致酶的減活。該酸的合適實例是鹽酸和醋酸。最優(yōu)選使用醋酸。如果需要也可加入堿來調(diào)節(jié)pH。
在根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，可將有機酸緩沖劑及其共軛堿加入反應混合物。合適的緩沖劑的實例是醋酸/醋酸鹽，丙酸/丙酸鹽、丁酸/丁酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鹽、馬來酸/馬來酸鹽和鄰苯二甲酸/鄰苯二甲酸鹽。利用這些緩沖劑的優(yōu)點是pH變化較小，同時在反應過程中仍可利用強酸和/或堿調(diào)節(jié)pH，這在沒有緩沖劑時很容易導致酶的減活。優(yōu)選使用醋酸/醋酸鹽緩沖劑，在反應過程中可利用醋酸或鹽酸來調(diào)節(jié)pH。當使用該緩沖劑時，應當盡可能避免由于存在緩沖劑而增加Z-Asp的溶解度，因為較高的溶解度導致回收的Z-Asp沉淀物少。
在根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式中，可通過將含原料的進料溶液、例如含Z-Asp、L-PM·HCI和/或酶的進料溶液之pH調(diào)整至所需要的值來調(diào)整反應混合物的pH。
在本發(fā)明的工藝中利用了含水介質(zhì)。本申請文件中的術語“含水介質(zhì)”是指任何均勻的單相極性含水體系，它可含有少量(最高約30％)的有機溶劑比如甲醇、乙腈、醋酸、甲基異丁基酮(MIBK)和甲苯。
根據(jù)本發(fā)明，含水介質(zhì)含有一些堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，基于反應混合物總重量的重量％計算時，優(yōu)選其量為3-25％。根據(jù)本發(fā)明的方法可利用各種堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽。適宜的實例是鉀、鈉、鋰和銨的鹵化物或硫酸鹽或其混合物。此時術語“銨”也是指被一個或多個C1-3烷基取代的銨；該取代的銨鹽的實例是氯化三乙銨、氯化三鉀銨、氯化二乙銨、氯化二甲銨等。涉及根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選是3-25wt％的重量百分比范圍時，相應鹽的溶解度部分決定了潛在的應用。堿金屬和銨鹽一般具有最好的溶解性并且優(yōu)選使用它們。特別優(yōu)選使用氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、氯化銨和/或硫酸銨。最優(yōu)選使用氯化鈉。
反應體系中鹽含量越高，則轉(zhuǎn)化進行的越快，同時不會對產(chǎn)率產(chǎn)生明顯的影響。但是在高含量時，很快就會增加體系的黏度，和/或一種或多種原料和/或鹽本身會超過溶解度極限，從而使得到的沉淀物被該原料或鹽不必要地污染了，由此導致反應的轉(zhuǎn)化程度降低。超過25％重量時，體系的黏度實際上使反應不可能進行。反應體系中鹽含量越低，則所需要的總反應時間越長，從而尤其是增加了L-PM的水解。在例如低于3wt％的低鹽濃度下，也對偶合產(chǎn)物的溶解度有不利影響。附帶提及的是，如果應過早地沉積加成產(chǎn)物(Z-APM·L-PM)，這不會影響本發(fā)明的反應，因為在反應過程中在提及的具體條件下，平衡的移動會導致該產(chǎn)物的所有部分或一部分轉(zhuǎn)化成Z-APM沉淀。優(yōu)選地，鹽含量是10-18重量％，因為在此范圍內(nèi)可發(fā)現(xiàn)如下組合的最有利條件a)體系的黏度；b)原料的溶解度和最終產(chǎn)品的沉淀形成；c)反應時間和d)Z-APM沉淀物的純度。
酶促偶合反應通常在10-60℃的溫度下進行。溫度越低，則偶合反應和副反應比如L-PM和Z-APM的水解反應速度越低。溫度越高，則酶的減活發(fā)生的越快。本領域技術人員可容易地確定所使用的酶應選擇什么樣的溫度，以實現(xiàn)Z-APM轉(zhuǎn)化率和酶穩(wěn)定性方面的最佳效果。
利用中性蛋白酶來進行本發(fā)明的酶促偶合反應。此時術語中性蛋白酶是指任何已知的中性蛋白水解的酶以及具有相當?shù)幕蛏踔猎黾拥幕钚缘钠渫蛔儺惙N，所述蛋白水解的酶可用于由Z-Asp和L-PM來合成Z-APM。中性蛋白酶的實例包括金屬蛋白酶比如由Bacillus thermoproteolyticus產(chǎn)生的嗜熱菌蛋白酶以及特別是通過各種桿菌類，比如Bacillus stearothermophilus(嗜熱脂肪芽孢桿菌)，Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)，Bacillus cereus(蠟狀芽孢桿菌)，膠原酶等制造的其它蛋白酶。一般地，這些酶在約6-8的pH下顯示出最佳的蛋白酶活性，但是已發(fā)現(xiàn)當在本發(fā)明的條件下利用這些酶時，在5.0to6.5、特別是5.2to6.2、尤其是5.5to6.0的初始pH也可達到好的效果，而且不需要利用過多量的酶。應指出的是，存在少量的Ca2+離子一般對酶的穩(wěn)定性和活性具有有益的效果。
本發(fā)明的連續(xù)或批加料方法中，通常不改變或幾乎不改變酶的活性，這使得反應長時間持續(xù)的同時反復應用酶。因此，特別是當利用溶解的酶時，建議將由所獲得的沉淀物分離后得到的酶再用作酶促偶合反應的酶。
偶合反應所用的酶量并不是非常關鍵，但是所利用酶的量通常應當可在可接受的有限的時間段內(nèi)得到高轉(zhuǎn)化率。一般地，占反應混合物總量為0.08-1.5重量％、優(yōu)選0.15-0.75重量％的酶量(此時理解為具有所討論的酶活性的蛋白質(zhì)，即所謂的活性蛋白質(zhì))是適宜的。如果酶量是基于所用的(干)酶制劑總量、即活性蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)以及其它輔助劑比如鹽的總量給出時，此時所提及的百分數(shù)一般相當于約0.5-10％或優(yōu)選的1-5％。酶通常被用作酶制劑，并且市售得到的也是酶制劑。通常該酶制劑中活性蛋白質(zhì)的量約為制劑重量的15％。
根據(jù)本發(fā)明的方法中，酶可以以任何適宜于該目的的形式、即以溶解的或固定的形式被使用。如果利用固定的酶催化劑，優(yōu)選固定的酶催化劑的顆粒尺寸和/或密度明顯不同于Z-APM沉淀物的顆粒尺寸和密度，從而便于分離沉淀物的同時使酶保持于反應介質(zhì)中。優(yōu)選使用將酶制劑溶解于反應介質(zhì)中得到的溶解酶，因為這在分離所得Z-APM沉淀物并且進一步處理它以及在生物催化劑本身的重復利用方面有優(yōu)勢。如前所述，也可以利用所討論的酶的突變異種?？筛鶕?jù)所使用的酶活性來改變以上限定的酶量百分數(shù)，當然利用突變異種酶時亦如此。
盡管本申請中提及了L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)，但是應理解為也涉及由其得到的酸式鹽比如鹽酸鹽(L-PM·HCI)。盡管本申請中提及了N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)，但是應理解為也涉及由其得到的鹽比如二鈉鹽(Z-Asp·二Na)。很明顯，當利用其酸式鹽替代L-PM和/或利用其鹽替代Z-Asp時，必須在有限程度內(nèi)調(diào)節(jié)所用的化學試劑的量，以得到所需要的pH。
Z-Asp和L-PM原料的濃度可在寬范圍內(nèi)變化，并且它們?nèi)Q于這些材料在反應混合物中的溶解度。但是，只要尚未達到連續(xù)進料階段，存在少量未溶解的原材料不會影響反應進程。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，回收未轉(zhuǎn)化的Z-Asp。在離開偶合反應器之后并且任選地在例如利用超濾除去酶之后，可隨后對反應混合物進行低pH下的萃取處理，也就是在低于例如4的pH下、利用不與水混溶的有機溶劑例如酯、酮、任選被取代的脂族或芳族烴、優(yōu)選甲苯或MIBK作為萃取液，將反應混合物中的至少一部分Z-Asp萃入有機溶劑中成為游離二酸。之后，可利用足量的堿將Z-Asp由有機相中反萃為其鹽。接著可將含有Z-Asp鹽的水溶液循環(huán)至反應工藝中。本領域技術人員可使萃取和反萃工藝最佳化。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，在酶促偶合反應中可將少量有機溶劑加入反應混合物。已驚人地發(fā)現(xiàn)，存在該有機溶劑可明顯降低酶的減活速度。適用于該目的的有機溶劑是與水不互溶的溶劑例如甲苯、MIBK及其混合物。優(yōu)選所使用的有機溶劑與回收Z-Asp所用的有機溶劑相同。甲苯最優(yōu)選，因為在氫解作用中其被從Z基團釋放，從而它不是工藝體系中前所未有的化合物。
將參考以下的實施例和對比實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述，但并非是對本發(fā)明的限制。
實驗程序在所有情況下均使用市售可得的野生型嗜熱菌蛋白酶(得自Amano)作為酶。以下實施例中，每種情況下均基于所利用的酶制劑量來計算具體的酶濃度和最初的酶活性。
利用凝膠過濾的高性能液體色譜(凝膠過濾的HPLC)來確定實施例1-4所述的Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率程度，該HPLC利用254nm下的UV-分光光度計檢測，它使用的柱填充了TSK-Ge1G2000SW和作為洗提液的0.15M醋酸鹽緩沖的乙腈/水70/30(v/v)，其pH為5.6并且溫度是25℃。
利用反相HPLC來分析酶的量，該反相HPLC利用280nm下的UV-分光光度計檢測，它使用的柱填充了TSK-Ge1Pheny1-5PWRP。用于洗提液的梯度為A0.15M醋酸鈣緩沖的pH＝6的乙腈/水5/95(v/v)和B0.15M醋酸鈣緩沖的pH＝6的乙腈/水60/40(v/v)。梯度0-4分鐘A/B＝90/10恒定；4-10分鐘6分鐘內(nèi)線性變化A/B＝90/10-40/60。
以不會對反應結(jié)果有明顯影響的方式從反應混合物中取出樣品。在對比例A中，樣品立即被甲醇吸收，以停止酶促反應，并且在分析之前在低溫下保存(通過自動注入洗提液的連續(xù)流)。在實施例1-4的情況下，樣品被用于HPLC的洗提液稀釋。
在所有實施例中對初始反應混合物的描述包括它們的濃度[Z-Asp]、[L-PM]、[Ca2+]、[NaCl]和[酶]。除非有其它的注釋，則按照以下方式制備混合物-將固體Z-Asp和NaCl溶解于NaOH水溶液中(“Z-Asp.Na溶液”，NaOH∶Z-Asp＝1.7mol/mol)。
-將固體L-PM.HCl溶解于少量水中(pH約為3.5的“L-PM.HCl溶液”)-在攪拌條件下緩慢地將Z-Asp.Na加入L-PM.HCl溶液，并且利用NaOH水溶液將pH大致調(diào)整至所需要的值-向該混合物中加入酶和CaCl2的水溶液-最后，利用NaOH水溶液將pH調(diào)整至最終(初始)值。
對比實施例A批反應制備的溶液含有[Z-Asp]＝0.74mol/kg[L-PM]＝0.65mol/kg[酶]＝3.8wt％[NaCl]＝13.0wt％pH＝5.3。
在40℃下攪拌(75rpm)該溶液，并且利用16wt％的HCl水溶液將pH調(diào)整至5.3，而且在整個偶合反應中保持該值。在約5小時的過程中，L-PM的轉(zhuǎn)化率與反應時間的曲線以12.0％/h(作為一級系數(shù))的量線性增加，這相當于5小時后L-PM的轉(zhuǎn)化率是40％。在形成沉淀物以后，間隔取樣幾次并且分析之。在所有的分析樣品中，固體似乎主要是Z-APM·L-PM。在5h-7h之間的反應時間內(nèi)，轉(zhuǎn)化率的增加曲線彎曲下降，并且從7h(相當于L-PM的轉(zhuǎn)化率是約45％)-30h(相當于L-PM的轉(zhuǎn)化率是84％)轉(zhuǎn)化率與時間的曲線重新以1.8％/h的一級系數(shù)線性增加。從30h-44h轉(zhuǎn)化率增加減緩，但44h后又提供了96％的L-PM轉(zhuǎn)化率。
對比實施例A表明在反應的初始階段形成了Z-APM·L-PM。由于為了形成Z-APM·L-PM而消耗了相對大量的L-PM，在5h之后留下了相對低濃度的“游離”L-PM，從而導致反應變緩。在約7小時以后，留下了非常少量的“游離”L-PM，并且由Z-APM·L-PM釋放L-PM的速度決定了酶促反應速度。在Z-Asp∶L-PM比率高達2∶1的情況下進行反應，申請人發(fā)現(xiàn)了類似的情形。
實施例1在一個CSTR中的連續(xù)反應，pH＝5.2
在該實施例中，利用了一個體積為5升的CSTR。開始的反應是批處理反應，之后進行批加料反應(加入了L-PM溶液)，并且最后通過既加入Z-Asp/酶溶液又加入L-PM溶液成為了連續(xù)反應。
批處理方式的反應(從0-17h)制備了具有以下成分的溶液，其中在最后的步驟中加入酶[Z-Asp]＝0.53mol/kg[L-PM]＝0.27mol/kg[酶]＝4.2wt％[NaCl]＝13wt％[Ca2+]＝8mmol/kg將混合物(總重量4.0kg)轉(zhuǎn)移至反應器并且隨后在40℃下攪拌17h(攪拌速度為280rpm)。在該期間中，利用20wt％的HCl水溶液小心地將pH調(diào)節(jié)至5.2。取出一些樣品、過濾并且用小量水洗滌。在所有情況下固體中的Z-APM∶Z-APM·L-PM＞99∶1。
批加料反應(從17-22h)在40℃下利用20wt％的HCl溶液將pH連續(xù)調(diào)節(jié)為5.2的條件下，以69g/h的加料速度將含以下物質(zhì)的溶液加入以上得到的混合物中[L-PM]＝2.0mol/kg[Ca2+]＝30mmol/kg。
在t＝22h、即緊接著批加料反應之后，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別已達到66％和90％。
連續(xù)反應(從22-42h)將以下溶液連續(xù)加入以上得到的混合物中·一種溶液，它包括[Z-Asp]＝0.61mol/kg[酶]＝5wt％[NaCl]＝10wt％以193.4g/h的加料速度加入，和·一種溶液，它包括＝2.0mol/kg[Ca2+]＝30mmol/kg以44.6g/h的加料速度加入。
在40℃下攪拌該反應混合物并且利用20wt％的HCl溶液將pH調(diào)節(jié)為5.2。保持時間是19h并且加料摩爾比Z-Asp/L-PM是1.33mol/mol。從22h-42h，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化程度穩(wěn)定(分別為65％和90％)，并且酶的余量為常數(shù)(80％)。間隔取樣幾次并且過濾之；固體中[Z-APM]∶[Z-APM·L-PM]的比率＞98∶2。Z-APM的穩(wěn)定產(chǎn)量是34g/h(此時基于L-PM的產(chǎn)率是89％)。
實施例2高pH＝5.8下的批加料反應，[NaCl]13wt％制備了起始溶液，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.734mol/kg[L-PM]＝0.125mol/kg[NaCl]＝12wt％[酶]＝3.4wt％[Ca2+]＝7.8mmol/kg總重量2.50kgpH＝5.8在40℃下攪拌該反應混合物49h，并且利用20wt％的HCl水溶液將pH連續(xù)調(diào)節(jié)為5.8。在該過程中加入L-PM的加料液([L-PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是12.46g/h。Z-Asp和L-PM之間的平均加料摩爾比是1.17mol/mol。
在49h以后，當加入了所有的L-PM·HCI加料液時，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別為81.2％和96.1％)。余下的酶為約49％。該漿液用于實施例3(反應器2)的連續(xù)實驗。通過分析由偶合漿液中取出的經(jīng)過濾和水洗滌的樣品可知，沉淀物似乎(幾乎)僅為Z-APM。
實施例3在2個CSTR中的連續(xù)反應，pH＝5.8在該實施例中，利用了兩個體積為5升的CSTR。
在反應器1中的批加料反應制備混合物，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.75mol/kg[L-PM]＝0.125mol/kg[NaCl]＝11wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kg總重量3.49kg在40℃下攪拌該混合物24h。在該過程中加入L-PM·HCl加料液([PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是29.79g/h。利用20wt％的HCl水溶液將pH控制在5.8。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別是69％和95％，并且余酶為94％。該漿液的體積是3.5升，這相當于4.2kg。
反應器1中的連續(xù)反應向該漿液中同時加入以下兩種溶液·以163.4g/h的加料速度加入Z-Asp/酶溶液(其pH被調(diào)節(jié)至6.5)，該溶液含有[Z-Asp]＝0.80mol/kg，[酶]＝3.5wt％和[Ca2+]＝10mmol/kg·以46.6g/h的加料速度加入L-PM·Hcl溶液，它含有[L-PM]＝2.0mol/kg。
向漿液中同時加入這些溶液的起始時刻被稱為t＝0。在40℃下攪拌該混合物并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。保持時間是20h。產(chǎn)品流速是219g/h，收集之直至達到t＝24h。監(jiān)控反應；發(fā)現(xiàn)連續(xù)反應非常穩(wěn)定。Z-Asp/L-PM的轉(zhuǎn)化率分別恒定為68％和95％。
反應器1和2中的連續(xù)反應當t＝24h，將該實施例2得到的一部分漿液(2.6kg)加入反應器2中，用作使反應器2開始的初始漿液。關閉反應器的底部，因此此時沒有排出任何物質(zhì)。
反應器1從t＝24時起，反應器1就保持在穩(wěn)定態(tài)，不同的是，沒有收集從反應器1排出的漿液，而是將其加入反應器2。反應器和所有溶液始終保持在40℃并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。加入反應器1的原料量如下[Z-Asp]＝0.63mol/kg和[L-PM]＝0.45mol/kg，反應器1的平均加料摩爾比是1.4∶1。酶濃度是2.7wt％。反應混合物的總重是4.2kg。
反應器1中的滯留時間是20h。
反應器2除了反應器中已存在的物質(zhì)和從反應器1排出的連續(xù)流(參見以上的描述)外，還以7.7g/h的加料速度加入了含有[L-PM]＝2.0mol/kg的L-PM·HCI溶液。當反應器2中的漿液總重量達到4.35kg(相當于3.6升的體積)時，開始從反應器2中連續(xù)排出漿液。溫度始終保持在40℃并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。加入反應器2的原料量如下[Z-Asp]＝0.60mol/kg和[L-PM]＝0.50mol/kg，反應器2的平均加料摩爾比是1.2∶1。酶濃度是2.6wt％。反應器2中的滯留時間是20h。
在整個實驗中(運行至t＝100h)所有組分的濃度都非常穩(wěn)定。Z-Asp/L-PM的轉(zhuǎn)化率是常數(shù)(分別是82％和98％)并且反應器中留存的酶是55％-60％。
該實施例表明pH＝5.8時在2個CSTR中進行的1∶1連續(xù)偶合切實可行。但是，為了留存最大量的活性酶，本領域技術人員可容易地使反應條件最佳化，例如參見實施例4。
實施例4在2個CSTR中的連續(xù)反應，pH＝5.8在該實施例中，利用了兩個體積為5升的CSTR。
在反應器1中的批加料反應制備混合物，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.75mol/kg[L-PM]＝0.13mol/kg[NaCl]＝13.0wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kg總重量3.5kg在40℃下攪拌(180rpm)該混合物48h。在該過程中加入L-PM·HCl加料液([L-PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是15.0g/h。利用50wt％的AcOH溶液將pH控制在5.8。加入反應器1的原料量如下[Z-Asp]＝0.623mol/kg和[L-PM]＝0.443mol/kg，加料摩爾比是1.4∶1。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別是70％和95％，并且余酶為91％。為了將該混合物轉(zhuǎn)化為用于反應器1中連續(xù)偶合反應的初始混合物，重新使酶量保持在100％。
反應器1中的連續(xù)反應向上述漿液中同時加入以下三種溶液。向漿液中同時加入這些溶液的起始時刻被稱為t＝0h。
1.以163.4g/h的加料速度加入Z-Asp/酶溶液，該溶液含有[Z-Asp]＝0.80mol/kg，[NaCl]＝14.5wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kgpH＝6.0。
2.以46.6g/h的加料速度加入L-PM·Hcl溶液，它含有[L-PM]＝2.0mol/kg。
3.用于調(diào)節(jié)pH的少量50wt％醋酸水溶液。
加料摩爾比Z-Asp/L-PM是1.4mol/mol。在t＝0時還開始以210g/h的加料速度將反應器1的排出物加入反應器2(仍是空的)。反應器體積是3.5升(4.2kg)。滯留時間是20h。在40℃下攪拌(速度是180rpm)混合物并且利用50wt％的醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。
通過取樣并且分析[Z-Asp]、[L-PM]、[Z-APM]、[L-Phe]等來監(jiān)控反應；發(fā)現(xiàn)連續(xù)操作非常穩(wěn)定達100h。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率幾乎分別恒定為66.5％和95.2％，并且余酶恒定為88.5％。
反應器2中的連續(xù)反應從t＝0開始，將反應器1的漿液排入第2反應器。在t＝22.5小時時，開始連續(xù)排出第2反應器中的漿液。從t＝22h開始，將以下溶液加入反應器21以7.7g/h的加料速度加入L-PM溶液([L-PM]＝2mol/kg)，2以24.3g/h的加料速度加入甲苯3.少量的50wt％醋酸水溶液以調(diào)節(jié)pH。
加料摩爾比[Z-Asp]/[L-PM]是1.2mol/mol。在40℃下攪拌(速度是180rpm)混合物并且利用50wt％醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.8。滯留時間約為20h。通過取樣并且分析[Z-Asp]、[L-PM]、[Z-APM]、[L-Phe]等來監(jiān)控反應；發(fā)現(xiàn)連續(xù)操作非常穩(wěn)定達100h。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率幾乎分別恒定為78.5％和97.7％，并且余酶一直恒定在88.0％。
權(quán)利要求
1.通過N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)和L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)在反應混合物中的高轉(zhuǎn)化率酶促偶合制備N-芐氧基羰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯(Z-APM)的方法，所述反應混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物，所述方法的特征在于Z-Asp和L-PM的酶促偶合在連續(xù)或分批加料工藝中進行，pH為5.0-6.5，Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比為1∶1-2∶1，并且其中Z-Asp和L-PM的實際摩爾比高于平均加料摩爾比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于酶促偶合在利用至少一個充分混合的反應器的連續(xù)工藝中進行。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于串聯(lián)使用兩個充分混合的反應器。
4.權(quán)利要求1-3的任一方法，其特征在于Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比在1.1∶1-1.6∶1之間。
5.權(quán)利要求1-4的任一方法，其特征在于pH的范圍是5.5-6.0。
6.權(quán)利要求1-5的任一方法，其特征在于在偶合反應過程中，利用酸、優(yōu)選醋酸來調(diào)節(jié)反應混合物的pH值。
7.權(quán)利要求1-6的任一方法，其特征在于反應混合物含有緩沖液。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于緩沖液選自醋酸/醋酸鹽，丙酸/丙酸鹽、丁酸/丁酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鹽、馬來酸/馬來酸鹽、鄰苯二甲酸/鄰苯二甲酸鹽緩沖液。
9.權(quán)利要求1-8的任一方法，其特征在于基于總反應混合物的重量％計算時，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的含量為3-25％。
10.權(quán)利要求1-9的任一方法，其特征在于酶促偶合反應在10-60℃的溫度下進行。
11.權(quán)利要求1-10的任一方法，其特征在于在占反應混合物總量為0.08-1.5重量％的酶(活性蛋白質(zhì))存在下進行酶促偶合。
12.權(quán)利要求1-11的任一方法，其特征在于在偶合反應過程中，將與水不混溶的有機溶劑加入反應混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于與水不混溶的有機溶劑是甲苯或甲基異丁基酮(MIBK)。
14.權(quán)利要求1-13的任一方法，其特征在于在達到連續(xù)加料階段之前，Z-Asp和L-PM的實際摩爾比至少比平均加料摩爾比高40％。
15.權(quán)利要求1-13的任一方法，其特征在于在偶合反應之后，將反應混合物過濾，以產(chǎn)生固體Z-APM和母液，在pH＜4的條件下利用有機溶劑對母液進行萃取處理，其中至少部分Z-Asp被從母液萃入有機溶劑，接著以Z-Asp鹽的形式將Z-Asp反萃出有機溶劑而進入pH＞4.5的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過N－芐氧基羰基－L－天冬氨酸(Z－Asp)和L－苯丙氨酸甲酯(L－PM)在反應混合物中的高轉(zhuǎn)化率酶促偶合制備N－芐氧基羰基－α－L－天冬氨基－L－苯丙氨酸甲酯(Z－APM)的方法，該反應混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物，該方法的特征在于通過在連續(xù)或分批加料工藝中、在5.0－6.5的pH下，以1∶1－2∶1的Z－Asp和L－PM的平均加料摩爾比并且其中Z－Asp和L－PM的實際摩爾比高于平均加料摩爾比的條件下進行Z－Asp和L－PM的酶促偶合。優(yōu)選基于反應混合物總重量計算時，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的存在量為3－25％。
文檔編號C07K5/072GK1514881SQ02811440
公開日2004年7月21日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月7日
發(fā)明者A·托庫達, N·雅馬莫托, S·納卡穆拉, P·J·L·M·奎德弗里格, A 托庫達, L M 奎德弗里格, 呂, 砟 申請人:荷蘭加甜劑公司