專利名稱：具有調(diào)節(jié)的選擇性的免疫細(xì)胞因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及含有細(xì)胞因子的融合蛋白和提高這些融合蛋白的治療效力的方法。更具體地，本發(fā)明涉及顯示出在病人體內(nèi)比相應(yīng)的天然發(fā)生的細(xì)胞因子具有更長循環(huán)半衰期并且具有改進(jìn)的治療性質(zhì)的細(xì)胞因子融合蛋白。本發(fā)明尤其涉及具有改進(jìn)的治療特征的IL2融合蛋白。
背景技術(shù)：
白介素-2(IL-2)是一種作用于免疫系統(tǒng)而主要產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的有效的細(xì)胞因子。在適宜的條件下，在抗原位點(diǎn)的附近局部產(chǎn)生高濃度的IL-2以便提供抗原免疫應(yīng)答產(chǎn)生所需要的共同刺激信號。由于IL-2在T細(xì)胞的生長和分化中的作用，它已經(jīng)成為治療腫瘤的免疫治療方法中的候選者。除了刺激T細(xì)胞，IL-2還顯示出刺激B細(xì)胞、NK細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。
IL-2是被批準(zhǔn)的治療轉(zhuǎn)移性腎癌和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療性藥物，但是其應(yīng)用受到嚴(yán)重的毒副作用的限制，這些毒副作用包括發(fā)燒、惡心、血管滲漏和低血壓。在施用IL-2時(shí)所觀察到的各種毒性作用中，最不希望的并且被認(rèn)為嚴(yán)重干擾IL-2治療的一種毒性作用是血管滲漏綜合癥(vascularleak syndrome，VLS)及其相關(guān)并發(fā)癥。
因此，在本領(lǐng)域中需要進(jìn)一步增強(qiáng)IL-2蛋白的治療有用性。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于IL-2融合蛋白的IL-2部分中的突變的鑒定，該突變增加IL-2融合蛋白的最大耐受劑量(相對于施用于病人時(shí)，該蛋白的最大有效劑量而言)。優(yōu)選的融合蛋白能夠通過明顯不同的相互作用結(jié)合一種以上在病人體內(nèi)的相同細(xì)胞上表達(dá)的受體種類。優(yōu)選的細(xì)胞因子融合蛋白包括能夠結(jié)合一種以上類型的細(xì)胞因子受體復(fù)合物和結(jié)合一種以上細(xì)胞類型的細(xì)胞因子。本發(fā)明還提供了鑒定具有有用性質(zhì)的特定細(xì)胞因子融合蛋白變體的方法。
本發(fā)明提供的融合蛋白含有融合到突變IL-2部分上的非IL-2部分，其中該融合蛋白顯示出比參考蛋白(包括與非突變IL-2部分融合的非IL-2部分)更強(qiáng)的選擇性，并且選擇性測量為表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞的活化相對于表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞的活化的比值。
融合蛋白的突變IL-2部分包括成熟人IL-2蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白包括IL-2部分中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包括IL-2部分中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸的缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包括該融合蛋白的IL-2部分中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾。
本發(fā)明的融合蛋白中的突變改變了融合蛋白相對于參考融合蛋白的選擇性，其中選擇性測量為表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞的活化相對于表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞的活化的比值。融合蛋白中的突變還可以導(dǎo)致對該融合蛋白的IL-2Rβγ受體親和性相對于對該融合蛋白的IL-2Rαβγ受體親和性產(chǎn)生差別效應(yīng)。優(yōu)選的突變或變更導(dǎo)致融合蛋白對表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞的活化作用相對于該融合蛋白對表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞的活化作用減少。
本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白通常顯示出大于約2倍的差別效應(yīng)。在一個(gè)方面，通過依賴IL-2生長的細(xì)胞或細(xì)胞系的增殖性應(yīng)答來測量差別效應(yīng)。這種對融合蛋白的應(yīng)答表示為ED50值，其通過繪出劑量應(yīng)答來曲線和確定導(dǎo)致半數(shù)最大應(yīng)答的蛋白濃度得到。通過本發(fā)明融合蛋白在表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞上的ED50值與在表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞上的ED50值的比值相對于參考融合蛋白的ED50值的比值，測量了該融合蛋白的差別效應(yīng)。
本發(fā)明融合蛋白的選擇性可以相對于含有融合到非突變IL-2部分上與融合蛋白中的非IL-2部分相同的非IL-2部分的參考融合蛋白來測量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上面描述針對本發(fā)明融合蛋白測量到的差別效應(yīng)在約5倍到約10倍之間。優(yōu)選地，本發(fā)明融合蛋白顯示出的差別效應(yīng)在約10倍到約1000倍之間。
在一個(gè)備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，將融合蛋白的選擇性與如下參考融合蛋白的選擇性作比較，該參考融合蛋白含有與該融合蛋白相同的非IL-2部分，該非IL-2部分在參考融合蛋白中融合到IL-2部分(包括在88位具有天冬酰胺變?yōu)榫彼岬陌被嶂脫Q(N88R)的成熟人IL-2)上。具有改進(jìn)的治療指數(shù)的本發(fā)明融合蛋白包括選擇性和N88R的選擇性接近但是為具有N88R氨基酸置換的參考融合蛋白的選擇性的約0.1％到約100％的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白的選擇性是在IL-2部分具有N88R氨基酸置換的參考融合蛋白的選擇性的約0.1％到約30％。本發(fā)明融合蛋白還包括選擇性是在IL-2部分具有N88R氨基酸置換的參考融合蛋白的選擇性的約1％到約20％的融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白的選擇性還可以是在成熟人IL-2部分中包含N88R氨基酸置換的參考融合蛋白的選擇性的約2％到約10％。
本發(fā)明融合蛋白具有比成熟人IL-2蛋白的血清半衰期更長的血清半衰期。本發(fā)明融合蛋白的長血清半衰期可以歸因于該融合蛋白的非IL-2部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白的非IL-2部分是白蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白的非IL-2部分是抗體域，包括例如KS-1/4抗體域變體、NHS76抗體域變體和14.18抗體域變體。該抗體域也可選自各種其他抗體，例如抗各種腫瘤和病毒抗原的抗體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上描述，針對本發(fā)明融合蛋白測量到的差別效應(yīng)為約5倍到約10倍。優(yōu)選地，本發(fā)明融合蛋白所顯示的差別效應(yīng)在約10倍到約1000倍之間。
有用的是突變本發(fā)明融合蛋白的IL-2部分的氨基酸以便導(dǎo)致2倍或更大的差別效應(yīng)。IL-2部分中不同的氨基酸突變可以導(dǎo)致差別效應(yīng)大于約2倍、在約5倍和約10倍之間或優(yōu)選地在約10倍和約1000倍之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸突變是用蘇氨酸置換相應(yīng)于成熟的人IL-2部分的第20位的天冬氨酸(D20T)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸突變是用精氨酸置換成熟的人IL-2蛋白的88位的天冬酰胺(N88R)。本發(fā)明融合蛋白還可以包括在一個(gè)以上的氨基酸位置的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白包括將成熟人IL-2蛋白第88位天冬酰胺變?yōu)榫彼帷?5位亮氨酸變?yōu)樘K氨酸和86位異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸的氨基酸置換。
IL-2部分中某些位置的氨基酸突變可以導(dǎo)致大于約2倍的差別效應(yīng)。有用的是突變相應(yīng)于成熟人IL-2蛋白的K8、Q13、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、H79、L80、R81、D84、N88、I92和E95位的氨基酸。其他有用的可突變氨基酸位置是成熟人IL-2蛋白的L25、N31、L40、M46、K48、K49、D109、E110、A112、T113、V115、E116、N119、R120、I122、T123、Q126、S127、S130和T131。在本發(fā)明融合蛋白中優(yōu)選的突變氨基酸位置包括D20、N88和Q126。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在上面列出的優(yōu)選位置處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸在融合蛋白中被突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用精氨酸置換88位的天冬酰胺(N88R)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用蘇氨酸置換20位的天冬氨酸(D20T)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用天冬氨酸置換126位的谷氨酰胺(Q126D)。各種氨基酸置換導(dǎo)致本發(fā)明融合蛋白在具有IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞上的活性相對于其在具有IL-2Rβγ受體的細(xì)胞上的活性有選擇性，此選擇性可以通過融合蛋白對IL-2Rβγ受體的親和性相對于融合蛋白對IL-2Rαβγ受體的親和性反映出來。
在上述一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置含有突變的融合蛋白具有大于約2倍的差別效應(yīng)。優(yōu)選地，差別效應(yīng)在約5倍到10倍之間，更優(yōu)選地，在約10倍到約1000倍之間。
除了突變IL-2部分中的氨基酸，也可以突變非IL-2部分中的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非IL-2部分是抗體域。該抗體域可以選自各種不同的免疫球蛋白(Ig)抗體，優(yōu)選IgG抗體，包括例如，IgGγ1、IgGγ2和IgGγ4的抗體域，或者這些抗體域的任何組合。如本文中所用的，術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”意指(i)一種完整抗體(例如，單克隆抗體或多克隆抗體)，(ii)完整抗體的抗原結(jié)合部分，包括例如，F(xiàn)ab片段、Fab’片段和(Fab’)2片段、Fv片段、單鏈抗體結(jié)合位點(diǎn)、sFv，(iii)雙特異性抗體和其抗原結(jié)合部分，和(iv)多特異性抗體和其抗原結(jié)合部分。在本發(fā)明蛋白中，免疫球蛋白Fc區(qū)可包括至少一個(gè)免疫球蛋白恒定重鏈區(qū)，例如免疫球蛋白恒定重鏈2(CH2)區(qū)、免疫球蛋白恒定重鏈3(CH3)區(qū)，以及依賴于用于產(chǎn)生Fc區(qū)的免疫球蛋白的類型，任選地免疫球蛋白恒定重鏈4(CH4)區(qū)，或者上面的組合。在特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白Fc區(qū)可能缺乏免疫球蛋白恒定重鏈1(CH1)區(qū)。雖然免疫球蛋白Fc區(qū)可以基于任何免疫球蛋白種類，例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，但是優(yōu)選免疫球蛋白Fc區(qū)基于IgG。本發(fā)明融合蛋白中包括的抗體部分優(yōu)選來自人，但是也可來自鼠抗體或者任何其他哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物免疫球蛋白。本發(fā)明融合蛋白中所用的Fc區(qū)可以考慮改良以適應(yīng)于該分子的特定應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)來自免疫球蛋白γ1同種型或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)來自免疫球蛋白γ2同種型或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)可來自免疫球蛋白γ3同種型或其變體。Fc區(qū)可以含有一個(gè)鉸鏈區(qū)，該鉸鏈區(qū)來自與Fc區(qū)自身不同的免疫球蛋白同種型。例如，F(xiàn)c區(qū)可以來自免疫球蛋白γ2同種型并且包括一個(gè)來自免疫球蛋白γ1同種型或其變體的鉸鏈區(qū)。在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)來自免疫球蛋白γ4同種型。尤其優(yōu)選經(jīng)修飾后含有一個(gè)來自免疫球蛋白γ1同種型或其變體的鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白γ4同種型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白在Ig部分含有突變。一個(gè)有用的突變是IgGγ1序列QYNSTYR(SEQ ID NO1)中的突變——將N變?yōu)镼；一個(gè)尤其有用的突變是γ2或γ4序列QFNST(SEQ ID NO2)中的突變——將二肽基元FN變?yōu)锳Q。
本發(fā)明還描述了編碼本發(fā)明各種融合蛋白的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明融合蛋白對于治療癌癥、病毒感染和免疫疾病尤其有用。
此處公開的這些目的和其他目的以及優(yōu)點(diǎn)和特征將在下面的說明、附圖和權(quán)利要求中進(jìn)一步彰顯。
附圖簡述

圖1描述了細(xì)胞因子與第二蛋白部分的融合，該融合改變了細(xì)胞因子的天然結(jié)合特征。圖1A描述了含有Fc的融合蛋白中IL-2的融合配偶體，其是一種二聚體分子，如抗體或Fc部分，因此當(dāng)融合蛋白的IL-2部分和其受體相互作用時(shí)兩分子的IL-2被帶到細(xì)胞表面。圖1B描述了產(chǎn)生相同效果的另一種機(jī)理。
圖2顯示了融合蛋白免疫細(xì)胞因子huKS-IL2(用三角形代表)和兩個(gè)變體——huKS-ala-IL2(用圓形代表)和huKS-ala-IL2(N88R)(用星號代表)的典型的藥物動(dòng)力學(xué)曲線。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了提高IL-2融合蛋白尤其是IL-2免疫細(xì)胞因子的治療指數(shù)的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明，治療分子的治療指數(shù)是分子的最大耐受劑量除以該分子的最大有效劑量的比值。本發(fā)明包括IL-2免疫細(xì)胞因子的改良變體，其與游離的IL-2相比顯示出明顯更長的循環(huán)半衰期。本發(fā)明還提供了顯示出選擇性IL-2應(yīng)答的IL-2融合蛋白，尤其是IL-2免疫細(xì)胞因子，選擇性IL-2應(yīng)答可以反映為本發(fā)明融合蛋白對具有各種效應(yīng)子功能的細(xì)胞的活化作用降低，這些細(xì)胞的活化是IL-2毒性作用的主要原因。而且，本發(fā)明提供了具有改良活性的IL-2融合蛋白。一種本發(fā)明IL-2融合蛋白包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置的變化，這些變化改變IL-2融合蛋白對不同IL-2受體的相對親和性，導(dǎo)致IL-2融合蛋白的生物學(xué)性質(zhì)改變。本發(fā)明可以用于減少或最小化與IL-2治療相關(guān)的毒性。不管任何給定IL-2毒性(如VLS)的根本機(jī)制如何，該毒性均部分由如下事實(shí)導(dǎo)致，即盡管希望IL-2在特定位點(diǎn)起作用，但由于IL-2為靜脈內(nèi)注射，所以IL-2可以在身體內(nèi)發(fā)揮全身性作用。IL-2的全身性施用比局部施用需要高得多的劑量，這反過來將促進(jìn)在較低劑量時(shí)看不到的毒性，因此上述事實(shí)會使問題惡化。本發(fā)明提供了減毒IL-2融合蛋白。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)減毒IL-2融合蛋白的方法。
一般地，本發(fā)明對包括融合到非IL-2部分上的IL-2部分的融合蛋白有用。根據(jù)本發(fā)明，非IL-2部分可以是合成的或天然蛋白或其一部分或變體(包括物種變體、等位變體和突變體)。優(yōu)選的非IL-2部分包括Fc和白蛋白部分。根據(jù)本發(fā)明，IL-2部分可以是天然IL-2分子或其保留了至少一種IL-2活性或功能的部分或變體(包括物種變體、等位變體和突變體)(根據(jù)本發(fā)明，IL-2部分可以是修飾后具有不同的IL-2受體結(jié)合親和性的IL-2)。
根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞通過特定細(xì)胞表面受體(IL-2R)應(yīng)答IL-2，IL-2R以兩種形式存在。高親和性受體是異源三聚體，由α、β、γ亞基組成；中等親和性受體是異源二聚體，由β和γ亞基組成。這兩種IL-2R對IL-2的結(jié)合常數(shù)相差兩個(gè)數(shù)量級。通過βγ復(fù)合物內(nèi)的相互作用在受體的胞質(zhì)側(cè)介導(dǎo)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。不同細(xì)胞類型表達(dá)不同量的α、β和γ亞基。例如，活化的T細(xì)胞表達(dá)所有三種亞基以形成高親和性IL-2Rαβγ，而成熟的靜息T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)β和γ亞基以得到中等親和性IL-2Rβγ。這樣，為達(dá)到刺激，細(xì)胞需要不同水平地暴露于IL-2，反過來，通過調(diào)節(jié)特定細(xì)胞環(huán)境中的IL-2活性，可以控制免疫應(yīng)答的性質(zhì)。
本發(fā)明的方法和組合物在IL-2融合蛋白如帶有IL-2的免疫細(xì)胞因子的情況下尤其有用。根據(jù)本發(fā)明，帶有IL-2的免疫細(xì)胞因子是已被證實(shí)可以通過直接將IL-2靶向腫瘤微環(huán)境內(nèi)而顯著提高IL-2的治療效力的合成分子。免疫細(xì)胞因子是由抗體部分和細(xì)胞因子部分如IL-2部分組成的融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，抗體部分可以是完整抗體或免疫球蛋白或其具有生物學(xué)功能如抗原特異結(jié)合親和性的部分或變體(包括物種變體、等位變體和突變體)。類似地，本發(fā)明的細(xì)胞因子部分可以是天然細(xì)胞因子或其保持至少某種細(xì)胞因子活性的部分或變體(包括物種變體、等位變體和突變體)。免疫細(xì)胞因子治療的好處是顯而易見的。例如，免疫細(xì)胞因子的抗體部分可以識別腫瘤特異性表位而將免疫細(xì)胞因子分子靶向腫瘤位點(diǎn)。因此，可以將高濃度的IL-2遞送到腫瘤微環(huán)境中，從而導(dǎo)致許多上面提到的免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化和增殖，而所用的免疫細(xì)胞因子的劑量比使用游離IL-2時(shí)所需要的劑量要低得多。而且，與游離IL-2相比，免疫細(xì)胞因子更長的循環(huán)半衰期也有助于免疫細(xì)胞因子的效力。最后，也可以利用抗體的天然效應(yīng)子功能，例如在含有FcγRIII的NK細(xì)胞中激活抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。
IL-2免疫細(xì)胞因子比游離IL-2有更大的效力。然而，IL-2免疫細(xì)胞因子的某些特征可能加重IL-2分子的潛在副作用。因?yàn)橄鄬τ谟坞xIL-2，IL-2免疫細(xì)胞因子在血流中有顯著更長的循環(huán)半衰期，IL-2或融合蛋白分子的其他部分激活通常在脈管系統(tǒng)中存在的組分的可能性亦增加。同樣的考慮也適用于含有融合到可導(dǎo)致循環(huán)中IL-2半衰期延長的另一部分如Fc或白蛋白上的IL-2的其他融合蛋白。
本發(fā)明提供了改變的IL-2融合蛋白，例如與完整抗體或抗體的一部分或者白蛋白融合的IL-2，和這些融合蛋白未改變的形式相比，此改變形式的融合蛋白的毒性減弱。本發(fā)明還提供了在IL-2和/或非IL-2部分中具有一個(gè)或多個(gè)變化的融合蛋白，這些變化改變了融合蛋白在表達(dá)α、β和γIL-2受體亞基的細(xì)胞中相對于在表達(dá)β和γIL-2受體亞基的細(xì)胞中的相對活性。本發(fā)明還提供了含有改變的IL-2的融合蛋白，與這些融合蛋白未改變的形式相比，此改變的融合蛋白顯示出對IL-2受體的α、β或γ亞基的親和性發(fā)生改變。
許多含有IL-2的抗體融合蛋白顯示出與游離IL-2相比具有量變的但是對于治療應(yīng)用卻不是質(zhì)量上最優(yōu)的IL-2活性。本發(fā)明提供了修飾形式的抗體-IL2融合蛋白，其中IL-2或抗體或兩部分都發(fā)生改變以為給定應(yīng)用從質(zhì)量上改進(jìn)IL-2活性。
本發(fā)明還提供了用于確定在設(shè)計(jì)用于治療疾病的修飾融合蛋白時(shí)尤其有用的修飾類型的策略。
圖1描述了融合蛋白可以結(jié)合至細(xì)胞表面從而改變?nèi)诤系鞍變?nèi)的部分的受體結(jié)合特征的可能機(jī)制。例如，圖1A描述了IL-2的融合配偶體是二聚體分子。這增加了另一個(gè)IL-2分子與其受體相互作用的可能性，這例如可以通過降低解離速率實(shí)現(xiàn)，從而導(dǎo)致結(jié)合的凈增加。圖1B描述了產(chǎn)生相同效果的另一個(gè)機(jī)制。在帶有IL-2受體和針對融合蛋白中的IL-2融合配偶體的受體(例如針對Ig部分的Fc部分的Fc受體)的細(xì)胞中，融合配偶體的受體(例如Fc受體)能夠結(jié)合融合蛋白并將其拴在細(xì)胞表面，在細(xì)胞表面融合蛋白結(jié)合IL-2受體的可能性增加。
最近完成了一種抗體-細(xì)胞因子融合蛋白(稱為huKS-IL2)的I/II期試驗(yàn)。huKS-IL2是由融合到細(xì)胞因子白介素2的KS-1/4抗體組成的融合蛋白。KS-1/4識別腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)從而具有將IL-2濃縮在腫瘤位點(diǎn)的效果。在該試驗(yàn)過程中，測量了病人對治療的反應(yīng)。對治療顯示出顯著反應(yīng)的一個(gè)病人經(jīng)歷了臨床部分反應(yīng)，接著是疾病的穩(wěn)定和痛苦藥物治療的減少。該病人在前的標(biāo)準(zhǔn)治療已經(jīng)失敗。該病人的生命比沒有這種治療時(shí)所預(yù)期的有顯著延長。
令人驚奇的是，作為前面的化療的結(jié)果，該病人的T細(xì)胞群基本上被消除了，該病人的T細(xì)胞數(shù)比試驗(yàn)中的所有其他病人的要低得多?？紤]到已知IL-2激活T細(xì)胞，例如，已知IL-2增強(qiáng)CD8(+)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，明顯缺少T細(xì)胞的該病人的強(qiáng)烈反應(yīng)是尤其沒想到的。該發(fā)現(xiàn)促使進(jìn)一步研究新的抗體-IL-2融合蛋白，其中IL-2部分可以顯示出改變的細(xì)胞特異性，導(dǎo)致IL-2融合蛋白的治療指數(shù)的提高。
從IL-2的晶體結(jié)構(gòu)、與相關(guān)細(xì)胞因子的序列比較和定點(diǎn)誘變研究，在闡明IL-2中與不同IL-2受體亞基接觸的氨基酸和它們對生物學(xué)活性的重要性方面取得了很大進(jìn)步。例如，D20殘基(在所有哺乳動(dòng)物的IL-2中都保守)是結(jié)合IL-2受體的β亞基的關(guān)鍵殘基，在此位置的各種置換造成明顯不同的影響。例如，變體IL-2(D20K)不能結(jié)合任何IL-2R復(fù)合體并且通常沒有活性，而變體IL-2(D20E)或IL-2(D20T)保留它們的生物學(xué)活性。氨基酸位置R38和F42對于結(jié)合α亞基是關(guān)鍵的，盡管在這些位點(diǎn)的突變減小了IL-2和高親和性受體IL-2Rαβγ的相互作用，它仍然結(jié)合中等親和性受體IL-2Rβγ，從而保留了一些生物活性。N88是另一個(gè)參與介導(dǎo)與β亞基相互作用的殘基，雖然IL-2(N88R)變體對中等親和性受體的親和力顯著降低，其對于高親和性受體的親和力基本沒變。所以IL-2的N88R突變體仍然能夠活化T細(xì)胞。
可以通過許多本領(lǐng)域中已知方法(包括例如放射免疫測定法)測定本發(fā)明融合蛋白對不同受體的結(jié)合親和性。
因此，可以通過突變與受體亞基之一接觸的特定氨基酸或者改變氨基酸殘基的組合而擾亂IL-2的結(jié)構(gòu)，使得其對一種IL-2受體復(fù)合體比對另一種IL-2受體復(fù)合體具有更大親和力。結(jié)果，該分子在一種細(xì)胞類型中比在另一種細(xì)胞類型中顯示出更大活性。根據(jù)本發(fā)明，可以操縱Ig-IL2融合蛋白中的IL-2結(jié)構(gòu)而得到期望效果。而且，在某些情況下，Ig-IL2變體融合蛋白和相應(yīng)的游離IL-2突變蛋白相比具有不同的生物學(xué)特征。
根據(jù)本發(fā)明，還可以操縱融合蛋白中的IL-2部分使得其對一個(gè)或多個(gè)IL-2受體亞基(α，β或γ)的親和力改變從而導(dǎo)致該融合蛋白的生物活性總體降低。這些變體能夠活化IL-2應(yīng)答細(xì)胞，但是需要比游離IL-2更高的濃度。所以，當(dāng)IL-2融合蛋白被濃縮在目的靶位點(diǎn)(例如通過靶定部分)時(shí)，這些變體具有改良的治療指數(shù)。
IL-2R的α受體亞基似乎具有拴系功能該低親和性受體結(jié)合IL-2并保持IL-2接近細(xì)胞表面，從而附近的細(xì)胞表面IL-2Rβ和IL-2Rγ受體亞基的有效濃度增加了。IL-2受體的α亞基和βγ亞基一起產(chǎn)生了高親和性IL-2R復(fù)合體。本發(fā)明部分是基于認(rèn)識到IL-2融合蛋白能夠與細(xì)胞表面受體發(fā)生多種不同的相互作用。例如，對于含有抗體部分的融合蛋白，抗體部分自身能夠促進(jìn)融合蛋白與細(xì)胞表面的結(jié)合，而且IL-2可以以多份拷貝存在于融合蛋白中。結(jié)果，IL-2可以被拴在只表達(dá)IL-2R的β或γ亞基的細(xì)胞上，從而IL-2活化這種細(xì)胞的能力增強(qiáng)。
例如，一種融合IL-2的二聚體免疫球蛋白(Ig)具有IL-2的兩份拷貝，從而一個(gè)IL-2部分與其受體的結(jié)合增加了第二個(gè)IL-2部分與相同細(xì)胞表面上的受體分子的相互作用的可能性。圖1A中的圖解代表了細(xì)胞表面上Ig-IL2融合蛋白的可能構(gòu)型。本發(fā)明提供了Ig-IL2融合蛋白，其中IL-2部分被改變而降低與IL-2Rβγ受體的結(jié)合。
可以改變Ig-IL2融合蛋白與某些免疫細(xì)胞表面的結(jié)合的另一個(gè)機(jī)制是細(xì)胞表面的Fc受體可以結(jié)合Ig部分的Fc部分從而將IL-2拴到具有Fc受體和IL-2受體的細(xì)胞表面(圖1B)。這些細(xì)胞包括NK細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本發(fā)明提供了Ig部分被改變而降低了與Fc受體的結(jié)合的Ig-IL2融合蛋白。本發(fā)明還提供了Ig部分和IL-2部分都整合了上述性質(zhì)的改變的Ig-IL2融合蛋白。
基于可以人工將Ig-IL2融合蛋白拴到具有IL-2受體亞基的細(xì)胞上這一知識，可以設(shè)計(jì)拴系部分發(fā)生改變的變體融合蛋白。例如，有用的是改變Ig-IL2融合蛋白的Fc受體結(jié)合特征。這可以通過例如突變Fc部分內(nèi)的已知氨基酸接觸位點(diǎn)或者通過除去N-連接的糖基化(通過突變或蛋白的酶促消化)完成。
類似地，根據(jù)本發(fā)明，有用的是在IL-2部分內(nèi)導(dǎo)入對結(jié)合IL-2受體亞基有影響的突變。尤其是，有用的是突變IL-2中與IL-2受體的β亞基接觸的氨基酸。一類尤其有用的突變是降低IL-2與IL-2Rβ的結(jié)合能，但是不空間位阻該相互作用。例如，將接觸氨基酸突變?yōu)榫哂懈?cè)鏈的氨基酸尤其有用。這種突變的效果是顯著降低IL-2對β-γ形式的IL-2受體的親和力和減少這些受體介導(dǎo)的信號途徑的活化，但是對α-β-γ形式的IL-2受體的結(jié)合或者IL-2在具有這些IL-2受體的細(xì)胞內(nèi)引起的活性產(chǎn)生相對很小的影響或沒有影響。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變減小了但沒有除去對β-γ形式的IL-2受體的親和力。
類似地，有用的是在IL-2表面的與IL-2受體的α亞基相互作用的氨基酸中導(dǎo)入突變。一種尤其有用的突變是降低IL-2與IL-2Rα的結(jié)合能，但是不空間位阻該相互作用。例如，將接觸氨基酸突變?yōu)榫哂懈?cè)鏈的氨基酸尤其有用。這種突變的效果是顯著降低IL-2對α-β-γ形式的IL-2受體的親和力，但是對β-γ形式的IL-2受體的結(jié)合影響相對很小或沒有影響。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變減小了但沒有除去對α-β-γ形式的IL-2受體的親和力。
類似地，有用的是在IL-2表面的與IL-2受體的γ亞基相互作用的氨基酸中導(dǎo)入突變。如前面的情況，一種尤其有用的突變是降低IL-2與IL-2Rγ的結(jié)合能，但是不空間位阻該相互作用。例如，將接觸氨基酸突變?yōu)榫哂懈?cè)鏈的氨基酸尤其有用。這種突變的效果是顯著降低IL-2對β-γ形式的IL-2受體的親和力，但是對α-β-γ形式的IL-2受體的結(jié)合影響相對很小或沒有影響。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變減小了但沒有除去對β-γ形式的IL-2受體的親和力。
還有用的是向IL-2上與IL-2受體亞基的不同表面相互作用的氨基酸中導(dǎo)入突變的組合。盡管每個(gè)突變單獨(dú)地對IL-2與α-β-γ形式的或β-γ形式的IL-2受體的結(jié)合影響很小或沒有影響，但是這些突變的組合可以使IL-2對其受體的親和性或IL-2的生物活性達(dá)到所需的降低效果。
根據(jù)本發(fā)明，IL-2其他部分的突變可以間接地有助于改變IL-2與β-γ形式或α-β-γ形式的IL-2受體的相互作用，從而導(dǎo)致具有調(diào)整的活性的IL-2分子。例如，突變可以輕微的改變該分子的構(gòu)象，由此改變其結(jié)合特性。
根據(jù)本發(fā)明，還有用的是產(chǎn)生在IL-2部分中含有調(diào)節(jié)IL-2部分與IL-2受體復(fù)合體的結(jié)合的突變并在抗體部分中含有突變的融合蛋白。如果想要改變Ig-IL2融合蛋白與特定Fc受體的相互作用，那么這些融合蛋白可能尤其有用。
與融合到另一個(gè)蛋白部分如Ig的IL-2部分相比，游離的IL-2部分可以顯示出對IL-2R復(fù)合體的不同的結(jié)合特征。一種可能的發(fā)生機(jī)制已經(jīng)在上面給出。另一種可能機(jī)制是免疫細(xì)胞因子中的IL-2在空間或構(gòu)象上受限并且該特定限制反映在IL-2部分與不同IL-2受體復(fù)合體的結(jié)合特征中。所以，有用的是在融合蛋白中導(dǎo)入調(diào)節(jié)該限制的改變。例如，非IL-2部分的改變可用于調(diào)節(jié)IL-2的活性。
可以在適宜的細(xì)胞或動(dòng)物模型中檢驗(yàn)在特定應(yīng)用(如人類疾病的治療)中特定IL-2融合蛋白(如Ig-IL2融合蛋白或含有Fc或白蛋白的IL-2融合蛋白)的有用性?？赡軙r(shí)優(yōu)選在動(dòng)物中檢驗(yàn)，因?yàn)榇藱z驗(yàn)與人類疾病中免疫系統(tǒng)行為的完全復(fù)雜性更接近。例如，某些細(xì)胞的特定平衡可能對抵抗目的疾病，如癌癥或細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染是最佳的。例如，相對高水平的T細(xì)胞活性可能用于抗某些腫瘤類型，而相對高水平的NK細(xì)胞活性可能用于抗不同的腫瘤類型。
本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是具有上佳的毒性譜的IL-2融合蛋白變體，如Ig-IL2融合物或含有Fc或白蛋白的IL-2融合物。例如，含有突變D20T的Ig-IL2融合蛋白在動(dòng)物如小鼠中顯示出比相應(yīng)的20位為D的Ig-IL2融合蛋白有更低的毒性。在另一個(gè)實(shí)例中，在IL-2部分含有突變N88R或L85T、I86T、N88R突變組合的Ig-IL2融合蛋白在動(dòng)物如小鼠中顯示出比相應(yīng)的在88為N的Ig-IL2融合蛋白有更低的毒性。而且，在IL-2部分含有突變D20T或突變N88R的抗體-IL2融合蛋白當(dāng)用于治療表達(dá)該抗體的抗原靶標(biāo)的腫瘤時(shí)顯示出與相應(yīng)的親本抗體-IL2融合蛋白相當(dāng)?shù)男ЯΑ?br> 相對所報(bào)道的游離IL-2蛋白中的D20T突變的性質(zhì)，Ig-IL2融合蛋白的D20T變體的性質(zhì)尤其令人驚奇。具體地，游離IL-2蛋白的D20T突變并不使該蛋白相對于野生型IL-2蛋白在對具有IL-2Rαβγ的細(xì)胞或具有IL2R-βγ的細(xì)胞的活性方面表現(xiàn)出不同(Shanafelt等，PCTWO99/60128)。然而，含有D20T突變的Ig-IL2融合蛋白活化具有IL2R-βγ的細(xì)胞的潛力急劇降低，但是活化具有IL-2Rαβγ的細(xì)胞的能力基本正常。
所以，Ig-IL2融合蛋白中IL-2部分的幾個(gè)氨基酸的突變可以導(dǎo)致毒性減弱但對該融合蛋白在各種疾病的治療中的效力相對幾乎無影響。例如，IL-2融合蛋白變體對其受體的親和力可能被改變的程度是該特定融合蛋白濃縮在其目的靶點(diǎn)的狀況的函數(shù)。尤其有用的是突變IL-2部分內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)下面的氨基酸Lys8、Gln13、Glu15、His16、Leu19、Asp20、Gln22、Met23、Asn26、Arg38、Phe42、Lys43、Thr51、His79、Leu80、Arg81、Asp84、Asn88、Val91、Ile92和Glu95。還有用的是突變IL-2部分內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)下面的氨基酸Leu25、Asn31、Leu40、Met46、Lys48、Lys49、Asp109、Glu110、Ala112、Thr113、Val115、Glu116、Asn119、Arg120、Ile122、Thr123、Gln126、Ser127、Ser130和Thr131。
本發(fā)明公開了融合到IL-2的Ig部分的形式，例如抗體-IL2融合物如huKS-IL2或dI-NHS76-IL2，其中融合到IL-2的Ig部分的改變影響該融合蛋白對IL-2R復(fù)合體的結(jié)合性質(zhì)。這些改變可以是重鏈氨基酸序列中的氨基酸置換，或者化學(xué)修飾。有用的氨基酸置換包括影響該融合蛋白糖基化或直接影響與Fc受體相互作用的置換。一種尤其有用的置換可能是抑制通常在IgG重鏈的N297(EU命名法)位置處發(fā)現(xiàn)的糖基化的置換?；瘜W(xué)和生物化學(xué)修飾包括分子的PEG化或用N-聚糖酶處理除去N-連接的糖基鏈。不希望被理論所束縛，可以設(shè)想分子的抗體部分中的特定改變可以影響IL-2的構(gòu)象，例如通過改變抗體分子的剛性。對于huKS-IL2，這些改變可以導(dǎo)致一種KS-IL2分子，其現(xiàn)在在基于細(xì)胞的生物分析中對T細(xì)胞的選擇性增加。
對于抗體-IL2融合蛋白，常有用的是選擇一種可賦予該分子其他希望的性質(zhì)的Ig部分。例如，可能優(yōu)選γ1亞類的IgG部分以保持免疫效應(yīng)子功能如ADCC。備選地，可能優(yōu)選γ2或γ4亞類的IgG部分，例如以便減少FcR受體相互作用。當(dāng)使用γ2或γ4亞類的IgG部分時(shí)，尤其優(yōu)選包含衍生自γ1的鉸鏈區(qū)。
常有用的是將Ig-IL2融合蛋白的突變和化學(xué)或生物化學(xué)修飾與具有明顯不同有用性質(zhì)的其他突變(例如，某些Fc區(qū)的C末端的賴氨酸到丙氨酸或另一疏水性殘基的突變)組合使用。例如，尤其有用的是將本發(fā)明修飾應(yīng)用于抗體融合蛋白huKS-ala-IL2或dI-NHS(76)-ala-IL2。還優(yōu)選的是向分子中導(dǎo)入能除去潛在T細(xì)胞表位的其他突變。尤其優(yōu)選的是這些突變不會實(shí)質(zhì)性地改變分子的期望性質(zhì)。
本發(fā)明還公開了融合到IL-2的Ig部分的形式，例如抗體-IL2融合物如huKS-IL2，其中IL-2氨基酸序列中的特定改變，例如IL2(D20T)或IL2(N88R)改變了融合蛋白對IL-2R復(fù)合體的結(jié)合性質(zhì)。成熟人IL-2蛋白的氨基酸序列描述于SEQ ID NO3。結(jié)合性質(zhì)的改變反映在在基于細(xì)胞的生物分析中對T細(xì)胞的選擇性增加。該特定突變影響對T細(xì)胞的選擇性程度。而且，這些改變導(dǎo)致一種當(dāng)全身性施用于小鼠時(shí)比例如huKS-ala-IL2的毒副作用小的融合分子，例如huKS-ala-IL2(D20T)或huKS-ala-IL2(N88R)。這些改變還導(dǎo)致一種在許多小鼠腫瘤模型中在腫瘤治療方面至少和正常huKS-IL2或huKS-ala-IL2一樣有效的融合蛋白，例如huKS-ala-IL2(N88R)。
因?yàn)樾枰宄[瘤的免疫應(yīng)答是多種多樣的并且隨腫瘤類型的不同而不同，所以當(dāng)使用減毒分子時(shí)完全從該分子除去某個(gè)功能是不希望的。例如，在誘導(dǎo)了結(jié)腸癌的肺部轉(zhuǎn)移的小鼠模型中，huKS-IL2通過T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制不需要NK細(xì)胞能有效治療該癌癥，而在成神經(jīng)細(xì)胞瘤小鼠模型中，已證實(shí)通過huKS-IL2消滅腫瘤需要NK細(xì)胞而不需要T細(xì)胞。因此，存在以下情況可以更適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)選擇性譜使得仍然允許NK介導(dǎo)的應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，更希望的方法是精細(xì)地改變該分子的選擇性譜使得仍然完成涉及多種受體類型的應(yīng)答(最優(yōu)選在該分子濃縮的位置)。例如，本發(fā)明提供Ig-IL2融合蛋白的改變，其中與相應(yīng)的未修飾的Ig-IL2融合蛋白相比，改變的蛋白對IL-2Rαβγ的選擇性，相對于IL-2Rβγ而言，增強(qiáng)了2-10倍、10-100倍、100-1000倍或者大于1000倍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供減毒Ig-IL2融合蛋白對于治療癌癥或感染性疾病的最適用途。雖然改變的選擇性可能導(dǎo)致血管毒性降低，但增加融合蛋白的劑量不一定最優(yōu)地增加治療指數(shù)。例如，這些劑量的增加可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制的誘導(dǎo)。所以，有用的是使用低毒Ig-IL2融合蛋白和降低這些效果的藥物的聯(lián)合治療模式。
一種最近鑒定的細(xì)胞免疫應(yīng)答的有力抑制劑是一類表達(dá)高親和IL-2R的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(綜述見Maloy和Powrie，(2001)NatureImmunol.2816)。根據(jù)本發(fā)明，低毒Ig-IL2融合蛋白的增加的劑量可以額外地活化這些細(xì)胞。這些細(xì)胞受到刺激時(shí)將上調(diào)它們的細(xì)胞表面的CTLA-4，CTLA-4接合免疫細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子B7-1和B7-2并反過來引起有效的負(fù)信號(Takahashi等，(2000)J.Exp.Med.192303)。這樣，這些過程的抑制劑可用于和本發(fā)明融合蛋白的聯(lián)合療法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用中和CTLA-4及其效果的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用具有類似活性的其它蛋白，如可溶性B7受體和它們的融合蛋白(例如B7-Ig)。其他實(shí)施方案包括殺死或抑制這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞自身的抗體如抗CD4和抗CD25抗體的使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，后者作相繼施用而不是同時(shí)施用。
根據(jù)本發(fā)明，另一個(gè)有用的機(jī)制涉及過度刺激可以導(dǎo)致前列腺素產(chǎn)生的環(huán)加氧酶2(COX-2)，已知前列腺素抑制免疫應(yīng)答(見PCT US99/08376)。所以，進(jìn)一步的實(shí)施方案組合使用低毒Ig-IL2分子與COX-2抑制劑如吲哚美辛(indomethacin)或者更特異的抑制劑塞來考昔(Celecoxib)(Pfizer)和羅非考昔(Rofecoxib)(Merck&Co)?？梢岳斫馔ㄟ^增加低毒Ig-IL2融合蛋白劑量也可以激活其他免疫機(jī)制，并且可以設(shè)計(jì)組合療法以應(yīng)對這些機(jī)制。而且，低劑量的某些細(xì)胞毒性藥物(如環(huán)磷酰胺)具有體內(nèi)免疫增強(qiáng)效果，這些藥物可能是組合治療中有用的治療劑。
已經(jīng)開發(fā)了白蛋白融合物，目的是產(chǎn)生具有延長的血清半衰期的治療性融合蛋白。例如Yeh等(Yeh P等Proc Natl Acad Sci USA. 891904-8.)構(gòu)建了一種白蛋白-CD4融合蛋白，其比單獨(dú)的相應(yīng)CD4部分有長得多的血清半衰期。
有用的是構(gòu)建白蛋白與IL-2、紅細(xì)胞生成素、α干擾素和其他配體的融合物。這些融合蛋白比單獨(dú)的相應(yīng)配體具有更長的血清半衰期。使用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳工程和蛋白表達(dá)技術(shù)可以在N-到C-末端方向構(gòu)建配體-白蛋白融合物或白蛋白-配體融合物形式的這些融合物。備選地，可以通過化學(xué)偶聯(lián)連接白蛋白和配體。
然而，白蛋白-配體融合蛋白常具有不想要的性質(zhì)。不想被理論束縛，為什么白蛋白-配體融合蛋白可能具有不想要的性質(zhì)的一個(gè)原因是事實(shí)上在血管內(nèi)皮細(xì)胞上有白蛋白受體(Tiruppathi等Proc Natl Acad Sci USA. 93250-4)。結(jié)果，配體對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響可能被增強(qiáng)。
例如，白蛋白-IL2融合蛋白具有延長的血清半衰期，但是也導(dǎo)致增強(qiáng)的血管滲漏。不想被理論束縛，注意到血管系統(tǒng)中IL-2介導(dǎo)的應(yīng)答的活化因?yàn)槿诤系鞍讓ρ芟到y(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞上存在的白蛋白受體的結(jié)合而增加。白蛋白-IL2融合蛋白對具有白蛋白受體和IL-2受體的細(xì)胞的結(jié)合增強(qiáng)，其機(jī)制和圖1b中所示的導(dǎo)致Ig-配體融合蛋白對細(xì)胞表面的結(jié)合增強(qiáng)的機(jī)制類似。
為了減少白蛋白-IL2導(dǎo)致的血管滲漏，有用的是向IL-2部分導(dǎo)入特異性降低IL-2對IL-2Rβγ受體的親和力的突變。例如，構(gòu)建白蛋白-IL2(N88R)或白蛋白-IL2(D20T)融合蛋白，隨后發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物如小鼠的疾病模型中具有減低的毒性和增強(qiáng)的治療指數(shù)。
本發(fā)明分子用于癌和腫瘤的治療，尤其是實(shí)體瘤的治療。根據(jù)本發(fā)明可以治療的腫瘤的實(shí)例是上皮來源的腫瘤，如存在但不限于，卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、膀胱、頭和頸部的癌。同樣，根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)外胚層起源的癌和腫瘤(例如，但不限于，黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、軟組織肉瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤)是合適的治療候選者。
根據(jù)本發(fā)明，有用的是使治療劑靶向到腫瘤位點(diǎn)或癌或轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)。含有抗優(yōu)選由腫瘤或癌細(xì)胞呈遞的抗原的抗體的Ig融合蛋白尤其有用。例如，含有對EpCAM(例如KS1/4)或胚纖連蛋白(例如BC1)或CEA或染色質(zhì)復(fù)合體(例如NHS76)或GD2(例如14.18)或CD19或CD20或CD52或HER2/neu/c-erbB-2或MUG-1或PSMA具有特異性的抗體部分的融合蛋白尤其有用。而且，抗各種病毒抗原的抗體也尤其有用。
實(shí)施例實(shí)施例1 在IL-2編碼序列或抗體編碼序列中具有密碼子置換的Ig-IL2融合基因的構(gòu)建在Gillies等，(1998)J.Immunol.1606195-6203中描述了一種用于免疫細(xì)胞因子的表達(dá)載體。核苷酸序列中的幾處修飾使得能夠?qū)⒕幋a序列加入到人γ-1基因的3’末端。在編碼重鏈的人γ-1基因中，通過導(dǎo)入一個(gè)沉默突變(TCC到TCA)破壞了翻譯終止密碼子上游280bp處的XmaI限制酶切位點(diǎn)。另一個(gè)沉默突變(TCT到TCC)被導(dǎo)入重鏈的C末端賴氨酸上游三個(gè)殘基的Ser密碼子處產(chǎn)生序列TCC CCG GGT AAA(SEQ ID NO.4)，該序列含有一個(gè)新的XmaI位點(diǎn)[Lo等，(1998)Protein Engineering 11495-500]。
通過化學(xué)合成了IL-2 cDNA，其含有一個(gè)新的且單一的PvuII限制性酶切位點(diǎn)[Gillies等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428-1432]。Xmal和PuvII在該表達(dá)載體中都是單一的，它們方便了包括以下的抗體IL-2變體的構(gòu)建。
1)huKS-ala-IL2。先前已經(jīng)描述了huKS-ala-IL2的構(gòu)建(例如WO01/58957)。所得蛋白在Ig重鏈恒定區(qū)和成熟huIL-2的連接處有一個(gè)氨基酸置換。該連接通常具有序列SPGK-APT(SEQ ID NO5)，其中-SPGK-是重鏈的C-末端，-APT-是成熟IL-2蛋白的N-末端。在huKS-ala-IL2中導(dǎo)入了一個(gè)K到A的置換(稱作位置K[-1])并且該連接現(xiàn)具有序列SPGA-APT(SEQ ID NO6)。結(jié)果該蛋白的血清半衰期提高了(見
2)dI-KS-ala-IL2。該KS-IL2融合蛋白在KS-ala-IL2中含有置換以致產(chǎn)生潛在T-細(xì)胞表位被除去的融合蛋白形式(在共同待審的專利申請U.S.S.N.10/112,582和10/138,727中描述，此處引用它們的完整公開作為參考)。
本發(fā)明融合蛋白的Ig部分的恒定區(qū)可以選自正常與可變區(qū)結(jié)合的恒定區(qū)或者不同的恒定區(qū)，后者導(dǎo)致融合蛋白的Ig部分包含來自不同亞類的Ig分子或不同種類的可變區(qū)和恒定區(qū)。例如，可以使用IgG的γ4恒定區(qū)(SEQ ID NO7)代替γ1恒定區(qū)(SEQ ID NO8)。該改變具有γ4鏈能導(dǎo)致更長血清半衰期的優(yōu)點(diǎn)。因此，也可以用IgGγ2恒定區(qū)(SEQ ID NO9)代替IgGγ1恒定區(qū)(SEQ ID NO8)。而且，衍生自IgGγ1的鉸鏈區(qū)(SEQID NO10)可以代替通常在IgGγ2(SEQ ID NO11)或IgGγ4恒定區(qū)(SEQID NO12)中發(fā)生的鉸鏈區(qū)。融合蛋白的Ig組分也可以在恒定區(qū)中包含使得IgG對FcγRI、FcγRII或FcγRIII中的至少一個(gè)的結(jié)合親和力降低的突變。本發(fā)明融合蛋白可以在IgG恒定區(qū)中包括除去潛在糖基化位點(diǎn)和T細(xì)胞表位的突變。例如，各種恒定區(qū)可在恒定區(qū)的C末端部分包括除去潛在T細(xì)胞表位的改變。例如，通過將IgGγ1和IgGγ2恒定區(qū)中的氨基酸序列KSLSLSPGK(SEQ ID NO13)和IgGγ4恒定區(qū)中的氨基酸序列KSLSLSLGK(SEQ ID NO14)改變成氨基酸序列KSATATPGA(SEQ IDNO15)，除去IgG分子的各種恒定區(qū)的C末端部分中的潛在T細(xì)胞表位。
3)huKS-ala-IL2(N88R)。該huKS-IL2變體在上述Ig重鏈恒定區(qū)和成熟huIL-2之間的連接處含有相同的氨基酸置換(K[-1]A，通過密碼子AAA變成GCC產(chǎn)生)，而且該變體在成熟huIL-2序列的N88處置換成R(通過將密碼子aAT改變成aGG產(chǎn)生)。通過向huIL-2的核苷酸序列中導(dǎo)入另一改變——沉默突變(氨基酸位置G98，密碼子從ggAtcc變成ggCtcc)，除去已有的BamHI限制性酶切位點(diǎn)。
在huKS-ala-IL2(N88R)的構(gòu)建中使用基于PCR的誘變策略。使用Bluescript載體(Stratagene)中的huIL2作為模板產(chǎn)生了橫跨成熟huIL2的編碼序列的兩個(gè)重疊的PCR片段。通過將這些突變分別整合到有義引物和反義引物中使得上游PCR片段含有編碼K[-1]A和N88R的核苷酸變化。這些變化通過引物序列中的黑體核苷酸表示。有義引物序列是5’CCCCGGGTGCCGCCCCAACTTCAAGTTCTACA3’(SEQ ID NO16)；反義引物序列是5’AGCCCTTTAGTTCCAGAACTATTACGTTGATCCTGCTGATTAAGTCCCTAGGT3’.(SEQ ID NO17)。帶下劃線的核苷酸指示破壞BamHI位點(diǎn)的變化。第二，下游PCR片段含有與上游PCR片段重疊的20個(gè)核苷酸和剩余IL2序列。該反應(yīng)中所用有義引物是5’AGTTCTGGAACTAAAGGGCTCCGAAACAACATTCATGTGT(SEQ ID NO18)。帶下劃線的核苷酸表示破壞BamHI位點(diǎn)的沉默突變。所用反義引物是與pBluescript載體序列退火的標(biāo)準(zhǔn)M13反向引物。這些重疊PCR片段和引物SEQ ID 16和M13反向引物用于反應(yīng)中以產(chǎn)生PCR終產(chǎn)物，其隨后插入到TA載體(Invitrogen)。
校驗(yàn)插入片段的序列，用含有修飾的IL2序列的442bp XmaI/XhoI片段(來自質(zhì)粒TA-IL2(N88R))置換親本免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒(編碼huKS-IL2)中的野生型huIL-2序列。通過限制性圖譜和測序校驗(yàn)所得編碼huKS-ala-IL2(N88R)的免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒。
4)huKS M1-IL2(TTSR(SEQ ID NO19))。通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建免疫細(xì)胞因子變體huKS M1-IL2(在例如共同待審的專利申請U.S.S.N.10/112,582中描述，此處引入其完整公開作為參考)。它在融合蛋白的抗體-IL2連接區(qū)中含有多個(gè)氨基酸置換，這些置換除去了潛在的T細(xì)胞表位而導(dǎo)致免疫原性降低的蛋白。該序列從KSLSLSPGA-APT(SEQ ID NO20)變?yōu)镵SATATPGA-APT(SEQ ID NO21)(短劃線表示Ig/IL-2連接位點(diǎn)，下劃線為置換的氨基酸)并且用“M1”表示。整合到該變體中的還有連接處前的最后一個(gè)氨基酸由K到A的改變，該變化已被證實(shí)增加免疫細(xì)胞因子的血清半衰期。
HuKS M1-IL2(TTSR)在免疫細(xì)胞因子的IL-2部分還含有其它氨基酸置換。為了除去通過上述N88R置換產(chǎn)生的潛在T細(xì)胞表位，天然huIL-2的序列從-DLISNI-(SEQ ID NO22)改變?yōu)?DTTSRI-(SEQ ID NO23)。
通過將突變整合到有義引物中，使用基于PCR的誘變方法向huIL-2基因的核苷酸序列中導(dǎo)入這些變化。分別通過密碼子變化ACC、ACC和AGG產(chǎn)生序列TTxR。用序列為5’ACTTAAGACCTAGGGACACCACCAGCAGGATCAACGTAATAGT3’(SEQ ID NO24)的有義引物和序列為5’ATCATGTCTGGATCCCTC3’(SEQ ID NO25)的反義引物從編碼huKS-ala-IL2(N88R)的模板免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生包含huIL-2序列的3’末端的誘變的197bp PCR片段。將PCR片段克隆到TA載體并校驗(yàn)序列。為了再生完整IL-2序列，將該片段作為Af1II/XhoI限制性消化物連接到從編碼huKS-ala-IL2(N88R)的免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒得到的2kb HindIII/Af1II片段上并插入到HindIII/XhoI限制性切割的pBluescript載體中。在三向連接中，誘變的IL-2基因交換代替編碼KS M1-IL2的免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒中的天然huIL-2序列。
5)huKS(N到Q)-IL2。用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建編碼huKS(N到Q)-IL2的免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒。huKS(N到Q)-IL2在抗體Fcγ1恒定區(qū)的CH2域含有一個(gè)除去N-連接的糖基化的氨基酸置換。氨基酸序列從QYNSTYR(SEQ ID NO1)改變?yōu)镼YQSTYR(SEQ ID NO26)，被置換的氨基酸用粗體顯示。類似地，構(gòu)建包含γ2和γ4恒定區(qū)的融合蛋白，其含有氨基酸序列從QFNST(SEQ ID NO2)變化到QAQST(SEQ ID NO27)而額外地除去潛在T細(xì)胞表位的突變。
實(shí)施例2導(dǎo)致修飾的受體特異性的Ig-IL2融合蛋白的化學(xué)或酶學(xué)修飾該實(shí)施例描述用于產(chǎn)生PEG化huKS-IL2或去糖基化huKS-IL2及其變體的免疫細(xì)胞因子的生物化學(xué)操作。同樣的方法可以應(yīng)用于其他IL-2融合蛋白，如免疫細(xì)胞因子14.18-IL2或白蛋白-細(xì)胞因子融合物。這些變體在隨后的實(shí)施例中用于研究在基于細(xì)胞的生物分析中它們對各種細(xì)胞系的增殖應(yīng)答(表1)或者該分子的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。
HuKS-IL2的PEG化。PEG(20,000)通過蛋白上的胺基團(tuán)共價(jià)連接到該蛋白。為此目的，使用了一種含有琥珀酰亞胺連接子的PEG反應(yīng)性衍生物(mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯，下面叫做“SPA-PEG”)。將huKS-IL2在由50mM磷酸鈉(pH7.5)、0.05％Tween 80組成的無胺緩沖液中充分透析后濃縮。以摩爾比5∶1或10∶1將過量SPA-PEG與huKS-IL2混合。臨使用前用去離子水制備5mM SPA-PEG儲存液。將合適體積的SPA-PEG溶液與huKS-IL2混合并且將反應(yīng)物于室溫下在搖動(dòng)平臺上孵育30到40分鐘。在加入5到10摩爾過量甘氨酸結(jié)束反應(yīng)后，通過大小排阻層析純化反應(yīng)產(chǎn)物。將反應(yīng)物樣品加到在50mM HEPES和150mM NaCl中平衡的Superdex 200柱上，合并并濃縮含有PEG化蛋白的洗脫部分。
HuKS-IL2的N-聚糖酶處理。在37℃用30mU PNGaseF(NewEngland Biolabs)孵育huKS-IL2(1.5mg)過夜。通過使反應(yīng)產(chǎn)物通過蛋白A-Sepharose柱并在pH3洗脫結(jié)合的huKS-IL2來純化反應(yīng)產(chǎn)物。中和洗脫物并將其在PBS和0.05％Tween 80的緩沖液中于離心柱中濃縮。通過大小排阻層析和尿素凝膠校驗(yàn)huKS-IL2的去糖基化。
實(shí)施例3Ig-IL2和Ig-IL2變體的表達(dá)和純化此處描述的針對huKS-ala-IL2(N88R)的一般性方法可用于多種多樣的Ig-細(xì)胞因子融合蛋白，包括突變細(xì)胞因子的Ig-融合物。為了得到表達(dá)huKS-ala-IL2(N88R)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，通過電穿孔將編碼huKS-ala-IL2(N88R)的免疫細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒的DNA導(dǎo)入小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。NS/0細(xì)胞生長于補(bǔ)加10％熱失活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中。用PBS將約5×106個(gè)細(xì)胞洗滌一次并重新懸浮于0.5ml PBS。在冰上于Gene PulserCuvette(0.4cm電極距，BioRad)中將10μg線性化質(zhì)粒DNA與細(xì)胞孵育10分鐘。用Gene Pulser(BioRad，Hercules，CA)(0.25V和500μF)進(jìn)行電穿孔。將細(xì)胞在冰上恢復(fù)10分鐘，之后將它們重新懸浮于生長培養(yǎng)基中并涂于兩個(gè)96孔板上。通過在100nM氨甲蝶呤(MTX)(轉(zhuǎn)染后兩天加入生長培養(yǎng)基)存在下生長選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。每3天喂養(yǎng)細(xì)胞2到3次以上，在2到3周內(nèi)出現(xiàn)MTX抗性克隆。通過抗Fc ELISA分析克隆的上清液以鑒定高產(chǎn)克隆。分離并在含有100nM MTX的生長培養(yǎng)基中增殖高產(chǎn)克隆。
通過蛋白A親和柱層析從組織培養(yǎng)上清液純化免疫細(xì)胞因子。對于huKS-ala-IL2(N88R)，將重組蛋白A(rPA)Agarose柱用10體積層析緩沖液(running buffer)(如100mM精氨酸，5mM檸檬酸，0.01％Tween 80pH5.6)預(yù)平衡，向柱子加入含有huSK-ala-IL2(N88R)的過濾過的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，流速16ml/min，每毫升rPA樹脂結(jié)合約40mghuSK-ala-IL2(N88R)。用同樣的緩沖液充分洗滌柱子，最后用50mM甘氨酸(pH3)洗脫免疫細(xì)胞因子。收集峰級分并用1N NaOH調(diào)節(jié)pH到中性。
實(shí)施例4 生物分析中Ig-IL2變體的活性對于基于細(xì)胞的生物分析，利用依賴于IL-2生長的細(xì)胞系，通過這些細(xì)胞的增殖評價(jià)Ig融合蛋白(例如huKS-IL2和huKS-IL2變體)的活性。例如，CTLL-2(ATCC#TIB-214；Matesanz和Alcina，1996)和TF-1β(Farner等， Blood 864568-4578)被分別用于跟蹤T細(xì)胞應(yīng)答和NK細(xì)胞樣應(yīng)答。CTLL-2是一種表達(dá)高親和性IL-2Rαβγ的鼠T淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系，TF-1β是來自表達(dá)中等親和性IL-2Rβγ的未成熟前體類紅細(xì)胞的人細(xì)胞系。對這些分析有用的另一個(gè)細(xì)胞系是例如，來自人成年T細(xì)胞淋巴瘤Kit-225(K6)的細(xì)胞系(Uchida等， Blood 701069-1072)。當(dāng)與細(xì)胞系TF-1β配對時(shí)，在含有相同哺乳動(dòng)物物種的受體的一對細(xì)胞系中估計(jì)融合蛋白的活性。也可以用來自人PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)的細(xì)胞群——以分離NK細(xì)胞(含有IL-2Rβγ)或產(chǎn)生活化的T細(xì)胞(表達(dá)IL-2Rαβγ)——進(jìn)行這些分析。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已經(jīng)知道從人PBMC中分離這些細(xì)胞群體的技術(shù)。例如，通過在10mg/ml植物凝集素(PHA-P；L9017，Sigma，St.Louis)中孵育PBMC 3天得到T細(xì)胞或PHA-blast。通常通過負(fù)選擇實(shí)驗(yàn)方案，例如將NK-細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)用于人細(xì)胞得到靜息NK細(xì)胞。為了使這些融合蛋白的活性與從小鼠腫瘤模型得到的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，有用的是在從表達(dá)一種或另一種IL-2受體復(fù)合體的小鼠得到的細(xì)胞群體上進(jìn)行這些分析。例如，可以用SPINSEPTM鼠NK細(xì)胞富集試劑盒(Stemcell Technologies Inc，Vancouver，BC，Canada)從重組缺陷(SCID)Balb/C小鼠的脾臟得到NK細(xì)胞群體?？赏ㄟ^FACS分析評價(jià)這些富集的群體之任一的純度。
簡單地說，將洗滌后的細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板上并在補(bǔ)加例如，純化的huKS-IL2或huKS-IL2變體的細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育。而且，將從R&D Systems(Minneapolis，MN)得到的野生型huIL-2蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)分析。將所加蛋白制備成在0.45ng/ml到420ng/ml(按IL-2的摩爾當(dāng)量標(biāo)準(zhǔn)化)之間跨大約1000倍的濃度范圍的稀釋系列。32小時(shí)后，向每孔中加入0.3μCi[甲基-3H]胸苷(Dupont-NEN-027)并將細(xì)胞再孵育16小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并于玻璃濾器上裂解。在閃爍計(jì)數(shù)器中測量摻入到DNA中的3H-胸苷。
作出劑量應(yīng)答曲線并鑒定導(dǎo)致半數(shù)最大應(yīng)答的蛋白濃度，得到關(guān)于細(xì)胞增殖的每種huKS-IL2蛋白變體的ED50值。應(yīng)答的選擇性表示為ED50值的比，例如ED50[TF1-β]/ED50[CTLL-2]。這樣，高ED50比表明相比CTLL-2細(xì)胞應(yīng)答，需要相對更高的蛋白劑量以引起TF-1β細(xì)胞應(yīng)答。將HuKS-IL2變體的ED50值的比與游離huIL-2和親本huKS-IL2蛋白的相比。該標(biāo)準(zhǔn)化的值是差別效果的量度。比參考蛋白更大的值說明選擇性向CTLL-2細(xì)胞偏移。在某些情況下，可能優(yōu)選用來自相同物種的細(xì)胞系得到ED50比，以便IL-2活性不會在它們與受體的相互作用方面額外地受到交叉物種差異的影響。下面的實(shí)施例用鼠CTLL-2和人TF-1β細(xì)胞計(jì)算Ig-IL2融合蛋白和游離IL-2的ED50比，從該實(shí)驗(yàn)所得代表性結(jié)果如表1所示。
表1

在該實(shí)施例中，用huKS-IL2得到的ED50比(0.17)為用游離IL-2得到的ED50比(0.81)的大約5分之一。這說明該融合蛋白的選擇性譜偏移了，顯示出對TF-1β細(xì)胞的更強(qiáng)的選擇性。一種不同的抗體/IL-2組合——14.18-IL2對于TF-1β的選擇性也高于單獨(dú)IL-2(ED50比為0.07)，說明該效果不局限于抗體-IL2融合蛋白中所含的特定抗體，并且人Ig-IL2融合蛋白相對于huIL-2對鼠源高親和性受體攜帶細(xì)胞的活性降低可能反映了Ig-IL2融合蛋白的一般特性。
其他變體具有改變的ED50比，從而有利于CTLL-2細(xì)胞應(yīng)答?？煽吹絟uKS-ala-IL2(N88R)(ED50比大于2000)的急劇效果，反映了在這些細(xì)胞中通過中等親和性受體介導(dǎo)的TF-1β細(xì)胞增殖幾乎不能檢測。這樣，雖然huKS-ala-IL2(N88R)激活了具有IL-2Rαβγ的細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，但是它沒有顯著激活具有IL-2Rβγ的細(xì)胞。也可以在純化的表達(dá)鼠IL-2Rβγ復(fù)合體的鼠NK細(xì)胞上分析huKS-ala-IL2(N88R)的活性；不同于所報(bào)道的游離人IL2(N88R)蛋白的活性——當(dāng)檢查小鼠T細(xì)胞和NK細(xì)胞時(shí)選擇性實(shí)質(zhì)上喪失(見Wetzel等，ASCO 2001會議摘要)，小鼠NK細(xì)胞中huKS-ala-IL2(N88R)的ED50值和用TF-1β細(xì)胞時(shí)觀察到的相似。
在具有影響融合蛋白抗體部分的糖基化的變化的Ig-IL2變體中觀察到應(yīng)答的選擇性向CTLL-2細(xì)胞有微妙的偏移。具體地，KS(N到Q)-IL2(其在抗體的Fc部分缺乏糖基化)的ED50比值(0.72)相對于huKS-IL2的增加了3倍，而用N-聚糖酶處理的huKS-IL2的ED50比為0.45，相對于huKS-IL2增加了兩倍。同樣的，用N-聚糖酶處理的融合不同抗體分子的IL-2導(dǎo)致類似結(jié)果；例如，用N-聚糖酶處理的14.18-IL2和未處理的14.18-IL2相比ED50比增加了3倍。這些結(jié)果表明該分子自身的抗體部分中的某些改變影響融合的IL-2分子的結(jié)合和活化性質(zhì)。
融合蛋白的PEG化也改變其選擇性譜。再次觀察到向CTLL-2刺激活性的偏移。對于huKS-IL2，PEG化的變體對CTLL-2細(xì)胞的選擇性增加了9倍(ED50比為1.99)，對于14.18-IL2，PEG化導(dǎo)致選擇性增加了20倍(ED50比為1.34)。
在某些情況下，對給定蛋白的選擇性的偏移可能也反映了分析中所用細(xì)胞類型的特定組合，如表2所示的代表性結(jié)果。例如，當(dāng)用具有人IL-2Rαβγ的細(xì)胞系Kit225代替鼠CTLL-2比較KS-IL2、KS-ala-IL2和IL-2時(shí)，選擇性偏移模式?jīng)]有保持。尤其對于Kit225細(xì)胞，這三種蛋白顯示出基本相同的活性。然而，在TF-1β細(xì)胞和Kit-225細(xì)胞間Ig-IL2變體的選擇性應(yīng)答的傾向被發(fā)現(xiàn)大多數(shù)和用TF-1β細(xì)胞和CTLL-2細(xì)胞建立的(包括Ig-IL2融合蛋白的Fc部分去糖基化的影響)類似(見下表2的代表性結(jié)果和實(shí)施例10)。
表2蛋白 ED50比TF-1β/Kit-225IL-2 2.8HuKS-IL2 4HuKS-ala-IL2 10.4KS-ala-IL2(N88R) 52,000此外，發(fā)現(xiàn)Kit-225細(xì)胞比CTLL-2細(xì)胞對IL-2和IL-2融合蛋白及其變體更敏感。例如，在Kit-225細(xì)胞中HuKS-ala-IL2的ED50值是0.08而在CTLL-2細(xì)胞中是5.0，對于KS-ala-IL2(N88R)在Kit225細(xì)胞中是0.13而在CTLL-2細(xì)胞中是3，這表明在這些分析中Kit255細(xì)胞的靈敏性增加了約10-50倍。從而對給定蛋白，ED50比值依賴于所用細(xì)胞類型的特定組合。
實(shí)施例5 具有修飾的受體結(jié)合特征的IL-2融合蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)將huKS-ala-IL2(N88R)的藥物動(dòng)力學(xué)(PK)曲線與huKS-ala-IL2和huKS-IL2的曲線進(jìn)行了比較。對于每種蛋白，使用了三只6-8周齡的小鼠。將25μg在PBS中稀釋到125μg/ml的融合蛋白注射到小鼠的尾部靜脈，在注射后立即(0小時(shí))、0.5、1、2、4、8和24小時(shí)通過眼眶后叢采血得到50μl血樣。在包被有肝素的試管中收集血樣以防止血液凝結(jié)，用ELISA測定法測量細(xì)胞后血漿上清液中免疫細(xì)胞因子水平。以前已經(jīng)描述了用于藥物動(dòng)力學(xué)研究的ELISA測定法的步驟(WO01/58957)。該測定法測量完整免疫細(xì)胞因子的存在。在包被EpCAM的板上進(jìn)行血漿中的免疫細(xì)胞因子的捕捉，用抗IL-2的HRP-偶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測。以前的研究表明在連接處具有K到A置換的huKS-IL2變體——huKS-ala-IL2和huKS-IL2相比循環(huán)半衰期急劇提高(WO01/58957)。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)huKS-ala-IL2(N88R)的循環(huán)半衰期類似地提高了，這說明該分子的IL-2部分中的N88R改變對藥物動(dòng)力學(xué)沒有實(shí)質(zhì)影響。代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2所示。圖2說明了24小時(shí)內(nèi)血清中存在的免疫細(xì)胞因子隨時(shí)間的濃度(用血清中的剩余蛋白濃度相對于靜脈內(nèi)給藥后即刻的起始濃度的百分比表示)。在ELISA分析中測定蛋白濃度，其中通過免疫細(xì)胞因子的抗體部分捕捉該免疫細(xì)胞因子，通過其細(xì)胞因子部分檢測該免疫細(xì)胞因子。X軸＝時(shí)間(小時(shí))；Y軸＝log(剩余蛋白濃度百分?jǐn)?shù))。
實(shí)施例6 哺乳動(dòng)物中具有修飾的受體結(jié)合特征的Ig-IL2融合蛋白的毒性檢測了小鼠中KS-IL2變體huKS-IL2、huKS-ala-IL2和huKS-ala-IL2(N88R)的相對毒性。如實(shí)施例5所示，與huKS-IL2相比，huKS-ala-IL2和huKS-al-IL2(N88R)具有實(shí)質(zhì)上增加的PK。不過，為了比較的目的，雖然PK不同仍對不同分子使用了相同的給藥時(shí)間表。盡管更長的血清半衰期可能增加治療劑的功效，但是也可能導(dǎo)致毒性增加。然而，本實(shí)施例表明雖然與huKS-IL2相比huKS-ala-IL2毒性增加(因?yàn)楦L的循環(huán)半衰期)，huKS-ala-IL2(N88R)與huKS-IL2相比雖然循環(huán)半衰期更長，但是毒性降低。
連續(xù)5天每天對Balb/C小鼠(每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件3只動(dòng)物)靜脈注射三種蛋白中的一種。將融合蛋白稀釋到200μl PBS中并按下面的劑量施用huKS-IL2和huKS-ala-IL2為每只小鼠25、50或75μg，huKS-ala-IL2(N88R)為每只小鼠50、75或100μg。對照組靜脈注射PBS。每天監(jiān)測小鼠的存活并且檢查對小鼠存活的影響。施用所有劑量的huKS-IL2的小鼠都幸存下來。然而huKS-ala-IL2毒性較強(qiáng)。雖然小鼠耐受25μg huKS-ala-IL2劑量，但是劑量為50μg時(shí)所有3只小鼠在第6天都死亡了，在劑量為75μg時(shí)在第4.5天兩只小鼠死亡，第三只小鼠在第5天死亡。另一方面，小鼠良好耐受所有劑量(包括100μg)的huKS-ala-IL2(N88R)。實(shí)際上，還以每只小鼠200μg的劑量施用了huKS-ala-IL2(N88R)，并且小鼠幸存下來了。從而，huKS-ala-IL2(N88R)的毒性顯著比huKS-ala-IL2的低。
將在用huKS-ala-IL2治療過程中死亡的小鼠解剖并評價(jià)了它們的器官。所有器官(包括肺、脾、肝、胃和腎)都總體上腫大，表明廣泛的血管滲漏。也評價(jià)了用變體huKS-ala-IL2(N88R)處理的動(dòng)物的器官。如上所述處理小鼠，發(fā)現(xiàn)用huKS-ala-IL2(N88R)處理的動(dòng)物的器官重量基本上和對照動(dòng)物的類似，尤其是肺和肝。不希望受理論束縛，認(rèn)為脾的重量的增加更多是由于抗該人蛋白的抗體免疫應(yīng)答導(dǎo)致的蜂窩狀結(jié)構(gòu)(Cellularity)增加而不是血管滲漏引起的。推論huKS-ala-IL2(N88R)導(dǎo)致的血管滲漏沒有huKS-ala-IL2的嚴(yán)重。表3提供了相對于對照小鼠器官，器官重量增加倍數(shù)(x)的大約值的實(shí)例。
表3

評價(jià)了各種小鼠品系背景(在它們的免疫系統(tǒng)組成上具有已知的改變)在這些Ig-IL2融合蛋白的毒性方面的影響。使用了小鼠品系DBA/2、Balb/C、B6.CB17-Prkdcscid/SzJ(SCID)、淺棕色鼠和SCID/淺棕色鼠。對于huKS-ala-IL2，以每只小鼠25μg和50μg的劑量如上施用融合蛋白，對于huKS-ala-IL2(N88R)劑量為每只小鼠200μg，為期兩周評估小鼠存活和重量。
對于huKS-ala-IL2，大多數(shù)小鼠品系得到的結(jié)果與以上用Balb/C小鼠所報(bào)道的結(jié)果類似50μg的劑量導(dǎo)致動(dòng)物在第5天死亡，而在較低劑量動(dòng)物幸存下來并且它們的重量恢復(fù)到約它們原來的體重，但是沒有達(dá)到模擬處理的對照動(dòng)物的體重增加。有趣的是，缺乏功能性NK細(xì)胞的淺棕色鼠更能耐受50μg的高劑量；兩只動(dòng)物到第9天死亡，但是一只盡管最初體重顯著降低(到第7天約25％)，但是卻恢復(fù)了，到第15天達(dá)到模擬處理的動(dòng)物和低劑量處理的動(dòng)物的體重。DBA/2小鼠對huKS-ala-IL2更敏感；甚至在較低劑量時(shí)，DBA/2小鼠在第5天和第9天死亡了。
對于huKS-ala-IL2(N88R)，DBA/2小鼠對于Ig-IL2融合蛋白的易感性增加也是明顯的到第8天，所有動(dòng)物都死亡了，即使劑量減半(100μg)動(dòng)物也在第9天死亡。該融合蛋白在淺棕色鼠中耐受性也是最好的，而SCID/淺棕色鼠體重顯著降低(到第10天保持穩(wěn)定，為模擬處理的對照小鼠體重的約80％)。
實(shí)施例7 具有修飾的受體結(jié)合特征的Ig-IL2融合蛋白在哺乳動(dòng)物各種腫瘤的治療中的功效a)Balb/C小鼠中CT26/KSA皮下腫瘤的治療。通過用編碼人KS抗原(KSA)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)皮下腫瘤。將2×10E6活細(xì)胞懸浮于100μl PBS中并皮下注射到6周齡Balb/C小鼠的背部。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到100-200mm3時(shí)，將8只為一組的小鼠進(jìn)行下面三種處理之一連續(xù)5天皮下注射稀釋到200μl PBS中的15μg huKS-ala-IL2或huKS-ala-IL2(N88R)或者只施用PBS。每周兩次共50天測量腫瘤體積評價(jià)疾病的發(fā)展。在對照小鼠中，腫瘤體積穩(wěn)定增加，處死時(shí)(約第32天)達(dá)到約3500到6000mm3。而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積到50天時(shí)基本保持恒定，這說明huKS-ala-IL2(N88R)在防止腫瘤生長方面和huKS-ala-IL2一樣有效。
b)C57BL/6小鼠中LLC/KSA皮下腫瘤的治療。在另一腫瘤模型中，通過用編碼KS抗原的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的Lewis肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)皮下腫瘤。將1×10E6表達(dá)EpCAM的LLC活細(xì)胞懸浮于100μl PBS中并皮下注射到6-8周齡C57BL/6小鼠的背部。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到100-150mm3時(shí)，如上處理和評價(jià)8只一組的小鼠，只是每次注射施用的劑量增加到20μg。在對照動(dòng)物中，腫瘤體積增加迅速，在20天內(nèi)超過6500mm3；兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的腫瘤生長受到相同程度的阻礙，在相同時(shí)間內(nèi)達(dá)到4000mm3，這再次說明在相同劑量下huKS-ala-IL2和huKS-ala-IL2(N88R)的治療功效沒有差別。
c)B6.CB17-Prkdcscid/SzJ小鼠中LLC/KSA皮下腫瘤的治療。本發(fā)明融合蛋白也可以對成熟T細(xì)胞之外的細(xì)胞有效。例如，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明融合蛋白在甚至沒有成熟T細(xì)胞的小鼠中也導(dǎo)致腫瘤生長的阻礙。這些結(jié)果提示本發(fā)明融合蛋白可以用于例如無免疫應(yīng)答病人的腫瘤的治療。
在11周齡B6.CB17-Prkdcscid/SzJ小鼠(它們無T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)中評價(jià)了LLC/KSA皮下腫瘤模型。按照上面描述的相同的治療方案。對照動(dòng)物中腫瘤生長快速，在15天中達(dá)到3500mm3。huKS-ala-IL2和huKS-ala-IL2(N88R)阻礙腫瘤生長的有效性類似，在相同期間內(nèi)體積為對照動(dòng)物中腫瘤體積的一半以下。而且，C57BL/6小鼠(具有完整免疫系統(tǒng))和B6.CB17-Prkdcscid/SzJ小鼠(無T細(xì)胞和B細(xì)胞)的腫瘤生長速率的差別極小。
此外，KS-ala-IL2對具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠中和缺乏功能性T細(xì)胞的小鼠中的腫瘤具有同樣好的治療效果這一事實(shí)表明在該腫瘤模型中，免疫應(yīng)答通過非T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制起作用。所以，有價(jià)值的是在治療分子中保持通過各種效應(yīng)細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答的選擇。對于huKS-ala-IL2(N88R)(其在每種小鼠背景中和KS-ala-IL2一樣有效)，獨(dú)立于T細(xì)胞起作用的效應(yīng)細(xì)胞活性明顯被保存了。
d)對C57BL/6小鼠肺的LLC/KSA轉(zhuǎn)移的治療。LLC/KSA也被用于肺轉(zhuǎn)移模型。將1×10E6個(gè)成活細(xì)胞懸浮于200μl PBS中并靜脈注射到6-8周齡C57BL/6小鼠中。在第4天，將8個(gè)一組的小鼠置于下面的治療條件中的一種之下連續(xù)5天，小鼠靜脈注射200μl PBS或20μg稀釋到200μl PBS中的KS-ala-IL2或KS-ala-IL2(N88R)。在約第27天處死動(dòng)物，解剖肺并在Bouin溶液中固定。通過對被轉(zhuǎn)移瘤覆蓋的表面區(qū)域的百分?jǐn)?shù)和肺的重量評估肺中轉(zhuǎn)移的程度。
對照組的肺有超過96％的表面區(qū)域被轉(zhuǎn)移瘤覆蓋，并且肺重量(0.75g)比正常肺增加了約5倍。而用huKS-ala-IL2治療的小鼠的肺極少被轉(zhuǎn)移瘤覆蓋(5.6％)，用huKS-ala-Il2(N88R)處理的小鼠的肺實(shí)質(zhì)上無轉(zhuǎn)移(0％)。用KS-ala-IL2和KS-ala-IL2(N88R)治療的動(dòng)物的肺重量正常。從而，證明在比影響動(dòng)物存活的閾值低許多倍的劑量下，huKS-ala-IL2(N88R)和KS-ala-IL2在治療肺轉(zhuǎn)移中一樣有效。
實(shí)施例8 組合療法中的KS-IL2變體研究了將低毒KS-IL2變體(如huKS-ala-IL2(N88R))和另一種免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合施用治療腫瘤的效果，其中使用如實(shí)施例7b中描述的小鼠皮下腫瘤模型LLC/KSA進(jìn)行。
a)huKS-ala-IL2變體和環(huán)磷酰胺。對于組合治療，在第0天(此時(shí)腫瘤平均90mm3)以75mg/kg劑量腹膜內(nèi)施用環(huán)磷酰胺，然后每天施用融合蛋白共5天(從第1天到第5天)。以20μg或100μg劑量施用KS-ala-IL2(N88R)。對照條件包括模擬處理的動(dòng)物和單獨(dú)用huKS-ala-IL2以20μg劑量處理的動(dòng)物或單獨(dú)用huKS-ala-IL2(N88R)以20μg或100μg劑量處理的動(dòng)物。模擬處理的動(dòng)物的腫瘤到第19天長到約5000mm3，而用huKS-ala-IL2處理的小鼠的腫瘤約2200mm3，用20μg或100μghuKS-ala-IL2(N88R)處理的小鼠的腫瘤分別為約2600mm3和1700mm3。20μg劑量huKS-ala-IL2(N88R)與環(huán)磷酰胺共同施用導(dǎo)致腫瘤為1700mm3并且在高效量時(shí)為1250mm3，比用huKS-ala-IL2單獨(dú)處理的要顯著小。
b)huKS-ala-IL2變體和吲哚美辛。對于聯(lián)合治療，以35μg/小鼠/天的劑量口服施用吲哚美辛同時(shí)每天施用融合蛋白共5天(從第1天到第5天)。腫瘤最初平均90mm3。以20μg劑量施用huKS-ala-IL2(N88R)。對照條件包括模擬處理的動(dòng)物和單獨(dú)用20μg劑量huKS-ala-IL2或單獨(dú)用20μg劑量huKS-ala-IL2(N88R)治療的動(dòng)物。模擬處理的動(dòng)物中腫瘤到第19天時(shí)長到約5000mm3，而用huKS-ala-IL2治療的小鼠腫瘤約2200mm3，用20μg huKS-ala-IL2(N88R)治療的小鼠分別為約2600mm3和1700mm3。吲哚美辛與20μg劑量huKS-ala-IL2(N88R)共同施用導(dǎo)致腫瘤大小降低到850mm3，比單獨(dú)用huKS-ala-IL2治療得到的腫瘤顯著地小。
實(shí)施例9 治療指數(shù)提高的KS-IL2變體構(gòu)建了在IL-2序列的特定位置具有突變的KS-IL2變體。例如，在可能與IL-2受體的α亞基接觸的位置產(chǎn)生置換。合適的殘基為例如huIL-2成熟序列中的F42。該氨基酸的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為穩(wěn)定IL-2中的局部構(gòu)象(Mott等，JMB 1995，247979)，并且發(fā)現(xiàn)在免疫細(xì)胞因子該位置用例如Y、A或K進(jìn)行置換導(dǎo)致分子的IL-2受體親和性和生物活性進(jìn)行性降低。在動(dòng)物中檢驗(yàn)這些分子，發(fā)現(xiàn)和未改變形式的免疫細(xì)胞因子相比這些變體在腫瘤治療中的治療指數(shù)增加了。其他有效的置換是在位置R38和K43。
該免疫細(xì)胞因子的IL-2部分中的其他置換在可能與β亞基接觸的區(qū)域內(nèi)，例如，在成熟huIL-2的E15或L19位置發(fā)生。當(dāng)免疫細(xì)胞因子的這些殘基突變成例如A或R時(shí)發(fā)現(xiàn)和未改變形式的免疫細(xì)胞因子相比，變體免疫細(xì)胞因子對IL-2受體的β亞基的親和性降低。通常發(fā)現(xiàn)置換成R比置換成A的影響更嚴(yán)重，這可能和R的側(cè)鏈大有關(guān)。在動(dòng)物中檢驗(yàn)這些分子，發(fā)現(xiàn)和未改變形式的免疫細(xì)胞因子相比，這些變體在腫瘤治療中的治療指數(shù)增加。其他置換在D84和V91位導(dǎo)入并且它們被證實(shí)對治療指數(shù)的增加也有效。
在成熟huIL-2的N119位導(dǎo)入免疫細(xì)胞因子的IL-2部分中的置換，可能影響該分子與IL-2受體的γ亞基接觸的區(qū)域。突變到A產(chǎn)生更微妙的免疫細(xì)胞因子變體，突變到R產(chǎn)生更具破壞性的突變。在具有腫瘤的動(dòng)物中檢驗(yàn)這些變體的效果，發(fā)現(xiàn)與未改變形式的免疫細(xì)胞因子相比這些變體免疫細(xì)胞因子具有提高的治療指數(shù)。
還發(fā)現(xiàn)可通過在IL-2免疫細(xì)胞因子中產(chǎn)生多個(gè)突變增加治療指數(shù)，尤其是對于其中免疫細(xì)胞因子中的單突變已顯示只微小或可忽略地增加治療指數(shù)的分子。例如，發(fā)現(xiàn)含有F42A與L19A組合或L19A與N119A組合的免疫細(xì)胞因子比每種單獨(dú)的免疫細(xì)胞因子更有效。對于涉及多個(gè)突變的應(yīng)用，尤其有用的是使用降低氨基酸側(cè)鏈大小的突變。另一個(gè)導(dǎo)入免疫細(xì)胞因子的IL-2部分的置換在成熟huIL-2的T51處。盡管向A的突變沒有顯示治療指數(shù)的提高，而向P的突變產(chǎn)生了當(dāng)和未改變形式的免疫細(xì)胞因子相比在腫瘤治療中治療指數(shù)提高的免疫細(xì)胞因子。
實(shí)施例10 Ig-IL2融合蛋白變體huKS-ala-IL2(D20T)及其變體產(chǎn)生了基于Ig-IL2的變體(D20T)，Ig-IL2(D20T)在成熟huIL-2的20位含有天冬氨酸向蘇氨酸的置換。這些變體在Ig結(jié)構(gòu)域，如在Fc部分或抗體靶定結(jié)構(gòu)域含有額外的置換。為了產(chǎn)生編碼這些分子的DNA構(gòu)建體，基本按照實(shí)施例1中描述的步驟進(jìn)行，其中利用構(gòu)建體-特異性引物通過PCR導(dǎo)入突變并利用合適的克隆策略，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法和策略。
a)huKS-ala-IL2(D20T)。為了導(dǎo)入突變D20T，使用了PCR誘變方法，引物為5’-CAGCTGCAACTGGAGCATCTCCTGCTGACCCTCCAGATGATTCTGAAT-3’(粗體核苷酸為置換的密碼子)(SEQ ID NO28)和引物T3(5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’)(SEQ ID NO29)，從pBS質(zhì)粒的野生型huIL-2 DNA擴(kuò)增DNA片段并插入TA載體(Invitrogen)中以產(chǎn)生TA-IL2(D20T)。測序校驗(yàn)突變發(fā)生。為了置換huKS-ala-IL2中的最初IL-2序列，在三重連接反應(yīng)中將來自TA-IL2(D20T)的385 bp PvuII/XhoI片段克隆到親本免疫細(xì)胞因子質(zhì)粒中?；救鐚?shí)施例3中所描述的表達(dá)和純化融合蛋白。分別在SEQ ID NO30和SEQ ID NO31中顯示了相應(yīng)于hu-KS重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
產(chǎn)生了huKS-ala-IL2(D20T)的其他變體，將相同的PCR-衍生的片段整合到不同質(zhì)粒主鏈中。
b)dI-KS-ala-IL2(D20T)。以前已描述了具有除去潛在T細(xì)胞表位的改變的KS-ala-IL2?；救鐚?shí)施例3中所描述的表達(dá)和純化融合蛋白。相應(yīng)于與IL2(D20T)融合的dI-KS抗體重鏈的氨基酸序列顯示在SEQ IDNO32中。SEQ ID NO33和34相應(yīng)于dI-KS抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
c)去糖基化dI-KS-ala-IL2(D20T)。基本如實(shí)施例2中所描述的在蛋白dI-KS-ala-IL2(D20T)上用N-聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)去糖基化。
d)dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)。該IL2(D20T)融合蛋白的Ig部分衍生自IgGγ4亞類的恒定區(qū)(SEQ ID NO7)，其還保留IgGγ1鉸鏈(SEQ ID NO10)的特性。而且，導(dǎo)入了去除潛在T細(xì)胞表位的突變。此外，該融合蛋白含有天冬氨酸到谷氨酰胺的置換，該置換除去了Fc中N-糖基化位點(diǎn)(見實(shí)施例4)。伴隨的苯丙氨酸到丙氨酸的置換除去了潛在的T表位。基本如實(shí)施例3中所描述的表達(dá)和純化融合蛋白。
e)dI-NHS76(γ2h)-ala-IL2(D20T)。該IL2(D20T)融合蛋白的Ig部分衍生自IgGγ2亞類的恒定區(qū)，其還保留IgGγ1鉸鏈的特性。在NHS76中，Ig可變區(qū)抗DNA-組蛋白復(fù)合物中所含有的表位并且特異識別腫瘤的壞死中心(Williams等，PCT WO 00/01822)。還導(dǎo)入了去除輕鏈可變區(qū)中的潛在T細(xì)胞表位的突變。該殘基，即亮氨酸104，位于CDR3 V-J連接處，其被纈氨酸置換?；救鐚?shí)施例3所描述的表達(dá)并純化了該融合蛋白。
f)dI-NHS76(γ2h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)。該蛋白基于實(shí)施例10e的蛋白，其還含有如實(shí)施例10d所述的去除Fc中的N-連接的糖基化和潛在T細(xì)胞表位的突變?；救鐚?shí)施例3所描述的表達(dá)并純化了該融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白包括融合到IL2(D20T)變體的NHS75(γ2h)(FN＞AQ)分子的重鏈序列，如SEQ ID NO35所述，和相應(yīng)于SEQ ID NO36的輕鏈可變和恒定區(qū)序列。然而，可以將SEQ ID NO35的重鏈區(qū)與任何IgG輕鏈可變區(qū)或恒定區(qū)組合使用。
g)dI-NHS76(γ4h)-ala-IL2(D20T)。該蛋白和實(shí)施例10e中描述的蛋白類似，但是該蛋白含有來自γ4而不是γ2IgG亞類的重鏈。如實(shí)施例3所述表達(dá)和純化了該融合蛋白。
h)dI-NHS76(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)。該蛋白基于實(shí)施例10g的蛋白，還含有如實(shí)施例10d所述的去除Fc中的N-連接的糖基化和潛在T細(xì)胞表位的突變?；救鐚?shí)施例3所描述的表達(dá)并純化了該融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白包括融合到IL-2(D20T)變體的dI-NHS76(γ4h)(FN＞AQ)分子的重鏈序列，如SEQ ID NO37所述，和相應(yīng)于SEQ ID NO36的輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)序列。然而，可以將SEQ IDNO37的重鏈區(qū)與任何IgG輕鏈可變區(qū)或恒定區(qū)組合使用。
本發(fā)明融合蛋白的Ig部分可以包括衍生自任何IgG亞類的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，包括含有來自不同物種的IgG分子結(jié)構(gòu)域的組合。所以，本發(fā)明融合蛋白可以包括衍生自任何IgG亞類的鉸鏈區(qū)，例如，衍生自IgGγ1的鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO10)、衍生自γ2的鉸鏈區(qū)(SEQ ID 11)或衍生自γ4的鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO12)。
生物分析中Ig-IL2(D20T)的活性在生物分析中檢驗(yàn)Ig-IL2(D20T)融合蛋白測量依賴IL2生長的細(xì)胞增殖的能力，其表達(dá)為ED50值(見實(shí)施例4)。在鼠CTLL-2細(xì)胞或人Kit-255細(xì)胞(其表達(dá)IL-2Rαβγ)和人TF-1β細(xì)胞或分離的鼠NK細(xì)胞(表達(dá)IL-2Rβγ)中進(jìn)行分析。
例如，在代表性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與huKS-ala-IL2相比，dI-KS-ala-IL2(D20T)在具有IL-2Rαβγ的細(xì)胞CTLL-2中的ED50值沒有改變，而在具有IL-2Rβγ的細(xì)胞TF-1β中，ED50值高大約900倍。所以ED50比(如實(shí)施例4中定義)為約150，說明與huKS-ala-IL2相比，選擇性向具有IL-2Rαβγ的CTLL-2細(xì)胞偏移了約750倍。和在這對細(xì)胞系中用huKS-ala-IL2(N88R)所看到的約20,000倍的選擇性偏移(相對于KS-ala-IL2)相比，該選擇性對di-KS-ala-IL2(D20T)降低了約10到20倍，這反映了從表達(dá)IL-2Rβγ的細(xì)胞得到可測量的增殖性應(yīng)答。當(dāng)使用人Kit225細(xì)胞時(shí)該趨勢也是明顯的。如用其他含有KS抗體的融合蛋白所發(fā)現(xiàn)的，抗體部分的去糖基化對降低融合蛋白在表達(dá)IL-2Rβγ的細(xì)胞中的活性具有小但一致的影響。
在含有不同抗體部分的Ig-IL(D20T)變體中也測量了依賴IL-2的細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)與dI-NHS76(γ2)-ala-IL2相比，dI-NHS76(γ2)-ala-IL2(D20T)在帶有IL-2Rαβγ的細(xì)胞Kit-255中的ED50值增加了3倍，而在帶有IL-2Rβγ的細(xì)胞TF-1β中ED50增加了約230倍。所得ED50比值350與使用dI-KS(γ4)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)時(shí)所看到的ED50比值位于相同的范圍內(nèi)并且比huKS-ala-IL2(N88R)在選擇性上低至少10倍。代表性結(jié)果如表4所示。
表4蛋白 ED50比ED50比TF-1β/CTLL-2 TF-1β/Kit-225dI-KS-ala-IL2(D20T) 150 3000dI-KS(γ4)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T) 5600*dI-NHS76(γ2)-ala-IL2(D20T)350*＝不同批的平均值Ig-IL2(D20T)變體的藥物動(dòng)力學(xué)為了評價(jià)Ig-IL2變體與細(xì)胞表面Fc受體的相互作用，用U937細(xì)胞在基于細(xì)胞的ELISA中分析了Ig-IL2融合蛋白與FcγR受體的結(jié)合。將融合蛋白(huKS-ala-IL2、dI-huKS-ala-IL2、dI-KS-ala-IL2(D20T)和dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T))2倍稀釋，從100μg/ml到780ng/ml，與細(xì)胞孵育并用FITC偶聯(lián)的抗人IgG Fc AbF(ab’)2(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)檢測結(jié)合。huKS-ala-IL2和dI-KS-ala-IL2對這些細(xì)胞的半最大結(jié)合濃度為約5μg/ml，有趣的是，用dI-KS-ala-IL2(D20T)蛋白該濃度增加2倍。盡管防止Ig部分(dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T))糖基化的突變的導(dǎo)入降低了該蛋白對U937細(xì)胞的結(jié)合5-10倍，但是結(jié)合并沒有被完全消除。
研究了小鼠中Ig-IL2(D20T)變體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，基本如實(shí)施例5所述。令人驚奇的是，當(dāng)與dI-KS-ala-IL2比較時(shí)，dI-KS-ala-IL2(D20T)的半衰期急劇降低了。對PK曲線的分析表明在α期該效果尤其劇烈雖然1小時(shí)后仍然可以得到50％的dI-KS-ala-IL2，只有大約5％的dI-KS-ala-IL2(D20T)仍然存在。這些蛋白的PK曲線的β期的斜率類似。用融合蛋白dI-NHS76(γ2h)-ala-IL2(D20T)(其含有通常顯示出最小的FcR結(jié)合親和性的γ2亞類的IgG)得到了與用dI-KS-ala-IL2(D20T)時(shí)所看到的基本相同的PK曲線。從而，IL(D20T)蛋白部分對融合蛋白的影響不局限于抗體dI-KS。
發(fā)現(xiàn)Ig融合蛋白的去糖基化通常具有增強(qiáng)PK曲線的α期的效果。所以研究了dI-KS-ala-IL2(D20T)的酶促去糖基化對PK曲線的影響。事實(shí)上，PK曲線的α期基本恢復(fù)到用dI-KS-ala-IL2時(shí)所觀察到的情況。當(dāng)通過誘變除去糖基化時(shí)在融合蛋白dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)中得到相同效果。從而，對PK曲線的影響可能是由FcR結(jié)合的降低所致。
Ig-IL2(D20T)變體的毒性在Balb/C小鼠中比較了Ig-IL2(D20T)變體KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)與di-KS-ala-IL2的毒性，如實(shí)施例6所述。
兩種融合蛋白在小鼠中有類似的血清半衰期。施用dI-(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)5個(gè)日劑量，每個(gè)日劑量為100μg/小鼠、200μg/小鼠或400μg/小鼠，而施用dI-KS-ala-IL2 5個(gè)日劑量，每個(gè)日劑量為40μg/小鼠。發(fā)現(xiàn)即使dI-kS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)的劑量為400μg/小鼠，小鼠也幸存下來，而接受1/10劑量的dI-KS-ala-IL2的對照小鼠到第6天時(shí)就死亡了。用dI-kS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)治療的小鼠的體重受到輕微影響，在第7天時(shí)暫時(shí)降到最初體重的97％。耐受劑量大于10倍的差異可以說明治療指數(shù)的實(shí)質(zhì)提高。
Ig-IL2(D20T)變體對治療腫瘤的功效如實(shí)施例7a所述，在具有從CT26/KSA細(xì)胞衍生的皮下腫瘤的Balb/C小鼠中評價(jià)Ig-IL2(D20T)變體的功效。
以15μg/小鼠和30μg/小鼠的劑量施用融合蛋白dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)。腫瘤開始時(shí)平均大小為126mm3，到第28天大小達(dá)到1800mm3到5000mm3。用15μg/小鼠dI-KS-ala-IL2治療的小鼠中腫瘤長到平均大小355mm3，而用15μg/小鼠dI-KS-ala-IL2(D20T)治療的小鼠中腫瘤長到平均大小2250mm3。這最可能是由于該分子的較差的PK的原因。用較低劑量15μg/小鼠dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)治療的小鼠中腫瘤長到一定程度，平均大小為1450mm3；然而，在30μg/小鼠的劑量時(shí)腫瘤平均大小達(dá)到950mm3，重要的是，在過半的小鼠中腫瘤沒有看得到的生長。從而，劑量增加時(shí)dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)對抑制腫瘤的生長有顯著的作用。實(shí)際上，實(shí)驗(yàn)中所用劑量比該分子的最大耐受劑量低至少12倍，所以該分子可能比huKS-ala-IL2具有提高的治療指數(shù)，相比較，huKS-ala-IL2以最大耐受劑量的1/3至1/2施用。
實(shí)施例11 野生型和突變型IL-2融合蛋白對不同IL-2受體的相對親和性可以通過測定法如放射免疫測定法測量本發(fā)明各種融合蛋白對IL-2Rβγ受體相對于IL-2Rαβγ受體的差異親和性。將相等數(shù)量的表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞和表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞接種于塑料板上。用等量野生型或突變IL-2融合蛋白進(jìn)行系列稀釋，加到等數(shù)量表達(dá)IL-2Rαβγ的細(xì)胞或表達(dá)IL-2Rβγ的細(xì)胞中以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。洗掉未結(jié)合的融合蛋白并通過放射標(biāo)記的配體檢測結(jié)合到每種細(xì)胞類型的融合蛋白的量。對于Fc-IL-2融合蛋白，配體可以是諸如結(jié)合IgG的Fc部分的葡萄球菌A蛋白分子。配體還可以是識別特定亞類的IgG分子的一部分的另一抗體，例如Igγ1、Igγ2或Igγ4恒定區(qū)的抗體。洗掉未結(jié)合的配體，在γ計(jì)數(shù)器上測量含有與野生型IL-2融合蛋白結(jié)合的IL-2Rαβγ表達(dá)細(xì)胞、與突變IL-2融合蛋白結(jié)合的IL-2Rαβγ表達(dá)細(xì)胞、與野生型IL-2融合蛋白結(jié)合的IL-2Rβγ表達(dá)細(xì)胞或與突變?nèi)诤系鞍捉Y(jié)合的IL-2Rβγ表達(dá)細(xì)胞的平板的放射性。將從結(jié)合測定中得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以計(jì)算細(xì)胞數(shù)和在細(xì)胞上表達(dá)的受體數(shù)。
在另一個(gè)測定法中，可以用本領(lǐng)域中熟知的各種技術(shù)放射性地或非放射性地標(biāo)記融合蛋白自身。類似于上述用于標(biāo)記的配體的測定法，將野生型或突變型標(biāo)記的融合蛋白加到等數(shù)量接種的細(xì)胞中并測量標(biāo)記的融合蛋白的量。
通過結(jié)合的配體或結(jié)合的融合蛋白的濃度(如上述)與未結(jié)合的配體或未結(jié)合的融合蛋白的濃度和加到每個(gè)反應(yīng)中的融合蛋白的總濃度的乘積的比來測量融合蛋白對特定受體的結(jié)合親和性。當(dāng)與野生型IL-2融合蛋白相比較時(shí)，IL-2部分中的某些突變改變了融合蛋白對IL-2Rβγ受體和IL-2Rαβγ受體的相對親和性。
等價(jià)方案本發(fā)明可以以其他特定形式實(shí)施而不脫離本發(fā)明的精神或基本特征。所以應(yīng)該在所有方面都認(rèn)為前面的實(shí)施方案是舉例說明性的而不限制此處所描述的發(fā)明。從而本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是前面的說明書說明，并且落入權(quán)利要求的等價(jià)意義和范圍內(nèi)的所有修改都旨在包括在其中。
本文引用的所有專利、專利申請和科學(xué)出版物的全文并入作為參考。
序列表<110>默克專利有限公司<120>具有調(diào)節(jié)的選擇性的細(xì)胞免疫因子<130>LEX-020PC<150>60/337,113<151>2001-12-04<150>60/371,966<151>2002-04-12<160>37<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgGγ1序列<400>1Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Igγ2或4序列<400>2Gln Phe Asn Ser Thr1 5<210>3<211>133<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His1 5 10 15Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu65 70 75 80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile115 120 125Ile Ser Thr Leu Thr130<210>4<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人γ-1重鏈基因中產(chǎn)生的XmaI位點(diǎn)<400>4tccccgggta aa 12<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>野生型huKS-ala-IL2接點(diǎn)<400>5Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變huKS-ala-IL2接點(diǎn)<400>6Ser Gly Pro Ala Ala Pro Thr1 5<210>7<211>327<212>PRT<213>人<220>
<221>misc<222>(1)..(327)<223>人γ4恒定區(qū)<400>7Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro100 105 110Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys115 120 125Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val130 135 140Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe165 170 175Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp180 185 190Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu195 200 205Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg210 215 220Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp245 250 255Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys260 265 270Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser275 280 285Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser290 295 300Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 315 320Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys325<210>8<211>330<212>PRT<213>人<220>
<221>misc<222>(1)..(330)<223>IgG1恒定區(qū)<400>8Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>9<211>326<212>PRT<213>人<220>
<221>misc<222>(1)..(326)<223>人γ2恒定區(qū)<400>9Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro100 105 110Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp130 135 140Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly145 150 155 160Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn165 170 175Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp180 185 190Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro195 200 205Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu210 215 220Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn225 230 235 240Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile245 250 255Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr260 265 270Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys275 280 285Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys290 295 300Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu305 310 315 320Ser Leu Ser Pro Gly Lys325<210>10<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IgGγ1鉸鏈區(qū)
<400>10Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IgGγ2鉸鏈區(qū)<400>11Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IgGγ4鉸鏈區(qū)<400>12Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro1 5 10<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgGγ1和γ2恒定區(qū)的C末端<400>13Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgGγ4恒定區(qū)的C末端<400>14Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的IgGγ恒定區(qū)的C末端<400>15Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala1 5<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>產(chǎn)生huKS-ala-IL2(N88R)融合蛋白的有義引物<400>16ccccgggtgc cgccccaact tcaagttcta ca32<210>17<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>產(chǎn)生huKS-ala-IL2(N88R)融合蛋白的反義引物<400>17agccctttag ttccagaact attacgttga tcctgctgat taagtcccta ggt53<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二有義引物<400>18agttctggaa ctaaagggct ccgaaacaac attcatgtgt 40<210>19<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>huKS M1 IL-2變體中的突變序列
<400>19Thr Thr Ser Arg1<210>20<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體-IL-2接點(diǎn)序列<400>20Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ala Pro Thr1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的抗體-IL-2接點(diǎn)序列<400>21Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Thr1 5 10<210>22<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>huKS M1-IL2變體中的序列<400>22Asp Leu Ile Ser Asn Ile1 5<210>23<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>huKS M1-IL2變體中的突變序列<400>23Asp Thr Thr Ser Arg Ile
1 5<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>產(chǎn)生N88R突變的有義引物<400>24acttaagacc tagggacacc accagcagga tcaacgtaat agt43<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于N88R突變的反義引物<400>25atcatgtctg gatccctc18<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fcγ1恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中N到Q的突變<400>26Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg1 5<210>27<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>γ2或4恒定區(qū)中Fc部分的FN到AQ突變<400>27Gln Ala Gln Ser Thr1 5<210>28<211>48<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于D20T突變的有義引物<400>28cagctgcaac tggagcatct cctgctgacc ctccagatga ttctgaat 48<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于D20T突變的反義引物<400>29attaaccctc actaaaggga 20<210>30<211>116<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>hu-KS重鏈可變區(qū)<400>30Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe65 70 75 80Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val100 105 110Thr Val Ser Ser115
<210>31<211>106<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>hu-KS輕鏈可變區(qū)<400>31Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe35 40 45Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>32<211>579<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合到IL-2變體的dI-KS-ala IL2(D20T)重鏈<400>32Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala115 120 125Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu130 135 140Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly145 150 155 160Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser165 170 175Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu180 185 190Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr195 200 205Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr210 215 220Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe225 230 235 240Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro245 250 255GLu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val260 265 270Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr275 280 285Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys305 310 315 320Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser325 330 335Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro340 345 350Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val355 360 365Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly370 375 380Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp385 390 395 400Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp405 410 415Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His420 425 430Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro435 440 445Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu450 455 460Leu Thr Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro465 470 475 480Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala485 490 495Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu500 505 510Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro515 520 525Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly530 535 540Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
545 550 555 560Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser565 570 575Thr Leu Thr<210>33<211>116<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>dI-KS重鏈可變區(qū)<400>33Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>34<211>106<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>dI-KS輕鏈可變區(qū)
<400>34Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile20 25 30Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Trp Ile Phe35 40 45Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>35<211>580<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合到IL2變體的dI-NHS76(γ2h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)重鏈<400>35Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu50 55 60Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Ala Arg Gly Lys Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val225 230 235 240Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser290 295 300Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser385 390 395 400Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala435 440 445Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu450 455 460Leu Leu Thr Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn465 470 475 480Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys485 490 495Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro500 505 510Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg515 520 525Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys530 535 540Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr545 550 555 560Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile565 570 575Ser Thr Leu Thr
580<210>36<211>229<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>dI-NHS76(γ4th)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)可變輕鏈區(qū)<400>36Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly His Gln100 105 110Asp Ser Asp Pro Leu Pro Leu Ile His Pro Ala Gly Gln Pro Lys Ala115 120 125Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala130 135 140Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala145 150 155 160Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val165 170 175Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser180 185 190
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr195 200 205Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala210 215 220Pro Thr Glu Cys Ser225<210>37<211>580<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合到IL-2變體的dI-NHS76(γ4h)(FN＞AQ)-ala-IL2(D20T)重鏈<400>37Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu50 55 60Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Lys Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu115 120 125Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys130 135 140Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser165 170 175Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser180 185 190Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn195 200 205Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His210 215 220Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val225 230 235 240Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu260 265 270Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser290 295 300Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser385 390 395 400Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala435 440 445Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu450 455 460Leu Leu Thr Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn465 470 475 480Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys485 490 495Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro500 505 510Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg515 520 525Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys530 535 540Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr545 550 555 560Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile565 570 575Ser Thr Leu Thr580
權(quán)利要求
1.含有融合到突變IL-2部分的非IL-2部分的融合蛋白，其中所述融合蛋白比參考蛋白對表達(dá)高親和性受體的細(xì)胞顯示出更高選擇性，其中所述參考蛋白含有融合到非突變IL-2部分的非IL-2部分，并且其中所述選擇性測量為表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞的活化與表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞的活化的比值。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中突變IL-2部分含有選自氨基酸置換、氨基酸缺失和氨基酸修飾的氨基酸突變。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述選擇性為含有融合到突變?nèi)薎L-2部分上的非IL-2部分的參考融合蛋白的選擇性的約0.1％到約100％，其中突變?nèi)薎L-2部分在成熟人IL-2蛋白的88位具有N到R的氨基酸置換。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述選擇性為含有融合到突變?nèi)薎L-2部分上的非IL-2部分的參考融合蛋白的選擇性的約0.1％到約30％，其中突變?nèi)薎L-2部分在成熟人IL-2蛋白的88位具有N到R的氨基酸置換。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述選擇性為含有融合到突變?nèi)薎L-2部分上的非IL-2部分的參考融合蛋白的選擇性的約1％到約20％，其中突變?nèi)薎L-2部分在成熟人IL-2蛋白的88位具有N到R的氨基酸置換。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述選擇性為含有融合到突變?nèi)薎L-2部分上的非IL-2部分的參考融合蛋白的選擇性的約2％到約10％，其中突變?nèi)薎L-2部分在成熟人IL-2蛋白的88位具有N到R的氨基酸置換。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中表達(dá)IL-2Rαβγ受體的細(xì)胞選自CTLL-2、Kit225和成熟T細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中表達(dá)IL-2Rβγ受體的細(xì)胞選自TF-1β細(xì)胞和NK細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白比成熟人IL-2蛋白具有更長的血清半衰期。
10.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述非IL-2部分是白蛋白。
11.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述非IL-2部分含有抗體域。
12.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中抗體域選自KS-1/4、dI-KS、dI-KS(γ4h)(FN＞AQ)、huKS、huKS(N到Q)、NHS76(γ2h)、NHS(γ4h)NHS76(γ2h)(FN＞AQ)、NHS76(γ4h)(FN＞AQ)和14.18。
13.權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述突變對融合蛋白的IL-2Rβγ受體親和性相對于對該蛋白的IL-2Rαβγ受體親和性具有差別效應(yīng)。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中差別效應(yīng)大于2倍，并且定義如下
15.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中差別效應(yīng)在約5倍到約10倍之間。
16.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中差別效應(yīng)在約10倍到約1000倍之間。
17.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中突變IL-2部分含有氨基酸置換N88R或D20T。
18.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白含有在成熟人IL-2蛋白的88位N變?yōu)镽的氨基酸置換。
19.權(quán)利要求18的融合蛋白，其中所述融合蛋白還含有在成熟人IL-2蛋白的85位L到T和86位I到T的氨基酸置換。
20.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白含有在成熟人IL-2蛋白的20位D變?yōu)門的氨基酸置換。
21.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述突變IL-2部分含有在選自K8、Q13、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、H79、L80、R81、D84、N88、I92和E95的氨基酸位置具有氨基酸突變的成熟人IL-2蛋白。
22.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述突變IL-2部分含有在選自L25、N31、L40、M46、K48、K49、D109、E110、A112、T113、V115、E116、N119、R120、I122、T123、Q126、S127、S130和T131的氨基酸位置具有氨基酸突變的成熟人IL-2蛋白。
23.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中氨基酸置換為N88R。
24.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中氨基酸置換為D20T。
25.權(quán)利要求22的融合蛋白，其中氨基酸置換為Q126D。
26.權(quán)利要求21或22的融合蛋白，其中所述氨基酸置換中的一個(gè)或多個(gè)對所述融合蛋白的IL-2Rβγ受體親和性相對于對所述蛋白的IL-2Rαβγ受體親和性具有差別效應(yīng)。
27.權(quán)利要求21或22的融合蛋白，其中差別效應(yīng)大于2倍并且定義為
28.含有IL-2部分和非IL-2部分的融合蛋白，所述非IL-2部分含有對所述融合蛋白的IL-2Rβγ受體親和性相對于對所述蛋白的IL-2Rαβγ受體親和性具有差別效應(yīng)的突變。
29.權(quán)利要求28的融合蛋白，其中所述差別效應(yīng)在約5倍到約10倍之間。
30.權(quán)利要求28的融合蛋白，其中所述差別效應(yīng)在約10倍到約1000倍之間。
31.權(quán)利要求28的融合蛋白，其中所述非IL-2部分含有抗體域。
32.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中所述抗體域含有IgGγ1域、IgGγ2域或IgGγ4域。
33.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中所述突變在所述抗體域中。
34.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中所述突變將SEQ ID NO1中的N改變?yōu)椴煌陌被帷?br> 35.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中所述N被變成Q。
36.權(quán)利要求32的融合蛋白，其中所述突變將SEQ ID NO2中的FN變成AQ。
37.權(quán)利要求31的融合蛋白，其含有SEQ ID NO35和SEQID NO36的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中所述抗體域含有IgGγ1域、IgGγ2域或IgGγ4域。
39.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中所述抗體域含有突變。
40.權(quán)利要求39的融合蛋白，其中所述突變將SEQ ID NO1中的N變?yōu)椴煌陌被帷?br> 41.權(quán)利要求40的融合蛋白，其中所述N被變成Q。
42.權(quán)利要求41的融合蛋白，其中所述突變將SEQ ID NO2中的FN變成AQ。
43.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中所述融合蛋白是含有SEQID NO35和SEQ ID NO36的氨基酸序列的兩個(gè)肽的二聚體。
44.一種改進(jìn)治療性融合蛋白的方法，所述融合蛋白含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合細(xì)胞表面不同受體的蛋白域，所述方法包括i.在兩種或多種體外分析中檢測所述融合蛋白的活性，所述分析對所述不同受體是特異的，ii.通過突變或化學(xué)或生物化學(xué)修飾法來修飾所述融合蛋白，iii.在所述兩種或多種分析中檢測所述修飾的融合蛋白，iv.鑒定相對于所述未修飾的融合蛋白在所述分析中活性受到差別影響的修飾的融合蛋白，v.在動(dòng)物中檢測所鑒定的修飾融合蛋白的活性。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述融合蛋白的所述修飾影響該融合蛋白的部分與所述部分的受體的相互作用。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述受體存在于一種或多種所述體外分析中。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述體外分析是基于細(xì)胞的分析。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述分析利用表達(dá)IL-2Rαβγ或IL-2Rβγ或兩者的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療指數(shù)增加的細(xì)胞因子融合蛋白和增加這些融合蛋白的治療指數(shù)的方法。本發(fā)明融合蛋白能夠結(jié)合一種以上類型的在細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞因子受體，還能夠結(jié)合一種以上細(xì)胞類型。此外，本發(fā)明融合蛋白比相應(yīng)的天然發(fā)生的細(xì)胞因子在病人體內(nèi)顯示出更長的循環(huán)半衰期。
文檔編號C07K16/24GK1599867SQ02824279
公開日2005年3月23日 申請日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日
發(fā)明者S·D·吉利斯 申請人:默克專利有限公司