專利名稱：從發(fā)酵液收獲晶體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種簡單有效的從發(fā)酵液獲得結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液的方法。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)驚喜發(fā)現(xiàn)一種簡單有效的從發(fā)酵液生產(chǎn)結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液的方法，可用下步驟生產(chǎn)(a)用一或多種凝固劑(coagulant)和/或一或多種絮凝劑處理所述發(fā)酵液，及(b)從該凝固和/或絮凝的發(fā)酵液中用分離裝置分離所述發(fā)酵液的生物量(biomass)，從而得到結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種簡單有效的從發(fā)酵液生產(chǎn)結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液的方法。
本發(fā)明方法可被用到未處理過的發(fā)酵液或經(jīng)過首次處理，例如pH調(diào)節(jié)，溫度調(diào)節(jié)，和/或水稀釋的發(fā)酵液。
目的代謝物本發(fā)明目的代謝物可以是抗生素如青霉素或頭孢菌素，或化學商品如檸檬酸。所述代謝物也可以是蛋白，例如治療性蛋白如胰島素或酶。所述酶可以是水解酶，轉(zhuǎn)移酶，裂解酶，異構(gòu)酶，或連接酶。
在優(yōu)選實施方案中，所述方法可應用到蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纖維素酶，和氧化還原酶。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的蛋白酶，優(yōu)選微生物來源的蛋白酶，還包括了經(jīng)過化學修飾或蛋白工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶類蛋白酶。堿性蛋白酶的實例可以是枯草溶菌素，特別是那些來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)的蛋白酶，例如枯草溶菌素(subtilisin)Novo，枯草溶菌素Carlsberg，枯草溶菌素309，枯草溶菌素147和枯草溶菌素168(WO 89/06279)。胰蛋白酶類蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶，見WO 89/06270和WO 94/25583所述。
有用的蛋白酶的實例是見WO 91/00345，WO 92/19729，WO 98/20115，WO 98/20116和WO 98/34946所述的變異體，特別是在位置27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，195，206，218，222，224，235和274處發(fā)生一個或多個位點取代的變異體。
脂酶合適的脂酶包括細菌或真菌來源的脂酶，也包括了經(jīng)過化學修飾或蛋白工程化的脂酶突變體?？梢圆捎玫闹咐鐏碓从诟|(zhì)霉屬(與嗜熱酶屬(Thermomyces)同義)的脂酶，例如見EP 258 068和EP 305 216所述的來源于H.Lanuginosa(T.Lanuginosus)的脂酶或見WO 96/13580所述的來源于H.insolens的脂酶；假單胞菌屬脂酶，例如來源于P.alcaligenes或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，司徒茨氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌(P.fluorescens)，假單胞菌菌株(Pseudomonas sp.)株系SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢桿菌屬脂酶，例如來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(Dartois等，1993，Biochemica et BiophysicaActa，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
其它實例還可以采用見WO 92/05249，WO94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202所述中的脂酶變異體。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β-淀粉酶)包括細菌或真菌來源的淀粉酶，也包括了經(jīng)過化學修飾或蛋白工程化的淀粉酶突變體。淀粉酶包括了，例如見GB1,296,839詳述的來源于芽孢桿菌屬，例如來源于地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)特定株系的α-淀粉酶。
可以采用的淀粉酶實例有WO 94/02597，WO 94/18314，WO 96/23873和WO 97/43424所述的變異體，特別是在位置15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444處發(fā)生一個或多個位點取代的變異體。
纖維素酶合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的纖維素酶，也包括了經(jīng)過化學修飾或蛋白工程化的突變體。合適的纖維素酶包括了來源于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、草根霉屬(Thielavia)和支頂孢屬(Acremonium)的纖維素酶，例如公開于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757和WO 89/09259的來源于Humicola insolens、嗜熱毀絲霉菌(Myceliophthora thermophila)和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是帶有護色效果(colour care benefits)的堿性或中性纖維素酶，所述纖維素酶的實例見EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397和WO 98/08940所述的纖維素酶。其它實例為WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544所述的纖維素酶變異體。
氧化還原酶根據(jù)本發(fā)明處理的氧化還原酶包括過氧化物酶(EC 1.11.1.7)和氧化酶，如漆酶和過氧化氫酶(EC 1.11.1.6)。
過氧化物酶本發(fā)明方法所用的過氧化物酶優(yōu)選由真菌或細菌等微生物產(chǎn)生。
特別優(yōu)選鬼傘屬過氧化物酶，特別是長根鬼傘(C.macrorhizus)或灰蓋鬼傘(C.cinereus)過氧化物酶，或其變體。
漆酶及漆酶相關(guān)酶
在本發(fā)明范疇，漆酶及漆酶相關(guān)酶是指酶分類(EC 1.10.3.2)包含的任何漆酶，酶分類(EC 1.10.3.1)包含的任一chatechol氧化酶，酶分類(EC 1.3.3.5)包含的任一膽紅素氧化酶或酶分類(EC 1.14.18.1)包含的任一單酚單加氧酶。
微生物漆酶可以來源于細菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，合適的實例有來源于如下菌株的漆酶曲霉屬，脈孢菌屬(Neurosrora)，例如粗糙脈孢霉(N.crassa)，Podospora，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)，栓菌屬，例如T.villosa和T.verdicolor，絲核菌屬(Rhizoctonia)，例如茄屬絲核菌(R.solani)，鬼傘屬，例如褶紋鬼傘(C.plicatilis)和灰蓋鬼傘，小脆柄菇屬(Psatyrella)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，例如嗜熱毀絲霉菌，Schytalidium，多孔菌屬(Polyporus)，例如P.pinsitus，射脈菌屬(Phlebia)，例如輻射射脈菌(P.radita)(WO 92/01046)或革蓋菌屬(Coriolus)，例如毛革蓋菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)。
發(fā)酵本發(fā)明發(fā)酵液可從本領域已知任何種屬的任何微生物獲得。
在優(yōu)選實施方案中，所述目的代謝物可從細菌或真菌來源獲得。例如，所述目的代謝物可得自革蘭氏陽性細菌如芽胞桿菌菌株，例如嗜堿芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌，短芽胞桿菌，環(huán)狀芽胞桿菌，凝結(jié)芽胞桿菌，燦爛芽胞桿菌，遲緩芽胞桿菌，Bacillus clausii，蘚樣芽胞桿菌，巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，或蘇云金芽胞桿菌；或鏈霉菌屬菌株，例如青色鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌；或得自革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌或假單胞菌菌株。
所述目的代謝物可得自真菌來源，例如來自酵母菌株如念珠菌屬，克魯維酵母屬，畢赤酵母屬，酵母菌(Saccharomyces)，裂殖酵母屬，或Yarrowia菌株，例如卡爾酵母，釀酒酵母，糖化酵母，Saccharomyces douglasii，克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)，諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。
在優(yōu)選實施方案中所述目的代謝物可得自絲狀真菌菌株如支頂孢屬，曲霉屬，短梗霉屬，隱球菌屬，F(xiàn)ilibasidium，鐮孢菌屬，腐質(zhì)霉屬，Magnaporthe，毛霉，毀絲霉屬，Neocallimastix，鏈孢霉屬，擬青霉屬，青霉菌，Piromyces，裂褶菌屬，踝節(jié)菌屬，Thermoascus，Thielavia，Tolypocladium，或木霉屬菌株，特別的是，所述目的代謝物可得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamor)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，F(xiàn)usarium cereals，F(xiàn)usarium crookwellense，大刀鐮孢(Fusarium culmorum)，禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)，禾赤鐮孢(Fusarium graminum)，異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)，合歡木鐮孢(Fusarium negundi)，尖鐮孢(Fusarium oxysporum)，多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)，粉紅鐮孢(Fusarium roseum)，接骨木鐮孢(Fusarium sambucmum)，膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)，擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)，F(xiàn)usarium sulphureum，F(xiàn)usarium torulosum，F(xiàn)usarium trichothecioides，F(xiàn)usarium venenatum，Humicola insolens，Humicola lanuginosa，米黑毛霉(Mucor miehei)，Myceliophthora thermophila，粗糙脈孢霉，產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)，Trichoderma harzianum，康寧木霉(Trichodermakoningii)，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei，或綠色木霉(Trichoderma viride)菌株。
這些種屬的菌株在一些培養(yǎng)物保藏中心可容易為公眾獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，真菌菌種保藏中心(CBS)，和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利保藏中心，北方地區(qū)研究中心(Northern Regional Research Center)(NRRL)。
為本發(fā)明目的，與已知來源相連的本文術(shù)語“從......獲得”意味著所述目的代謝物由所述來源或已插入來自所述來源的基因的細胞生產(chǎn)。
所述微生物菌株可用任何本領域已知方法發(fā)酵。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是含復合物氮和/或碳源的復合物培養(yǎng)基，如大豆粉(meal)，棉花籽粉，玉米浸泡液，酵母提取物，酪蛋白水解物，糖蜜等等。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是化學成分確定培養(yǎng)液，例如，如WO 98/37179所限定。
所述發(fā)酵可以分批進料(fed-batch)，重復分批進料或持續(xù)的發(fā)酵過程進行。
凝固劑和絮凝劑根據(jù)本發(fā)明可用的凝固劑可以是鹽，如選自第I族金屬鹽，第II族金屬鹽，和第III族金屬鹽，或其混合物；特別是鈣鹽，鎂鹽和鋁鹽。優(yōu)選鹽為銨鹽，磷酸鹽，硫酸鹽，碳酸鹽和檸檬酸鹽。鹵化物鹽，甲酸鹽和乙酸鹽也可應用，尤其是鹽酸鹽如氯化鈣。
可用鹽濃度在0.1-40％(w/w)的范圍；優(yōu)選在0.2-20％(w/w)的范圍；更優(yōu)選在0.3-6％(w/w)的范圍。
根據(jù)本發(fā)明其它可用的凝固劑為短鏈聚合物，特別是分子量在20道爾頓到500000道爾頓范圍的陽離子聚合物，如叔聚胺或季聚胺，例如從CytecIndustries獲得的C521，Poly-DADMAC′s(2-丙烯基二甲基氯化銨)，例如C591，或鋁源如聚水合氯化鋁Al2(OH)5Cl，例如從Gulbrandsen得到的GC850。
可用短鏈聚合物濃度通常在0.1-25％(w/w)的范圍；優(yōu)選在0.2-20％(w/w)的范圍；更優(yōu)選在0.3-15％(w/w)的范圍。
通常有利的是加入一種以上的凝固劑，例如鹽和一或多種短鏈聚合物。
根據(jù)本發(fā)明可用的絮凝劑可以是無機和/或有機聚合物，可以為陽離子，陰離子或非離子的。
可用陽離子聚合物是聚胺，可用陰離子聚合物是聚丙烯酰胺。
可用聚合物濃度在0.01-1.0％(w/w)的范圍；優(yōu)選在0.05-0.5％(w/w)的范圍。
分離裝置根據(jù)本發(fā)明可用的分離裝置為任何設計樣式的兩相離心機，特別是連續(xù)排泥(sludge decharging)離心機，傾析器(decanter)或旋流器(cyclone)。
可能在一些情況下將絮凝物，特別是陰離子聚合物加入所述分離裝置是有利的，從而可避免所述結(jié)晶和/或無定形懸液中的生物量(見實施例1)。
結(jié)晶和/或無定形懸液可以凝固和/或絮凝所述代謝物發(fā)酵液以使所述結(jié)晶和/或無定形代謝物在正確(right)的分離區(qū)，并因此可在例如離心過程中分離為生物量部分(代謝物濃度很低)，結(jié)晶和/或無定形代謝物組分(代謝物濃度高)及上清部分(代謝物濃度很低)中。所述凝固和/或絮凝的作用使所述結(jié)晶和/或無定形代謝物不會摻合成群，所以在分離所述生物量后所述結(jié)晶和/或無定形代謝物可被進一步濃縮來達到需要的產(chǎn)量。
根據(jù)本發(fā)明得到的懸液可用多種方法進一步純化，如通過研磨，篩選，干燥，過濾，離心，重結(jié)晶，層析方法，吸附過程和/或兩相提取。
本發(fā)明進一步闡述如下實施例，并不是為了限制本發(fā)明所要求的范圍。
實施例1從發(fā)酵液收獲蛋白酶晶體用本發(fā)明方法處理含有WO 91/00345所公開的得自芽孢桿菌菌株(Bacillus sp.)的突變枯草溶菌素的發(fā)酵液。
所述蛋白酶發(fā)酵液基于下述凝固/絮凝配方以生產(chǎn)規(guī)模運行溫度12℃稀釋用水兩倍CaCl2(36％ w/w)4.7％C521(17％ w/w)12.0％GC-850(20％ w/w)5.0％氫氧化鈉(3％ w/w)pH 7.5用一整批蛋白酶用Westfalia SB60離心機進行本試驗。所述進料含17-20％濕泥體積。
所用離心機裝備了噴嘴碗(nozzle bowl)和4m3/hr的標準化泥流量。
本實驗進行了21小時，其中所述進料流量是從7.5m3/hr逐步遞增到9.5m3/hr。
為避免離心濾液中的生物量，以7.5m3/hr以上的進料流量加入陰離子聚合物。
所用的陰離子聚合物溶液是0.15％(w/w)(聚丙烯酰胺)。
測量在所述試驗過程中離心濾液中的濕晶體百分比容量并將其用作產(chǎn)量指示。
表1顯示結(jié)果。
用兩個Alfa Laval NX418傾析器，而不用Westfalia SB60離心機來作第一步提取進行試驗。
所述試驗顯示所述離心過程從生產(chǎn)能力和產(chǎn)量來說優(yōu)于所述傾析器過程。
表1

實施例2從發(fā)酵液收獲α-淀粉酶晶體發(fā)酵在WO95/26397的SEQ ID NO2公開的得自芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶，如WO96/23873所述它具有雙缺失(D1830*+G184*)。
從生產(chǎn)收獲槽中取出所述α-淀粉酶發(fā)酵液，基于下述絮凝配方在實驗室進行試驗溫度12℃稀釋用水兩倍CaCl2(36％w/w)4.7％C521(17％w/w)12.0％GC-850(20％w/w)5.0％
氫氧化鈉(3％w/w)pH 7.5可以絮凝所述α-淀粉酶發(fā)酵液，從而所述酶晶體在正確的分離區(qū)(限度顆粒(limits particles))并因而可以在離心步驟中被分離。
所述絮凝液上清的活性顯示溶液中只有0.8％的α-淀粉酶。
權(quán)利要求
1.從發(fā)酵液生產(chǎn)結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液的方法，其包括(a)用一或多種凝固劑和/或一或多種絮凝劑處理所述發(fā)酵液，及(b)從該凝固和/或絮凝的發(fā)酵液中用分離裝置分離所述發(fā)酵液的生物量，從而得到結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述代謝物是蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白是酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述酶是蛋白酶，脂肪酶，纖維素酶，淀粉酶或氧化還原酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述凝固劑選自鹽和短鏈聚合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述鹽選自鈣鹽，鎂鹽和鋁鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述短鏈聚合物分子量在從20道爾頓到500000道爾頓的范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述絮凝劑是聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述聚合物是陽離子或陰離子聚合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述聚合物是多胺或聚丙烯酰胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述分離裝置選自離心機，傾析器和旋流器。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述離心機是連續(xù)排泥離心機。
全文摘要
一種從發(fā)酵液中生產(chǎn)結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液的方法，包括用一或多種凝固劑和/或一或多種絮凝劑處理所述發(fā)酵液；并從該凝固和/或絮凝的發(fā)酵液中用分離裝置分離所述發(fā)酵液的生物量，從而得到結(jié)晶和/或無定形代謝物懸液。
文檔編號C07K1/36GK1599795SQ02824311
公開日2005年3月23日 申請日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者本尼·尼爾森, 安德斯·蘭克-馬德森, 馬丁·T·喬根森 申請人:諾維信公司