專利名稱：活化或抑制類Toll受體9的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于對(duì)引起與CpG基序相互作用的類Toll受體(TLR9)上的抗原決定簇的識(shí)別。
現(xiàn)有技術(shù)有機(jī)體的免疫包括其所有用于對(duì)抗外界環(huán)境試劑(例如微生物、食物、化學(xué)品、藥物或花粉)的保護(hù)機(jī)制。在脊椎動(dòng)物中，免疫可為先天性或獲得性(適應(yīng)性)兩種。
先天性免疫由有機(jī)體出生時(shí)所帶成分授予。這些成分包括物理屏障(例如皮膚和粘膜(mucosal membranes))、內(nèi)在成分(例如發(fā)燒和咳嗽)、多種化學(xué)成分(例如干擾素、血清蛋白，如溶解酵素和聚胺)及細(xì)胞成分(如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和粒細(xì)胞)。
已顯示特定細(xì)菌的DNA(而不是脊椎動(dòng)物的DNA)可以活化有機(jī)體的先天免疫性(Tokunaga，T.等人，J.Natl.Cancer Institute72955-962(1984)；Messina，J.P.等人，J.Immunol 1471759-1764(1991))。先天免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)嚴(yán)重影響T和B淋巴細(xì)胞的適應(yīng)性免疫反應(yīng)這一事實(shí)如今也變得清楚。先天免疫細(xì)胞在確定T-細(xì)胞是否徹底反應(yīng)和誘導(dǎo)T-細(xì)胞反應(yīng)主要是Th1還是Th2反應(yīng)的抗原提呈方面具有重要作用(Aderem，A.等人，Nature406782-787(2000))。對(duì)任何抗原的免疫反應(yīng)可為Th1和Th2兩者之一，且每個(gè)都誘導(dǎo)不同的細(xì)胞激素、抗體和細(xì)胞反應(yīng)。
在研究這種對(duì)細(xì)菌DNA的先天免疫反應(yīng)中，我們已確認(rèn)識(shí)別細(xì)菌DNA為“外來(lái)”和誘發(fā)對(duì)抗它的增強(qiáng)免疫反應(yīng)可能源于DNA中未甲基化的“CG”二核苷酸序列(命名為“CpG”序列)段。未甲基化的CpG二核苷酸在所有細(xì)菌基因組以及病毒和無(wú)脊椎真核生物基因組中十分豐富(Bird，A.P.，Nuc.Acids Res.81499-1504(1980)；Burge，C，等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 891358-1362(1992))。在脊椎動(dòng)物基因組中，CpG基序僅能以低頻率發(fā)現(xiàn)，且所發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物CpG基序中約70％為甲基化Id。如果基頻是隨機(jī)的，那么如所期望的，僅約四分之一預(yù)測(cè)數(shù)目的CG序列存在于脊椎動(dòng)物中(Bird，A.P.，Trendsin Genetics 3342-347(1987))。與細(xì)菌CG相反，人類CG序列最為頻繁的是C在前或G在后。這些人類CG序列不是對(duì)免疫系統(tǒng)無(wú)效，就是甚至可能引起對(duì)免疫反應(yīng)的抑制。(Krieg，A.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9512631-12636(1998))。
細(xì)菌CpG-DNA是有效的類Th1輔助劑，觸發(fā)強(qiáng)偏Th1抗體反應(yīng)，且伴隨著抑制Th2反應(yīng)(Davis，H.L.等人，J.Immunol.160870-876(1998))。CpG-DNA也是有效的單B-細(xì)胞分裂素，其能驅(qū)動(dòng)超過(guò)95％的B-細(xì)胞進(jìn)入活化狀態(tài)(Krieg，A.M.等人，Nature 374546-549(1995))。這些先天免疫反應(yīng)可通過(guò)合成的未甲基化含CpG的寡脫氧核糖核酸(CpG-ODN)來(lái)模擬。由細(xì)菌CpG序列或CpG-ODN活化的B-細(xì)胞表現(xiàn)出表面II級(jí)的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子和伴同刺激分子B7-1及B7-2的增強(qiáng)表達(dá)(Krieg，A.M.，在Delivery Strategiesfor Antisense Oligonucleotide Therapeutics中，Ed.Akhtar，S.，CRC Press，Inc.，第177-190頁(yè)；Davis，H.L.等人，J.Immunol.160870-876(1998))。這提出了由CG二核苷酸組成的CpG“基序”可直接增強(qiáng)B-細(xì)胞抗原表達(dá)功能的這一可能性。盡管CpG基序在T-細(xì)胞上的效果還不太清楚，但是由T-細(xì)胞受體激勵(lì)的高度純化T-細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)CpG的協(xié)同增殖反應(yīng)，指示一通過(guò)其CpG可提升抗原-特效T-細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)制(Bendigs，S.等人，Eur.J.Immunol.291209-1218(1999))。
CpG-ODN強(qiáng)烈刺激NK細(xì)胞溶解酶活性和IFN-γ產(chǎn)量(Tokunaga，T等人，J.Natl.Cancer Institute 72955-962(1984)；Yamamoto S.，J.Immunol.1484072-4076(1992))?？乖磉_(dá)細(xì)胞，例如單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，通過(guò)CpG-ODN而被活化，結(jié)果產(chǎn)生Th1細(xì)胞激素(Jakob，T等人，J.Immunol.1613042-3049(1998))，以及產(chǎn)生二級(jí)MHC分子和協(xié)同刺激B7-1和B7-2分子(Stacy，K.J.等人，J.Immunol.1572116-2122(1996)；Sparwasser，T.等人，Eur.J.Immunol.282045-2054(1998))。
因此，CpG-ODN是有效的各種抗原依賴和非抗原依賴免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)劑和激勵(lì)劑，且可被用于研制對(duì)抗癌癥和傳染病的疫苗。由于CpG-ODN活化NK細(xì)胞，因此它們可有效用于增強(qiáng)抗腫瘤抗體的抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)。CpG-ODN可將T細(xì)胞反應(yīng)從Th2型反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1型反應(yīng)，這可導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的下調(diào)整(down-modulating)(Kline，J.N.等人，J.Immunol.1602555-2559(1998)；Sur，S.等人，J.Immunol.1625575-5582(1999)；Shirota，H.等人，J.Immunol.1645575-5582(2000)；Jahn-Schmid，B.等人，J.Allergy Clin.Immunol.1041015-1023(1999)；Broide，D.H.等人，J.Clin.Immunol.21175-182(2001))。
有趣的是，CpG-DNA驅(qū)動(dòng)的先天免疫反應(yīng)可通過(guò)將CpG基序變?yōu)镚C二核苷酸或通過(guò)甲基化胞核嘧啶而被消除。這種清楚的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系暗示了專用于未甲基化CpG基序的受體的存在。最近，在小鼠基因剔除研究中，已經(jīng)展示了CpG功能完全依賴于最近發(fā)現(xiàn)的類Toll受體9(TLR9)(Hemmi，H.等人，Nature 408740-745(2000))。基于活體外研究，認(rèn)為在于核內(nèi)體中將CpG-DNA內(nèi)在化之后CpG基序與TLR9相互作用(Wagner，H.，Immunity 14499-502(2001))。
TLR家族包括種系遺傳保存的膜貫通蛋白質(zhì)，其可引起先天免疫性且對(duì)于微生物識(shí)別是重要的。這些受體的細(xì)胞外區(qū)域包含多富亮氨酸重復(fù)(LRR)(multiple leucine-rich repeat)和具有與ILlR的細(xì)胞質(zhì)域相同的羧基終端富半胱氨酸域。第一個(gè)TLR，即dToll，在果蠅中發(fā)現(xiàn)，且對(duì)于真菌感染的先天免疫反應(yīng)具有重要作用(Anderson，K.V.，Curr.Opin.Immunol.1213-19(2000)；Means，T.K.，Life Sci.68241-258(2000))。隨后在其它有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)其它TLR成員。TLR2引起對(duì)肽聚糖(PGN)的免疫反應(yīng)而TLR4引起對(duì)脂多糖(LPS)的免疫反應(yīng)。人類TLR9(PDB入藏登記號(hào)AAF78037，識(shí)別序列號(hào)1)最近被克隆(Chuang，T-H等人，Eur.Cytokine Netw.11372-378(2000))。在TLR9上，未甲基化CpG的精確結(jié)合位置以前尚未被定義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括與TLR9上的肽片段(peptidic segment)結(jié)合并模擬CpG基序效應(yīng)的分子。CpG模擬劑包括但不局限于抗體、小分子化合物、肽、肽模擬及核酸。此外，本發(fā)明包括含有與TLR9上的肽片段(peptidic segment)結(jié)合并模擬CpG基序效應(yīng)的分子的組合物，其適合給予于需要治療的病人，視情況可與(例如)賦形劑、稀釋劑或載劑組合使用。
此外，本發(fā)明包括那些與TLR9的CXXC基序上的255Cys-Arg-Arg258Cys(如CRRC)或265Cys-Met-GIu268Cys(如CMEC)結(jié)合的分子。
本發(fā)明還包括使分子結(jié)合于TLR9并模擬CpG基序效應(yīng)的方法。這些方法包括產(chǎn)生對(duì)TLR9的CpG抗原決定簇的單克隆抗體。
此外，本發(fā)明包括治療由TLR-9所引起的疾病的方法，該方法包括給予CpG模擬劑，這些模擬劑包括但不局限于抗體、小分子化合物、肽、肽模擬及核酸。核酸包括寡核苷酸。這些分子可能用于治療、預(yù)防或改善如腫瘤、癌癥或病原傳染病(如由病毒、真菌、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)引起的病原傳染病)等疾病。
本發(fā)明還包括適合向患過(guò)敏性疾病的病人給予的組合物，這些組合物包括與TLR9結(jié)合并模擬CpG功能的分子，視情況可與(例如)賦形劑、稀釋劑或載劑組合使用。
本發(fā)明包括通過(guò)誘導(dǎo)Th-1型反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，其包括給予結(jié)合于TLR9并模擬CpG功能的分子。這些分子也將寄主細(xì)胞反應(yīng)由Th-2型向Th-1型轉(zhuǎn)變。因此，給予本發(fā)明的結(jié)合于TLR9的分子可能避免由Th2引起的、誘導(dǎo)免疫的過(guò)敏性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，使得該方法可運(yùn)用于免疫療法和治療哮喘中。本發(fā)明的分子可與特殊過(guò)敏源組合給予。
另外，本發(fā)明包括給予結(jié)合于TLR9并模擬CpG功能的分子，作為如小鼠或人類等哺乳動(dòng)物中的人造輔助劑。本發(fā)明包括通過(guò)給予疫苗抗原或編碼于DNA疫苗的抗原及與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬CpG基序效應(yīng)的分子或組合物來(lái)對(duì)被試者接種疫苗的方法。
本發(fā)明還包括免疫原，該免疫原包含從含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的合成肽、重組體蛋白質(zhì)、或編碼肽或重組體蛋白質(zhì)的DNA，這些物質(zhì)誘導(dǎo)了結(jié)合于TLR9的抗原決定簇、負(fù)責(zé)結(jié)合CpG(尤其在CRRC和/或CMEC)以及活化受體功能的抗體的產(chǎn)生。這些免疫原可被給予于被試者以便對(duì)癌癥或過(guò)敏反應(yīng)免疫。
本發(fā)明的另一實(shí)施例包括結(jié)合于TLR9并抑制或?qū)故荏w功能的分子。本發(fā)明包括對(duì)抗CpG效應(yīng)的分子。
本發(fā)明的另一實(shí)施例包括結(jié)合于TLR9以用于治療的抗體或其片斷的基因構(gòu)建物。在引入合適的寄主的基礎(chǔ)上，TLR9抗體基因構(gòu)建物將引導(dǎo)能夠結(jié)合于TLR9并模擬CpG功能或抑制TLR9受體功能兩者之一的抗體(或其片斷)的合成。欲表達(dá)之基因構(gòu)建物也可編碼該負(fù)責(zé)與CpG相互作用的TLR9的抗原決定簇。這些構(gòu)建物包括用于全部抗體分子的基因及其修改或衍生形式，包括類似于Fab、單鏈Fv(scFv)及F(ab’)2的免疫球蛋白片斷?；驑?gòu)建物可通過(guò)常規(guī)基因治療技術(shù)而被引入主體，這些技術(shù)包括裸露DNA、并入脂質(zhì)體的DNA、接合脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的DNA、或通過(guò)合適的質(zhì)體或重組體病毒載體。


圖1顯示了人類類Toll受體9的cDNA序列。
圖2顯示了人類類Toll受體9的蛋白質(zhì)序列。
具體實(shí)施例方式
據(jù)報(bào)道，未甲基化CpG與肽基序CXXC(兩個(gè)半胱氨酸殘基與兩個(gè)氨基酸側(cè)翼連接)結(jié)合(Voo，K.S.等人，Mol.Cell.Biol.202108-2121(2000))?；谠撔畔ⅲ覀儥z測(cè)了人類TLR9的氨基酸序列。我們鑒定了在255Cys-Arg-Arg-258Cys(如CRRC)及265Cys-Met-Glu-268Cys(如CMEC)上的兩個(gè)CXXC基序。我們現(xiàn)在提出擁有這兩種CXXC基序的肽片段(peptide segment)負(fù)責(zé)與TLR9的CpG相互作用，且因此對(duì)于由CpG引起的功能很重要。因此，本發(fā)明是關(guān)于對(duì)負(fù)責(zé)與CpG基序相互作用的TLR9上的抗原決定簇的鑒定。
本發(fā)明也包括對(duì)結(jié)合于TLR9的肽片段(peptidic segment)上并模擬CpG效應(yīng)的分子的產(chǎn)生和利用。CpG模擬劑可以是但不局限于抗體、小分子化合物、肽、肽模擬及核酸。這些新型試劑可被用于人類以治療癌癥和傳染性疾病，如那些由類似利什曼原蟲(chóng)、李司忒氏菌屬、弗朗西斯菌屬、血吸蟲(chóng)屬、埃博拉病毒、炭疽熱病毒以及瘧疾等細(xì)胞內(nèi)病菌引起的疾病。此外，這些分子可被用于治療過(guò)敏性疾病，例如但不局限于過(guò)敏性鼻炎和哮喘。這些新型試劑可被或者單獨(dú)使用，或者組合使用或當(dāng)給予人類時(shí)用作聯(lián)合劑(conjugate)。
模擬CpG功能的對(duì)抗TLR9的單克隆抗體可通過(guò)以含有從人類TLR9衍生的肽片段的合成肽或重組體蛋白質(zhì)來(lái)使如嚙齒動(dòng)物等的動(dòng)物獲得免疫而制得，其中TLR9包括如，CRRC或CMEC或兩者?；蛘?，免疫原可以是編碼從人類TLR9衍生的肽片段的DNA。本發(fā)明的抗體分子包括多克隆或單克隆的抗體、單鏈抗體，及其功能性片斷。單克隆抗體包括嵌合抗體或人源化抗體、人類抗體或DelmmunisedTM抗體。這些抗體的片斷包括Fv、Fab、F(ab’)2、保留母體抗體抗原結(jié)合功能的單鏈或雙鏈Fv片斷。該抗體可通過(guò)任何此項(xiàng)技術(shù)中已知之重組體方法制得且可被活體外或活體內(nèi)制得。單鏈抗體(“ScFv”)及其構(gòu)建物方法描述于美國(guó)專利第4,946,778號(hào)中。
產(chǎn)生抗體的技術(shù)如下單克隆抗體單克隆抗體可采用由Kohler等人首次提出(Nature，256495(1975))的雜交瘤方法制得，或可通過(guò)重組體DNA方法(美國(guó)專利第4,816,567號(hào))制得。
在雜交瘤方法中，一只小鼠或其它適當(dāng)主體動(dòng)物如上文所述被免疫以引出淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或有可能產(chǎn)生特定結(jié)合于用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體?；蛘撸馨图?xì)胞可能在活體外被免疫。然后通過(guò)使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，第59-103頁(yè)(Academic Press，1986))。
以此方式制得的雜交瘤細(xì)胞被植入合適的培養(yǎng)基(較佳含有一種或多種抑制未融合的母體骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì))并在其中生長(zhǎng)。例如，如果母體骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT載體)，這些物質(zhì)阻止缺乏HGPRT細(xì)胞的生長(zhǎng)。
較佳骨髓瘤細(xì)胞是有效融合、支持通過(guò)所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行抗體的穩(wěn)定高水平生產(chǎn)、并對(duì)于例如HAT載體等載體敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在這些骨髓瘤中，細(xì)胞系是鼠科骨髓瘤系，例如那些可獲自SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA的從MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤衍生的系以及獲自American Type CultureCollection，Rockville，Md.USA.的SP2/0或X63-Ag8-653細(xì)胞。人類骨髓瘤和鼠-人異質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞系也已為產(chǎn)生人類單克隆抗體而描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(yè)(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。也可使用鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。
雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基被化驗(yàn)以測(cè)定對(duì)抗該抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合專一性可由免疫沉淀反應(yīng)或由活體外化驗(yàn)(例如放射性免疫測(cè)定法(RIA或)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA))來(lái)決定。
在鑒別出產(chǎn)生具有需要專一性、親和性、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)限制稀釋過(guò)程而被亞克隆并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59-103頁(yè)(Academic Press，1986))生長(zhǎng)。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640載體。此外，雜交瘤細(xì)胞可在活體內(nèi)生長(zhǎng)，例如腹水腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。
通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化過(guò)程(例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法)來(lái)將通過(guò)亞克隆而分泌的單克隆抗體自培養(yǎng)基、腹水流體或血清適當(dāng)分離。
使用常規(guī)過(guò)程(Innis M.等人在PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications.中，Academic，San Diego，CA(1990)，Sanger，F(xiàn).S，等人Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))易于將編碼單克隆抗體的DNA分離并排序。雜交瘤細(xì)胞用作該DNA源。一旦被分離，DNA可能被置于表達(dá)載體，該載體接著被轉(zhuǎn)移入如E.coli細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞等宿主細(xì)胞，以便在重組體宿主細(xì)胞中得到單克隆抗體的合成。下文將詳細(xì)描述抗體的重組體生產(chǎn)。
在另一實(shí)施例中，可將抗體或抗體片斷從使用McCafferty等人在Nature 348552-554(1990)中所描述的技術(shù)所產(chǎn)生的抗體噬菌體庫(kù)中分離。Clackson等人在Nature 352624-628(1991)和Marks等人在J.Mol.Biol.222581-597(1991)中分別描述了使用噬菌體庫(kù)分離鼠科動(dòng)物和人類的抗體。后續(xù)出版物描述了通過(guò)鏈滑動(dòng)產(chǎn)生高親和性(nM范圍)人類抗體(Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及將組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建物非常大的噬菌體庫(kù)的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)為用于單克隆抗體分離的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的替代技術(shù)。
DNA也可被修改，例如，通過(guò)以人類重鏈或輕鏈常量域的編碼序列來(lái)替代相應(yīng)的鼠科動(dòng)物序列(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrison，等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通過(guò)共價(jià)連接于非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列的免疫球蛋白編碼序列。
通常，該非免疫球蛋白多肽被用來(lái)替代抗體的常量域，或者其被用來(lái)替代抗體的一抗原復(fù)合位的可變域，以產(chǎn)生一種嵌合二價(jià)抗體，該嵌合二價(jià)抗體包含一個(gè)對(duì)一種抗原具有專一性的抗原復(fù)合位和另一個(gè)對(duì)不同抗原具有專一性的抗原復(fù)合位。
另一可供選擇的方法是使用電融合而不是化學(xué)融合以形成雜交瘤。這種技術(shù)很完善。代替融合，還可使用(例如)Epstein Barr病毒或一種轉(zhuǎn)換基因，來(lái)轉(zhuǎn)換B-細(xì)胞以使其不死。(參看例如，「預(yù)定特性的持續(xù)增生人類細(xì)胞系合成抗體」(″Continuously ProliferatingHuman Cell Lines Synthesizing Antibody of PredeterminedSpecificity″)Zurawaki，V.R.等人，在「單克隆抗體」(MonoclonalAntibodies)中，Kennett R.H.等人編輯，Plenum Press，N.Y.1980，第19-33頁(yè)。)產(chǎn)生特定的抗-TLR9單克隆抗體的雜交瘤可通過(guò)使用TLR9衍生抗原的ELISA以及通過(guò)使用細(xì)胞表達(dá)人類TLR9的細(xì)胞結(jié)合化驗(yàn)來(lái)鑒定。對(duì)抗體的該專一性活性(不是競(jìng)爭(zhēng)性(agonistic)(模擬CpG)就是對(duì)抗性(抑制CpG))將通過(guò)檢驗(yàn)它們對(duì)細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響以及對(duì)在B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞的主要培養(yǎng)基中的Th1-型細(xì)胞激素之生產(chǎn)的影響來(lái)測(cè)試。功能上有趣的抗體將在動(dòng)物模型(例如那些對(duì)于敏感癥和哮喘、腫瘤、細(xì)胞內(nèi)病原疾病和疫苗)中被進(jìn)一步測(cè)試。
人源化和人類抗體人源化抗體具有從非人類源中引入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基經(jīng)常被稱作“引入”殘基，其通常來(lái)自“引入”可變域?？勺裱璚inter及合作者(Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen，等人，Science，2391534-1536(1988))的方法，通過(guò)以多種嚙齒動(dòng)物CDR或CDR序列來(lái)替代人類抗體的相應(yīng)序列，來(lái)基本上執(zhí)行人源化。相應(yīng)地，這些具有充分少于一個(gè)完整人類可變域的“人源化”抗體由來(lái)自非人類物種的相應(yīng)序列而替代。實(shí)際上，人源化抗體通常是以下人類抗體，其中一些CDR殘基以及有可能一些FR殘基被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類似位置的殘基取代。
將被用于產(chǎn)生人源化抗體的人類可變域(輕和重兩者)的選擇對(duì)于減少抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最佳適合”方法，根據(jù)已知的人類可變域序列的整個(gè)庫(kù)對(duì)嚙齒動(dòng)物抗體的可變域的序列進(jìn)行篩選(screen)。最接近嚙齒動(dòng)物序列的人類序列接著被接受以用作人源化抗體的人類構(gòu)架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一方法使用從輕鏈或重鏈的特定亞群的所有人類抗體的一致序列衍生的特定構(gòu)架。相同構(gòu)架可用于多種不同人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化以使其具有對(duì)抗原高親和力的保持力和其它良好的生物性能。為了達(dá)到這個(gè)目的，根據(jù)一較佳方法，通過(guò)使用母體和人源化序列的三維模型而進(jìn)行的對(duì)母體序列和多種概念性人源化產(chǎn)品的分析過(guò)程，來(lái)制備人源化抗體。通?？色@得三維免疫球蛋白模型且其為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟悉?？衫妹枋龊惋@示所選中的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。對(duì)這些顯示的觀察允許對(duì)殘基在該候選免疫球蛋白序列的功能化中的可能作用的分析，也就是，對(duì)影響該候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基的分析。通過(guò)這條途徑，F(xiàn)R殘基可被從受者和重要序列中選擇并組合，以便獲得需要的抗體特性(例如對(duì)目標(biāo)抗原或多個(gè)目標(biāo)抗原的增強(qiáng)的親和力)。一般而言，在對(duì)抗原結(jié)合性的影響中，直接且最主要涉及到CDR殘基。
或者，熟練的研究員可產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移動(dòng)物(例如小鼠)，該基因轉(zhuǎn)移動(dòng)物在免疫化的基礎(chǔ)上有能力于缺乏內(nèi)生免疫球蛋白生產(chǎn)時(shí)產(chǎn)生人類抗體的全部組成部分。該基因轉(zhuǎn)移小鼠可獲自Abgenix Inc.，F(xiàn)remont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey購(gòu)得。據(jù)描述，嵌合和種系(germ-line)突變小鼠抗體的重鏈結(jié)合區(qū)域(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致對(duì)內(nèi)生抗體生產(chǎn)的完全抑制。在這種種系突變小鼠中的人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致抗原激發(fā)下人類抗體的產(chǎn)生。見(jiàn)例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.733(1993)；和Duchosal等人Nature 355258(1992)。人類抗體也可從噬菌體顯示庫(kù)中衍生(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan，等人，Nature Biotech14309(1996))。
DelmmunisedTM抗體DelmmunisedTM抗體是其中潛在的T細(xì)胞抗原決定簇已被除去的抗原，如國(guó)際專利申請(qǐng)案PCT/GB98/01473所述。因此，我們希望在將這些抗體用于活體內(nèi)時(shí)將人體免疫原性(immunogenicity)去除或充分減少。
此外，例如，抗體可通過(guò)共價(jià)結(jié)合于聚合物而被化學(xué)修改以增加其循環(huán)半壽期。較佳聚合物和將其附于肽的方法描述于美國(guó)專利第4,766,106號(hào)、第4,179,337號(hào)、第4,495,285號(hào)和第4,609,546號(hào)，其全文均以引用的方式并入本文中。較佳聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下可溶于水且具有較佳的在1000至40000之間、更佳在2000至20000之間、最佳的3000至12000之間的平均分子量。
其它分子可通過(guò)常規(guī)方法將適合用于本發(fā)明的其它分子從化合物庫(kù)中分離或篩選(screen)出來(lái)。一種用于產(chǎn)生和篩選一化合物庫(kù)的自動(dòng)系統(tǒng)被描述于美國(guó)專利第5,901,069號(hào)和第5,463,564號(hào)中。一個(gè)更受關(guān)注的方法包括結(jié)合位的三維模型化，并接著制作一適合該模型的分子家族。接著對(duì)這些分子進(jìn)行篩選，以選出具有最佳結(jié)合特性的分子。
基因構(gòu)建物本發(fā)明的基因構(gòu)建物可被并入病毒基因組并隨后被封裝入合適的病毒粒子中，該病毒粒子允許通過(guò)病毒感染進(jìn)行高效基因傳遞。通常用于基因療法的例示性病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體、腺病毒載體及腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體。適合用于基因療法的新近研制的病毒載體包括緩慢病毒(基于HIV-1或HIV-2的載體)及α-病毒載體(基于Sindbis病毒和Semliki Forest病毒)?？赏ㄟ^(guò)將抄錄單元亞克隆入含有病毒封裝所必須的序列的適當(dāng)盒式載體(cassette vecto)而將基因構(gòu)建物并入逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、緩慢病毒或AAV載體的病毒基因組中。在將所得構(gòu)建物的DNA轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生病毒組份的合適的封裝細(xì)胞系中時(shí)，重組體病毒基因組可被適當(dāng)?shù)胤庋b入有活力的病毒粒子。
為將基因構(gòu)建物并入腺病毒基因組，通常需要一個(gè)額外步驟。由于腺病毒基因組長(zhǎng)度為大約36Kbp，因此通過(guò)限制核酸內(nèi)切酶消化力和結(jié)扎不便將抗體基因直接插入基因組。代替的方法是，基因被插入一盒式載體(cassette vecto)，例如pAvCvSv(Kobayashi K等人(1996)J.Biol.Chem.226852-60)。該載體具有pBR322骨干且含有腺病毒類型5(Ad5)5’逆轉(zhuǎn)終端重復(fù)(ITR)，Ad5本原的復(fù)制、Ad5殼體化信號(hào)、Ela強(qiáng)化因子、多克隆位、以及作為同源重組體片斷的來(lái)自核苷位置3328至6246的Ad5序列。接著將所得質(zhì)體連同含有大量在某些病毒區(qū)域(例如E1核E3基因)具有缺失的腺病毒基因組一起共轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞系，例如293細(xì)胞(Graham FL，等人，J.Gen.Virol.3659-72(1977))。在兩DNA之間交迭區(qū)域的同源重組體將允許藏有抗-TLR9基因的重組體病毒基因組的產(chǎn)生。該重組體基因組隨后將被封裝入293宿主細(xì)胞中的有活力的傳染性病毒粒子?？刹捎孟嗨品椒▉?lái)將基因并入α-病毒或其它具有大基因組之病毒的基因組，以產(chǎn)生重組體病毒。
這些基因構(gòu)建物可被制備為質(zhì)體，該質(zhì)體可被直接或作為裸露DNA兩種方式中的一種而傳遞至宿主細(xì)胞或組織，或作為DNA并入脂質(zhì)體、與適當(dāng)?shù)闹|(zhì)組份接合、或并入病毒載體。較佳將其注射以用于給予。基因構(gòu)建物將被期待用于引導(dǎo)結(jié)合于TLR9或其抗體片斷的分子的合成，這些分子將逐漸進(jìn)入血流以與TLR9相互作用?？赏ㄟ^(guò)肌肉內(nèi)路線、靜脈內(nèi)路線或皮下路線將重組體病毒構(gòu)建物給予于具有過(guò)敏性疾病的個(gè)體。可通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以外推法來(lái)確定劑量或在人類臨床試驗(yàn)中確定劑量。
在另一實(shí)施例中，細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以表達(dá)特定針對(duì)、結(jié)合于、或抑制TLR9受體的內(nèi)抗體(intrabody)。此處所用的“內(nèi)抗體”是一種抗體，該抗體在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)并具有活性。內(nèi)抗體通常不是分泌而是被引導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)。內(nèi)抗體通常結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)且因此將目標(biāo)俘獲于細(xì)胞內(nèi)代謝區(qū)(例如，ER)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟知內(nèi)抗體(參看如Chen等人，Hum.Gene Therap.71515-1525(1996)；MarascoImmunotech. 1119(1995)；及Maciejewski等人Nature Med.1667-673(1995))。理論上，內(nèi)抗體的高親和性和選擇性結(jié)合性質(zhì)可用于以多種機(jī)制來(lái)調(diào)整細(xì)胞的生理和新陳代謝。例如，內(nèi)抗體的結(jié)合可被用于阻塞或穩(wěn)定大分子相互作用、通過(guò)閉塞一活性位來(lái)調(diào)整酶功能、視需要可隔絕基質(zhì)或?qū)⒚刚{(diào)節(jié)至活性或非活性構(gòu)象。內(nèi)抗體也可用于從其通常細(xì)胞代謝區(qū)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，例如，通過(guò)閉塞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，或通過(guò)去往細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)ER中的保持力。在這點(diǎn)上，內(nèi)抗體與本發(fā)明結(jié)合，可有效地引發(fā)模擬CpG的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
額外的藥物賦形劑可被用于控制本發(fā)明的分子的活性持續(xù)時(shí)間。這些賦形劑可被圈閉于通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)膠狀藥物發(fā)送體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米粒子及納米膠囊)中或大乳劑中的界面聚合(羥甲基纖維素或明膠微膠囊)而制得的微膠囊中。制備脂質(zhì)體發(fā)送系統(tǒng)的方法描述于Gabizon等人，Cancer Research424734(1982)；Cafiso，Biochem Biophys Acta 649129(1981)；及Szoka，Ann Rev Biophys Eng 9467(1980)。其它藥物發(fā)送體系為此項(xiàng)技術(shù)中已知且被描述于，例如，Poznansky等人，在Drug DeliverySystems(R.L.Juliano編輯，Oxford，N.Y.1980)，第253-315頁(yè)；M.L.Poznansky，Pharm Revs 36277(1984)。
液體藥物組合物可被凍干以阻止退化并保持無(wú)菌。一般熟悉此項(xiàng)技術(shù)者了解凍干液體組合物的方法。僅在使用前，該組合物可通過(guò)無(wú)菌稀釋劑(例如林格氏溶液、蒸餾水或無(wú)菌鹽水)來(lái)復(fù)原，該無(wú)菌稀釋劑可能包括額外的成分。在復(fù)原時(shí)，可將該組合物給予于患者。
本發(fā)明的分子可通過(guò)多種路線中的任何一種被給予，且以所指示的或用于所探尋目的的治療有效的濃度而被給予。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，可使用多種此項(xiàng)技術(shù)中已知的可接受的賦形劑來(lái)調(diào)配這些抗體。通常，通過(guò)注射(靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射兩種方式中的一種)來(lái)給予這些抗體。一般熟悉此項(xiàng)技術(shù)者了解完成該給予的方法。還可能獲得可被局部或口服給予、或能經(jīng)過(guò)粘膜傳送的組合物。
給予的劑量和模式將依賴于個(gè)體和將被給予的試劑而定?？赏ㄟ^(guò)臨床試驗(yàn)中的例行試驗(yàn)或通過(guò)抗體有效的動(dòng)物模式以外推法來(lái)確定劑量。
上述描述、術(shù)語(yǔ)、表達(dá)和實(shí)例僅為例示性且并非為限制性。本發(fā)明包括所有上述實(shí)施例的已知和未知的等效實(shí)施例。本發(fā)明僅受下列權(quán)利要求限制而不受本文檔或任何其它源中的任何其它部分的任何陳述所限制。
權(quán)利要求
1.一種分子，其與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1的分子，其為抗體或其免疫功能片斷、肽、寡核苷酸、肽模擬或有機(jī)化合物。
3.一種組合物，其包括與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)的分子。
4.如權(quán)利要求3的組合物，其中所述的分子是抗體或其免疫功能片斷、肽、寡核苷酸、肽模擬或一有機(jī)化合物。
5.如權(quán)利要求1的分子，其中所述的分子結(jié)合于TLR9的Cys-Arg-Arg-Cys或Cys-Met-Glu-Cys中的至少一個(gè)。
6.一種促效藥抗-TLR9分子，其與TLR9結(jié)合并刺激TLR9。
7.如權(quán)利要求2、4或6中任一項(xiàng)的抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7的單克隆抗體，其中所述的抗體是嵌合抗體、人源化抗體、DelmmunisedTM抗體或人類抗體。
9.一種細(xì)胞系，其產(chǎn)生如權(quán)利要求2、4或6中任一項(xiàng)的抗體。
10.一種細(xì)胞系，其產(chǎn)生如權(quán)利要求9的抗體。
11.一種治療TLR-調(diào)節(jié)性疾病的方法，其包括給予有效量的與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)的分子或組合物。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中所述的分子是抗體或其免疫功能片斷、肽、寡核苷酸、肽模擬或有機(jī)化合物。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述的分子是與TLR9結(jié)合并刺激TLR9的促效藥抗-TLR9分子。
14.如權(quán)利要求12的方法，其中所述的分子是單克隆抗體。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述的單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體、DelmmunisedTM抗體或人類抗體。
16.如權(quán)利要求11的方法，其中所述的疾病是過(guò)敏性疾病。
17.如權(quán)利要求11的方法，其中所述的疾病是傳染性疾病。
18.一種增強(qiáng)對(duì)腫瘤或癌癥的治療的方法，其包括與抗-腫瘤或抗-癌癥劑結(jié)合而給予與TLR9上肽片段結(jié)合的分子或組合物，從而增強(qiáng)該抗-腫瘤或抗-癌癥劑的效果。
19.一種誘導(dǎo)Th1-型反應(yīng)的方法，其包括給予有效量的與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)的分子或組合物。
20.一種使被試者對(duì)因接觸特定過(guò)敏源而引起的過(guò)敏性反應(yīng)的脫敏的方法，其包括向該被試者給予有效量的與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)的分子或組合物。
21.一種使被試者免疫的方法，其包括向被試者給予抗原或編碼于DNA疫苗中的抗原以及與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)的分子或組合物。
22.一種免疫原，其包括合成肽、重組體蛋白質(zhì)或從含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的編碼該肽或該重組體蛋白質(zhì)的DNA，其誘導(dǎo)結(jié)合于負(fù)責(zé)結(jié)合CpG的該TLR9抗原決定簇的抗體的產(chǎn)生。
23.如權(quán)利要求22的免疫原，其中所述的分子與CRRC和/或CMEC結(jié)合。
24.一種使病人免疫的方法，其包括給予合成肽、重組體蛋白質(zhì)或從含有CRRC和/或CMEC的TLR9衍生的編碼該肽或該重組體蛋白質(zhì)的DNA，其誘導(dǎo)結(jié)合于負(fù)責(zé)結(jié)合CpG的該TLR9抗原決定簇的抗體的產(chǎn)生。
25.一種分子，其與TLR9上的肽片段結(jié)合且抑制該受體的功能。
26.一種治療TLR-調(diào)節(jié)性疾病的方法，其包括給予有效量的與TLR9上的肽片段結(jié)合且抑制該受體的功能的分子或組合物。
27.一種編碼抗體或其片斷的核酸構(gòu)建物，其與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬該CpG基序效應(yīng)。
28.一種重組體表達(dá)載體，其包括如權(quán)利要求27的核酸。
29.一種細(xì)胞，其被如權(quán)利要求27的核酸所轉(zhuǎn)化。
30.一種誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)與TLR9的肽片段結(jié)合的分子的方法，其包括給予包括如權(quán)利要求27的核酸的配方。
全文摘要
本發(fā)明包括與TLR9上的肽片段(peptidic segment)結(jié)合并模擬CpG基序效應(yīng)的分子。CpG模擬試劑包括但不局限于抗體、小分子化合物、肽、模擬肽及核酸，其包含組合物，該組合物包含與TLR9上的肽片段結(jié)合并模擬CpG基序效應(yīng)的分子，此組合物適用于給予給需要治療的病人，并可選擇性地與(例如)賦形劑、稀釋劑或載劑配合使用。此外，本發(fā)明包括與位于
文檔編號(hào)C07K16/18GK1642982SQ02818821
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2002年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者安玲玲, 吳和仁, M·S·C·馮 申請(qǐng)人:唐誠(chéng)公司