專利名稱：含有蛋白酶激活序列的氣單胞菌溶素原及其在前列腺癌治療中的使用方法
技術領域：
本申請涉及新的變體氣單胞菌溶素原(proaerolysin)(PA)蛋白，以及將它們用于治療局部性和轉移性前列腺癌的方法。
背景技術：
在美國男性中，每三個診斷出的癌癥中就有一個是起源于前列腺，這使前列腺癌成為美國男性中最經(jīng)常被診斷出來的惡性腫瘤(Berges等，Clin.Cancer Res.1473-480，1995)。在美國，前列腺癌的發(fā)病率尚未隨著生活方式的改變而降低；事實上，自從1930年以來，臨床前列腺癌的發(fā)病率一直在穩(wěn)定地增長(Pinski等，Cancer Res.616372-6，2001)。前列腺癌的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加的速度比任何其它類型的癌癥都要快；在診斷出前列腺癌的男性中只有不到1％的人年齡在50歲以下(Furuya等，Cancer Res.546167-75，1994)。因此，隨著男性人群的預期壽命隨時間不斷增加，臨床前列腺癌的發(fā)病率也將增加(Furuya等，Cancer Res.546167-75，1994)。
目前，尚沒有一種治療方法能夠顯著地延長患有轉移性前列腺癌的男性的存活率(Khan和Denmeade，Prostate 4580-83，2000)?？诜萍に厮幬锶バ?雄激素消融作用)是癌癥的第一種有效的全身性治療方法，至今仍是總體上最有用的前列腺癌治療方法。盡管雄激素消融療法具有重要的緩和作用，但它對總體的存活率幾乎沒有影響(Berges等，Clin.Cancer Res.1473-480，1995)。這種療法最終失敗的原因是由于在受試者個體內的轉移性前列腺癌異源性地由雄激素依賴性和雄激素不依賴性的癌細胞構成(Christensen等，Bioorg.Medicinal Chem.71273-80，1999)。在雄激素消融后，這些腫瘤中的雄激素依賴性細胞停止繁殖，并激活了一種稱為程序性細胞死亡(PCD)或細胞凋亡的細胞自殺途徑。由于消除了雄激素依賴性細胞這一分支，大部分患有轉移性前列腺癌的男性對雄激素去除療法有良好的反應。然而，所有的病人最終會惡化到對進一步的抗雄激素療法沒有反應的狀態(tài)，不論這種療法進行得多么徹底，這是由于在轉移的位點存在雄激素不依賴性前列腺癌細胞。不幸的是，由于目前還沒有能夠有效消滅雄激素不依賴性前列腺癌細胞的療法，此疾病發(fā)展到這種情況時一律會致命(Khan和Denmeade，Prostate 4580-83，2000)。
已經(jīng)提出了幾種治療前列腺癌的替代方法。其中之一是發(fā)展了一些方法，當癌癥仍然還在前列腺中并因而通過明確的局部療法(localtherapy)還可能治療時，主動地篩選局部疾病。局部癌癥通常分化較為緩和，體積也較小。在最近的幾十年中，對局部前列腺癌的外科和放療治療已取得進步。這些進步在最近幾年達到了頂點，使得前列腺癌的死亡率在50年來第一次下降。
然而，在這些進展增加了治愈率的同時，仍然有大量男性沒有被局部療法所治愈，并最終死于轉移性癌癥。這種臨床上的現(xiàn)實導致了對轉移性前列腺癌的非激素療法的開發(fā)。標準的抗增殖化療劑在治療前列腺癌上尚未成功。這種試劑對于雄激素不依賴性前列腺癌可能是無效的，因為與其它的腫瘤類型和許多正常組織例如皮膚、胃腸道和骨髓相比，這些癌癥的增殖速度明顯較低。例如，對11名剛剛死亡的雄激素消融療法失敗的病人進行尸體解剖，所獲得的117個前列腺癌轉移位點中生長分數(shù)為7.1±0.8％(Pinski等，Cancer Res.616372-6，2001)。這種低的增殖速度可以解釋人體中的前列腺癌細胞對標準的抗增殖化學療法的相對無反應性，而在體外高速增殖的雄激素不依賴性前列腺癌細胞系對PCD誘導保持了極度的敏感性。
已經(jīng)提出了幾種策略來治療慢速增殖的前列腺癌。一種方法是鑒定出前列腺癌細胞在惡性轉化過程中所需要的獨特的賴以生存的特異性信號途徑。一旦鑒定出來，就可以開發(fā)這些途徑的小分子或生物抑制劑作為治療藥物。這種方法的一個例子是使用Her2/neu或EGF受體途徑的小分子或單克隆抗體抑制劑。另一種方法是抑制一種普遍存在的細胞內蛋白，其功能是管理所有細胞類型的存活。這種方法可以克服不均質性和“抗性”的問題，因為一個腫瘤中所有的癌細胞都可以通過這種方法殺死。但是，這種細胞毒性將不是細胞類型特異的，施用這種通用的毒素將涉及嚴重的全身性中毒。因此，需要一種能夠將細胞毒素直接定位到前列腺癌位點的方法。
另一種治療緩慢增殖的前列腺癌的策略是投送一種細胞毒素，它不是通過在抑制了關鍵的信號或代謝途徑后誘導細胞凋亡來殺死細胞，而是通過破壞細胞質膜引起非特異性細胞裂解來殺死細胞。已經(jīng)描述了許多這樣的細胞裂解毒素(Lesieur等，Mol.Membr.Biol.1445064，1997)。這些細胞裂解毒素通常是來源于細菌，并且一般是β-片層結構的蛋白，它們在質膜上寡聚化以產生充分表征的小孔，這些小孔一旦形成就很快地導致裂解性的細胞死亡(Rossjohn等，J.Struct.Biol.12192-100，1998)。這些毒素在殺死細胞的能力方面也是非特異性，因此不可能在治療時施用而不具有明顯的毒性。因此，需要一種治療前列腺癌的藥物，它主要只對前列腺癌細胞具有細胞毒性。
發(fā)明概述在此公開了變體氣單胞菌溶素原(PA)分子，以及將它們用于治療局部和轉移性前列腺癌、例如慢性增殖的前列腺癌的方法。
在一個實施例中，一個變體PA分子包含了一個前列腺特異性蛋白酶切割位點、例如一個前列腺特異性抗原(PSA)-、前列腺特異性膜抗原(PSMA)-、或者人血管舒緩素2(hK2)-特異性切割位點，其在功能上代替了天然PA的費林蛋白酶(furin)切割位點。在這種方法中，給患有前列腺癌的受試者施用這種公開的變體PA分子，將導致在存在前列腺特異性蛋白酶的情況下激活這種公開的變體PA分子，并使細胞，例如前列腺癌細胞裂解。在某些例子中，變體PA分子還包含了一個前列腺組織特異性結合結構域，以增強其到癌細胞的定位。
在另一個實施例中，一個變體PA分子包含了一個費林蛋白酶切割位點，以及一個前列腺組織特異性結合結構域，它在功能上代替了天然PA的結合結構域，以幫助定位到前列腺癌細胞。
還公開了使用這些公開的變體PA分子治療局部或轉移性前列腺癌的方法。此外，還公開了刺激受試者的免疫系統(tǒng)以增強治療局部和轉移性前列腺癌的方法。
附圖簡述

圖1是氣單胞菌溶素原結構域的示意圖(沒有按比例畫)，并顯示了被費林蛋白酶激活的結果。
圖2是一個條形圖，顯示了溶血分析的結果，其中PSA-PA1與人血漿或用酶法激活的PSA強化的人血漿(10000ng/ml)預先保溫。
圖3比較了幾個用PSA切割位點代替天然的費林蛋白酶位點的氣單胞菌溶素原變體相對于野生型氣單胞菌溶素原的體外毒性。
圖4是一張條形圖，比較了在體內PSA-PA1在PSA產生(LNCaP)和非PSA產生(SN12C)腫瘤中的特異性。
圖5是一張示意圖(未按比例)，顯示了如何將一個氣單胞菌溶素原的序列進行改變以產生幾個不同的變體PA分子?！?”號代表了一個或多個點突變，和/或一個或多個缺失，它們降低了PA結合結構域的功能(即在細胞膜中集中的能力)。
序列表列于隨附的序列表中的核酸和氨基酸序列，對于核苷酸堿基使用標準的字母縮寫來表示，對于氨基酸使用三字母的代碼來顯示。每個核酸序列只顯示了一條鏈，但是通過參照所示的鏈，其互補鏈也應包括在其中。
SEQ ID NO1和2分別顯示了野生型的氣單胞菌溶素原的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO3和4分別顯示了PSA-PA1的cDNA和蛋白序列，其中氣單胞菌溶素原的費林蛋白酶位點已經(jīng)被一個PSA切割位點取代。
SEQ ID NO5和15-21是在人semenogelin I和II蛋白中發(fā)現(xiàn)的PSA切割位點。
SEQ ID NO6和7分別顯示了PSA-1K的cDNA和蛋白序列，其中氣單胞菌溶素原的費林蛋白酶位點已經(jīng)被一個PSA切割位點取代。
SEQ ID NO8、11和14-21是其它的PSA切割位點。
SEQ ID NO9和10分別顯示了PSA-PA2的cDNA和蛋白序列，其中氣單胞菌溶素原的費林蛋白酶位點已經(jīng)被一個PSA切割位點取代。
SEQ ID NO12和13分別顯示了PSA-PA3的cDNA和蛋白序列，其中氣單胞菌溶素原的費林蛋白酶位點已經(jīng)被一個PSA切割位點取代。
SEQ ID NO22是天然的促黃體激素釋放激素(LHRH)的蛋白序列。
SEQ ID NO23是一個修飾的LHRH的蛋白序列。
SEQ ID NO24是一個變體PA肽的蛋白序列，其中PA的費林蛋白酶位點已經(jīng)被一個PSA切割位點取代，以及其中PA的天然的結合結構域被缺失了并用SEQ ID NO23取代。
SEQ ID NO25是一個變體PA肽的蛋白序列，其中PA的費林蛋白酶位點被保留，并且PA的天然的結合結構域被缺失了并用SEQ IDNO23取代。
幾個實施方案的詳細描述縮寫和術語對術語和方法提供下面的解釋以更好地描述本發(fā)明，并指導在執(zhí)行本發(fā)明時的那些本領域普通專業(yè)技術人員。在這里以及隨附的權利要求中，除非在上下文中有明確的指示，單數(shù)形式的“一個”或“一種”或“這個”也包括了復數(shù)的意義。例如，提到“一個變體PA分子”時包括了多個這樣的分子，提到“這種抗體”時包括了涉及的一個或多個抗體及其本領域專業(yè)技術人員熟知的等價物，依此類推。
除非另有解釋，在此所用的全部技術和科學術語都與在本發(fā)明所屬領域內的專業(yè)技術人員所通常理解的意義相同。
氣單胞菌溶素一種形成通道的毒素，在產生時作為無活性的毒素原的形式，稱為氣單胞菌溶素原(PA)(野生型的PA顯示在SEQ IDNO1和2中)。PA蛋白包括許多分離的功能區(qū)域，包括一個結合結構域(大約為SEQ ID NO2的1-83位氨基酸)、一個毒素結構域(大約為SEQ ID NO2的84-426位氨基酸)以及一個含有蛋白酶激活位點(SEQID NO2的427-432位氨基酸)的C-末端抑制肽結構域(大約為SEQ IDNO2的427-470位氨基酸)。
結合結構域能夠識別并結合到例如在T淋巴細胞的Thy-1中發(fā)現(xiàn)的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)膜錨、在紅細胞膜上發(fā)現(xiàn)的PIGA基因產物以及前列腺干細胞抗原(PSCA)上。大多數(shù)哺乳動物細胞在它們的表面表達GPI錨定的蛋白。氣單胞菌溶素原中的激活或蛋白切割位點是一個6個氨基酸的序列，可以被弗林蛋白酶家族識別為蛋白水解的底物。PA在被弗林蛋白酶水解掉C-末端的抑制區(qū)段后被激活(圖1)。被激活的氣單胞菌溶素結合到細胞膜中的GPI錨定蛋白上，形成了一個七聚體，它插入到膜中產生了已經(jīng)明確定義的大約17的通道。通道的形成通過壞死導致細胞快速死亡。野生型的氣單胞菌溶素在例如1nM或更低的濃度下就對哺乳動物細胞包括紅細胞具有毒性。
動物活的多細胞有脊椎的生物體，其中包括例如哺乳動物和鳥類。
抗體免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子具有免疫活性的部分，即含有能夠與抗原特異性結合(發(fā)生免疫反應)的抗原結合位點的分子。
天然存在的抗體(例如IgG)包括4條多肽鏈，兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互連接。但是，抗體的抗原結合功能可以由天然存在的抗體的片段來執(zhí)行。因此，術語“抗體”也被用于指稱這些抗原結合片段。涵蓋在術語“抗體”中的結合片段的例子包括(1)由VL、VH、CL和CH1結構域組成的Fab片段；(2)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(3)由抗體的一個單一臂上的VL和VH結構域組成的Fv片段；(4)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等，Nature 341544-6，1989)；(5)分離的互補決定區(qū)域(CDR)；以及(6)F(ab’)2片段，這是一種二價的片段，含有兩個Fab片段，在鉸鏈區(qū)通過一個二硫橋連接起來。此外，盡管Fv片段的兩個結構域是由單獨的基因編碼的，但可以通過重組的方法制造一個合成的接頭將它們連接成一個單一的蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；Bird等，Science 242423-6，1988；以及Hunston等，Proc.Natl.Acad.Sci.855879-83，1988)。這樣的單鏈抗體也包括在內。在一個實施方案中，抗體包括了駱駝化的抗體(camelizedantibodies)(例如參見Tanha等，J.Biol.Chem.27624774-80，2001)。
在一個實施例中，抗體片段能夠與它們的靶抗原交聯(lián)，例如二價片段，如F(ab’)2片段。此外，其自身不能與其靶抗原交聯(lián)的抗體片段(例如Fab片段)可以與第二個抗體結合使用，第二個抗體可以用來交聯(lián)抗體片段，從而將靶抗原交聯(lián)起來。抗體可以使用常規(guī)的技術分為片段，片段的篩選采用與完整抗體所用的相同的方法?？贵w還可以包括能夠特異性結合靶抗原的雙特異性和嵌合的分子。
“特異性結合”是指每個抗體與抗原進行特異性免疫反應的能力。結合是在抗體分子與T細胞表面分子的抗原決定簇之間的非隨機性結合反應。預期的結合特異性一般是由抗體與T細胞表面分子和無關的抗原之間不同的結合能力作為參照點來決定的，因而在兩個不同的抗原之間是不同的，特別是當兩個抗原具有獨特的表位時。特異性結合到一個特定的表位的抗體被稱為一個“特異性抗體”。
癌癥經(jīng)歷了特征性的退行性發(fā)育、失去了分化能力的惡性腫瘤，生長速度增加，侵染周圍的組織，并且能夠轉移。
cDNA(互補DNA)一段缺失了內部非編碼區(qū)段(內含子)和決定轉錄的調控序列的DNA。cDNA可以在實驗室中通過對從細胞中提取的信使RNA進行反轉錄而合成。
化學合成一種用來制造蛋白或肽的人工方法。合成蛋白或合成肽是指通過這樣的人工方法制造的蛋白或肽。
化學療法在癌癥治療中，化學療法是指施用一種或一組化合物以殺死或減緩快速增殖細胞的繁殖?；焺┌切┍绢I域的專業(yè)技術人員所熟知的藥劑，包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、抗代謝物(如氟達拉賓(Fludarabine))、抗腫瘤藥物(如鬼臼亞乙苷、阿霉素、氨甲蝶呤和長春花新堿)、卡鉑(carboplatin)、順氯氨鉑(cisplatinum)以及紫杉烷類(taxanes)，例如紫杉醇和克癌易(taxotere)。這些藥劑可以與此處公開的變體PA分子共同給受試者施用?；蛘呋虼送?，化療劑也可以在給受試者施用此處公開的變體PA分子之前和/或之后施用。在一個實施例中，化療劑與激素類和放射治療共同使用，同時施用此處公開的變體PA分子，用來治療局部的前列腺癌。
保守取代用一個或多個氨基酸(例如2、5或10個殘基)取代具有相似的生物化學性質的氨基酸殘基。一般來說，保守取代對產生的多肽的活性幾乎沒有或完全沒有影響。例如，在理想情況下，包含了一個或多個保守取代的修飾的PA肽保留了氣單胞菌溶素原活性?？梢允褂脴藴实某绦蛉缍c突變或PCR方法來操作編碼該多肽的核苷酸序列從而產生含有一個或多個保守取代的該多肽。
取代的突變體是指那些在其氨基酸序列中至少一個殘基被移除并在該位點插入了一個不同的殘基的突變體。可以取代蛋白中的原始氨基酸并被認為是保守取代的氨基酸的例子包括絲氨酸取代丙氨酸；賴氨酸取代精氨酸；谷氨酰胺或組氨酸取代天冬酰胺；谷氨酸取代天冬氨酸；絲氨酸取代半胱氨酸；天冬酰胺取代谷氨酰胺；天冬氨酸取代谷氨酸；脯氨酸取代甘氨酸；天冬酰胺或谷氨酰胺取代組氨酸；亮氨酸或纈氨酸取代異亮氨酸；異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸；精氨酸或谷氨酰胺取代賴氨酸；亮氨酸或異亮氨酸取代甲硫氨酸；甲硫氨酸；亮氨酸或酪氨酸取代苯丙氨酸；蘇氨酸取代絲氨酸；絲氨酸取代蘇氨酸；酪氨酸取代色氨酸；色氨酸或苯丙氨酸取代酪氨酸；以及異亮氨酸或亮氨酸取代纈氨酸。
許可的取代是非保守的氨基酸取代，但是也不顯著地改變氣單胞菌溶素原的活性。一個例子是SEQ ID NO2或4上300位的丙氨酸被半胱氨酸取代。
關于保守取代的進一步信息可以在其它文獻中發(fā)現(xiàn)，例如在Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169751-7，1987)、O’Regan等(Gene 77237-51，1989)、Sahin-Toth等(Protein Sci.3240-7，1994)、Hochuli等(Bio/Technology 61321-5，1988)、WO00/67796(Curd等)以及標準的遺傳學和分子生物學教科書中。
在一個實施例中，這樣的突變體可以通過附加的測試來容易地篩選，方法是進行分析(例如如實施例2-5中描述的那樣)以確定突變體是否保留了變體PA的活性。
含有一個術語意義為“包括”。例如除非有清楚的明示，“含有A或B”意味著包括A或B，或者包括A和B兩者。
缺失除去一個核酸的一段序列例如DNA，然后將兩端的區(qū)域連在一起。
DNA脫氧核糖核酸。DNA是一個長鏈的聚合物，含有大多數(shù)生物體的遺傳物質(某些病毒具有含有核糖核酸RNA的基因)。在DNA聚合物中重復單位是四種不同的核苷酸，每種含有四種堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一，它們結合到一個連接了磷酸基團的脫氧核糖上。DNA分子中的核苷酸三聯(lián)體稱為密碼子，編碼了多肽中的氨基酸。術語“密碼子”也被用于DNA序列轉錄成的mRNA中相應的(以及互補的)三個核苷酸的序列。
增強提高某種物質的質量、數(shù)量或力量。在一個實施方案中，當受試者使用一種療法時，如果受試者對抗腫瘤更加有效，就說這種療法增強了受試者減輕腫瘤例如前列腺癌的能力。在另一個實施方案中，在受試者中如果一種藥物對于減輕腫瘤更為有效，就說這種療法增強了這種藥物減輕腫瘤例如前列腺癌的能力。這些增強可以使用此處公開的方法進行測量，例如確定腫瘤體積的減小(見實施例5)。
功能性缺失對一個基因序列所做的突變、部分或完全缺失、插入或其它的改變，使這部分基因序列無功能。
例如，PA結合結構域的功能性缺失導致PA在細胞膜上結合和聚集能力的下降。功能性缺失可以通過在氣單胞菌溶素原中插入另一個功能性結合結構域而逆轉，例如插入一個前列腺特異性結合結構域如LHRH肽。
可用于功能性缺失氣單胞菌溶素原結合結構域的方法的例子包括但不限于缺失SEQ ID NO2的大約1-83位氨基酸或其片段，例如SEQID NO2的大約45-66位氨基酸，或者將W45A、I47E、M57A、Y61A、K66Q(氨基酸編號參照SEQ ID NO2)突變中的一個或多個插入到變體氣單胞菌溶素序列中(例如參見Mackenzie等，J.Biol.Chem.27422604-22609，1999)。
在另一個例子中，對天然的PA弗林蛋白酶切割位點的功能性缺失導致PA被弗林蛋白酶切割和激活的能力與野生型的PA分子相比降低。
固定化結合到一個表面，例如一個固體表面上。固體表面可以是聚合物，例如聚苯乙烯或聚丙烯。在一個實施方案中，固體表面是小珠的形式。在一個實施方案中，固體表面包括一種修飾的PA毒素，在某些例子中還包括一個或多個前列腺特異性結合配體，例如LHRH肽、PSMA抗體和PSMA單鏈抗體。在理想情況下，一旦珠子到達前列腺細胞靶，修飾的PA毒素就從珠子上釋放出來。將多肽固定化在固體表面的方法可以在WO 94/29436和美國專利號5858358中發(fā)現(xiàn)。
分子如何能夠結合到珠子上的例子包括但不限于PA毒素-PSA切割位點-珠子-前列腺結合配體或前列腺結合配體-珠子-PSA位點-PA毒素-PSA切割位點-抑制劑。
分離的一種“分離的”生物成分(例如核酸分子或蛋白)已經(jīng)基本上與該成分天然存在的生物體的細胞中的其它生物成分(即其它的染色體和染色體外DNA和RNA)分離開或純化了。已經(jīng)被“分離的”核酸和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白。該術語也包括通過在宿主細胞中重組表達制備的核酸和蛋白以及化學合成的核酸和蛋白。
一種分離的細胞是指已經(jīng)基本上與細胞天然存在的生物體中的其它生物成分分離開或純化的細胞。
惡性細胞具有退行發(fā)育侵入和轉移性質的細胞。
哺乳動物該術語包括人類和非人類的哺乳動物。同樣地，術語“受試者”包括人類和獸類受試者。哺乳動物的例子包括但不限于人、豬、牛、山羊、貓、狗、兔和小鼠。
腫瘤異常生長的細胞。
正常細胞非腫瘤細胞、非惡性細胞、非感染性細胞。
寡核苷酸一個線性的多核苷酸序列，其長度不超過大約200個核苷酸堿基，例如一個至少大約6個核苷酸，例如至少15、50、100或200個核苷酸長的多核苷酸(如DNA或RNA)。
可操作地連接當?shù)谝粋€核酸序列與第二個核酸序列有功能上的關系時稱為第一個核酸序列與第二個核酸序列可操作地連接。例如，如果一個啟動子影響了一個編碼序列的轉錄或表達，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。一般來說，可操作連接的DNA序列是連續(xù)的，并且必須將兩個蛋白編碼區(qū)連接在同樣的閱讀框架內。
ORF(可讀框)一系列沒有任何終止密碼子的編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通常被翻譯為一個肽。
多核苷酸一個任何長度的線性核酸序列。因此，多核苷酸包括至少為15、50、100、200、400、500、1000、1100或1200(寡核苷酸)的分子，以及全長cDNA或染色體的核苷酸。
氣單胞菌溶素原氣單胞菌溶素的無活性的毒素前體。野生型或天然的氣單胞菌溶素原的cDNA和蛋白分別顯示在SEQ ID NO1和2中。
在一個實施例中，一個變體或修飾的氣單胞菌溶素原分子包含一個前列腺特異的蛋白酶切割位點，例如一個PSA特異性切割位點，這使得在存在前列腺特異的蛋白酶如PSA、PMSA或hK2的情況下可以使變體PA激活(例如參見圖5C-I)。在一個實施例中，一個前列腺特異的蛋白酶切割位點被插入在PA天然的弗林蛋白酶切割位點中，以便PA在存在前列腺特異的蛋白酶而不是弗林蛋白酶的情況下被激活(例如參見圖5D-I)。此外，也可以使用對6個氨基酸序列的突變并插入一個前列腺特異的蛋白酶切割位點來功能性缺失弗林蛋白酶切割位點(例如參見圖5C)。在另一個實施例中，一個變體PA分子還包括缺失或取代一個或多個，例如至少兩個天然的PA氨基酸。在另一個實施例中，變體PA分子還包括另一個連接或添加到變體PA分子上(或其中)的分子(例如抗體或肽)。在另一個實施例中，變體PA分子包含了一個前列腺組織特異性結合結構域。
在另一個實施例中，變體PA分子還包含了功能性缺失的結合結構域(大約為SEQ ID NO2的1-83位的氨基酸)?？梢允褂萌魏伪绢I域已知的方法進行功能性缺失，例如缺失、插入、突變或取代。這樣的例子包括但不限于缺失整個結合結構域或其一部分(例如參見圖5G-I)，或者引入點突變(例如上述的那些，例如參見圖5D-F)，從而導致結合結構域的功能降低。例如，一個功能性缺失了結合結構域(并且沒有結合序列代替它)的PA分子，其在細胞膜上聚集的能力降低，因此比野生型的PA序列裂解細胞的速度慢(例如參見圖5D)。此外還公開了如下所述的天然結合結構域被功能性缺失并用前列腺組織特異性結合結構域代替的變體PA分子(例如參見圖5E-I)。
在另一個實施例中，變體或修飾的PA分子包含了一個弗林蛋白酶切割位點，以及一個被前列腺組織特異性結合結構域代替的功能性缺失的結合結構域(例如參見圖5J-M)。這樣的變體PA分子通過前列腺組織特異性結合結構域被定向到前列腺細胞中，并在存在弗林蛋白酶的情況下被激活。
特定的非限制的變體PSA蛋白的例子顯示在SEQ ID NO4、7、10、13、24和25中。
修飾的PA的活性是影響細胞裂解的試劑的活性。細胞包括但不限于前列腺特異性蛋白酶分泌細胞，例如PSA-分泌細胞、前列腺癌細胞、慢速增殖的前列腺癌細胞。試劑包括但不限于修飾的PA蛋白、核酸、特異性結合試劑，包括在此公開的變異體、突變體、多態(tài)性、融合體及其片段。在一個實施例中，當修飾的PA蛋白或核酸與一個PSA-分泌細胞(如前列腺癌細胞)接觸時，促進了細胞的裂解和死亡，就可以說修飾的PA活性被增強了，增強的程度可以是例如與非PSA產生細胞的裂解相比高至少10％，或高至少25％、50％、100％、200％或甚至500％。在其它的例子中，當修飾的PA蛋白和核酸與腫瘤接觸，減少了腫瘤細胞(例如前列腺腫瘤)的體積時，就可以說修飾的PA活性被增強了，腫瘤細胞的體積可以減少例如至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％(完全消除了腫瘤)。
在此描述了可用于確定一種試劑是否具有修飾的PA活性的分析方法，例如在實施例2-5和9中。例如，可以評估一個修飾的PA肽的特異性裂解PSA-產生細胞的能力(實施例2和5)、在人血漿中的穩(wěn)定性(實施例3)、是否為PSA酶活性的有效底物(實施例9)。功能性蛋白活性可以通過裂解PSA-產生細胞對非PSA-產生細胞的傾向性、前列腺腫瘤體積的減小、與野生型PA相比毒性的減少、以及與野生型PA相比在血液中穩(wěn)定性的增加而加以檢測。
同樣的分析可用于確定此處公開的任何修飾的PA試劑是否能夠減少腫瘤(例如前列腺腫瘤)的體積并特異性裂解PSA-產生細胞。例如，在SEQ ID NO4、24和25中顯示的修飾的PA肽預期能夠減少前列腺腫瘤的體積。任何這些分析方法都可以通過使用體內表達修飾的PA基因、以及變異體、融合體及其片段來代替施用純化的蛋白來進行修改。
啟動子一組核酸控制序列，可以指導核酸的轉錄。啟動子包括靠近轉錄起始位點的必需的核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子的情況下，其為TATA元件。一個啟動子也任選包含遠端的增強子或阻遏子元件，它們可以位于距轉錄起始位點多達幾千個堿基對之外。
前列腺特異性啟動子一種對睪酮和其它雄性激素有反應性、因而啟動基因在前列腺細胞中表達的啟動子。例子包括但不限于probasin啟動子、前列腺特異性抗原(PSA)啟動子、前列腺特異性膜抗原(PSMA)啟動子以及人血管舒緩素2(hK2)啟動子。
前列腺特異性蛋白酶切割位點一段氨基酸序列，能夠被前列腺特異性蛋白酶識別并特異性地有效水解(切割)。例子包括但不限于PSA-特異性切割位點、PSMA-特異性切割位點和HK-2-特異性切割位點。
PSA-特異性切割位點是一段氨基酸序列，能夠被前列腺特異性抗原(PSA)識別并特異性地有效水解。這樣的肽序列可以被引入其它的分子，例如PA，以產生可以被PSA激活的藥物前體。修飾的PA被PSA激活后，PA就具有活性，能夠發(fā)揮細胞毒性。PSA-特異性切割位點的例子包括但不限于在SEQ ID NO5、8、11和14-21中顯示的那些，以及在授權于DeFeo-Jones等的美國專利號5866679、授權于Garsky等的美國專利號5948750、授權于Feng等的美國專利號5998362、授權于Isaacs等的美國專利號6265540、授權于D’Amico等的美國專利號6368598以及授權于Feng等的美國專利號6391305中所公開的那些(在此全部引為參考)。
特定的PSMA-特異性切割位點的例子可以在授權于Isaacs和Denmeade的WO/0243773中發(fā)現(xiàn)(在此引為參考)。特定的HK-2-特異性切割位點的例子在授權于Denmeade等的WO/0109165中被公開(在此引為參考)。
前列腺組織特異性結合結構域一種分子，例如肽配體、毒素或抗體，它對前列腺細胞比對其它的細胞類型具有較高的特異性。在一個例子中，前列腺組織特異性結合結構域在前列腺組織或細胞中比在其它類型的細胞中具有較低的KD(即與受試者的其它正常組織相比選擇性結合到前列腺組織上)，例如至少10倍低的KD，例如至少20、50、75、100或甚至200倍低的KD。這樣的序列可用于將一種試劑例如一個變體PA分子定位到前列腺中。例子包括但不限于能夠識別相對來說是前列腺特異蛋白如PSA、PSMA、hK2、prostasin和hepsin的抗體；具有前列腺選擇性受體的配體，例如天然的或合成的促黃體激素釋放激素(LHRH)；以及內皮縮血管肽(結合到同源的內皮縮血管肽受體上)。
純化的術語“純化的”并不需要絕對的純度；它更傾向于作為一個相對的術語。因此，例如一個基本上是純化的蛋白或核酸制劑(例如在此公開的修飾的PA毒素)是指這樣一種制劑，其中提到的蛋白或核酸比在其細胞內或生產反應室內(當適當時)的自然環(huán)境中的蛋白更純。例如，一個修飾的PA蛋白制劑，如果蛋白占到了制劑中的總蛋白含量的至少50％，例如至少70％，就是純化的。純化蛋白和核酸的方法在本技術領域內眾所周知?？捎糜诩兓鞍?，例如修飾的PA的方法的例子包括、但不限于在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約，1989年，第17章)中公開的方法。
重組的重組的核酸是指一種核酸，其序列不是天然存在的，或者其序列是通過將兩個分開的序列片段進行人工組合而產生的。人工組合的實現(xiàn)通常是通過化學合成，或者更常見的是通過例如遺傳工程技術對分離的核酸區(qū)段進行人工操作。重組的蛋白是指由編碼該蛋白的重組核酸的表達而產生的蛋白。
樣品從一個受試者的細胞獲得的含有基因組DNA、cDNA、RNA或蛋白的生物樣品，例如存在于外周血、尿液、唾液、精液、活組織切片、外科標本、細針抽出物(aspriate)、羊膜穿刺樣品和尸體解剖材料的樣品。在一個例子中，樣品包括從一個受試者獲得的前列腺癌細胞。
序列同一性/相似性兩個或多個核酸序列、或兩個或多個氨基酸序列之間的同一性/相似性根據(jù)序列間的同一性或相似性來表示。序列同一性可以根據(jù)同一性百分比來度量；百分數(shù)越高，序列越一致。序列相似性可以根據(jù)相似性百分比來度量(考慮了保守的氨基酸取代)；百分數(shù)越高，序列越相似。
將序列比對用于比較的方法在本領域內眾所周知。各種程序和比對算法在下列文獻中有描述Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5151-3，1989；Corpet等，Nuc.Acids Res.1610881-90，1988；Huang等，Computer Appls.in theBioscience 8155-65，1992；以及Pearson等，Meth.Mol.Bio.24307-31，1994。在Altschul等，J.Mol.Biol.215403-10，1990中描述了對序列比對方法和同源性計算的詳細的考慮。
NCBI基本局域比對搜索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-10，1990)可從幾個來源獲得，包括國立生物信息中心(NCBI，國立醫(yī)學圖書館，38樓A座，8N805房，Bethesda，MD20894)，以及在互聯(lián)網(wǎng)上，用于聯(lián)系序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其它的信息可以在NCBI網(wǎng)站上發(fā)現(xiàn)。
為了比較大于大約30個氨基酸的氨基酸序列，利用了Blast2序列功能，它使用了缺省的BLOSUM62矩陣設置以默認參數(shù)(間距存在值為11，每個殘基的間距值為1)。當比對短的肽時(少于大約30個氨基酸)，比對應使用Blast2序列功能進行，使用PAM30矩陣設置以默認參數(shù)(開放間距9，延伸間距1補償)。使用這種方法進行評估時，與參比序列具有更高相似性的蛋白將顯示同一性百分比增加，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的序列同一性。當只有完整序列的一部分被比較序列同一性時，在10-20個氨基酸的短窗口內同源物一般具有至少75％的序列同一性，依賴于它們與參比序列的同一性，可以具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。在這樣的短窗口中確定序列同一性的方法在NCBI網(wǎng)站上有描述。
蛋白同源物其特征一般為使用NCBI基本Blast2.0，有間隙的blastp以及數(shù)據(jù)庫例如nr或swisspor數(shù)據(jù)庫，在氨基酸序列全長比對的基礎上計算出的序列同一性為至少70％，例如至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％。用blastn程序搜索的查詢用DUST過濾(Hancock和Armstrong，1994，Comput.Appl.Biosci.1067-70)。其它程序使用SEG。
本領域的專業(yè)技術人員將會意識到提供這些序列同一性的范圍只是指導性的，有可能在提供的范圍之外獲得極其顯著的同源物。在此提供的是上述的肽同源物以及編碼這些同源物的核酸分子。
然而，不顯示出高度同一性的核酸序列可以編碼相同或相似的(保守的)氨基酸序列，這是由于遺傳密碼的簡并性。使用這種簡并性可以造成核酸序列的變化，從而產生多個核酸分子，但它們都編碼基本上相同的蛋白。用這種方法測定，這些同源的肽可以具有例如至少75％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。當不是完整的序列被比較序列同一性時，在10-20個氨基酸的小窗口中同源物可以具有例如至少75％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。在這樣的短窗口中確定序列同一性的方法可以在NCBI網(wǎng)站上發(fā)現(xiàn)。本領域的專業(yè)技術人員將會意識到提供這些序列同一性的范圍只是指導性的，有可能在提供的范圍之外獲得顯著的同源物或其變異體。
受試者一類活的多細胞的有脊椎的生物體，包括了需要增加所需的生物學效應的人類和獸類受試者。例子包括但不限于人、猿、狗、貓、小鼠、大鼠、兔、馬、豬和牛。
治療有效量一種足夠達到所需的生物學效應的量，例如能夠有效減小尺寸(即體積)、副作用和/或前列腺癌轉移的量。在一個實施例中，它是足夠降低前列腺癌的癥狀或效應，例如腫瘤的大小的量。在特定的實施例中，它是能夠有效減少前列腺腫瘤的大小和/或前列腺腫瘤轉移至少30％、40％、50％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％(完全消除腫瘤)所需的量。
在特定的實施例中，它是在例如一個患有一種或多種前列腺腫瘤并施用了修飾的PA分子的受試者中，有效減小前列腺腫瘤所需的修飾的PA分子的量和/或前列腺癌細胞被修飾的PA裂解的量。在另一個實施例中，它是能夠有效減少前列腺腫瘤的轉移所需的修飾的PA分子的量和/或前列腺癌細胞被這種修飾的PA分子裂解的量。
在一個實施方案中，治療有效量也包括足以在被治療受試者中實現(xiàn)期望的效果所需的修飾的PA的量和/或前列腺癌細胞被修飾的PA裂解的量。例如，這些量可以是一種改善諸如癌癥如前列腺癌的征兆和/或癥狀所必需的量。
有效量的修飾的PA和/或被這種修飾的PA分子裂解的前列腺癌細胞可以在一劑或在幾劑中施用，例如在一個療程中每日施用。但是，有效量依賴于被治療的受試者、被治療的癥狀的嚴重性和類型、以及給藥的方式。例如，治療有效量的修飾的PA，如果靜脈內施用可以在每70公斤體重大約1-10mg之間變化，例如大約2.8mg，如果在前列腺內或腫瘤內施用可以在每70公斤體重大約10-100mg之間變化，例如大約28mg。此外，被PA(變異體或野生型)裂解的前列腺癌細胞的治療有效量可以在大約106到108個細胞之間變化。
治療有效劑量在一個實施例中，在施用它的受試者體內足夠減小腫瘤細胞例如前列腺腫瘤的體積、導致病理癥狀消退或能夠緩解由病癥引起的征兆或癥狀所需的修飾PA的劑量。在一個特定的實施例中，它是足夠減少前列腺癌轉移所需的修飾PA的劑量。
在另一個實施例中，它是由于細胞與在施用它的受試者體內足夠減小腫瘤細胞例如前列腺腫瘤的體積、導致病理癥狀消退或能夠緩解由病癥引起的征兆或癥狀所需的修飾PA接觸而產生的細胞裂解物的劑量。在一個特定的實施例中，它是由于細胞與足夠減少前列腺癌轉移所需的修飾或野生型PA接觸而產生的細胞裂解物的劑量。
腫瘤一種贅生物。包括實體和血液(或液體)腫瘤。
血液腫瘤的例子包括但不限于白血病、包括急性白血病(例如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病以及成髓細胞性、前髓細胞性、髓單核細胞性、單核細胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(例如慢性髓細胞(粒細胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病)、脾大性紅細胞增多、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(包括低度、中度和高度的)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrdm氏巨球蛋白血癥、重鏈病、骨髓發(fā)育異常綜合征、套細胞淋巴瘤和脊髓發(fā)育不良。
實體腫瘤例如肉瘤和癌的例子包括但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、扁平細胞癌、基細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、Wilm氏腫瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(例如神經(jīng)膠質瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質細胞瘤、melangioma、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成視網(wǎng)膜細胞瘤)。
轉化的一種轉化的細胞是一個其中通過分子生物學技術導入了核酸分子的細胞。在此所用的術語“轉化”包含了所有可用于將核酸分子導入這樣的細胞的技術，包括用病毒載體轉染、用質粒載體轉化、以及通過電穿孔、脂轉染和微粒槍加速導入裸DNA。
轉基因細胞含有外源的非天然DNA的轉化細胞。
轉基因哺乳動物含有外源的非天然DNA的轉化的哺乳動物。在一個實施方案中，非天然的DNA是含有一個PSA切割位點的修飾的PA，例如SEQ ID NO3，或編碼SEQ ID NO24或25所示蛋白的核酸序列。
變異體或片段或融合蛋白修飾的PA分子的產生可以以各種方法完成(例如參見實施例12和16)?？梢愿脑炀幋a修飾的PA蛋白或融合蛋白、或蛋白的一個片段或變異體(例如與修飾的PA具有80％、90％或95％序列同一性的片段或變異體)的DNA序列，以允許蛋白在真核細胞或生物體、細菌、昆蟲和/或植物內表達。為了獲得表達，DNA序列可以改變，并與其它調控序列進行可操作的連接。最終的含有調控序列和治療性修飾PA蛋白的產物稱為載體。載體可以被導入真核細胞、細菌、昆蟲和/或植物細胞。一旦進入細胞，載體就使得蛋白得以生產。
融合蛋白含有與其它氨基酸序列相連的修飾的PA(或其變異體、多態(tài)性、突變體或片段)，所述其它氨基酸序列不抑制所需的蛋白活性，例如裂解PSA-分泌細胞的能力。在一個實施例中，所述其它氨基酸序列在長度上不超過5、6、7、8、9、10、20、30或50個氨基酸殘基。
本領域的專業(yè)技術人員將會意識到，DNA可以以大量的方式進行改變而不會影響到被編碼蛋白的生物學活性。例如，可以使用PCR在編碼變異的PA毒素的DNA序列中產生變化。這樣的變異體可以是對用于表達蛋白的宿主細胞中的密碼子偏好性或其它方便了表達的序列改變進行優(yōu)化的變異體。
載體當被導入宿主細胞時產生了轉化的宿主細胞的核酸分子。載體可以包含允許它在宿主細胞內復制的核酸序列，例如復制原點。載體還可以包括一個或多個可選擇的標記基因和其它本領域熟知的遺傳元件。
其它在分子遺傳學中常用術語的定義可以在下列文獻中發(fā)現(xiàn)牛津大學出版社1994年出版的Benjamin Lewin編輯的《基因》(第5版)(ISBN 0-19-854287-9)、Blackwell科學有限公司1994年出版的Kendrew等編輯的《分子生物學百科全書(The Encyclopedia of MolecularBiology)》(ISBN 0-632-02182-9)、以及VCH出版公司1995年出版的Robert A.Meyers編輯的《分子生物學和生物技術綜合案頭參考書(Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive DeskReference)》(ISBN 1-56081-569-8)。
突變的氣單胞菌溶素原分子細菌毒素，例如由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)產生的氣單胞菌溶素和由金黃色葡萄球菌(Staph aureus)產生的α-溶血素，是β-片層結構的蛋白，它們在質膜上聚合產生孔，導致快速的細胞裂解性細胞死亡(圖1)?？椎男纬蓪嵸|上破壞了細胞膜，導致在細胞周期所有階段的細胞、包括非增殖細胞(即G0休止的細胞)的死亡。但是，野生型的氣單胞菌溶素不加區(qū)分地殺死所有的細胞。此處公開的是氣單胞菌溶素的一種無活性的毒素前體形式(變異PA)，它可以被定位到前列腺癌特異性蛋白并被該蛋白激活。該公開的變異PA分子用于治療局部和轉移性前列腺癌的一個優(yōu)點是，它將一種不依賴于增殖的療法與前列腺特異性藥物的遞送相結合，從而對病人產生最小的副作用。本領域的專業(yè)技術人員將理解，其它的毒素前體，例如膿毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium septicum)的α毒素、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的δ-毒素以及人類的穿孔素(perforin)，都可以代替氣單胞菌溶素原。
此處公開的變體PA分子，包括了DNA序列和蛋白序列，含有前列腺特異性蛋白酶切割序列。前列腺特異性蛋白酶切割序列的例子包括但不限于PSA、PSMA和hK2切割序列。前列腺特異性蛋白酶切割序列在功能上代替了PA的天然的弗林蛋白酶切割位點(例如參見圖5B-I)。這種代替產生了一種氣單胞菌溶素原的變異體，它只有在存在具有酶活性的蛋白酶，如PSA、PSMA或hK2的情況下才變得具有細胞裂解活性。PSA是一種絲氨酸蛋白酶，能夠識別和水解特異性肽序列。它由正常的和癌化的前列腺細胞以一種具有酶活性的形式分泌出來，進入血液循環(huán)后變?yōu)闊o活性。由于在血液和除了前列腺的其它正常組織中都不含有具有酶活性的PSA，PSA的蛋白水解活性可用于在前列腺癌的位點活化毒素前體。任何PSA、PSMA或hK2的切割位點都可以使用。PSA切割位點的例子包括但不限于在SEQ ID NO5、8、11和14-21中顯示的那些。在一個特定的實施例中，PSA切割位點包含SEQ ID NO5。
在一些實施例中，PA的弗林蛋白酶切割位點(SEQ ID NO2的427-432位氨基酸)被缺失并插入一個前列腺特異性蛋白酶切割位點，例如一個PSA切割位點(例如參見圖5B)。在其它的實施例中，PA的弗林蛋白酶切割位點被突變，并將一個前列腺特異性蛋白酶切割位點，例如一個PSA切割位點插入或添加到弗林蛋白酶位點的N-端或C-端(例如參見圖5C)。
還公開了變體PA分子，其中PA結合結構域被功能性缺失(例如參見圖5D-M)。這樣的變體PA分子可以含有一個天然的弗林蛋白酶切割位點(例如參見圖5J-M)，由此通過用一個前列腺組織特異性結合結構域功能性取代PA結合結構域以達到向前列腺細胞的定位。此外，變體PA分子也可以含有一個前列腺特異性蛋白酶切割位點(例如參見圖5D-I)，由此毒素前體的激活一般發(fā)生在分泌前列腺特異性蛋白酶的細胞中。PA結合結構域包括SEQ ID NO2的大約1-83位氨基酸。可以使用任何本領域已知的方法將結合結構域功能性缺失，例如通過缺失結合結構域的所有或部分氨基酸，比如缺失SEQ ID NO2或4的1-83位氨基酸(例如參見圖5G)，或比如缺失在SEQ ID NO2或4的45-66位氨基酸中的一個或多個氨基酸(例如參見圖5D，其中*號表示一個或多個缺失)。在另一個實施例中，通過在變體PA序列中引入一個或多個位點特異性突變來將結合結構域功能性缺失，例如SEQ IDNO2或4的W45A、I47E、M57A、Y61A和K66Q(例如參見圖5D，其中*號表示一個或多個突變)。
公開了含有天然的PA結合結構域被前列腺組織特異性結合結構域功能性取代的變體PA分子(例如參見圖5E、5F、5H和5I-M)。一個或多個前列腺組織特異性結合結構域的使用可以增強公開的變體PA分子向前列腺細胞及其轉移細胞的定向。已知幾種前列腺組織特異性結合結構域。例子包括但不限于促黃體激素釋放激素(LHRH)序列，例如在SEQ ID NO22和23中所示的那些，以及識別PSA和/或PSMA的抗體。
一個或多個前列腺組織特異性結合結構域可以連接到一個或多個公開的變體PA分子的氨基酸上，但是在理想情況下，可以不明顯地干擾變體PA被前列腺特異性蛋白酶如PSA激活的能力，以及在細胞膜上形成孔的能力。例如，前列腺組織特異性結合結構域可以連接或插入到變體PA的N-端和/或C-端(例如參見圖5E和5H)。在一些實施例中，PA的天然的結合結構域(即SEQ ID NO2或4的1-83位氨基酸)被缺失了，以便在N-端添加或連接前列腺組織特異性結合結構域導致添加在SEQ ID NO2或4的84位氨基酸上(例如參見圖5H和5L)。在其它的實施例中，在PA的天然結合結構域中引入了較小的缺失或點突變，以便在N-端添加或連接前列腺組織特異性結合結構域導致添加在SEQ ID NO2或4的1位氨基酸上(或功能性缺失天然的PA結合結構域后緊接的N-端氨基酸上)(例如參見圖5E和5I)。在一些實施例中，PA的N-端氨基酸在結合前列腺組織特異性結合結構域前被改變?yōu)榘腚装彼峄蚱渌被幔詭椭鷮⑶傲邢俳M織特異性結合結構域連接到變體PA蛋白上。
也可以選擇或加上這樣的步驟，即將一個或多個前列腺組織特異性結合結構域添加或連接到變體PA分子的其它氨基酸上，例如SEQ IDNO2或4的215位或300位氨基酸(例如參見圖5F、5I、5K和5M)。在一些實施例中，半胱氨酸代替了那個位置的天然氨基酸。例如，可以對SEQ ID NO2或4進行下列改變215位的酪氨酸變?yōu)榘腚装彼峄?00位的丙氨酸變?yōu)榘腚装彼帷Ｔ谝粋€實施例中，當前列腺組織特異性結合結構域是一個抗體時，可以使用交聯(lián)將抗體添加到變體PA上，例如將抗體的氨基基團與位于PA突變體上的半胱氨酸反應(例如SEQ ID NO2中的19位、75位、159位和/或164位的半胱氨酸)。
還公開了特定的變體PA分子，例如在SEQ ID NO3、4、6、7、9、10、12、13、24和25中顯示的那些。
在一些實施例中，公開的變體PA分子被連接或固定化到一個表面上，例如一個珠子。珠子也可以含有前列腺特異性配體以增強向前列腺細胞，例如局部或轉移性前列腺癌細胞的定向。
使用修飾的氣單胞菌溶素原治療前列腺癌上面公開和討論的變體PA分子在前列腺癌位點中通過前列腺特異性蛋白酶如PSA、PSMA和hK2的蛋白水解活性被特異性地激活成為潛在的細胞毒素。在一些實施例中定向是通過包含了一個或多個前列腺組織特異性結合結構域來達到的，例如LHRH肽，它可以結合到由前列腺癌細胞表達的同源的LHRH受體上，或者PSMA或LHRH抗體，它們可以結合到在前列腺癌細胞表面表達的PSMA或LHRH上。本領域的專業(yè)技術人員將意識到使用包含弗林蛋白酶切割位點和LHRH肽或抗體的變體PA分子，以及使用變體PA分子和此處公開的方法，可以治療其它表達LHRH受體的癌癥，例如黑素瘤和乳腺、卵巢和肺癌。此外，本領域的專業(yè)技術人員將意識到使用包含弗林蛋白酶或PSMA切割位點和/或PSMA抗體的變體PA分子，以及使用變體PA分子和此處公開的方法，可以治療其它表達PSMA(例如在腫瘤的血管系統(tǒng)中)的癌癥，例如乳腺、結腸、腎、睪丸和腦癌。
公開的變體PA分子，例如核酸和/或蛋白，可以使用本領域任何已知的方法，局部地或全身地給藥到患有局部或轉移性前列腺癌的受試者中。此外，公開的變體PA分子可以給藥到受試者進行免疫刺激治療。由于公開的變體PA分子的結合和激活特異性，局部和全身給藥將對病人的正常組織產生極小的影響，并在理想情況下產生很少至完全沒有副作用。
在一個實施例中，公開的變體PA分子被注射到患有前列腺癌如局部腫瘤的受試者的前列腺中(前列腺內給藥)和/或前列腺腫瘤中(腫瘤內給藥)。在前列腺中的這種局部注射和隨后的前列腺癌細胞的裂解可以產生免疫刺激效應，導致治療的受試者中微型轉移性疾病的減少或消除。采用這種方式，全身性疾病通過一種極小毒性、局部使用的治療方法得到治療或緩解。
此外，或可以選擇的是，公開的變體PA分子可以全身性給藥，例如靜脈內、肌內、皮下或口服給藥到患有前列腺癌例如轉移性前列腺腫瘤的受試者中。全身性療法也可能具有免疫刺激性抗腫瘤效應。含有PSA切割位點的公開的變體PA分子不被血清蛋白酶或血液內失去酶活的PSA水解。代之以未被水解的公開的變體PA分子通過血液被運送到轉移性癌沉積物中的細胞外體液中，在那里它們可以被這些前列腺癌細胞分泌的有酶活性的PSA水解成為有活性的治療性毒素。一旦被水解，釋放出的毒素由于它的高度的細胞膜通透能力進入緊鄰的PSA產生細胞和不產生PSA的旁觀細胞，并誘導這些細胞的細胞裂解性死亡。
還公開了另一種全身性治療受試者中的前列腺癌的方法。在這種方法中，將前列腺癌細胞從患有前列腺癌如轉移性前列腺腫瘤的受試者中取出。可以選擇或加上的是，可以使用已建立的前列腺癌細胞系。可以使用的前列腺癌細胞系的例子包括但不限于PSA產生細胞例如LNCaP(例如ATCC NOCRL-1740和CRL-10995)和CWR22R(ATCCNOCRL-2505和Nagabhushan等，Cancer Res.56(13)3042-6，1996)、或非PSA產生細胞例如PC-3(ATCC NOCRL-1435)和DU145(ATCCNOHTB-81)。將取出的細胞或細胞系與公開的變體PA分子保溫或接觸。保溫導致細胞被變體PA分子裂解，產生了細胞裂解物，將它給藥到受試者。在一個實施例中，該方法還包括給藥免疫刺激因子、來自經(jīng)改造能夠產生免疫刺激因子的前列腺癌細胞的裂解物、和/或被輻射的前列腺癌細胞(包括被改造能夠產生免疫刺激因子的前列腺癌細胞)。免疫刺激因子的例子包括但不限于粒細胞巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CFS)、白細胞介素蛋白家族的成員包括但不限于白細胞介素2和白細胞介素6、粒細胞集落刺激因子(G-CFS)、以及干擾素家族的成員例如α-、β-或γ-干擾素。給受試者施用這些物質可以與細胞裂解物同時(共給藥)、在施用細胞裂解物之前、和/或在施用細胞裂解物之后進行。
在一個實施例中，這樣的給藥增強了受試者減小前列腺腫瘤和/或轉移性腫瘤的體積的能力。例如，公開的方法可以減小前列腺腫瘤細胞的體積和/或轉移性腫瘤細胞的體積，例如至少10％，例如至少20％或以上。此外，公開的方法還可以導致與前列腺腫瘤和/或轉移性前列腺腫瘤相關的癥狀的減輕。
公開的變體PA分子可以作為單一形式的療法給藥，也可以與其它療法結合使用，例如放射療法和/或雄激素去除療法(例如LHRH受體激動劑/拮抗劑、抗雄激素、雌激素、腎上腺類固醇合成抑制劑酮康唑(ketoconazole)和氨基苯乙哌啶酮)。此外，公開的變體PA分子可以單獨施用，也可以與可藥用的載體結合使用，和/或與其它治療化合物結合使用，例如那些能夠減少產生針對施用的變體PA蛋白的抗體的化合物(例如美羅華(Rituximab)和類固醇)以及其它的抗腫瘤劑。
某些特定的實施例的公開不意味著排除了其它的實施方案。此外，任何此處描述的治療不需要排除其它的治療，而可以與其它的生物活性劑或治療方案結合使用。
實施例1PSA激活的氣單胞菌溶素原毒素的產生本實施例描述了用于產生表1中所示的被PSA激活的突變氣單胞菌溶素原毒素的方法。本領域的專業(yè)技術人員將會理解同樣的方法可以用于生產其它的被PSA或任何其它的前列腺特異性蛋白酶激活的變體氣單胞菌溶素原蛋白。這些蛋白可以通過用一個前列腺特異性蛋白酶切割位點，例如PSA特異性切割序列取代氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶序列而產生(見實施例9)。
表1PSA特異性氣單胞菌溶素原變體

表1所示的變體或修飾的氣單胞菌溶素原(PA)包含了一個氣單胞菌溶素原序列(野生型PA顯示于SEQ ID NO1和2中)，其中的6個氨基酸的弗林蛋白酶識別位點(SEQ ID NO2的427-432位氨基酸)被一個PSA底物所取代。例如，命名為PSA-PA1的變體氣單胞菌溶素原(PA)毒素(SEQ ID NO3和4)，包含了一個PA序列，其中的弗林蛋白酶切割位點被PSA底物HSSKLQ取代(SEQ ID NO5)。
使用前述的方法(Vallette等，Nucl.Acids Res.17723-33，1988)通過重組PCR，用PSA-特異性切割位點(SEQ ID NO5、8、11或14)代替氣單胞菌溶素的弗林蛋白酶位點(SEQ ID NO2的427-432位氨基酸)。簡而言之，在總體積為50μl pfu反應緩沖液[20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，以及0.1mg/ml BSA]中進行重組PCR，其中含有0.2mM脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)、0.5μM正向和反向引物、0.1μg模板DNA和2.5單位克隆的pfu聚合酶。
使用Taq聚合酶通過PCR篩選帶有氣單胞菌溶素原插入的轉化細胞。在PCR反應緩沖液[50mM KCl，1.5mM MgCl2，以及10mMTris-HCl(pH9.0)]中制備了含有0.2mM dNTPs、0.5μM正向和反向引物及5單位Taq聚合酶的混合物。10μl這種混合物樣品被等分到0.2ml的管中，并使用無菌牙簽加入轉化的細胞。
最終的PCR產物用適當?shù)南拗菩悦赶?，然后連接到克隆載體pTZ18u(BioRad)中用于擴增。簡而言之，限制性消化在Pharmacia通用(One-Phor-All)緩沖液[10mM Tris-乙酸(pH7.5)，10mM乙酸鎂，以及50mM乙酸鉀]中于37℃進行90分鐘，每μg DNA加入大約1單位的限制性酶。產生的插入片段和pTZ18u載體DNA以大約5∶1的比例混合，在45℃加熱15分鐘。然后樣品用通用緩沖液稀釋并加入ATP，對于粘性末端的連接加到終濃度為1mM，而對于平末端的連接加到終濃度為0.5mM。然后，在每個樣品中加入11單位的T4 DNA連接酶，并將樣品輕輕混合。連接在13℃進行4小時(對于粘性末端連接)或16小時(對于平末端連接)。
對DNA進行測序以確保正確的取代發(fā)生。然后從克隆載體分離插入的片段并亞克隆到宿主范圍廣泛的質粒pMMB66HE中(Furste等，Gene 48119-131，1986)以便在大腸桿菌中表達。使用以前描述的CaCl2洗滌的方法(Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-4，1972)將大腸桿菌DH5α細胞制作為感受態(tài)。指數(shù)相生長的細胞(OD600＝0.4-0.7)通過收集，并用四分之一體積的冷的100mM MgCl2洗滌。再次離心收集細胞，重新懸浮在2倍體積的冷的100mM CaCl2中。然后將細胞冰浴大約45分鐘。接著將細胞離心并重新懸浮在十分之一體積的100mMCaCl2中。繼續(xù)冰浴45分鐘，然后加入甘油到終濃度為15％。使用前感受態(tài)細胞被儲存在-70℃。
根據(jù)Inoue等的方法(Gene 9623-8，1990)將重組質粒轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。感受態(tài)細胞(200μl的等分試樣)與0.5-10ng的DNA一起在冰上保溫1小時。然后將細胞在42℃熱沖擊4分鐘。將細胞快速移回到冰上5分鐘。隨后在每個樣品中加入500μl LB培養(yǎng)基，并將細胞在37℃孵育1小時，輕輕攪動。將等分試樣(150μl)鋪在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂板上。平板在37℃保溫。
使用Harayama等的濾膜雜交技術(Mol.Gen.Genet.18047-56，1980)通過接合將重組的pMMB66HE克隆轉移到殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)CB3株中(參見Buckley，Biochem.Cell.Biol.68221-4，1990)。使用這種蛋白酶缺陷的殺鮭氣單胞菌(A.Salmonicida)菌株導致產生沒有被激活的氣單胞菌溶素污染的氣單胞菌溶素原變體，并導致產生大量的蛋白。最終的氣單胞菌溶素原蛋白采用以前描述的羥基磷灰石層析和離子交換層析來純化(Buckley，Biochem.Cell.Biol.68221-4，1990)。該方法使得氣單胞菌溶素原的制備從一批到另一批是一致的。
實施例2PSA-PA1在體外特異性裂解PSA產生細胞本實施例描述了用于確定實施例1中描述的氣單胞菌溶素原變異體的特異性方法。這樣的方法可用于測試任何包含PSA特異性切割位點的氣單胞菌溶素原變異體的特異性。
針對PSA產生的LNCaP細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA)和非PSA產生的TSU細胞(Dr.T.Itzumi，TeikyoUniversity，Japan)測試了PSA-PA1毒素。細胞在存在10-12到10-6M毒素的情況下保溫24小時。然后，基于細胞排除臺盼藍(Trypan Blue)的能力對細胞進行計數(shù)并記錄細胞存活百分數(shù)。測定了毒素針對LNCaP和TSU細胞系殺死50％細胞所需的濃度(IC50)。
PSA-PA1對PSA產生細胞的LD50是10-10M。相反，對非PSA產生細胞TSU的LD50是大約5×10-8M。這個結果表明PSA-PA1毒素被PSA特異性激活，其證據(jù)為它對PSA產生和非PSA產生的人類癌細胞系的毒性有500倍的差別。
實施例3在含有PSA的血液中PSA-PA1不被激活公開的前列腺特異性蛋白酶激活的變體氣單胞菌溶素原肽，例如實施例1中描述的那些，當局部治療前列腺癌時可以前列腺內(或腫瘤內)注射。當全身性治療轉移性前列腺癌時毒素也可以靜脈內(或肌內)注射。這些含有PSA位點的變體PA分子在血液中應不被激活，這是因為存在大大過量摩爾的血清蛋白酶抑制劑如α1-抗胰凝乳蛋白酶和α2-巨球蛋白，從而使得PSA在血液中失去酶活性。
為了測試PSA-PA1被其它的血清蛋白酶和人血清中的PSA的非特異性激活作用，進行了如下靈敏的溶血分析。在含有PSA-PA1毒素±PSA的血漿或緩沖液中加入紅細胞(RBC，2％v/v)。通過測量釋放到上清液中的血紅蛋白來分析溶血的程度。加入0.1％Triton導致在幾秒鐘內100％的溶血，從而被用做陽性對照。水解的量以樣品在540nm處的吸收值與Triton處理的樣品的吸收值的比率來表示。在加入RBC之前將PSA-PA1毒素(10-8M)與PSA在緩沖水溶液中預先單獨保溫1小時導致大約45％的溶血(圖2)。
為了測定PSA-PA1在人血漿中是否被激活，將PSA-PA1毒素(10-8M)在50％的人血漿中保溫1小時。在相關的實驗中，首先在人血漿中加入過量的PSA(10000ng/ml)并保溫幾個小時。然后將含有血漿±PSA的PSA-PA1與人RBC(2％v/v)保溫。在人血漿或用高濃度的PSA增效的人血漿中加入PSA-PA1，沒有產生明顯的溶血(即小于Triton對照的1％)(圖2)。這些結果表明，即使在血液中含有可測量到的PSA，PSA-PA1也可以被全身性用藥而不會在血液中有明顯的激活。
實施例4氣單胞菌溶素原變體在體外和體內的毒性本實施例描述了用于測定公開的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白在體外和體內的毒性的方法。該方法可用于測量任何可被前列腺特異性蛋白酶切割的氣單胞菌溶素原變異體蛋白的毒性。
為了測定體外的毒性，如下進行了細胞存活分析。EI4小鼠T-細胞淋巴瘤細胞(ATCC TIB-39)被培養(yǎng)在MTS/PMS 96孔細胞滴度板(Promega)中，每個孔105個細胞。如圖3所示加入1×10-13M到1×10-7M的氣單胞菌溶素原變異體，與細胞在37℃溫育4小時。然后根據(jù)MTS/PMS試劑盒生產商的指示，通過在讀板器上讀板來確定細胞的存活率。如圖3所示，氣單胞菌溶素原變異體的毒性低于野生型的氣單胞菌溶素原，LC50為4×10-9(PSA-PA1)、1×10-9(PSA-1K)和1×10-7(PSA-PA2)，野生型的LC50為1.5×10-10。
為了測定體內的毒性，將氣單胞菌溶素原變異體通過靜脈內給藥到小鼠。野生型的氣單胞菌溶素原(SEQ ID NO2)對小鼠有高度毒性；1μg的劑量導致在1小時內死亡，單次靜脈內注射后24小時的LD100(即在24小時內殺死100％動物的劑量)為0.1μg。相反，PSA-PA1(SEQ IDNO4)在注射后24小時的LD100高25倍(即2.5μg的總劑量)。
實施例5PSA-PA1減小了PSA分泌腫瘤細胞的體積在實施例4中描述的毒性數(shù)據(jù)的基礎上，一組帶有LNCaP的小鼠(能夠產生PSA的人LNCaP前列腺癌異種移植)和一組帶有SN12C的小鼠(不能產生PSA的帶有人腎癌異種移植的對照小鼠)被單次通過腫瘤內注射100μl給藥0.25到25μg PSA-PA1(0.1到10倍的LD100劑量)。在注射后48小時，收獲腫瘤，用H&E固定并染色，用于Ki-67(增殖指數(shù))和Tunel(凋亡指數(shù))的測定。樣品內腫瘤的百分數(shù)通過在對腫瘤薄切片進行圖象分析后計算存活的腫瘤與全部腫瘤面積的比率來確定。
如圖4所示，給藥2.5到25μg的PSA-PA1減小了腫瘤體積85-99％，而給藥0.25μg的PSA-PA1時觀察到的減小少于20％。相反，當帶有不能產生PSA的人腎癌異種移植的SN12C小鼠(細胞由Isaiah博士提供，F(xiàn)idler Anderson癌癥中心，Houston TX)被腫瘤內注射PSA-PA1時，在同樣的劑量范圍內沒有觀察到存活腫瘤的百分數(shù)明顯下降(即小于25％)(圖4)。
在對照腫瘤(SN12C小鼠)中，在腫瘤內給藥PSA-PA1后48小時增殖指數(shù)是大約40％。相反，在相應的PSA-PA1處理的腫瘤中，Ki-67陽性細胞的百分數(shù)在48小時時小于1％。此外，在對照腫瘤中凋亡指數(shù)在腫瘤內給藥PSA-PA1后48小時時小于1％，而在PSA-PA1處理的腫瘤中到48小時時所有的細胞都是陽性的(即凋亡指數(shù)大于99％)。
這些結果表明PSA-PA1毒素能夠有效、快速地殺死PSA產生細胞，這種體內的細胞毒性是特異性，依賴于腫瘤細胞外體液中所含的PSA的存在。
實施例6通過前列腺特異性結合結構域定向毒素前體本實施例描述了產生和使用變體前列腺特異性蛋白酶激活的氣單胞菌溶素原毒素的方法，該毒素中野生型(或天然的)PA結合結構域(大約位于SEQ ID NO2的1-83位氨基酸)被前列腺組織特異型結合結構域，例如LHRH肽功能性取代。PA的天然結合結構域可以通過本領域任何已知的方法進行功能性缺失，例如通過缺失SEQ ID NO2中的大約1-83位的氨基酸(或其片段，如45-66位的氨基酸)，或通過插入能夠降低PA在細胞膜上聚集的能力的突變。
PA的GPI錨定蛋白結合結構域的N-端(大約位于SEQ ID NO2的1-83位氨基酸)可以被功能性缺失(例如通過缺失1-83位的氨基酸或通過插入突變以使該結構域失去功能)，而對孔的形成沒有顯著的影響。但是，結合結構域是毒素在細胞膜上聚集所必需的。只有當細胞暴露在高幾個數(shù)量級濃度的毒素下，缺少結合結構域的突變蛋白才是細胞裂解的。在實施例4中描述的野生型和變體PSA激活的PA的大多數(shù)體內毒性是由于它非特異性地結合到能被大多數(shù)哺乳動物細胞表達的GPI錨定蛋白上。為了產生更特異的更少全身毒性的毒素前體，可以將氣單胞菌溶素原的非特異性GPI錨定蛋白結合結構域功能性缺失，并用一個前列腺組織特異性結合結構域代替。
抗體能夠用于高度特異性地將修飾的氣單胞菌溶素原蛋白定位到前列腺組織的結合部分的一個例子是一種含有針對前列腺特異性膜蛋白的單鏈抗體的融合蛋白，以及能夠識別與毒素結構域融合的PSMA或LHRH的抗體。在理想情況下，將抗體添加到修飾的PA分子上將不會顯著地干擾分子在細胞膜上結合和聚集從而導致細胞死亡的能力。使用本領域熟知的基因融合方法可以將抗體結合到修飾的PA的N-端或C-端(例如參見Debinski和Pastan，Clin.Cancer Res.11015-22，1995)。例如，抗體可以取代氣單胞菌溶素原的天然的小裂片(SEQ IDNO2的1-83位氨基酸)，或者抗體可以添加到在天然結合結構域發(fā)生變體PA分子上。這樣的修飾的氣單胞菌溶素原也可以含有一個PSA激活序列以增加特異性。在一個實施例中，抗體是針對與PA的毒素結構域融合的PSMA的單鏈抗體。
此外，抗體或Fab片段可以通過共價交聯(lián)結合到修飾的PA上(例如參見Woo等，Arch.Pharm.Res.22(5)459-63，1999和Debinski和Pastan，Clin.Cancer Res.11015-22，1995)。交聯(lián)可以是非特異性，例如通過使用同型雙功能的賴氨酸反應交聯(lián)試劑，也可以是特異性，例如通過使用能夠與抗體的氨基基團和與氣單胞菌溶素原變體上的半胱氨酸(例如SEQ ID NO2中19、75、159和/或164位的半胱氨酸)反應的交聯(lián)試劑。
配體其它可以使用的結合部分是能夠與它們在前列腺癌細胞膜上表達的同源受體結合的小肽配體。例子包括但不限于天然的和合成的促黃體激素釋放激素(LHRH)激動劑肽(例如參見Genbank登記號CAA25526和SEQ ID NO22和23)，可以高度親和性地與LHRH受體結合，以及能夠選擇性結合于PMSA的肽。LHRH受體能夠被高比例的人前列腺癌表達，但不能被造血細胞表達。這種不同的表達提供了結合的特異性。
已經(jīng)知道LHRH的某些殘基，例如第6位的甘氨酸(Gly6)可以被取代而不犧牲與受體結合的親和性(Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89972-6，1992；Nechushtan等，J.Biol.Chem.，27211597-603，1997)。因此，可以生產與純化的LHRH D-Lys6(在賴氨酸的ε-氨基位)共價結合的變體PA毒素(其中天然的結合結構域被功能性缺失)。
LHRH D-Lys6(SEQ ID NO23)可以被添加到功能性缺失了結合結構域的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白的不同部分。然而在理想情況下，這樣的添加將不會顯著地干擾毒素插入細胞膜形成孔的能力。例如，D-Lys6類似物的ε-氨基可以通過一個二羧酸接頭連接到修飾的氣單胞菌溶素原的氨基末端。弗林蛋白酶或前列腺特異性蛋白酶的切割(依賴于在氣單胞菌溶素原肽上存在的切割位點)將導致C-端的抑制部分被釋放而毒素仍然與LHRH結合。
此外或可以選擇的是，LHRH D-Lys6類似物的ε-氨基可以通過在修飾的PA的C-端添加一個半胱氨酸，然后將該半胱氨酸與LHRH D-Lys6類似物的ε-氨基交聯(lián)，從而直接連接到缺少功能性的野生型結合結構域的修飾的氣單胞菌溶素原的C-端羧基上。這種結合將產生衍生的PA蛋白，其中LHRH肽被連接到PA的C-端抑制結構域上。弗林蛋白酶或前列腺特異性蛋白酶例如PSA的切割將釋放出毒素，留下抑制片段結合在LHRH受體上。因此，孔的形成不會由于緊密地與受體結合而受到抑制。此外，也可以產生重組的融合蛋白，其中修飾的LHRH肽與缺少功能性天然結合結構域的修飾的PA毒素的N-和C-端同時融合。
在另一個實施例中，一個半胱氨酸殘基被引入LHRH肽的第6位，該肽通過一個二硫鍵與修飾的PA毒素結合，例如在SEQ ID NO2的215和/或300位氨基酸，其中215和/或300位氨基酸已經(jīng)被突變?yōu)榘腚装彼?。在另一個實施例中，產生了一種重組蛋白，其中LHRH肽被融合到修飾的PA毒素的氨基末端。
使用實施例1-5中描述的方法，對獲得的含有用前列腺組織特異性結合結構域功能性取代了天然的PA結合結構域的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白進行體外和體內測試，測試其結合特異性和毒素的激活。
為了證實前列腺組織特異性結合結構域例如LHRH或PSMA可以功能性地取代天然的PA結合結構域，進行了下面的實驗。下述的方法描述了一種其中天然的PA結合結構域已被缺失、LHRH結合到得到的氣單胞菌溶素原上的分子的使用。但是同樣的方法也可以用來測試任何變體PA分子，例如其中使用了其它的前列腺組織特異性結合結構域、并且PA結合結構域被突變(例如通過插入一個或多個下列的突變W45A、I47E、M57A、Y61A、K66Q和W324A)而不是缺失的分子。
產生了含有天然的PA弗林蛋白酶激活序列的LHRH-氣單胞菌溶素原。使用實施例2中描述的方法比較了這些毒素與LHRH受體陽性細胞(LNCaP)和陰性細胞(TSU)結合的特異性。兩個細胞系都激活野生型的含有弗林蛋白酶激活位點的PA。因此，當每個細胞系都可以激活LHRH-氣單胞菌溶素原蛋白時，理想的肽是在低濃度下對LHRH受體陽性細胞有毒性的肽。使用這些方法，鑒定出了氣單胞菌溶素原上可以結合LHRH而不干擾毒素引起的通道形成的區(qū)域。
為了證實LHRH-氣單胞菌溶素原蛋白都結合到LHRH受體上并且能夠被PSA激活，使用實施例1中描述的方法產生了含有PSA激活位點而非弗林蛋白酶位點的毒素。使用實施例2中描述的方法，比較了這些毒素被LHRH陽性的產生PSA的LNCaP細胞與被LHRH受體陰性的不產生PSA的TSU細胞的激活。
LHRH-PSA激活的氣單胞菌溶素原毒素在體內進行測試以證實導入的LHRH結合部分導致了非特異性毒性的降低和定向能力的增加。如上所述，使用實施例4中描述的方法確定了這些毒素在單次靜脈內注射后的LD100，并與相應的不含LHRH的PSA激活的毒素進行了比較。然后，將毒素以不同的劑量，例如0.1μg到1mg，通過靜脈內給藥到帶有LNCaP的動物，以證實在較高、較低的毒素劑量下觀察到的增強的抗腫瘤效應。
實施例7確定氣單胞菌溶素原的抗原性本實施例提供了確定此處公開的修飾的氣單胞菌溶素原肽是否具有抗原性的方法。此外還公開了降低潛在的抗原性的方法。
如前面的實施例所述，腫瘤內注射PSA-PA1(SEQ ID NO4)證實了毒素通過前列腺內注射在治療局部前列腺癌中的用處。但是，這種治療也可以通過其它途徑給藥，例如靜脈內(iv)、肌內、口服等以全身性治療轉移性前列腺癌。但是，此處公開的全身性給藥變體PA肽有可能會導致中和抗體反應的發(fā)展，從而限制重復地用藥。
對任何此處公開的PA變異體的抗體反應的動力學和強度可以如下述確定。例如，針對PSA-PA1(SEQ ID NO4)的抗原性反應可以在具有免疫能力的小鼠中確定，以發(fā)展一種可用于具有免疫能力的人中的劑量方案。具有免疫能力的小鼠(C57-BL6)靜脈內給藥PSA-PA1(SEQID NO5)，每天5次每周三次，劑量范圍從0.1μg到5μg。在不同的時期(例如在給藥一劑之后，給藥多劑之后)的小鼠被處死并取得血清。可以使用基于ELISA的分析方法來檢測抗氣單胞菌溶素原抗體的存在。在該分析中，確定量的氣單胞菌溶素原被固定在96孔板的聚苯乙烯表面上。在用牛血清白蛋白(BSA)進行足夠的封閉之后，以不同的稀釋度在孔中加入來自暴露于氣單胞菌溶素原的小鼠血清。在保溫確定的時間后，洗滌孔，加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠第二抗體，然后加入底物。存在的抗體的量通過在分光光度計上測量吸光度而確定，這使抗體對變化的靜脈內給藥PSA-PA1的日程和劑量的反應的時間過程和強度得以確定。
為了減少氣單胞菌溶素原的抗原性，天然的結合結構域可以被功能性缺失并用例如LHRH取代，如實施例6所示。在以不同的給藥計劃暴露到缺失了天然的結合結構域部分的LHRH-氣單胞菌溶素原蛋白后，這些肽的抗原性可以使用上述的方法測定。可以使用的另一種允許用前列腺特異性蛋白酶激活的毒素進行連續(xù)治療的方法是使用具有非重疊抗原性的其它裂解毒素(見實施例10)。一個例子是使用一種修飾的結構相關的細菌毒素例如膿毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium septicum)的α-毒素，它也可以被前列腺特異性蛋白酶例如PSA激活，但是不被識別PA的抗體識別或中和(見實施例10)。另一個例子是使用一種由人組織產生的孔形成毒素，例如由細胞裂解性人T細胞產生的人穿孔素。其中野生型激活序列被作為前列腺特異性蛋白酶的底物的肽例如PSA取代的修飾的穿孔素可以被給藥而不會產生抗體反應，因為這些蛋白是人源的。
此外，提供了確定產生的抗體是否能夠中和氣單胞菌溶素的細胞裂解性質的方法。公開的修飾的PA(例如SEQ ID NO4、24和25)與PSA保溫以激活毒素。被激活的毒素與不同劑量的含有抗體的血清保溫。加入洗滌過的RBC，按照上面實施例2的描述確定與對照(沒有暴露到毒素的血清)相比的溶血程度。
此外，帶有產生PSA的腫瘤的動物可以用PSA激活的氣單胞菌溶素原毒素接種兩次，然后用致死劑量的毒素(見實施例4)再次攻擊，以確定抗體是否在體內中和毒性。隨后，在對接種免疫的動物腫瘤內注射后評估抗腫瘤反應，以確定當腫瘤內注射時抗體是否中和毒素。
實施例8誘導全身性免疫刺激反應本實施例提供了方法可用于證明氣單胞菌溶素原介導的細胞裂解產生全身性免疫刺激效應。這種由前列腺內給藥此處公開的毒素所引起的全身性免疫刺激效應會提供對于前列腺內的前列腺癌的局部治療，同時也誘導了針對潛伏的微型轉移性病癥的全身性抗腫瘤效應。或者或此外，受試者還可以在存在或不存在細胞因子如GMCSF的情況下用修飾的氣單胞菌溶素原裂解的前列腺癌細胞進行接種免疫，以治療復發(fā)或原發(fā)性轉移性病癥。
用修飾的氣單胞菌溶素原裂解的前列腺腫瘤細胞的給藥為了證實用修飾的氣單胞菌溶素原處理的細胞可以在受試者中刺激全身性免疫反應，使用了下述的方法。簡而言之，受試者(例如患有前列腺癌的具有免疫活性的小鼠或人類受試者)被給藥用一種或多種此處公開的修飾的氣單胞菌溶素原分子裂解的前列腺腫瘤細胞(例如TC2小鼠前列腺癌細胞、從患有前列腺癌的受試者獲得的前列腺癌細胞、和/或用于給藥到病人的人前列腺癌細胞系)。為了確定是否發(fā)生了全身性免疫反應，已經(jīng)給藥裂解的前列腺癌細胞的小鼠可以用同樣的細胞進行重新攻擊，并測量這些接種的腫瘤細胞的生長。例如，C57-BL6小鼠用氣單胞菌溶素原裂解的TC2細胞皮下注射。為了完成這一步，通過在無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)中與氣單胞菌溶素原在37℃保溫1小時，107個TC2細胞被裂解。給藥動物每周兩次注射這種細胞裂解物以刺激針對TC2細胞的免疫反應。然后在第二次裂解物接種后一星期，用皮下注射TC2癌細胞再次攻擊動物。TC2是一個從TRAMP小鼠(Foster等，Cancer Res.573325-30，1997)分離的癌組織衍生的小鼠前列腺癌細胞系。對照受試者被注射同樣數(shù)量的通過凍溶裂解或用輻射處理誘導了凋亡的細胞。另一個對照組只注射修飾的氣單胞菌溶素原肽。使用實施例5中描述的方法比較了組間的腫瘤生長。
對于人類受試者，可以使用在前列腺切除術或活組織檢查時從病人獲得的前列腺癌細胞或人前列腺癌細胞系。人前列腺癌細胞系的例子包括產生PSA的LNCaP(例如ATCC Nos.CRL-1740和CRL-10995)或CWR22R(ATCC No.CRL-2505和Nagabhushan等，Cancer Res.56(13)3042-6，1996)細胞、或不產生PSA的PC-3(ATCC No.CRL-1435)和DU145(ATCC No.HTB-81)。來自各種來源的(病人或細胞系)大約107-108個的細胞在滅菌的PBS中與1μg PA(野生型或變異體)在37℃保溫1小時。通過劇烈吹打將得到的裂解物完全混合，然后通過皮下注射大約0.5ml將懸浮液給藥受試者。病人可以每星期治療3劑。對病人進行嚴密的監(jiān)控并每星期進行身體檢查。對針對PSA、PSMA和hK2的抗體的存在進行分析，并使用以前描述的方法(Simons等，CancerRes.595160-8，1999)分析B和T細胞反應，可以監(jiān)測針對皮下注射PA的免疫反應。
或者或此外，來自病人的前列腺癌細胞或被改造能夠表達免疫刺激蛋白(例如GM-CSF)的前列腺癌細胞系與PA(野生型或變異體)保溫，并用于產生裂解物(例如參見Simons等，Cancer Res.595160-8，1999)。PA裂解的前列腺癌細胞可以與產生免疫刺激分子的被輻射的前列腺癌細胞共同給藥。輻射誘導細胞經(jīng)歷凋亡。將細胞裂解殺死的細胞和誘導凋亡殺死的細胞結合起來預料產生優(yōu)良的免疫刺激效應(Sauter等，J.Exp.Med.191423-33，2000)。在一個例子中，對受試者同時給藥與免疫刺激蛋白混合的PA裂解的前列腺癌細胞。在另一個例子中，PA裂解的前列腺癌細胞通過皮下給藥，免疫刺激蛋白，例如GM-CSF，白細胞介素，干擾素，G-CSF(Dranoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903539-43，1993)則全身性給藥。
修飾的氣單胞菌溶素原的前列腺內給藥另一種可用于在患有前列腺癌的受試者體內刺激全身性免疫反應的方法是直接將此處公開的修飾的氣單胞菌溶素原毒素給藥到受試者的前列腺中。例如，修飾的氣單胞菌溶素原毒素可以直接給藥到患有前列腺腫瘤的人類受試者的前列腺中(或其腫瘤中)，或者給藥到通過將紅細胞凝集素(HA)引發(fā)的T細胞過繼轉移后得到的轉基因ProHA小鼠中。預計在前列腺內注射修飾的氣單胞菌溶素原毒素后導致的細胞裂解，將在ProHA小鼠的前列腺中激發(fā)針對HA或針對人的前列腺腫瘤抗原的免疫反應。ProHA轉基因小鼠在前列腺限制性啟動子probasin的控制下表達流感的蛋白HA。ProHA小鼠只在前列腺中表達HA。在這個系統(tǒng)中，來自單獨供體小鼠的特異性CD4和CD8 T細胞與HA接觸而引發(fā)，然后過繼轉移到HA轉基因動物中。
受試者被給藥亞致死前列腺內劑量的修飾的氣單胞菌溶素原(例如使用實施例4中描述的方法確定)。由于ProHA小鼠不產生PSA或酶學上等效的類似物，使用了野生型的氣單胞菌溶素。然而在人中給藥一種或多種公開的修飾的氣單胞菌溶素原毒素。在前列腺內注射24小時后，處死一些小鼠，取出前列腺并分析壞死的程度。第二組注射的小鼠接受的是HA特異性CD4和CD8 T細胞，它們收集自以前描述的用109個空斑形成單位的表達重組紅細胞凝集素的痘苗病毒接種免疫的TCR轉基因供體(Staveley-O’Carroll等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951178-83，1998)。這些T細胞是Thy 1.1+，被轉移到Thy 1.2+的ProHA小鼠中。在過繼轉移到氣單胞菌溶素原處理的ProHA小鼠后4天，受體小鼠被處死，脾臟、腋下(無關的)和前列腺導管節(jié)被切下、分離并洗滌。
為了評估特異性T細胞的活化進行了下列分析使用藻紅素標記的抗Thy1.1抗體和細胞色素標記的抗CD4或CD8抗體(Pharmingen，San Diego，CA)將一百萬個分離的細胞染色。使用FacsScan(BectonDickinson)對分離的細胞進行分析。HA特異性T細胞增長的指數(shù)通過用在ProHA處理的動物中的純系型(Thy1.1+)細胞的百分數(shù)除以在未處理的ProHA對照的同樣組織位點中的純系型細胞的百分數(shù)來計算。此外，在前列腺導管中與無關的淋巴結中的純系型細胞的百分數(shù)的比率，提供了PA治療后的前列腺特異性增殖的指數(shù)。在另一個分析中，按照以前描述的方法(Adler等，J.Exp.Med.1871555-64，1998)測量了抗原特異性增殖。簡而言之，收集的淋巴細胞或脾細胞與II類HA肽(CD4細胞特異性增殖)或I類HA肽(CD8細胞特異性增殖)一起保溫。細胞培養(yǎng)3天，然后用氚化的胸腺嘧啶脈沖過夜，然后收獲并確定讀數(shù)。相對于對照的總讀數(shù)增加意味著特異性T細胞的活化。
來自接受了HA特異性Thy1.1 T細胞的PA處理的ProHA小鼠的前列腺被分析如下。使用標準的免疫組化程序將來自處理的小鼠的固定化前列腺切片用生物素化的Thy1.1抗體(Pharmingen)染色，并用鏈霉親和素過氧化物酶進行負染色。為了確定刺激的程度，陽性染色的程度與鹽水處理的對照進行了比較。
為了評估前列腺內注射氣單胞菌溶素原是否可以影響隨后的腫瘤發(fā)育、生長或擴散形式，可以使用下述的方法。在動物生命周期的不同時間點(性成熟前、性成熟后患有轉移性腫瘤前、患有轉移性腫瘤時)在TRAMP小鼠的前列腺中注射氣單胞菌溶素原(或此處公開的修飾的氣單胞菌溶素原肽)。在無菌條件下對麻醉的動物進行前列腺內注射。在前列腺內接種后的不同時間點，動物被處死并進行尸體剖檢以評估腫瘤的程度。前列腺被取出并進行免疫組化分析以評估前體病灶和明顯的前列腺癌的存在。同樣地，性成熟前的TRAMP小鼠可以皮下給藥兩次用氣單胞菌溶素原裂解的TC2細胞，或用氣單胞菌溶素原裂解的從患有晚期癌癥的TRAMP小鼠中取出的原發(fā)腫瘤。這些動物被追蹤，并在確定的時間點處死，以評估與對照相比腫瘤發(fā)育的時間過程和程度。
同樣的方法可以用于將修飾的PA給藥到患有局部性前列腺癌的病人。這樣的前列腺內給藥修飾的PA療法可以單獨、也可以與放射(外粒子束或短程放射治療)和/或雄激素消融療法結合使用，作為局部性前列腺癌的起始治療。前列腺內給藥修飾的PA療法也可以用于給藥到用輻射療法治療失敗并且被懷疑為只是在前列腺內患有局部前列腺癌復發(fā)的病人。前列腺內給藥修飾的PA療法也可以使用在患有局部性或轉移性前列腺癌的病人身上，以直接治療局部性癌癥，并通過刺激全身性抗腫瘤免疫反應來治療轉移性癌癥。
為了進行前列腺內給藥修飾的PA療法，按照與施用前列腺內短程放射治療相同的既定樣板將修飾的PA注射到病人的前列腺中。進行前列腺內給藥所需的技術和設備也與用于短程放射治療的相同，已經(jīng)在以前描述過了(Deweese等，Cancer Res.617464-72，2001)。為了確定前列腺內給藥的合適劑量，進行了發(fā)現(xiàn)劑量的臨床試驗。病人在涵蓋了整個前列腺的預定位點接受多次的注射(20-80次)。修飾的PA的總的給藥劑量在大約0.1-1.0mg的范圍，總共不超過10mg。每次注射的劑量用總劑量除以總的注射次數(shù)確定。病人被當作住院病人對待，在注射后在醫(yī)院中監(jiān)測48小時。其后病人每星期檢查毒性的病征。前列腺的核磁共振成像(MBI)可用于在前列腺的尺度上直接監(jiān)測治療的效果。對前列腺內給藥PA的免疫反應將如以前描述的那樣進行檢測(Simons等，Cancer Res.595160-8，1999)。
實施例9添加的PSA切割位點添加的PSA切割位點是已知的，基于人類精液蛋白semenogelin I和II的PSA切割圖譜和基于纖維素膜的分析(參見表2和Denmeade等，Cancer Res.574924-30，1997)。使用實施例1中描述的方法，可以用表2中顯示的PSA切割位點代替氣單胞菌溶素原中野生型弗林蛋白酶激活位點(SEQ ID NO2的427-432位氨基酸)。簡單地說，可以使用重組PCR將PA的弗林蛋白酶位點用PSA特異性切割位點代替，例如表1和表2中顯示的那些。變體PA序列被亞克隆到pMMB66HE中以便在大腸桿菌中表達。重組的克隆被轉移到蛋白酶缺陷的菌株殺鮭氣單胞菌(A.Salmonicida)中，產生的變體氣單胞菌溶素原蛋白用羥基磷灰石層析和離子交換層析純化。
表2、PSA水解的動力學*

*肽被熒光標記(氨基甲基香豆素)。分析在50mM Tris，0.1M NaCl，pH7.8中進行。
表2中顯示的序列中包含了能夠被PSA有效但不是特異性水解的底物(KGISSQY，SEQ ID NO15和SRKSQQY，SEQ ID NO16)，以及不能被PSA有效但是特異性水解的底物(ATKSKQH，SEQ ID NO17和LGGSSQL，SEQ ID NO19)。這些修飾的毒素的性質可以與含有HSSKLQ(SEQ ID NO5)序列的PSA-PA1相比。作為對照，產生了一個其中激活位點被完全缺失的修飾的毒素(EX-PA)使用實施例3中描述的溶血分析方法篩選了這些純化的毒素的PSA水解能力。野生型氣單胞菌溶素原不被激活并引起紅細胞裂解。但是氣單胞菌溶素原被蛋白酶激活后會導致快速的溶血。簡單來說，為了分析PSA的激活，不同濃度的純化的變異PA毒素與PSA保溫1小時，清洗，加入無血清的紅細胞(RBC)(2％v/v)。在另外1小時后，將保溫的混合物離心，測定上清液在540nm處的吸收值。確定裂解50％RBC所需的最小濃度的修飾毒素，以便在PSA水解效率的基礎上對毒素進行排序。
為了確定PSA的激活作用和激活的特異性，使用實施例2中描述的方法，通過在體外將純化的PSA-氣單胞菌溶素原毒素暴露到產生PSA(LNCaP)和不產生PSA的癌細胞系(TSU)進行細胞毒性分析。對于每種變異PA毒素針對LNCaP和TSU細胞系測定殺死50％細胞所需的濃度(IC50)。細胞毒性相差的倍數(shù)被用來在特異性基礎上對PSA激活的毒素進行排序。
還可以使用實施例5中描述的方法，通過將變異PA毒素腫瘤內注射到裸鼠內產生PSA的LNCaP的異種移植物，在體內篩選變異PA毒素的抗腫瘤活性。如同前面的實施例5中所描述的，腫瘤內注射PSA-PA1毒素在48小時內減小了腫瘤。相反，野生型氣單胞菌溶素原，它在體外能夠更有效地被產生PSA和不產生PSA的細胞系激活，對LNCaP的異種移植物卻效果最小。這表明毒素激活的動力學可能對于全面的抗腫瘤效應是重要的。PSA-PA1被PSA的激活更為特異，但是激活的動力學比野生型毒素慢。這使得PSA-PA1可以在腫瘤內分布得更廣泛。因此，在激活位點中更好的PSA底物，卻反而可能導致在體內全面的抗腫瘤效應降低。
為了評估PSA激活的氣單胞菌溶素原對野生型PA在腫瘤內或正常組織中的分布，可以使用熒光標記(例如FITC)的PSA-PA1和PA蛋白。用熒光標記的PSA-PA1和PA注射產生PSA的LNCaP異種移植物。在腫瘤內注射后24小時時，收獲腫瘤，固定并切片用于顯微鏡分析。插入細胞膜的熒光標記的氣單胞菌溶素原蛋白在固定過程中保留下來。然后使用帶有適當?shù)臑V光片的熒光顯微鏡分析切片，濾光片被設置為確定氣單胞菌溶素原毒素在腫瘤樣本中的分布程度。
然后，將變體PA毒素注射到LNCaP異種移植物中，在48小時后使用實施例5中描述的方法通過腫瘤測量評估抗腫瘤反應。變體PA毒素根據(jù)腫瘤內注射后體內的抗腫瘤效應進行排序。
此外，也可以使用實施例4中描述的方法，通過測定在單次靜脈內注射后能夠殺死100％小鼠的劑量(即LD100)來測試變體PA毒素的整體的全身性毒性。
使用這些方法，可以鑒定出那些能夠最有效和最特異性地被PSA激活、并且在體內其毒性至少全身性的并產生最顯著的抗腫瘤效應的PSA激活的變體PA毒素。這樣的PSA激活的變體PA毒素也可以使用實施例6中描述的方法進行修飾。
實施例10減少PSA激活的修飾的氣單胞菌溶素原毒素的抗原性本實施例描述了可用于生產和表征其它修飾的形成孔的蛋白酶激活的毒素前體的抗原性和抗腫瘤效應的其它方法。
一種克服公開的變體PA毒素的潛在抗原性的方法是連續(xù)地給藥那些同樣地被PSA激活但不被氣單胞菌溶素原抗體識別的結構相關的毒素前體。這些毒素前體的例子包括但不限于膿毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium septicum)的α-毒素(Ballard等，Infect.Immun.63340-4，1995；Gordon等，J.Biol.Chem.27427274-80，1999；Genbank登記號S75954)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的δ-毒素(Genbank登記號D00117)以及人類的穿孔素(Genbank登記號NM005041)。這些毒素前體在機理上與氣單胞菌溶素相似，但具有不同的肽序列，因此特異性針對氣單胞菌溶素原的抗體不能識別它們。這些毒素前體已經(jīng)被克隆并以重組的形式被生產(Imagawa等，F(xiàn)EMS.Microbiol.Lett.17287-92，1994；Meza等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.145333-9，1996)。
這些毒素前體象氣單胞菌溶素原一樣，含有一個C-端的抑制肽，為了激活必需通過蛋白水解作用除去它。每個這些蛋白毒素中的激活位點已經(jīng)被確定。對于膿毒梭狀芽孢桿菌的α-毒素，激活位點是弗林蛋白酶切割位點(Gordon等，Infect.Immun.654130-4，1997)。蘇云金芽孢桿菌的δ-毒素的激活位點可以被某些昆蟲中腸中的蛋白酶切割(Miranda等，Insect Biochem.Mol.Biol.311155-63，2001)。對于人類的穿孔素，激活序列已經(jīng)確定，但是激活的蛋白酶還沒有被鑒定(Uellner等，EMBO J.167287-96，1997)。
每種這些毒素前體的激活位點，都可以使用實施例1中描述的方法被修飾為含有前列腺特異性蛋白酶切割位點(例如表1-2中顯示的PSA切割位點)。如果需要，天然的毒素前體結合結構域可以使用實施例6中描述的方法被功能性缺失，并用前列腺組織特異性結合結構域代替。此外，激活位點可以不被修飾，但結合結構域使用實施例6中描述的方法被功能性缺失，并用前列腺組織特異性結合結構域代替。這些修飾的毒素前體例如可以使用RBC溶血分析(實施例3)來分析蛋白酶激活，分析體外的針對產生PSA和不產生PSA的細胞系的活性(實施例2)，以及在人血清中的穩(wěn)定性(實施例3)。如果這些毒素能夠被PSA特異性地有效激活，那么就使用實施例5中描述的方法在體內測試它們針對產生PSA的異種移植物的活性。此外，使用實施例7中描述的方法確定抗體產生的動力學和程度。用每種毒素處理的動物的血清被篩選它們與毒素家族的每個其它成員之間的交叉反應性，以確定交叉識別的程度。
另一種減少全身性免疫反應的方法是施用免疫抑制療法。免疫抑制療法的例子包括但不限于全身或局部的皮質類固醇(Suga等，Ann.Thorac.Surg.731092-97，2002)、環(huán)孢菌素A(Fang等，Hum.Gene Ther.61039-44，1995)、環(huán)磷酰胺(Smith等，Gene Ther.3496-502，1996)、脫氧精胍菌素(Kaplan等，Hum.Gene Ther.81095-1104，1997)和針對T和/或B細胞的抗體[例如抗-CD4配體、抗CD4抗體、抗CD20抗體(Rituximab)](Manning等，Hum.Gene Ther.9477-85，1998)。這些試劑可以在給藥修飾的PA分子和/或與PA(野生型或變異體)保溫產生的細胞裂解物之前、期間或之后給藥。
實施例11序列變異體的生產此處公開的是通過給藥含有前列腺特異性蛋白酶切割位點的修飾的氣單胞菌溶素原肽治療前列腺癌的試劑和方法。本領域的專業(yè)技術人員可以理解使用其它的氣單胞菌溶素原、PSA、LHRH和PSMA序列(例如多態(tài)性、片段或變體)可以用于實行本發(fā)明公開的方法，只要這些序列的獨特的功能特點能夠保留。例如，氣單胞菌溶素原變體，如果它們保留了被前列腺特異性蛋白酶激活及在細胞膜上形成孔道導致細胞死亡的能力，就可用于實踐此處公開的方法。使用此處公開的分析方法，例如實施例2-5中描述的方法，可以容易地測定活性。在另一個實施方案中，修飾的氣單胞菌溶素原分子具有特異性裂解PSA產生細胞的特性(例如裂解PSA產生細胞的程度比不產生PSA的細胞高)。
本公開促進了DNA分子以及蛋白的使用，它們衍生于天然蛋白，但它們精確的核苷酸或氨基酸序列與天然的序列相比發(fā)生了改變。這樣的變異體可以通過標準的分子生物學實驗室技術獲得，序列信息在此公開。
衍生自天然DNA分子的DNA分子和核苷酸序列也可以被定義為在嚴緊條件下與公開的DNA序列或其片段雜交的DNA序列。導致特定程度的嚴緊性的雜交條件隨著雜交方法的性質和用于雜交的DNA的組成和長度而變化。一般來說，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度(特別是Na+的濃度)決定了雜交的嚴緊性。關于為獲得特定量的嚴緊性所需的雜交條件的計算被Sambrook等討論(分子克隆實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約，1989年，第9和11章)，在此引為參考。一般來說，與用[32P]-dCTP標記的靶探針的雜交在高離子強度的溶液例如6×SSC中、在比熔解溫度Tm低約5-25℃的溫度下進行。嚴緊條件的一個例子是鹽濃度為至少大約0.01到1.0M Na離子濃度(或其它鹽)、在pH7.0到8.3，對于短的探針(例如10到50個核苷酸)溫度為至少大約30℃。通過加入去穩(wěn)定試劑例如甲酰胺也可以獲得嚴緊的條件。例如，5×SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的條件適合于等位基因特異性探針雜交。
遺傳密碼的簡并性進一步擴大了本公開的范圍，因為它使得在DNA分子的核苷酸序列發(fā)生較多變異而同時還能維持被編碼蛋白的氨基酸序列。例如氨基酸丙氨酸由核苷酸三聯(lián)體密碼子GCT、GCG、GCC和GCA編碼。因此，核苷酸序列可以改變而不影響編碼蛋白的氨基酸組成或蛋白的性質?；谶z傳密碼的簡并性，可以使用上述的標準DNA突變技術或通過DNA序列的合成從cDNA分子衍生變異的DNA分子。由于遺傳密碼的簡并性而產生的序列變異，某些DNA序列在嚴緊條件下不能與公開的cDNA序列雜交，這些序列也包含在本公開中。
PA的變異體、片段、融合蛋白和多態(tài)性將保留裂解PSA產生細胞的能力，如使用此處公開的分析方法所確定的那樣(例如參見實施例2和5)。如同本領域的專業(yè)技術人員所理解的，公開的序列的變異體和片段保留了與蛋白的氨基酸序列相比至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的序列同一性，并維持了蛋白的功能活性。
實施例12蛋白的重組表達利用公共可用的cDNA和相應的氨基酸序列以及此處公開的PA變體、片段和融合蛋白，能夠使用標準的實驗室技術表達和純化任何蛋白。純化的蛋白可用于病人的治療。本領域的專業(yè)技術人員將會明白，公開的修飾的PA毒素可以在任何目的細胞或生物體中生產，并在給藥到受試者前加以純化。
生產重組蛋白的方法在本領域內眾所周知。因此，本公開的范圍包括了任何蛋白的重組表達。例如參見授權于Johnson等的美國專利號5342764、授權于Pausch等的美國專利號5846819、授權于Fleer等的美國專利號5876969和Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港出版社，紐約，1989年，第17章，在此引為參考)。
實施例13肽的修飾能夠被前列腺特異性蛋白酶如PSA激活的修飾的PA蛋白，可以使用各種化學技術進行修飾，以產生與未修飾的肽具有基本相同的活性以及任選具有其它所需性質(例如減少的抗原性)的衍生物。例如，肽的羧酸基團，不論是羧基末端還是側鏈，都可以以可藥用的陽離子的鹽的形式被提供，或被酯化形成C1-C16的酯，或被轉化為通式為NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自獨立為H或C1-C16烷基，或組合起來形成一個雜環(huán)，例如一個5-或6-員環(huán)。肽的氨基基團，不論是氨基末端還是側鏈，都可以以可藥用的酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、馬來酸、酒石酸和其它有機酸加成鹽的形式被提供，或被修飾為C1-C16烷基或雙烷基氨基或進一步轉化為酰胺。
肽側鏈的羥基可以使用普遍接受的技術被轉化為C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽側鏈的苯基和酚基環(huán)可以被一個或多個鹵素原子，例如F、Cl、Br或I取代，或被C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或這些羧酸的酰胺取代。肽側鏈的亞甲基基團可以被延長為同系的C2-C4亞烷基。巰基可以被許多普遍接受的保護基團中的任何一個，例如乙酰胺基團來保護。本領域的專業(yè)技術人員也意識到在此處公開的肽內引入環(huán)狀結構的方法，以選擇和提供對結構的構象限制，產生增強的穩(wěn)定性。例如，可以在肽的羧基末端或氨基末端加上半胱氨酸殘基，以便在氧化時，肽將含有一個二硫鍵，產生一個環(huán)狀的肽。其它的環(huán)化肽的方法包括形成硫酯和羧基和氨基末端的酰胺和酯。
為了維持有功能的肽，肽的特定變體與肽只能有少量的氨基酸不同。這樣的變體可以含有不干擾肽的所需活性的缺失(例如1-3個或更多的氨基酸的缺失)、插入(例如1-3個或更多的氨基酸的插入)或取代。取代的變體是其中氨基酸序列上的至少一個殘基被除去并在它的位點插入了一個不同的殘基。在特定的實施方案中，這樣的變體含有單個殘基的氨基酸取代，例如在一個蛋白中有1、3、5或甚至10個取代。
此處也公開了肽模擬和有機模擬的實施方案，這樣的肽和有機模擬物的化學成分的三維排列模擬了肽中的骨架和組分氨基酸側鏈的三維排列，由此產生了這樣的能夠裂解PSA產生細胞的修飾的PA毒素的肽和有機模擬物。對于計算機模擬應用，一個藥效基團是對生物學活性的結構需要的一個理想化的三維定義。肽和有機模擬物可以被設計成將每個藥效基團適合于現(xiàn)在的計算機模擬軟件(使用計算機輔助的藥物設計或CADD)。對CADD中所用的技術描述參見Walters的《藥物的計算機輔助模擬(Computer-Assisted Modeling of Drugs)》，在Klegerman和Groves 1993年主編的《藥物生物技術(PharmaceuticalBiotechnology)》第165-174頁，Interpharm出版社，Buffalo Grove，IL，和Munson 1995年主編的《藥物學原理(Principles of Pharmacology)》第102章。
實施例14
表達修飾的氣單胞菌溶素原肽的方法作為施用修飾的氣單胞菌溶素原肽治療前列腺癌的一個選擇或附加的方法，還可以通過在體內表達公開的修飾的氣單胞菌溶素原毒素來完成長期的或全身性的治療(例如治療或防止腫瘤的轉移)。
本公開提供了在細胞或組織中體內表達修飾的氣單胞菌溶素原肽的方法。在一個例子中，細胞或組織的轉染發(fā)生在體內。在這個例子中，細胞或組織(例如一個移植物)從受試者中取出，然后用一個含有編碼目的蛋白的cDNA的表達載體轉染。轉染的細胞將產生有功能的蛋白，并可以被重新導入受試者體內。在另一個例子中，一個編碼目的蛋白的核酸被直接給藥到受試者(例如靜脈內、腫瘤內或前列腺內)，然后在體內發(fā)生轉染。
此處公開的修飾的氣單胞菌溶素原肽和方法可用于治療患有前列腺腫瘤的受試者。這樣的方法將減小腫瘤的體積，并且在某些實施方案中能夠防止或治療前列腺腫瘤的轉移。
人類細胞轉染所需的科學和醫(yī)學步驟現(xiàn)在是常規(guī)的方法。氣單胞菌溶素原、結合結構域以及前列腺特異性蛋白酶蛋白和cDNA序列可以公共地得到，使得基于這些步驟的人(和其它哺乳動物)體內基因表達得到發(fā)展。此外，此處公開了特定的變體氣單胞菌溶素原分子。使用基因工程的腫瘤滲透淋巴細胞(TILs)對黑素瘤病人的免疫療法已經(jīng)被Rosenberg等報道(N.Ebgl.J.Med.323570-8，1990)。在這個研究中，使用了一個逆轉錄病毒載體將一個新霉素抗性基因導入了TILs。同樣的方法可以用來將修飾的氣單胞菌溶素原肽cDNA導入患有前列腺癌的受試者中。
將基因轉入供體細胞的通用策略在美國專利號5529774中公開，在此引為參考。一般來說，編碼具有所需療效的蛋白的基因被克隆到一個病毒表達載體中，然后將該載體導入靶生物體。病毒感染細胞，并在體內產生蛋白序列，在那里它具有了所需的療效(Zabner等，Cell75207-16，1993)。
可能只需要將DNA或蛋白元件導入某些細胞或組織中。例如，如果一個受試者只患有前列腺腫瘤，只將蛋白或DNA導入前列腺(或腫瘤)中可能就足夠了。然而，在某些情況下，治療受試者的所有細胞，或更廣泛地分散載體，例如通過血管內(i.V.)或口服給藥，可能更有療效并更簡單。例如，如果受試者患有的前列腺腫瘤已經(jīng)轉移，全身性地導入蛋白或DNA可能是必需的。
編碼至少一種治療劑例如修飾的氣單胞菌溶素原毒素的核酸，是在適當?shù)膯幼拥目刂浦??？梢允褂玫倪m當?shù)膯幼影ǖ幌抻诨虻奶烊粏幼?、逆轉錄病毒LTR啟動子或者腺病毒啟動子例如腺病毒的主要晚期啟動子；CMV啟動子；RSV啟動子；可誘導的啟動子例如MMTV啟動子；金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；組蛋白啟動子；α-肌動蛋白啟動子；TK啟動子；B19細小病毒啟動子以及ApoAI啟動子。在一個例子中，啟動子是一個前列腺特異性啟動子，例如一個probasin啟動子。但是本公開不限于特定的外源基因或啟動子。
重組核酸可以通過任何一種能夠使重組核酸到達適當?shù)募毎姆椒ńo藥到受試者。這些方法包括注射、灌輸、沉積、植入或局部給藥。注射可以是皮內的或皮下的。重組核酸可以作為病毒載體，例如avipox病毒、重組痘苗病毒、復制缺陷的腺病毒或脊髓灰質炎病毒的一部分被投送，也可以以非傳染性的形式例如裸露的DNA或脂質體包裹的DNA的形式被投送，如同在實施例15中所進一步描述的。
實施例15用于體內基因表達的病毒載體腺病毒載體基本上包含了全部的腺病毒基因組(Shenk等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1111-39，1984)。此外，腺病毒載體是一種修飾的腺病毒載體，其中至少一部分的腺病毒基因組被缺失了。在一個例子中，載體包含了腺病毒的5’ITR、腺病毒的3’ITR、腺病毒的衣殼化信號、一個編碼治療劑的DNA序列以及用于表達編碼治療劑的DNA序列的啟動子。載體至少不含腺病毒E1和E3 DNA序列的大部分，但是不是必須不含E2和E4 DNA序列的全部，以及編碼由腺病毒主要晚期啟動子轉錄的腺病毒蛋白的DNA序列。在另一個例子中，載體是一種例如在Carter等的美國專利號4797368和McLaughlin等(J.Virol.621963-73，1988)中描述的腺病毒相關的病毒(AAV)和4型AAV(Chiorini等，J.Virol.716823-33，1997)以及5型AAV(Chiorini等，J.Virol.731309-19，1999)。
這樣的載體可以按照標準的技術來構建，使用一個穿梭質粒，其從5’端開始含有腺病毒的5’ITR、腺病毒的衣殼化信號、一個Ela增強子序列、一個啟動子(其可以是一個腺病毒啟動子或一個外源啟動子)、一個三重的前導序列、一個多克隆位點(可以是此處描述的多克隆位點)、一個poly A信號以及相應于腺病毒基因組區(qū)段的一個DNA區(qū)段。該DNA區(qū)段用作與修飾的或突變的腺病毒進行同源性重組的底物，可以包含例如一個不長于腺病毒5’基因組的3329到6246位堿基的區(qū)段。質粒還可以包含一個可選擇的標記和一個復制原點。復制原點可以是細菌的復制原點。編碼治療劑的所需的DNA序列可以被插入到質粒的多克隆位點中。
可用于實現(xiàn)此處公開的方法的載體的例子包括但不限于在授權于Woo等的WO 95/27512、授權于Walsh等的WO 01/127303、授權于Couto等的美國專利號6221349和授權于High等的美國專利號6093392中公開的那些載體。
實施例16融合蛋白的產生和表達制造融合蛋白的方法對于本領域的專業(yè)技術人員來說是眾所周知的。例如授權于Bauer等的美國專利號6057133(在此引為參考)公開了生產融合分子的方法，這些融合分子的組成是人類白細胞介素-3(hIL-3)變異體或突變體蛋白在功能上連接到第二個集落刺激因子、細胞因子、淋巴因子、白細胞介素、促紅細胞生長因子或IL-3變異體上。授權于Davis等的美國專利號6072041(在此引為參考)公開了生產融合蛋白的方法，該融合蛋白含有一個與治療蛋白共價連接的導向跨細胞受體的單鏈Fv分子。
同樣的方法可以用于產生含有與其它氨基酸序列，例如前列腺特異性結合結構域(例如LHRH或抗體)連接的PA(或其變異體、片段等)的融合蛋白。接頭區(qū)域可用于將蛋白的兩個部分彼此分開并在它們之間提供撓性。接頭區(qū)域一般是一個長度在1到500個氨基酸之間的多肽，例如長度小于30個氨基酸的多肽。連接兩個分子的接頭可以被設計為(1)允許兩個分子彼此獨立地折疊和行動，(2)不具備發(fā)展出能夠干擾兩個蛋白的功能結構域的有序的二級結構的傾向，(3)具有最小的疏水或帶電荷性質，這些性質可能與功能性蛋白結構域相互作用，以及(4)為兩個區(qū)域提供空間上的分離。在撓性蛋白區(qū)域的典型的表面氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。其它的中性氨基酸，例如蘇氨酸和丙氨酸，也可用于接頭序列中。由于在接頭序列中添加了獨特的限制性內切酶位點以方便融合子的構建，其它的氨基酸也可以包含在接頭中。如果需要，其它部分也可以被包含在其中。這些部分包括結合結構域，例如親和素或表位，例如一個多聚組氨酸標記，它對融合蛋白的純化和加工是有用的。此外，可檢測的標記也可以連接到融合蛋白上，以便可以方便地監(jiān)測融合蛋白通過身體或細胞的運輸量。這樣的標記包括放射性核素、酶、熒光團等。
可以通過使用中間載體將PA(或其變異體、片段等)的核酸序列與其它蛋白(或其變異體、片段等)的核酸序列相融合。此外，一個基因可以被直接克隆在含有另一個基因的載體中。接頭和銜接子可用于連接核酸序列，以及替換丟失的序列，其中在目的區(qū)域中含有一個限制性內切酶位點。編碼一個多肽、肽接頭和另一個多肽的遺傳物質(DNA)被插入一個適當?shù)谋磉_載體中，用于轉化原核或真核細胞，例如細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。轉化的生物體被培養(yǎng)，然后通過標準技術分離蛋白，例如如果使用了多聚組氨酸標記，可以使用可檢測的標記如鎳螯合的親和層析。因此得到的產物是一個新的蛋白，即一種融合的蛋白，其含有一個修飾的PA，它被一個接頭區(qū)域連接到第二個蛋白上。為了證實融合蛋白的表達，純化的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，使用建立的方法轉移到硝酸纖維素濾膜上。使用針對單一的組分，即多聚組氨酸標記和PA的抗體通過Western印跡分析來鑒定蛋白產物。
實施例17藥物組合物和給藥方式此處所用的藥物有效的載體是常規(guī)的。在Remington的《制藥學(Pharmaceutical Seience)》，Martin，Mack出版公司，Easton，PA，第15版(1975年)中描述了適合于藥物投送的組合物和制劑。
肽的給藥在一個將修飾的PA毒素例如SEQ ID NO4、24和25給藥到受試者的實施方案中，蛋白可以使用任何在本技術領域使用的途徑進行投送。例子包括但不限于靜脈內、腫瘤內、口服、前列腺內、肌內、皮下注射、經(jīng)皮給藥等。本公開還提供了僅包括藥物有效量的修飾的PA毒素或其與可藥用的載體在一起的藥物組合物。此外，藥物組合物或治療方法可以與一種或多種其它的治療方法結合(或分開)施用。其它治療方法的例子包括但不限于抗腫瘤劑、細胞裂解物(例如那些通過與修飾的PA毒素保溫而產生的)、非裂解的細胞(例如那些已經(jīng)被輻射殺死的)、免疫抑制劑(例如Rituximab、類固醇)和/或細胞因子(例如GM-CSF)。如同那些本領域的專業(yè)技術人員所了解的那樣，公開的實施方案包括藥物，可以使用常規(guī)的可藥用的載體、佐劑和平衡離子來制備。
修飾的PA毒素可以與至少一種，例如一種或多種藥物有效的載體，例如藥物和生理上可接受的流體結合使用。藥物有效載體的例子包括但不限于水、生理鹽水、平衡的鹽溶液、葡萄糖水溶液、芝麻油、甘油、乙醇及其組合等作為載體。載體和組合物可以是無菌的，制劑適合于給藥的方式。除了生物中性的載體，施用的藥物組合物可以含有少量的無毒性的輔助物，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑以及pH緩沖劑等，例如乙酸鈉或單月桂酸山梨聚糖。
組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉劑。對于固體組合物(例如粉劑、丸劑、片劑或膠囊形式)，可以包括常規(guī)的無毒性的固體載體，例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、糖精、纖維素、碳酸鎂或硬脂酸鎂。組合物可以使用傳統(tǒng)的結合劑和載體例如甘油三酯配制成栓劑。
修飾的PA毒素例如SEQ ID NO4、24和25在治療特定的紊亂或病癥例如前列腺癌中的有效量，依賴于紊亂或病癥的性質，可以通過標準的臨床技術來確定。此外，也可以使用體外分析方法來鑒定最適的劑量范圍(參見實施例2、4和5)。在制劑中使用的準確劑量也依賴于疾病或紊亂的嚴重性，將根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷和每個受試者的情況而決定。有效劑量可以從得自體外或動物模型試驗系統(tǒng)的劑量反應曲線推斷出來。對于一個70公斤的人，修飾的PA毒素的靜脈內有效劑量的例子是大約1-10mg的修飾的PA毒素，例如大約1-5mg，例如大約1-3mg，例如大約2.8mg。對于一個70公斤的人，修飾的PA毒素的前列腺內或腫瘤內有效劑量的例子是大約10-100mg的修飾的PA毒素，例如大約10-50mg，例如大約10-30mg，例如大約28mg。
本公開還提供了一個藥物包或盒，含有一個或多個容器，其中充滿了藥物組合物的一種或多種成分。任選與這樣的容器在一起的可以是一個告示，采用控制藥物或生物制品的生產、使用或銷售的政府機構規(guī)定的形式，該告示反映了生產、使用或銷售機構對于可用于人施用的批準。還可以包括使用組合物的說明書。
核酸分子的給藥在一個使用核酸并允許核酸在細胞內表達的例子中，核酸通過細胞內投送(例如通過從核酸載體的表達或通過受體介導的機制)。在一個實施方案中，核酸編碼一個修飾的PA，例如SEQ ID NO4、24或25。
已經(jīng)知道了多種給藥核酸的投送系統(tǒng)，包括包裹在脂質體、微粒、微囊中、受體介導的胞飲作用(Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，2624429-32)，以及將治療核酸構建為逆轉錄病毒或其它載體的一部分。導入的方法包括但不限于皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內和口服途徑。化合物可以通過任何方便的途徑給藥，例如通過灌輸或團注、通過上皮或粘膜皮膚襯吸收(例如口腔粘膜、直腸、陰道和腸粘膜等)，可以與其它的生物活性劑一起給藥。給藥可以是全身性的或局部的。
脂質體與靶位點融合并胞內遞送腔內的內含物。為了發(fā)生融合，利用各種維持接觸的方法，例如分離和結合試劑，使脂質體與靶細胞保持接觸維持足夠的時間?？梢允褂媚軌蚪閷と诤系募兓牡鞍谆螂?，例如仙臺病毒或流感病毒來制備脂質體。脂可以是任何已知的能夠形成脂質體的脂，包括陽離子脂，例如磷脂酰膽堿的有用組合。其它潛在的脂包括中性脂，例如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。Kato等(J.Biol.Chem.1991，2663361)描述的步驟可用于制備脂質體。
當藥物分子是核酸時，可以通過使用一種合適能夠用于給藥的核酸表達載體來進行給藥，以便使核酸進入細胞內，例如通過使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利號4980286)，或者通過直接的注射、或通過使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)、或者通過用脂或細胞表面受體或轉染試劑包被、或者通過將其與已知能夠進入細胞核的類似同源異型框的肽連接起來給藥(參見例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，881864-8)等。此外，核酸可以被導入細胞內，通過同源重組整合在宿主細胞DNA內來表達。
載體pcDNA是將外源cDNA導入細胞、在一個強的病毒啟動子下(CMV)驅動表達的方法的一個例子。但是，其它的載體也可以使用(參見實施例15)。其它的逆轉錄病毒載體(例如pRETRO-ON，Clontech)也使用這個啟動子，但是只有當靶細胞正在分裂時(如癌細胞那樣，特別是在化療后第一次緩解期間)具有無需任何轉染幫助進入細胞、才整合到靶細胞的基因組中的優(yōu)點，并且它們是受調控的。當使用這些質粒時，也可能可以通過給藥四環(huán)素來開啟核酸的表達。
其它的質粒載體，例如pMAM-neo(Clontech)或pMSG(Pharmacia)使用MMTV-LTR啟動子(可以被類固醇調節(jié))或SV40晚期啟動子(pSVL，Pharmacia)或對金屬硫蛋白反應的啟動子(pBPV，Pharmacia)或其它病毒載體，包括逆轉錄病毒。其它病毒載體的例子包括腺病毒、AAV(腺病毒相關病毒)、重組HSV、痘病毒(牛痘)和重組的慢病毒(例如HIV)。這些載體達到了將cDNA序列和轉錄所需的的控制元件投送到靶細胞中的基本目標。本公開包括所有形式的核酸的投送，包括合成的寡聚體、裸露的DNA、質粒和病毒，它們或者被或者不被整合到基因組中。
已經(jīng)解釋并描述了新的修飾的氣單胞菌溶素原毒素，以及使用這些分子治療前列腺癌和轉移腫瘤的方法，對于本領域的專業(yè)技術人員來說，顯然可以在不偏離這些原則的情況下對本公開的安排方式和細節(jié)進行修改。鑒于我們公開的原則可以應用到許多可能的實施方案中，應該認識到解釋所用的實施方案僅僅是本公開的特定的實施例，并不對本公開的范圍構成限制。更確切地說，本公開的范圍與下述的權利要求相符合。因此，我們要求所有在這些權利要求的范圍和精神之內的事物作為我們的發(fā)明的權利。
序列表<110>維多利亞大學創(chuàng)新和發(fā)展公司(University of Victoria Innovation and Development Corporation)約翰斯霍普金斯大學(The Johns Hopkins University)<120>含有蛋白酶激活序列的氣單胞菌溶素原及其在前列腺癌治療中的使用方法(PROAEROLYSIN CONTAINING PROTEASE ACTIVATION SEQUENCES AND METHODS OF USE FORTREATMENT OF PROSTATE CANCER)<130>SCT040525-47<140>
<141>
<150>60/314,613<151>2001-08-24<160>25<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1410<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1410)<223>
<400>1gca gag ccc gtc tat cca gac cag ctt cgc ttg ttt tca ttg ggc caa48Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln1 5 10 15ggg gtc tgt ggc gac aag tat cgc ccc gtc aat cga gaa gaa gcc caa96Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln20 25 30agc gtt aaa agc aat att gtc ggc atg atg ggg caa tgg caa ata agc144Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser35 40 45
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<223>以PSA序列替換費林蛋白酶位點的氣單胞菌溶素原(Proaerolysin with a PSA sequence substituted for the furin site)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1410)<223>
<400>3gca gag ccc gtc tat cca gac cag ctt cgc ttg ttt tca ttg ggc caa48Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln1 5 10 15ggg gtc tgt ggc gac aag tat cgc ccc gtc aat cga gaa gaa gcc caa96Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln20 25 30agc gtt aaa agc aat att gtc ggc atg atg ggg caa tgg caa ata agc144Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser35 40 45ggg ctg gcc aac ggc tgg gtc att atg ggg ccg ggt tat aac ggt gaa192Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu50 55 60ata aaa cca ggg aca gcg tcc aat acc tgg tgt tat ccg acc aat cct240Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro65 70 75 80gtt acc ggt gaa ata ccg aca ctg tct gcc ctg gat att cca gat ggt288Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly85 90 95gac gaa gtc gat gtg cag tgg cga ctg gta cat gac agt gcg aat ttc336Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe100 105 110atc aaa cca acc agc tat ctg gcc cat tac ctc ggt tat gcc tgg gtg384Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val115 120 125ggc ggc aat cac agc caa tat gtc ggc gaa gac atg gat gtg acc cgt432Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg130 135 140gat ggc gac ggc tgg gtg atc cgt ggc aac aat gac ggc ggc tgt gac480Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp145 150 155 160ggc tat cgc tgt ggt gac aag acg gcc atc aag gtc agc aac ttc gcc528Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala
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Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala165 170 175Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gln Ser180 185 190Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser195 200 205Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala210 215 220Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr225 230 235 240Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser245 250 255Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser260 265 270Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg275 280 285Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr290 295 300Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly305 310 315 320Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg325 330 335Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala340 345 350Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val355 360 365Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr370 375 380Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile385 390 395 400
Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile405 410 415Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Ser Gln Phe Tyr Ser Ser Asn420 425 430Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp435 440 445Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Val Ser Leu Ser Val450 455 460Thr Pro Ala Ala Asn Gln465 470<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PSA切割位點<400>11Gln Phe Tyr Ser Ser Asn1 5<210>12<211>1410<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>以PSA序列替換費林蛋白酶位點的氣單胞菌溶素原(Proaerolysin with a PSA sequence substituted for the furin site)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1410)<223>
<400>12gca gag ccc gtc tat cca gac cag ctt cgc ttg ttt tca ttg ggc caa 48Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln1 5 10 15ggg gtc tgt ggc gac aag tat cgc ccc gtc aat cga gaa gaa gcc caa 96Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln20 25 30agc gtt aaa agc aat att gtc ggc atg atg ggg caa tgg caa ata agc144Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser35 40 45ggg ctg gcc aac ggc tgg gtc att atg ggg ccg ggt tat aac ggt gaa192Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu50 55 60ata aaa cca ggg aca gcg tcc aat acc tgg tgt tat ccg acc aat cct240Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro65 70 75 80gtt acc ggt gaa ata ccg aca ctg tct gcc ctg gat att cca gat ggt288Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly85 90 95gac gaa gtc gat gtg cag tgg cga ctg gta cat gac agt gcg aat ttc336Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe100 105 110atc aaa cca acc agc tat ctg gcc cat tac ctc ggt tat gcc tgg gtg384Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val115 120 125ggc ggc aat cac agc caa tat gtc ggc gaa gac atg gat gtg acc cgt432Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg130 135 140gat ggc gac ggc tgg gtg atc cgt ggc aac aat gac ggc ggc tgt gac480Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp145 150 155 160ggc tat cgc tgt ggt gac aag acg gcc atc aag gtc agc aac ttc gcc528Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala165 170 175
tat aac ctg gat ccc gac agc ttc aag cat ggc gat gtc acc cag tcc576Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gln Ser180 185 190gac cgc cag ctg gtc aag act gtg gtg ggc tgg gcg gtc aac gac agc624Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser195 200 205gac acc ccc caa tcc ggc tat gac gtc acc ctg cgc tac gac aca gcc672Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala210 215 220acc aac tgg tcc aag acc aac acc tat ggc ctg agc gag aag gtg acc720Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr225 230 235 240acc aag aac aag ttc aag tgg cca ctg gtg ggg gaa acc caa ctc tcc768Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser245 250 255atc gag att gct gcc aat cag tcc tgg gcg tcc cag aac ggg ggc tcg816Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser260 265 270acc acc acc tcc ctg tct cag tcc gtg cga ccg act gtg ccg gcc cgc864Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg275 280 285tcc aag atc ccg gtg aag ata gag ctc tac aag gcc gac atc tcc tat912Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr290 295 300ccc tat gag ttc aag gcc gat gtc agc tat gac ctg acc ctg agc ggc960Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly305 310 315 320ttc ctg cgc tgg ggc ggc aac gcc tgg tat acc cac ccg gac aac cgt 1008Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg325 330 335ccg aac tgg aac cac acc ttc gtc ata ggt ccg tac aag gac aag gcg 1056Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala340 345 350
agc agc att cgg tac cag tgg gac aag cgt tac atc ccg ggt gaa gtg1104Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val355 360 365aag tgg tgg gac tgg aac tgg acc ata cag cag aac ggt ctg tct acc1152Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr370 375 380atg cag aac aac ctg gcc aga gtg ctg cgc ccg gtg cgg gcg ggg atc1200Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile385 390 395 400acc ggt gat ttc agt gcc gag agc cag ttt gcc ggc aac ata gag atc1248Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile405 410 415ggt gct ccc gtg ccg ctc gcg gct gac ggt ata agt agt ttc cag agt1296Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Gly Ile Ser Ser Phe Gln Ser420 425 430agt gtg gac ggc gct ggt caa ggc ctg agg ctg gag atc ccg ctc gat1344Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp435 440 445gcg caa gag ctc tcc ggg ctt ggc ttc aac aac gtc agc ctc agc gtg1392Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Val Ser Leu Ser Val450 455 460acc cct gct gcc aat caa1410Thr Pro Ala Ala Asn Gln465470<210>13<211>470<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>以PSA序列替換費林蛋白酶位點的氣單胞菌溶素原(Proaerolysin with a PSA sequence substituted for the furin site)<400>13
Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln1 5 10 15Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln20 25 30Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser35 40 45Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu50 55 60Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro65 70 75 80Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly85 90 95Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe100 105 110Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val115 120 125Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg130 135 140Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp145 150 155 160Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala165 170 175Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gln Ser180 185 190Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser195 200 205Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala210 215 220Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr225 230 235 240
Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser245 250 255Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser260 265 270Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg275 280 285Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr290 295 300Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly305 310 315 320Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg325 330 335Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala340 345 350Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val355 360 365Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr370 375 380Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile385 390 395 400Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile405 410 415Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Gly Ile Ser Ser Phe Gln Ser420 425 430Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp435 440 445Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Val Ser Leu Ser Val450 455 460Thr Pro Ala Ala Asn Gln
465 470<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PSA切割位點<400>14Gly Ile Ser Ser Phe Gln Ser1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Lys Gly Ile Ser Ser Gln Tyr1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Ser Arg Lys Ser Gln Gln Tyr1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Ala Thr Lys Ser Lys Gln His1 5
<210>18<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Lys Gly Leu Ser Ser Gln Cys1 5<210>19<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>19Leu Gly Gly Ser Ser Gln Leu1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Glu His Ser Ser Lys Leu Gln1 5<210>21<211>4<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>21Ser Lys Leu Gln1<210>22<211>10
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>23<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>LHRH變異序列<220>
<221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>Glu是焦谷氨酸<220>
<221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>Lys為D-Lys<400>23Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>24<211>397<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>變異的氣單胞菌溶素原肽<220>
<221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸
<220>
<221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>D-Lys<400>24Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser1 5 10 15Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu20 25 30Val His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His35 40 45Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly50 55 60Glu Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly65 70 75 80Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala85 90 95Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys100 105 110His Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val115 120 125Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val130 135 140Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr145 150 155 160Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu165 170 175Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp180 185 190Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val195 200 205
Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu210 215 220Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser225 230 235 240Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp245 250 255Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile260 265 270Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys275 280 285Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile290 295 300Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu305 310 315 320Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln325 330 335Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp340 345 350Ser His Ser Ser Lys Leu Gln Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu355 360 365Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe370 375 380Asn Asn Val Ser Leu Ser Val Thr Pro Ala Ala Asn Gln385 390 395<210>25<211>397<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>變異的氣單胞菌溶素原肽<220>
<221>MISC_特征<222>(1)..(1)<223>焦谷氨酸<220>
<221>MISC_特征<222>(6)..(6)<223>D-Lys<400>25Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser1 5 10 15Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu20 25 30Val His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His35 40 45Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly50 55 60Glu Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly65 70 75 80Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala85 90 95Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys100 105 110His Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val115 120 125Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val130 135 140Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr145 150 155 160Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu
165 170 175Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp180 185 190Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val195 200 205Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu210 215 220Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser225 230 235 240Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp245 250 255Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile260 265 270Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys275 280 285Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile290 295 300Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu305 310 315 320Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln325 330 335Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp340 345 350Ser Lys Val Arg Arg Ala Arg Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu355360 365Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe370 375 380Asn Asn Val Ser Leu Ser Val Thr Pro Ala Ala Asn Gln385 390 39權利要求
1.一種含有變體氣單胞菌溶素原氨基酸序列的純化的肽，其中變體氣單胞菌溶素原氨基酸序列含有一個前列腺特異性蛋白酶切割位點和一個功能性缺失的弗林蛋白酶切割位點。
2.權利要求1的肽，其中前列腺特異性蛋白酶切割位點含有一個前列腺特異性抗原(PSA)切割位點、一個前列腺特異性膜抗原(PSMA)切割位點或一個人源的血管舒緩素2(hK2)切割位點。
3.權利要求2的肽，其中PSA切割位點含有SEQ ID NO5、8、11、14、15、16、17、18、19、20或21。
4.權利要求3的肽，其中PSA切割位點含有SEQ ID NO5。
5.權利要求1的肽，其中變體氣單胞菌溶素原氨基酸序列還含有一個功能性缺失的結合結構域。
6.權利要求5的肽，其中結合結構域通過缺失SEQ ID NO2或4的1-83位氨基酸而被功能性缺失。
7.權利要求4的肽，其中結合結構域通過插入至少一個突變而被功能性缺失，所述突變選自SEQ ID NO2或4的W45A、I47E、M57A、Y61A和K66Q。
8.權利要求5的肽，其中肽還含有一個前列腺組織特異性結合結構域。
9.權利要求8的肽，其中前列腺組織特異性結合結構域含有一個促黃體激素釋放激素(LHRH)序列。
10.權利要求9的肽，其中LHRH序列含有SEQ ID NO22或23。
11.權利要求6的肽，其中肽還含有一個與變體氣單胞菌溶素原的N-端連接的LHRH序列。
12.權利要求7的肽，其中LHRH序列連接到SEQ ID NO2或4的215或300位氨基酸上，其中215或300位氨基酸已經(jīng)被突變?yōu)榘腚装彼帷?br> 13.權利要求6的肽，其中前列腺組織特異性結合結構域含有能夠識別PSA、hK2、PSMA或LHRH的抗體。
14.權利要求13的肽，其中抗體被連接到變體氣單胞菌溶素原的N-端。
15.權利要求13的肽，其中抗體被連接到變體氣單胞菌溶素原的C-端。
16.權利要求9的肽，其中肽序列含有SEQ ID NO24或25。
17.權利要求1的肽，其中肽被固定到一個表面上。
18.權利要求17的肽，其中表面是小珠。
19.權利要求18的肽，其中小珠還含有一個前列腺特異性配體。
20.一種在受試者中治療前列腺癌的方法，包括將權利要求1的肽給藥到受試者。
21.權利要求20的方法，其中肽通過腫瘤內和/或前列腺內給藥。
22.權利要求20的方法，其中肽通過靜脈內、肌內、皮下或口服給藥。
23.一種在受試者中治療前列腺癌的方法，包括將編碼權利要求1的肽的核酸序列給藥到受試者。
24.一種在受試者中治療前列腺癌的方法，包括將受試者的前列腺癌細胞與權利要求1的肽接觸。
25.權利要求20的方法，其中受試者患有局部性前列腺腫瘤。
26.一種在受試者中全身性治療前列腺癌的方法，包括從受試者中取出前列腺癌細胞；將細胞與權利要求1的肽接觸，從而產生細胞裂解物；以及將細胞裂解物給藥到受試者。
27.權利要求26的方法，其中受試者患有轉移性前列腺腫瘤。
28.權利要求26的方法，還含有將GM-CSF給藥到受試者。
29.權利要求28的方法，還含有將輻射的前列腺癌細胞給藥到受試者。
30.權利要求20的方法，其中給藥導致前列腺腫瘤細胞體積的減小。
31.權利要求30的方法，其中前列腺癌細胞體積減小至少10％。
32.權利要求26的方法，其中給藥導致前列腺腫瘤細胞體積的減小。
33.權利要求32的方法，其中給藥還導致了轉移性前列腺腫瘤的減少。
34.權利要求32的方法，其中給藥還導致對轉移性前列腺腫瘤的治療。
35.一種含有變體氣單胞菌溶素原氨基酸序列的純化的肽，其中變體氣單胞菌溶素原氨基酸序列含有一個弗林蛋白酶切割位點，一個功能性缺失的氣單胞菌溶素原結合結構域和一個前列腺組織特異性結合結構域。
36.權利要求35的肽，其中前列腺組織特異性結合結構域含有一個PSA抗體、一個hK2抗體、一個PSMA抗體、一個LHRH抗體、一個LHRH序列、一個結合PSMA的肽序列或任何與前列腺癌細胞選擇性結合的肽序列。
37.一種含有變體膿毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium septicum)的α-毒素氨基酸序列的純化的肽，其中變體膿毒梭狀芽孢桿菌的α-毒素氨基酸序列含有一個前列腺特異性蛋白酶切割位點和一個功能性缺失的弗林蛋白酶切割位點。
38.一種含有變體蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的δ-毒素氨基酸序列的純化的肽，其中變體蘇云金芽孢桿菌的δ-毒素氨基酸序列含有一個前列腺特異性蛋白酶切割位點和一個功能性缺失的野生型激活序列。
39.一種含有變體人類穿孔素氨基酸序列的純化的肽，其中變體人類穿孔素氨基酸序列含有一個前列腺特異性蛋白酶切割位點和一個功能性缺失的野生型穿孔素激活位點。
40.一種含有變體膿毒梭狀芽孢桿菌的α-毒素氨基酸序列的純化的肽，其中變體膿毒梭狀芽孢桿菌的α-毒素氨基酸序列含有一個弗林蛋白酶切割位點、一個功能性缺失的膿毒梭狀芽孢桿菌的α-毒素結合結構域和一個前列腺組織特異性結合結構域。
41.一種含有變體蘇云金芽孢桿菌的δ-毒素氨基酸序列的純化的肽，其中變體蘇云金芽孢桿菌的δ-毒素氨基酸序列含有一個野生型激活位點、一個功能性缺失的蘇云金芽孢桿菌的δ-毒素結合結構域和一個前列腺組織特異性結合結構域。
42.一種含有變體人類穿孔素氨基酸序列的純化的肽，其中變體人類穿孔素氨基酸序列含有一個野生型激活位點、一個功能性缺失的穿孔素結合結構域和一個前列腺組織特異性結合結構域。
43.一種編碼權利要求1的肽的純化的核酸序列。
44.權利要求30的方法，其中前列腺腫瘤細胞體積減少至少50％。
全文摘要
在此公開了修飾的氣單胞菌溶素原(PA)肽。在某些實施例中，該蛋白包含一個前列腺特異性蛋白酶切割位點，以及還可以包含一個前列腺組織特異性結合結構域，它在功能上代替天然的PA結合結構域。在其它的實施例中，該蛋白包含一個費林蛋白酶切割位點以及一個前列腺組織特異性結合結構域，它在功能上代替天然的PA結合結構域。還公開了使用這些肽治療前列腺癌的方法。
文檔編號C07K14/195GK1636017SQ02816622
公開日2005年7月6日 申請日期2002年8月23日 優(yōu)先權日2001年8月24日
發(fā)明者薩穆爾·R·登米德, 約翰·T·伊薩克斯, 詹姆士·托馬斯·巴克利 申請人:維多利亞大學創(chuàng)新和發(fā)展公司, 約翰斯霍普金斯大學