免疫特異性結(jié)合trail受體的抗體的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化學(xué)裝置的制造及其處理,應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：免疫特異性結(jié)合trail受體的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫特異性結(jié)合TRAIL受體，TR7的抗體及相關(guān)分子。這些抗體具有，例如預(yù)防和治療癌癥和其它增殖性紊亂的用途。本發(fā)明還涉及編碼抗TR7抗體的核酸分子，含有這些核酸的載體和宿主細(xì)胞，及生產(chǎn)它們的方法。本發(fā)明涉及用于預(yù)防、檢測(cè)、診斷、治療或減輕疾病或紊亂，尤其癌癥和其它過(guò)度增殖性紊亂的方法及組合物，包括給予動(dòng)物，優(yōu)選人有效量的免疫特異性結(jié)合TR7的一或多種抗體或其片段或變體，或者相關(guān)分子。
背景技術(shù)：
許多生物學(xué)功能，例如對(duì)某些刺激的應(yīng)答及天然生物學(xué)過(guò)程，是由一些因子如細(xì)胞因子控制的。許多細(xì)胞因子通過(guò)結(jié)合受體并產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答而通過(guò)受體起作用。
例如，腫瘤壞死因子(TNF)α和β是通過(guò)TNF受體起作用的細(xì)胞因子，其調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過(guò)程，包括防止感染及誘導(dǎo)休克和炎性疾病。TNF分子屬于“TNF-配體”超家族，并與其受體或反配體即“TNF-受體”超家族一起發(fā)揮作用。迄今為止，已經(jīng)鑒別了TNF-配體超家族的至少18個(gè)成員，并且定性了TNF-受體超家族的至少19個(gè)成員(見例如Locksley等，Cell(2001)104487-501)。
在這些配體中，包括TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也已知為TNF-β)，LT-β(在復(fù)合異源三聚體LT-α2-β中發(fā)現(xiàn))，F(xiàn)asL，CD40L，CD27L，CD30L，4-1BBL，OX40L和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)。TNF受體的超家族包括p55TNF受體，p75TNF受體，TNF受體相關(guān)蛋白，F(xiàn)AS抗原或APO-1，CD40，CD27，CD30，4-1BB，OX40，低親和性p75和NGF-受體(Meager，A.，Biologicals 22291-295(1994))。
TNF配體超家族的許多成員由激活的T細(xì)胞表達(dá)，提示它們是T細(xì)胞與構(gòu)成細(xì)胞個(gè)體發(fā)生和功能基礎(chǔ)的其它類型細(xì)胞的相互作用所必需的(Meager，A.，如前)。
從廢除這些蛋白質(zhì)表達(dá)的突變體的鑒別和產(chǎn)生中獲得了對(duì)TNF受體家族一些成員基本功能的相當(dāng)多的認(rèn)識(shí)。例如，在FAS抗原及其配體中天然存在的突變導(dǎo)致淋巴增殖性疾病(Watanabe-Fukunaga，R.等，Nature 356314(1992))，這也許反映了編程性細(xì)胞死亡的失敗。CD40配體的突變導(dǎo)致X連鎖的免疫缺陷狀態(tài)，其特征在于血漿中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明錯(cuò)誤的(faulty)T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞激活(Allen，R.C.等，Science 259990(1993))。低親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的定向突變導(dǎo)致特征在于錯(cuò)誤感覺(jué)周圍結(jié)構(gòu)更新的病變(Lee，K.F.等，Cell 69737(1992))。
TNF和LT-α能結(jié)合兩種TNF受體(55-kd和75-kd TNF受體)。由TNF和LT-α通過(guò)其受體作用而激發(fā)的大量生物學(xué)作用包括移植腫瘤的出血性壞死，胞毒性，在內(nèi)毒性休克中的作用，炎癥，免疫調(diào)節(jié)，增殖和抗病毒應(yīng)答，以及抗致電離輻射的有害影響的保護(hù)作用。TNF和LT-α參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制，包括內(nèi)毒性休克，腦型瘧，腫瘤，自身免疫疾病，AIDS和移植物—宿主排斥(Beutler，B.和Von Huffel，C.，Science 264667-668(1994))。p55受體中的突變導(dǎo)致對(duì)微生物感染的易感性增加。
另外，TNFR1(p55)和Fas的C末端附近的一個(gè)大約80個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域被報(bào)道為“死亡結(jié)構(gòu)域”，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的信號(hào)(Tartaglia等，Cell 74845(1993))。
凋亡，或編程性細(xì)胞死亡是多細(xì)胞生物體正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所必需的一種生理學(xué)過(guò)程(H.Steller，Science 267，1445-1449(1995))。編程性細(xì)胞死亡的紊亂是一些人體疾病的發(fā)病機(jī)制，所述疾病包括癌癥，神經(jīng)退行性紊亂及獲得性免疫缺陷綜合征(C.B.Thompson，Science 267，1456-1462(1995))。最近，兩種細(xì)胞表面死亡受體Fas/APO-1和TNFR-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物學(xué)功能受到許多關(guān)注(J.L.Cleveland等，Cell 81，479-482(1995)；A.Fraser等，Cell 85，781-784(1996)；S.Nagata等，Science 267，1449-56(1995))。這兩者均是TNF受體家族成員，該家族還包括TNFR-2，低親和性NGFR，CD40和CD30等(C.A.Smith等，Science 248，1019-23(1990)；M.Tewari等，in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M.Purton，Heldin，Carl編輯(Chapman和Hall，倫敦，1995)。雖然家族成員通過(guò)在胞外結(jié)構(gòu)域中存在富半胱氨酸重復(fù)而鑒定，但Fas/APO-1和TNFR-1還共有一個(gè)胞內(nèi)同源區(qū)域，其合適地被稱為“死亡結(jié)構(gòu)域”，其與果蠅自殺基因reaper遠(yuǎn)緣相關(guān)(P.Golstein等，Cell81，185-6(1995)；K.White等，Science 264，677-83(1994))。這個(gè)共有的死亡結(jié)構(gòu)域提示這兩種受體均與直至最近仍未鑒別的一相關(guān)系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用。Fas/APO-1的激活募集含有死亡結(jié)構(gòu)域的銜接(adapter)分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan等，Cell 81，505-12(1995)；M.P.Boldin等，J.Biol Chem 270，7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO 14，5579-5588(1995))，其繼而結(jié)合并可能激活FLICE/MACH1，F(xiàn)LICE/MACH1是促凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的成員(M.Muzio等，Cell 85，817-827(1996)；M.P.Boldin等，Cell 85，803-815(1996))。盡管Fas/APO-1的中心作用是觸發(fā)細(xì)胞死亡，但TNFR-1還可以引發(fā)一系列不同生物活性，其中許多活性是基于其激活NF-κB的能力(L.A.Tartaglia等，ImmunolToday 13，151-3(1992))。因此，TNFR-1募集多價(jià)銜接分子TRADD，其類似于FADD，也含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(H.Hsu等，Cell 81，495-504(1995)；H.Hsu等，Cell 84，299-308(1996))。通過(guò)其與許多信號(hào)分子包括FADD，TRAF2和RIP的締合，TRADD可以引發(fā)編程性細(xì)胞死亡和NF-κB激活(H.Hsu等，Cell 84，299-308(1996)；H.Hsu等，Immunity 4，387-396(1996))。
一種TNF相關(guān)的編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)配體已經(jīng)由一些研究小組報(bào)道，并已經(jīng)命名為凋亡誘導(dǎo)分子I(AIM-I)(國(guó)際申請(qǐng)No.WO97/33899)及TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體或(TRAIL)(Wiley，S.R.等，Immunity 3673-682(1995))。Pitti，R.M.等將這種新分子稱為Apo-2配體或(Apo-2L)。為方便起見，本文中稱為TRAIL。TRAIL的氨基酸序列示于SEQ ID NO72。
與轉(zhuǎn)錄物似乎大部分限制于激活的T細(xì)胞中的FAS配體不同，在許多組織中均可見高水平的TRAIL，并且其由一些細(xì)胞系組成型轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)示出TRAIL不依賴于FAS配體而起作用(Wiley，S.R.等(1995)，如前)。Marsters，S.A.等的研究已經(jīng)表明TRAIL迅速激活凋亡，其時(shí)間框架與FAS/Apo-1L發(fā)出的死亡信號(hào)相似，但比TNF誘導(dǎo)的凋亡快得多(Current Biology 6750-752(1996))。
已經(jīng)鑒別了5種TRAIL受體，包括TR7(也稱為TRAIL受體1(TRAIL-R1)和死亡受體4(DR4)，Pan等，Science 276111-3(1997)，國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO98/32856，WO00/67793，WO99/37684，WO2000/34355；WO99/02653，SEQ ID NO1)；TR7(也稱為TRAIL受體2(TRAIL-R2)，DR5和KILLER，Pan等，Science 277815-8(1997)，Sheridan等，Science 277818-21(1997)，Chaudhury等，Immunity 7821-30(1997)，國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO98/46643，WO99/09165，WO99/11791，WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986，SEQ ID NO3)；TR1(也稱為蝕骨抑制蛋白(Osteoprotegrin)(OPG)破骨細(xì)胞發(fā)生抑制因子(OCIF)，TNFRSF11B和FTHMA-090(國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO98/12344，WO2000/54651，WO2001/04137，WO66/26217，WO98/07840，WO2000/21554，WO99/53942和WO2001/03719，SEQ ID NO5)；TR5(也稱為TRAIL受體3(TRAIL-R3)，decoy受體1(DcR1)和TRID)(Degli-Esposti等，J.Exp.Med.1861165-70(1997)，國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO98/30693，WO00/71150，WO99/00423，EP867509，WO98/58062，SEQ ID NO2)；和TR10(也稱為TRAIL受體4(TRAIL-R4)，DcR2和TRUNDD，Pan等，F(xiàn)EBS Lett.42441-5(1998)，Degli-Eposti等，Immunity 7813-20(1997)，國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO98/54202，WO00/73321，WO2000/08155，WO99/03992，WO2000/34355和WO9910484，SEQ ID NO4)。TR7和TR7在其胞質(zhì)尾區(qū)中含有死亡結(jié)構(gòu)域，這些受體的觸發(fā)引起凋亡。另一方面，TR1，TR5和TR10可以分別抑制由胞毒性配體TRAIL誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡，部分是由于其不存在胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域截短所致。上述引用的所有出版物和專利在此均以其全文并入?yún)⒖?，特別是這些文獻(xiàn)中所揭示的TRAIL受體的核苷酸和氨基酸序列。
在哺乳動(dòng)物的生物學(xué)過(guò)程中，TNF家族配體和TNF家族受體的作用多種多樣，并影響許多正常及異常功能。因此明顯需要對(duì)在正常和病理狀態(tài)下影響TNF受體生物學(xué)活性的組合物如抗體進(jìn)行鑒別和定性。特別是需要分離和定性調(diào)節(jié)TRAIL受體生物學(xué)活性的抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明涵蓋了免疫特異性結(jié)合TR7多肽或TR7多肽片段或TR7變體的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。本發(fā)明特別涵蓋了免疫特異性結(jié)合人TR7多肽如SEQ ID NO3所示的人TR7多肽或多肽片段或變體的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合TR7多肽的抗體也結(jié)合TR7(例如SEQ ID NO3)，但不結(jié)合其它蛋白質(zhì)，包括TR1，TR5和TR10(SEQ ID NO5，2和4)。
本發(fā)明涉及預(yù)防，治療或減輕疾病或紊亂的方法和組合物，包括給予動(dòng)物、優(yōu)選人以有效量的免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的一或多種抗體或其片段或變體，或者相關(guān)分子。在特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防，治療或減輕與TR7功能或TR7配體功能或者異常TR7或TR7配體表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂的方法和組合物，包括給予動(dòng)物、優(yōu)選人以有效量的免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的一或多種抗體或其片段或變體或者相關(guān)分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基于抗體的預(yù)防，治療或減輕癌癥及其它過(guò)度增殖性紊亂(例如白血病，癌和淋巴瘤)的方法和組合物?？梢杂帽景l(fā)明抗體治療，預(yù)防或減輕的其它疾病和紊亂包括但不限于神經(jīng)退行性紊亂(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和亨廷頓舞蹈病(Huntington’sdisease))，免疫紊亂(例如狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，重癥肌無(wú)力，橋本病(Hashimoto’s disease)和免疫缺陷綜合征)，炎性紊亂(例如哮喘，過(guò)敏性紊亂和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，傳染病(例如AIDS，皰疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性紊亂。
本發(fā)明還涵蓋了檢測(cè)，診斷或預(yù)后疾病或紊亂的方法或組合物，包括給予動(dòng)物、優(yōu)選人以有效量的免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的一或多種抗體或其片段或變體或者相關(guān)分子。在特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明還涵蓋了檢測(cè)，診斷或預(yù)后與TR7功能或TR7配體功能或者異常TR7或TR7配體表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂的方法和組合物，包括給予動(dòng)物、優(yōu)選人以有效量的免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的一或多種抗體或其片段或變體或者相關(guān)分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基于抗體的方法和組合物，以檢測(cè)，診斷或預(yù)后癌癥及其它過(guò)度增殖性紊亂(例如白血病，癌和淋巴瘤)。可以用本發(fā)明抗體檢測(cè)，診斷或預(yù)后的其它疾病和紊亂包括但非限于神經(jīng)退行性紊亂(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和亨廷頓舞蹈病)，免疫紊亂(例如狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，重癥肌無(wú)力，橋本病和免疫缺陷綜合征)，炎性紊亂(例如哮喘，過(guò)敏性紊亂和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，傳染病(例如AIDS，皰疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性紊亂。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于預(yù)防，診斷，預(yù)后，治療或減輕以下類型癌癥的方法和組合物中乳腺癌，肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌)，結(jié)腸癌，尿道癌，膀胱癌，腎癌，胰腺癌，肝癌，胃癌，前列腺癌，白血病，非霍奇金淋巴瘤，食管癌，腦癌，白血病，卵巢癌，睪丸癌，黑素瘤，子宮癌，宮頸癌，喉癌，直腸癌，及口腔癌。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與化療劑如紫杉醇(Taxol)，依立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)，依立替康類似物及吉西他濱(gemcitabine)(GEMZARTM)組合施用。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括本發(fā)明抗體作為監(jiān)測(cè)TR7在細(xì)胞上表達(dá)的診斷工具的應(yīng)用。
本發(fā)明人產(chǎn)生了免疫特異性結(jié)合TR7多肽(例如SEQ ID NO3)的單鏈Fv(scFv)。因此，本發(fā)明涵蓋了表1中列舉的這些scFv。另外，本發(fā)明還涵蓋了工程化表達(dá)相應(yīng)于這些scFv的抗體的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏日如表1所示，ATCC保藏號(hào)也示于表1。ATCC位于美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯市大學(xué)大道10801號(hào)，郵編20110-2209。ATCC保藏物是根據(jù)國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏專利程序的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行保藏。
另外，本發(fā)明涵蓋了編碼scFv的多核苷酸以及scFv的氨基酸序列。本發(fā)明還涵蓋了免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的包含或者由這些scFv的片段或變體(例如具有表1所示任一scFv的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，VH CDR，VL結(jié)構(gòu)域或VL CDR)組成的分子，及編碼這些抗體和/或分子的核酸分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了結(jié)合TR7或其片段或變體的胞外區(qū)域/結(jié)構(gòu)域的抗體或其片段或變體。
本發(fā)明還提供了結(jié)合TR7多肽的抗體，該TR7多肽偶聯(lián)于一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記如酶，熒光標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記。本發(fā)明還提供了結(jié)合TR7多肽的抗體，該TR7多肽偶聯(lián)于一治療性或胞毒性制劑。本發(fā)明還提供了結(jié)合TR7多肽的抗體，該TR7多肽偶聯(lián)于一種放射性物質(zhì)。
本發(fā)明還提供了結(jié)合TR7多肽的抗體，其作為TR7興奮劑或TR7拮抗劑起作用。在特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體刺激TR7表達(dá)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。在其它特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體抑制TRAIL結(jié)合TR7。在另外的特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體上調(diào)TR7表達(dá)。
本發(fā)明還提供了抑制TR7表達(dá)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的抗體。在其它特異性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體下調(diào)TR7表達(dá)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的解離常數(shù)(KD)為10-7M或更低。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的解離常數(shù)(KD)為10-9M或更低。
本發(fā)明還提供了在相同濃度下比TRAIL多肽刺激TR7表達(dá)細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡更好的刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體。
本發(fā)明還提供了在有或無(wú)抗體交聯(lián)劑的情況下同樣地刺激TR7表達(dá)細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗體；和/或在沒(méi)有交聯(lián)抗體或其它交聯(lián)劑的情況下與相同濃度TRAIL相比以同樣或更好的強(qiáng)度刺激編程性細(xì)胞死亡的抗體。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的解離速率(off rate，Koff)為10-3/秒或更低。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的解離速率(Koff)為10-4/秒或更低。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的解離速率(Koff)為10-5/秒或更低。
本發(fā)明還提供了相對(duì)于它們結(jié)合其它蛋白質(zhì)(包括TR1，TR5和TR10)的能力優(yōu)先結(jié)合TR7和/或TR7的抗體。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的性質(zhì)，如以下實(shí)施例中所述，使它們成為比先前揭示的TR7結(jié)合抗體更好的治療劑。
本發(fā)明還提供了抗體組(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，其中組中成員相應(yīng)于本發(fā)明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多個(gè)不同的抗體(例如完整抗體，F(xiàn)abs，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)d片段，二硫鍵連接的Fvs(sdFvs)，抗獨(dú)特型(抗Id)抗體和scFvs)。本發(fā)明還提供了抗體的混合物，其中該混合物相應(yīng)于本發(fā)明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多個(gè)不同的抗體(例如完整抗體，F(xiàn)abs，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)d片段，二硫鍵連接的Fv(sdFv)，抗獨(dú)特型(抗Id)抗體和scFv))。本發(fā)明還提供了包含或由本發(fā)明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多個(gè)抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)組成的組合物。本發(fā)明的組合物可包含或由一或多個(gè)抗體或其片段或變體的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多個(gè)氨基酸序列組成?；蛘撸景l(fā)明的組合物可包含或由編碼本發(fā)明的一或多個(gè)抗體的核酸分子組成。
本發(fā)明還提供了融合蛋白，其包含一種本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)和一種異源多肽(即與抗體或抗體結(jié)構(gòu)域不相關(guān)的一種多肽)。本發(fā)明也涵蓋了編碼這些融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明的組合物可包含或由本發(fā)明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多種融合蛋白組成?；蛘?，本發(fā)明的組合物可包含或由編碼本發(fā)明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多種融合蛋白的核酸分子組成。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子如scFv，VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域)的核酸分子，其通常是分離的。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的一種宿主細(xì)胞及其子代。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了從核酸分子中表達(dá)本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)的一種方法。本發(fā)明的這些及其它方面在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。

圖1A-C示出在體外在存在或不存在環(huán)己酰亞胺的情況下，抗TR7抗體誘導(dǎo)MD-MBA-231和SW480細(xì)胞凋亡的能力。
圖2示出在Swiss nu/nu小鼠中抗TRAIL受體抗體處理對(duì)SW480腫瘤形成的作用。
發(fā)明詳述定義本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。由此，術(shù)語(yǔ)抗體不僅涵蓋了完整抗體分子，還涵蓋了抗體多聚體和抗體片段以及抗體、抗體多聚體及抗體片段的變體(包括衍生物)。在此術(shù)語(yǔ)“抗體”描述的分子例如包括但非限于單鏈Fv(scFv)，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2，二硫鍵連接的Fv(sdFv)，F(xiàn)v，及包含或由VL或VH結(jié)構(gòu)域組成的片段。術(shù)語(yǔ)“單鏈Fv”或“scFv”是指一種多肽，其包含與抗體VH結(jié)構(gòu)域連接的抗體VL結(jié)構(gòu)域。免疫特異性結(jié)合TR7的抗體與其它抗原可有交叉反應(yīng)性，例如另一種TRAIL受體。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合TR7的抗體與其它抗原(例如其它TRAIL受體或腫瘤壞死因子受體超家族的其它成員)不交叉反應(yīng)。免疫特異性結(jié)合TR7的抗體可以例如通過(guò)免疫分析或其它本領(lǐng)域已知技術(shù)鑒別，例如以下實(shí)施例中描述的免疫分析。
本發(fā)明的抗體包括但非限于單克隆抗體，多特異性抗體，人抗體或嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab’)片段，抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括例如本發(fā)明抗體的抗Id抗體)，胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體(即內(nèi)抗體)，及上述任一種抗體的表位結(jié)合片段。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA，和IgY)，類別(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亞類。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體包含或由具有表1所示任一氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域、VH CDR、VL結(jié)構(gòu)域或VL CDR、或其片段或變體組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1同種型。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白是IgG4同種型。免疫球蛋白可以既具有重鏈又具有輕鏈。IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY一系列重鏈可以與κ或λ形式的輕鏈成對(duì)。
本發(fā)明的抗體還可以包括抗體的多聚體形式。例如，本發(fā)明的抗體可采取單體免疫球蛋白分子的二聚體、三聚體或更高等級(jí)多聚體抗體形式。完整免疫球蛋白分子或F(ab’)2片段的二聚體是四價(jià)的，而Fab片段或scFV分子的二聚體是二價(jià)的?？贵w多聚體內(nèi)的各個(gè)單體可以相同或不同，即它們可以是異源或同源抗體多聚體。例如，多聚體內(nèi)的各個(gè)抗體可以具有相同或不同結(jié)合特異性?？贵w的多聚體化可以通過(guò)抗體的自然聚合或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)或重組連接技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，一些純化的抗體制品(例如純化的IgG1分子)自然形成含有抗體同源二聚體及其它較高等級(jí)抗體多聚體的蛋白質(zhì)集合體?；蛘?，抗體同源二聚體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)連接方法形成。例如，可以使用異源雙重功能交聯(lián)劑包括但非限于SMCC(琥珀酰亞氨基-4-(馬來(lái)酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧基酯(succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)和SATA(N-琥珀酰亞氨基S-乙酰硫代乙酸酯(N-succinimidylS-acetylthio-acetate))(可例如得自Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL))以形成抗體多聚體。形成抗體同源二聚體的一個(gè)方案例如由Ghetie等，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA(1997)947509-7514所提供，在此以其全文并入?yún)⒖肌？贵w同源二聚體可通過(guò)用胃蛋白酶消化而轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab’2同源二聚體。形成抗體同源二聚體的另一種方式是通過(guò)使用Zhao和Kohler，The Journalof Immunology(2002)25396-404所述autophilic T15肽形成抗體同源二聚體，在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 或者，抗體可以通過(guò)重組DNA技術(shù)而產(chǎn)生多聚體。IgM和IgA通過(guò)與J鏈多肽相互作用而天然形成抗體多聚體。非IgA或非IgM分子，如IgG分子可以工程化為含有IgA或IgM的J鏈相互作用結(jié)構(gòu)域，從而賦予在非IgA或非IgM分子上形成較高等級(jí)多聚體的能力(見例如Chintalacharuvu等(2001)Clinical Immunology 10121-31，及Frigerio等(2000)Plant Physiology 1483-94，這兩個(gè)文獻(xiàn)在此全文并入?yún)⒖?。ScFv二聚體也可通過(guò)本領(lǐng)域已知重組技術(shù)形成，構(gòu)建scFV二聚體的一個(gè)實(shí)施例由Goel等(2000)Cancer Research 606964-6971提供，在此全文并入?yún)⒖?。抗體多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法純化，包括但非限于大小排阻層析。
除非在該說(shuō)明書特別限定，抗TR7抗體的特異性結(jié)合或免疫特異性結(jié)合是指抗TR7抗體結(jié)合TR7但不明顯結(jié)合(即交叉反應(yīng))除了TR7之外的蛋白質(zhì)，如相同蛋白質(zhì)家族的其它蛋白質(zhì)。結(jié)合TR7蛋白質(zhì)及與其它蛋白質(zhì)不交叉反應(yīng)的抗體非必需是在所有條件均不結(jié)合所述其它蛋白質(zhì)的抗體，而是本發(fā)明的TR7特異性抗體與其結(jié)合所述其它蛋白質(zhì)的能力相比優(yōu)先結(jié)合TR7，因此適用于至少一種類型的分析或治療中，即在治療中給出低背景水平或者不產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)牟焕饔?。本領(lǐng)域熟知蛋白質(zhì)由抗體結(jié)合的部分稱為表位。表位可以是線性(即包含蛋白質(zhì)序列中的連續(xù)氨基酸殘基)或構(gòu)象的(即包含在蛋白質(zhì)原始結(jié)構(gòu)中不連續(xù)的一或多個(gè)氨基酸殘基，但在蛋白質(zhì)的二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)中相連續(xù))。已知TR7特異性抗體結(jié)合TR7的表位，因此根據(jù)TR7片段或變體中已知TR7特異性抗體結(jié)合的表位的存在與否，特異性結(jié)合TR7的抗體可以或不可以結(jié)合TR7和/或TR7變體(例如與TR7至少90％相同的蛋白質(zhì))的片段。另外，根據(jù)同源物中所述抗體識(shí)別的表位的存在與否，本發(fā)明的TR7特異性抗體可以結(jié)合TR7的同源物種(包括其片段)。另外，本發(fā)明的TR7特異性抗體可以結(jié)合修飾形式的TR7，例如TR7融合蛋白。在這種情況中，當(dāng)本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7融合蛋白時(shí)，所述抗體必須與融合蛋白的TR7部分接觸以特異性結(jié)合。特異性結(jié)合TR7的抗體可例如通過(guò)免疫分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法鑒別，例如以下實(shí)施例中所述免疫分析。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了免疫特異性或特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體。免疫特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體特異性結(jié)合或免疫特異性結(jié)合是指所述抗體結(jié)合TR7和TR4，但不明顯結(jié)合(即交叉反應(yīng))除了TR7或TR4之外的蛋白質(zhì)，如相同蛋白質(zhì)家族中的其它蛋白質(zhì)。結(jié)合TR7和TR4蛋白質(zhì)及與其它蛋白質(zhì)不交叉反應(yīng)的抗體非必需是在所有條件均不結(jié)合所述其它蛋白質(zhì)的抗體，而是免疫特異性或特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體與其結(jié)合所述其它蛋白質(zhì)的能力相比優(yōu)先結(jié)合TR7和TR4，因此適用于至少一種類型的分析或治療中，即在治療中給出低背景水平或者不產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)牟焕饔?。本領(lǐng)域熟知蛋白質(zhì)由抗體結(jié)合的部分稱為表位。表位可以是線性(即包含蛋白質(zhì)序列中的連續(xù)氨基酸殘基)或構(gòu)象的(即包含在蛋白質(zhì)原始結(jié)構(gòu)中不連續(xù)的一或多個(gè)氨基酸殘基，但在蛋白質(zhì)的二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)中相連續(xù))。已知結(jié)合TR7和TR4的抗體結(jié)合TR7和TR4的共同表位，因此根據(jù)TR7或TR4片段或變體中已知抗體結(jié)合的表位的存在與否，特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體可以或不可以結(jié)合TR7，TR4和/或TR7或TR4的變體(例如分別與TR7或TR4至少90％相同的蛋白質(zhì))的片段。另外，根據(jù)同源物中所述抗體識(shí)別的表位的存在與否，免疫特異性結(jié)合TR7和TR4的本發(fā)明抗體可以結(jié)合TR7和/或TR4(包括其片段)的同源物種。另外，免疫特異性結(jié)合TR7或TR4的本發(fā)明抗體可以結(jié)合修飾形式的TR7或TR4，例如TR7或TR4融合蛋白。在這種情況中，當(dāng)本發(fā)明的抗體結(jié)合融合蛋白時(shí)，所述抗體必須與融合蛋白的TR7或TR4部分接觸以特異性結(jié)合。特異性結(jié)合TR7或TR4的抗體可例如通過(guò)免疫分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法鑒別，例如以下實(shí)施例中所述的免疫分析。
本文所用術(shù)語(yǔ)“變體”是指一種多肽，其與TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗體或其抗體片段具有相似或相同功能，但不必需包含與TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗體或其抗體片段相似或相同的氨基酸序列，或者不是必需具有分別與TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗體或其抗體片段相似或相同的結(jié)構(gòu)。具有相似氨基酸序列的變體是指滿足以下至少一項(xiàng)條件的多肽(a)包含或由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列與本文所述的TR7多肽(SEQID NO3)或其片段、抗TR7抗體或其抗體片段(包括具有表1所示任一或多個(gè)scFv的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域、VHCDR、VL結(jié)構(gòu)域或VLCDR)的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的相同性；(b)由一種核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下與編碼本文所述TR7(SEQ ID NO3)、TR7多肽片段、抗TR7抗體或其抗體片段(包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域、VHCDR、VL結(jié)構(gòu)域或VLCDR)的核苷酸序列雜交，所述多肽具有至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)、至少100個(gè)、至少125個(gè)、或至少150個(gè)氨基酸殘基；及(c)由一種核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列與編碼本文所述TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗體或其抗體片段(包括具有表1所示任一或多個(gè)scFv的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域、VHCDR、VL結(jié)構(gòu)域或VLCDR)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。與本文所述TR7多肽、TR7多肽的片段、抗TR7抗體或其抗體片段具有相似結(jié)構(gòu)的多肽是指一種多肽，其具有與本文所述TR7多肽、TR7多肽的片段、抗TR7抗體或其抗體片段相似的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法確定，包括但非限于X射線結(jié)晶學(xué)，核磁共振，及晶體學(xué)電子顯微術(shù)。
為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的相同性百分率，將序列為進(jìn)行最佳對(duì)比目的而排列(例如可以在第一個(gè)氨基酸序列或核酸序列中引入一個(gè)缺口，以便與第二個(gè)氨基酸或核酸序列進(jìn)行最佳對(duì)比)，隨后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列中的一個(gè)位置在第二個(gè)序列中的相應(yīng)位置由相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則該分子在這個(gè)位置是相同的。兩個(gè)序列之間的相同性百分率是兩個(gè)序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％相同性＝相同的重疊位置數(shù)/總位置數(shù)×100％)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列等長(zhǎng)。
確定兩個(gè)序列之間的相同性百分率可以使用本領(lǐng)域已知的一種數(shù)學(xué)算法進(jìn)行。用于對(duì)比兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)實(shí)施例是Karlin和Altschul的算法，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 872264-2268(1990)，Karlin和Altschul，Proceedings of theNational Academy ofSciences USA 905873-5877(1993)中加以修改。Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)的BLASTn和BLASTx程序中已經(jīng)加入了這個(gè)算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTn程序(score＝100，wordlength＝12)進(jìn)行以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTx程序(score＝50，wordlength＝3)進(jìn)行以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為獲得進(jìn)行對(duì)比的缺口排列，可以利用Altschul等，Nucleic Acids Res.253589-3402(1997)所述的Gapped BLAST程序。或者，可以使用PSI-BLAST以進(jìn)行反復(fù)搜索，其檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系(文獻(xiàn)同上)。當(dāng)利用BLAST，Gapped BLAST和PSI-BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如BLASTx和BLASTn)的默認(rèn)參數(shù)(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
用于序列對(duì)比的另一個(gè)數(shù)學(xué)算法實(shí)施例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(版本2.0)其是GCG序列對(duì)比軟件包的一部分，其中已經(jīng)加入了這個(gè)算法。本領(lǐng)域已知的其它序列分析算法包括如Torellis和Robotti，Comput.Appl.Biosci.，103-5(1994)所述的ADVANCE和ADAM；及Pearson和Lipman，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 852444-8(1988)所述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定搜索的靈敏性和速度的一個(gè)控制選項(xiàng)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指本發(fā)明的一種變體多肽，其包含或由TR7多肽、TR7多肽片段或免疫特異性結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明抗體的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入氨基酸殘基取代、缺失或添加而改變。本文中術(shù)語(yǔ)“衍生物”還指已經(jīng)例如通過(guò)將任何類型分子共價(jià)附著于所述多肽而修飾的TR7多肽、TR7多肽片段或免疫特異性結(jié)合TR7多肽的抗體。例如，但非限制性地，TR7多肽，TR7多肽片段，或抗TR7抗體可以通過(guò)例如以下方式修飾糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化，蛋白酶解，與細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)連接等。TR7多肽、TR7多肽的片段或抗TR7抗體的衍生物可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)通過(guò)化學(xué)修飾加以修飾，包括但非限于，特異性化學(xué)裂解，乙?；?，甲?；?，衣霉素代謝合成等。另外，TR7多肽、TR7多肽的片段或抗TR7抗體的衍生物可以含有一或多個(gè)非典型氨基酸。多肽衍生物具有與本文所述TR7多肽、TR7多肽片段或抗TR7抗體相似或相同的功能。
本文術(shù)語(yǔ)“表位”是指在動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物中具有抗原性或免疫原性活性的TR7的部分。具有免疫原性活性的表位是激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)的抗體應(yīng)答的TR7的一部分。具有抗原性活性的表位是通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過(guò)本文所述免疫分析確定的與抗體免疫特異性結(jié)合的TR7的一部分?？乖员砦环潜匦枋敲庖咴缘摹?br> 本文所用術(shù)語(yǔ)“片段”是指一種多肽，其包含免疫特異性結(jié)合TRAIL受體的TR7或抗TR7抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子如scFv)的氨基酸序列的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)、至少100個(gè)、至少125個(gè)、至少150個(gè)、至少175個(gè)、至少200個(gè)或至少250個(gè)氨基酸殘基。
本文所用術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”是指一種多肽，其包含或由本發(fā)明的抗TR7抗體的氨基酸序列和一種異源多肽(即與抗體或抗體結(jié)構(gòu)域不相關(guān)的多肽)的氨基酸序列組成。
本文所用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指用一種核酸分子轉(zhuǎn)染的特定細(xì)胞及這種細(xì)胞的子代或潛在子代。子代與用核酸分子轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞可以不同，因?yàn)樵陔S后的傳代或者核酸分子整合入宿主細(xì)胞基因組中時(shí)可能發(fā)生突變或環(huán)境影響。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選以分離形式提供，并優(yōu)選是基本純化的。“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離的一種抗體。因此，例如在重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和/或包含于重組細(xì)胞中的多肽被認(rèn)為是適合本發(fā)明目的而分離的。
“分離的抗體”是指從其天然環(huán)境中分離的抗體。因此，在重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的和/或包含的抗體被認(rèn)為是適合本發(fā)明目的而分離的。
抗體結(jié)構(gòu)已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含一種四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每對(duì)具有一個(gè)“輕鏈”(大約25kDa)和一個(gè)“重鏈”(大約50-70kDa)。每個(gè)鏈的氨基末端部分包括一個(gè)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的大約100-110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每個(gè)鏈的羧基末端部分是一個(gè)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)。人輕鏈分為κ和λ輕鏈。重鏈分為μ，δ，γ，α，或ε重鏈，并由此限定抗體同種型分別為IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。見Fundamental Immunology第7章(Paul，W.編輯，第二版，Raven出版社，N.Y.(1989))(以其全文并入?yún)⒖?。每個(gè)輕鏈/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。
因此，一個(gè)完整的IgG抗體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性抗體之外，這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。
所述鏈均呈現(xiàn)相同的一般結(jié)構(gòu)，即通過(guò)三個(gè)高變區(qū)結(jié)合起來(lái)的相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)(FR)，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR。來(lái)自每對(duì)重鏈和輕鏈的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)排列，使其能結(jié)合特異性表位。從N末端至C末端，輕鏈和重鏈均包含結(jié)構(gòu)域FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸排布符合Kabat，Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或者Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883(1989)的定義。
雙特異性或雙功能抗體是一種人工雜合抗體，其具有兩個(gè)不同重鏈/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性抗體可以通過(guò)許多方法產(chǎn)生，包括雜交瘤融合或Fab’片段的連接，見例如Songsivilai及Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等，J.Immunol.1481547-1553(1992)。另外，雙特異性抗體可以形成為“diabodies”(Holliger等，““diabodies”small bivalent and bispecificantibody fragments”，PNAS USA 906444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“Bispecific single chain molecules(Janusins)targetcytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”，EMBO J.103655-3659(1991)及Traunecker等“Janusinnew molecular design for bispecificreagents”，Int J Cancer Suppl 751-52(1992))。
與生產(chǎn)常規(guī)抗體相比，生產(chǎn)雙特異性抗體相對(duì)費(fèi)力，而且產(chǎn)量和純度通常較低。雙特異性抗體不以具有單一結(jié)合位點(diǎn)的片段形式(例如Fab，F(xiàn)ab’和Fv)存在。
抗TR7抗體使用噬菌體展示技術(shù)，本發(fā)明人鑒別了免疫特異性結(jié)合TR7(或其片段或變體)的單鏈抗體分子(scFv)。本發(fā)明還涵蓋了包含或由這些scFv的片段或變體(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，VH CDR，VL結(jié)構(gòu)域或VL CDR)組成的分子，以及編碼這些scFv和/或分子的核酸分子。
特別地，本發(fā)明涉及包含或由選自下表1所示SEQ ID NO42-56、優(yōu)選地SEQ ID NO42，50和56的氨基酸序列組成的scFv。本發(fā)明還涵蓋了免疫特異性結(jié)合TR7的包含或由這些scFv的片段或變體(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，VH CDR，VL結(jié)構(gòu)域或VL CDR)組成的分子，以及編碼這些scFv和/或分子的核酸序列(例如SEQ ID NO57-71)。
相應(yīng)于SEQ ID NO42-56的scFv根據(jù)其結(jié)合TR7的能力而被選擇。
本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合TR7多肽或多肽片段的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。本發(fā)明特別提供了相應(yīng)于表1所示scFv的抗體。這些scFv可以通過(guò)將例如編碼scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列插入一個(gè)含有恒定區(qū)序列的表達(dá)載體中而常規(guī)地“轉(zhuǎn)變”為免疫球蛋白分子，并工程化而指導(dǎo)免疫球蛋白分子表達(dá)，如以下實(shí)施例4中詳細(xì)描述。
表達(dá)包含本發(fā)明scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域的IgG1抗體的NSO細(xì)胞系保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏日期示于表1，ATCC保藏號(hào)也示于表1。ATCC位于美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯大學(xué)大道10801號(hào)，郵編20110-2209。ATCC保藏物是根據(jù)國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏專利程序的布達(dá)佩斯條約而保藏。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是由細(xì)胞系NSO TR72521#140p12表達(dá)的抗體，所述細(xì)胞系于2002年3月25日保藏在ATCC，保藏號(hào)PTA-4178(見表1)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是由細(xì)胞系NSO TR72521(5G08)#176-41，p10表達(dá)的抗體，所述細(xì)胞系于2002年7月10日保藏在ATCC，保藏號(hào)PTA-4539(見表1)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是由細(xì)胞系NSO TR72654(84A02)#62 p10表達(dá)的抗體，所述細(xì)胞系于2002年5月21日保藏在ATCC，保藏號(hào)PTA-4376(見表1)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是由細(xì)胞系NSO TR7Ab 2834#10，p12表達(dá)的抗體，所述細(xì)胞系于2002年7月17日保藏在ATCC，保藏號(hào)PTA-4547(見表1)。
表1免疫特異性結(jié)合TRAIL受體的scFvs

本發(fā)明涵蓋了免疫特異性結(jié)合TR7多肽或其片段、變體或融合蛋白的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。TR7多肽包括但非限于TR7(SEQ ID NO3)，或者由保藏日為1997年3月7日的ATCC保藏物97920中所含的克隆HLYBX88中的cDNA編碼的多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以免疫特異性結(jié)合上述TR7及TR4(SEQ ID NO1)或由保藏日為1997年1月21日的ATCC保藏物97853中所含的克隆HCUDS60中的cDNA編碼的多肽。TRAIL受體可以通過(guò)重組表達(dá)編碼SEQ ID NO1-5的多肽(分別為TR4，TR5，TR7，TR10和TR1)的核酸，例如ATCC保藏號(hào)97853(TR4)，97798(TR5，于1996年11月20日保藏)，97920(TR7)或209040(TR10，于1997年5月15日保藏)中的cDNA而產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于結(jié)合其它蛋白質(zhì)包括TR1，TR4，TR5或TR10(SEQ ID NO5，1，2和4)或其片段、變體或融合蛋白的能力，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合TR7(SEQ ID NO3)或其片段、變體或融合蛋白(例如融合于Fc結(jié)構(gòu)域的TR7胞外區(qū))。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于結(jié)合其它蛋白質(zhì)包括TR1，TR5或TR10(SEQ IDNO5，2和4)或其片段、變體或融合蛋白的能力，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合TR7和TR4(SEQ ID NO3和1)或其片段、變體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR1，TR4，TR5，TR7和TR10(SEQ ID NO5，1，2，3和4)。與結(jié)合另一個(gè)抗原相比，抗體優(yōu)先結(jié)合一個(gè)抗原的能力可使用本領(lǐng)域已知的任何方法確定。
TR7多肽在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽，或其片段或變體。以下部分更詳細(xì)描述了可以由本發(fā)明抗體結(jié)合的TR7多肽，片段和變體。可以由本發(fā)明抗體結(jié)合的TR7多肽，片段和變體也見于例如國(guó)際公開號(hào)WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986所述，在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合TR7多肽。在一些實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7多肽的抗體可以結(jié)合TR7的片段，變體(包括TR7的同源物種)，多聚體或修飾形式。例如，對(duì)TR7有免疫特異性的抗體可以結(jié)合包含全部或部分TR7的融合蛋白中的TR7部分。
TR7蛋白可見作為單體或多聚體(即二聚體，三聚體，四聚體和更高的多聚體)形式。因此，本發(fā)明涉及結(jié)合呈單體或多聚體的一部分的TR7蛋白的抗體。在特異的實(shí)施方案中，所述TR7多肽是單體，二聚體，三聚體或四聚體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚體是至少二聚體，至少三聚體或至少四聚體。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合TR7同聚體(homomer)或異聚體(heteromer)。本文所用術(shù)語(yǔ)同聚體是指只含有本發(fā)明TR7蛋白(包括本文所述TR7片段，變體和融合蛋白)的多聚體。這些同聚體可含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白質(zhì)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的同聚體是只含有具有相同多肽序列的TR7蛋白的多聚體。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合含有具有不同多肽序列的TR7蛋白的TR7同聚體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種TR7同源二聚體(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7的至少一個(gè)同源二聚體，至少一個(gè)同源三聚體或至少一個(gè)同源四聚體。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7同源三聚體(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)。
本文所用術(shù)語(yǔ)異聚體是指這樣的多聚體，其除了含有本發(fā)明TR7蛋白之外，還含有異源蛋白(即含有與TR7多肽序列不相應(yīng)的多肽序列的蛋白質(zhì))。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種異源二聚體，異源三聚體或異源四聚體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合含有一或多個(gè)TR7多肽的至少一個(gè)同源二聚體，至少一個(gè)同源三聚體或至少一個(gè)同源四聚體。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種TR7異源三聚體(例如分別含有1或2個(gè)TR7蛋白及2或1個(gè)TR4蛋白)。
由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以是疏水性、親水性、離子性和/或共價(jià)結(jié)合的，和/或可以間接通過(guò)例如脂質(zhì)體形成而連接。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)TR7蛋白在溶液中互相接觸時(shí)，會(huì)形成由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體，例如同源二聚體或同源三聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)TR7蛋白質(zhì)與TR7多肽的抗體(或融合蛋白中的異源多肽序列的抗體)在溶液中接觸時(shí)，形成由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的異源多聚體，例如異源三聚體或異源四聚體。在其它實(shí)施方案中，由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體通過(guò)與本發(fā)明TR7蛋白的共價(jià)結(jié)合和/或在本發(fā)明TR7蛋白之間的共價(jià)結(jié)合而形成。這種共價(jià)結(jié)合可以涉及所述蛋白質(zhì)多肽序列(例如SEQ IDNO3所示多肽序列，或由ATCC保藏物97920的cDNA克隆編碼的多肽)中包含的一或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)例子中，所述共價(jià)結(jié)合是位于蛋白質(zhì)多肽序列內(nèi)的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸殘基之間的交聯(lián)。在另一個(gè)例子中，所述共價(jià)結(jié)合是化學(xué)或重組操作的結(jié)果。或者，這種共價(jià)結(jié)合可以涉及TR7融合蛋白中異源多肽序列中包含的一或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，共價(jià)結(jié)合發(fā)生在融合蛋白包含的異源序列之間(見例如美國(guó)專利No.5478925)。在一個(gè)特異的實(shí)施例中，共價(jià)結(jié)合發(fā)生在TR7-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的異源序列之間。在另一個(gè)特異的實(shí)施例中，融合蛋白的共價(jià)結(jié)合發(fā)生在異源多肽序列之間，所述異源多肽序列來(lái)自能形成共價(jià)結(jié)合的多聚體的另一個(gè)TNF家族配體/受體成員，例如oseteoprotegerin(見例如國(guó)際公開No.WO98/49305，在此以其全文并入?yún)⒖?。
可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法產(chǎn)生。例如，希望包含于本發(fā)明多聚體中的蛋白質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的接頭(linker)分子和接頭分子長(zhǎng)度優(yōu)化技術(shù)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(見例如美國(guó)專利No.5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。另外，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，以在位于希望包含于多聚體中的蛋白質(zhì)的多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基之間形成一或多個(gè)分子間交聯(lián)(見例如美國(guó)專利No.5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。另外，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過(guò)將半胱氨酸或生物素加入所述蛋白質(zhì)多肽序列的C或N末端而常規(guī)修飾，而且可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生含有一或多個(gè)這些修飾蛋白質(zhì)的多聚體(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。再者，可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生含有希望包含于可由本發(fā)明的一或多種抗體結(jié)合的多聚體中的蛋白質(zhì)組分的脂質(zhì)體(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。
或者，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的基因工程技術(shù)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體中包含的蛋白質(zhì)是使用本文所述的融合蛋白技術(shù)或本領(lǐng)域已知其它技術(shù)重組產(chǎn)生的(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，通過(guò)將編碼TR7多肽的多核苷酸序列與編碼接頭多肽的序列連接，然后進(jìn)一步與一種編碼從起始C末端至N末端的反方向的多肽翻譯產(chǎn)物(缺失前導(dǎo)序列)的合成多核苷酸連接，產(chǎn)生編碼可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的同源二聚體的多核苷酸(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文所述重組技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)產(chǎn)生重組TR7多肽，其含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域并可以通過(guò)膜重構(gòu)技術(shù)整合入脂質(zhì)體中(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩或多個(gè)TR7多肽通過(guò)合成接頭(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接頭)連接。實(shí)施例包括美國(guó)專利No.5073627(在此并入?yún)⒖?中所述那些肽接頭。包含由肽接頭分離的多個(gè)TR7多肽的蛋白質(zhì)可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含由肽接頭分離的多個(gè)TR7多肽的蛋白質(zhì)。
制備多聚體TR7多肽的另一種方法涉及使用融合于亮氨酸拉鏈或異亮氨酸多肽序列的TR7多肽。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是促進(jìn)含有這些結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)多聚體化的多肽。亮氨酸拉鏈最初在一些DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中鑒別(Landschulz等，Science2401759(1988))，至今已經(jīng)在許多不同的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。已知的亮氨酸拉鏈?zhǔn)翘烊淮嬖诘亩垠w化或三聚體化的肽及其衍生物。適于生產(chǎn)可溶多聚體TR7蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的實(shí)施例是PCT申請(qǐng)WO94/10308中所述的那些，在此并入?yún)⒖?。將包含與在溶液中二聚體化或三聚體化的肽融合的可溶TR7多肽的重組融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，并使用本領(lǐng)域已知技術(shù)從培養(yǎng)上清中回收所得可溶多聚體TR7。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7-亮氨酸拉鏈融合蛋白單體和/或TR7-亮氨酸拉鏈融合蛋白多聚體。
據(jù)信蛋白質(zhì)TNF家族的一些成員以三聚體形式存在(Beutler和Huffel，Science 264667，1994；Banner等，Cell 73431，1993)。因此，三聚體TR7可能具有生物活性增強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的亮氨酸拉鏈部分是優(yōu)先形成三聚體的那些部分。一個(gè)實(shí)施例是衍生自肺表面活性劑蛋白D(SPD)的亮氨酸拉鏈，如Hoppe等(FEBSLetters 344191(1994))，及美國(guó)專利申請(qǐng)No.08/446922所述，在此以其全文并入?yún)⒖肌Ｔ谔禺惖膶?shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7-亮氨酸拉鏈融合蛋白三聚體。
衍生自天然存在的三聚體蛋白質(zhì)的其它肽可以用于制備三聚體TR7。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7融合蛋白單體和/或TR7融合蛋白三聚體。
本發(fā)明的結(jié)合TR7受體多肽的抗體可以結(jié)合分離的或天然存在狀態(tài)的多肽?！胺蛛x的多肽”是指從其天然環(huán)境中分離的一種多肽。因此，對(duì)于本發(fā)明的目的，在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的和/或包含于重組細(xì)胞中的多肽是被認(rèn)為是分離的。另外，“分離的多肽”也指已經(jīng)從重組宿主細(xì)胞中部分或基本純化的多肽。例如，一種重組產(chǎn)生的TR7多肽通過(guò)一步方法基本純化，所述方法如Smith和Johnson，Gene6731-40(1988)所述。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合重組產(chǎn)生的TR7受體多肽。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在細(xì)胞表面上表達(dá)的TR7受體，其中所述TR7多肽由編碼SEQ ID NO3的1-411位氨基酸的多核苷酸編碼，所述多核苷酸可操縱地與控制所述多核苷酸表達(dá)的一個(gè)調(diào)節(jié)序列結(jié)合。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合TR7多肽或多肽片段，所述TR7多肽或多肽片段包括包含或由包含于SEQ ID NO3中的由ATCC保藏號(hào)97920中包含的cDNA編碼，或者由與ATCC保藏物No.97920中包含的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交(例如在嚴(yán)格雜交條件下)的核酸編碼的氨基酸序列組成的多肽，。蛋白質(zhì)片段可以是“游離存在的”，或包含于一個(gè)較大的多肽中，在該較大的多肽中該片段形成一個(gè)部分或一個(gè)區(qū)域，最優(yōu)選作為一個(gè)單一的連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合多肽片段，包括，例如包含或由大約以下氨基酸殘基組成的片段SEQID NO3的第1-51，52-78，79-91，92-111，112-134，135-151，152-178，179-180，181-208，209-218，219-231，232-251，252-271，272-291，292-311，312-323，324-361，362-391，392-411位氨基酸。文中“大約”包括特別指出的范圍，在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1)氨基酸。另外，多肽片段的長(zhǎng)度可以是至少大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150個(gè)氨基酸。文中“大約”包括特別指出的數(shù)值，在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1)氨基酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽片段包括選自以下一組的成員一種包含或由TR7受體胞外結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO3的約第52至約第184位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由兩個(gè)TR7富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可見于由SEQ ID NO3的約第84至約第179位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)片段中)組成的多肽；一種包含或由SEQID NO3的約第84至約第131位氨基酸殘基組成的TR7富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由SEQ ID NO3的約第132至約第179位氨基酸殘基組成的TR7富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由TR7受體跨膜結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO3的約第185至約第208位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由預(yù)測(cè)的成熟TR7多肽的片段組成的多肽，其中所述片段具有TR7功能活性(例如抗原性活性或生物學(xué)活性)；一種包含或由TR7受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO3的約第209至約第411位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由全部或部分缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的TR7受體胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由TR7受體死亡結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQID NO3的約第324至約第391位氨基酸殘基)組成的多肽；及一種包含或由TR7受體蛋白的1，2，3，4或多個(gè)攜帶表位部分組成的多肽。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8個(gè)成員的任意組合組成。如上，具有前導(dǎo)序列的，組成TR7受體胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基由計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到組成這些結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基基于用于限定每個(gè)結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)而可以略微變化(例如變化大約1至大約15個(gè)氨基酸殘基)。這些核酸分子編碼的多肽也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
如上所述，確信TR7的一或兩個(gè)胞外富半胱氨酸基序?qū)R7與其配體(例如TRAIL)之間的相互作用很重要。因此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由SEQ ID NO3的第84至131位，和/或第132至179位氨基酸殘基組成的TR7多肽片段。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由兩個(gè)胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO3的第84至179位氨基酸殘基)組成的TR7多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由TR7的胞外可溶結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2的第52至184位氨基酸殘基)組成的TR7多肽。在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的全部或部分胞外可溶結(jié)構(gòu)域(例如，一或兩個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明抗體激動(dòng)(agonize)TR7受體。
在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的全部或部分胞外可溶結(jié)構(gòu)域(例如，一或兩個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)表達(dá)TR7受體的細(xì)胞細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的抗體還可以結(jié)合包含或由TR7的結(jié)構(gòu)或功能屬性部分組成的片段。這些片段包括包含TR7的α-螺旋及α-螺旋形成區(qū)(“α-區(qū)”)，β-折疊及β-折疊形成區(qū)(“β-區(qū)”)，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲及卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，親水區(qū)，疏水區(qū)，α兩性區(qū)，β兩性區(qū)，表面形成區(qū)及高抗原指數(shù)區(qū)(即由抗原指數(shù)高于或等于1.5的氨基酸殘基組成的多肽區(qū)域，使用Jameson-Wolf程序的默認(rèn)參數(shù)鑒別)的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的區(qū)域是表2中所揭示的那些區(qū)域，并包括但非限于通過(guò)分析SEQ ID NO3的氨基酸序列而鑒別的上述類型的區(qū)域，這些優(yōu)選的區(qū)域包括Gamier-Robson預(yù)測(cè)的α-區(qū)，β-區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)；Chou-Fasman預(yù)測(cè)的α-區(qū)，β-區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)；Kyte-Doolittle預(yù)測(cè)的親水區(qū)及Hopp-Woods預(yù)測(cè)的疏水區(qū)；Eisenbergα和β兩性區(qū)；Emini表面形成區(qū)；及Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)，使用這些計(jì)算機(jī)程序的默認(rèn)參數(shù)預(yù)測(cè)。
表2示出的代表如上所述的TR7的結(jié)構(gòu)和功能屬性的數(shù)據(jù)，是使用多種DNA*STAR的模塊和算法按默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生的。第I欄表示α螺旋區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第II欄表示α螺旋區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第III欄表示β折疊區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第IV欄表示β折疊區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第V欄表示轉(zhuǎn)角區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第VI欄表示轉(zhuǎn)角區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第VII欄表示卷曲區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第VIII欄表示Kyte-Doolittle親水性圖；第IX欄表示Hopp-Woods疏水性圖；第X欄表示α兩性區(qū)的Eisenberg分析結(jié)果；第XI欄表示β兩性區(qū)的Eisenberg分析結(jié)果；第XII欄表示柔性區(qū)的Karplus-Schultz分析結(jié)果；第XIII欄表示Jameson-Wolf抗原指數(shù)分值；及第XIV欄表示Emini表面概率圖。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表2中第VIII，IX，XIII和XIV欄所示數(shù)據(jù)可以用于確定呈現(xiàn)高度抗原性潛力的TR7區(qū)域。通過(guò)選擇表示在一種在免疫應(yīng)答的初始過(guò)程中抗原識(shí)別可能發(fā)生的環(huán)境中很可能暴露于多肽表面的多肽區(qū)域的數(shù)值，從第VIII，IX，XIII和/或XIV欄所示數(shù)據(jù)中確定高抗原性區(qū)域。
表2所示上述優(yōu)選的區(qū)域包括但非限于通過(guò)分析SEQ ID NO3所示氨基酸序列而鑒別的上述類型的區(qū)域。如表2所示，這些優(yōu)選的區(qū)域包括Garnier-Robson α-區(qū)，β-區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)，Chou-Fasmanα-區(qū)，β-區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)，Eisenbergα-和β-兩性區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)及Emini表面形成區(qū)。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或TR7多肽片段或變體，所述多肽或片段或變體包含組合了若干結(jié)構(gòu)特征如上述及表2所示的若干(例如1，2，3或4個(gè))相同或不同區(qū)域特征的TR7區(qū)域。
表2殘基位置 III III IV VVI VII VIII IXX XI XII XIIIXIVMet1 A......1.11 -0.70 . *.1.292.18Glu2 A......1.50 -0.70 . *.1.631.69Gln3 A....T.1.89 -0.73 . *.2.172.28Arg4 ....TT.1.69 -0.76 . *.2.913.71Gly5 ....TT.1.87 -0.87 . *F3.402.17Gln6 ....TT.1.88 -0.44 . *F2.761.93Asn7 ......C1.29 -0.34 . *F1.871.00Ala8 ......C0.99 -0.16 . .F1.081.02Pro9 ......C0.53 0.11 . *.0.440.79Ala10A......0.29 0.14 . *.-0.10 0.48Ala11A....T.0.40 0.24 . ..0.100.48Ser12A....T.0.44 -0.26 . *F0.850.61Gly13A....T.1.14 -0.69 . *F1.301.22Ala14A....T.1.32 -1.19 . *F1.302.36Arg15A...T..1.57 -1.19 . *F1.502.39Lys16....T..1.94 -1.14 . .F1.502.39Arg17....T..1.90 -1.14 . *F1.803.66His18......C2.03 -1.21 * *F1.901.85Gly19.....TC2.73 -0.79 * *F2.401.43Pro20.....TC2.62 -0.79 * *F2.701.43Gly21.....TC1.99 -0.79 * .F3.001.82Pro22.....TC1.99 -0.79 . *F2.701.86Arg23.A....C1.68 -1.21 * .F2.302.35Glu24.AB....1.43 -1.21 * .F2.102.35Ala25.A..T..1.76 -1.14 * .F2.501.54Arg26.A..T..1.89 -1.57 * .F2.501.54Gly27....T..1.76 -1.14 * .F3.001.37Ala28....T.C1.43 -0.71 * *F2.701.35Arg29.....TC1.54 -0.79 * *F2.661.06Pro30.....TC1.28 -0.79 * *F2.622.10Gly31.....TC0.96 -0.57 * *F2.581.54Pro32.....TC1.34 -0.64 * *F2.541.22Arg33......C1.62 -0.64 * *F2.601.58Val34......C0.70 -0.59 * *F2.342.30Pro35..B....0.06 -0.33 * *F1.581.23Lys36..BB...-0.41-0.11 * .F0.970.46Thr37..BB...-1.060.57 * *F-0.19 0.52Leu38..BB...-2.020.57 * *.-0.60 0.25Val39..BB...-1.760.79 . ..-0.60 0.09Leu40A..B...-2.131.29 . ..-0.60 0.06Val41A..B...-3.031.30 . ..-0.60 0.08Val42A..B...-3.531.26 . ..-0.60 0.08Ala43A..B...-3.531.30 . ..-0.60 0.08Ala44A..B...-3.491.30 . ..-0.60 0.09Val45A..B...-3.531.34 . ..-0.60 0.10Leu46A..B...-2.981.34 . ..-0.60 0.07Leu47A..B...-2.711.23 . ..-0.60 0.09Leu48A..B...-2.121.23 . ..-0.60 0.13Val49A..B...-1.830.59 . ..-0.60 0.27Ser50A..B...-1.570.29 . *.-0.30 0.44
表2(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX X XI XII XIII XIVAla51AA.....-1.57 0.10 . ..-0.30 0.54Glu52AA.....-1.64 0.10 . ..-0.30 0.60Ser53AA.B...-1.14 0.14 . ..-0.30 0.31Ala54AA.B...-0.29 0.24 . ..-0.30 0.45Leu55AA.B...0.010.14 . ..-0.30 0.45Ile56AA.B...0.600.54 . ..-0.60 0.58Thr57AA.B...-0.21 0.16 . .F-0.15 0.96Gln58AA.B...-0.50 0.34 . .F-0.15 0.96Gln59AA.B...-0.12 0.16 . .F0.00 1.38Asp60.A.BT..0.69-0.10 . .F1.00 1.48Leu61.A....C1.58-0.19 . *F0.80 1.48Ala62.A....C2.00-0.19 . *F0.80 1.48Pro63.A....C1.41-0.59 . *F1.10 1.73Gln64.A..T..0.82-0.09 . *F1.00 2.13Gln65AA.....0.61-0.27 . *F0.60 2.13Arg66AA.....1.42-0.34 . *F0.60 2.13Ala67AA.....2.01-0.37 . *F0.94 2.13Ala68AA.....2.27-0.37 * *F1.28 2.13Pro69AA.....2.38-0.77 * *F1.92 2.17Gln70.A..T..2.08-0.77 * .F2.66 4.21Gln71....TT.1.67-0.89 * *F3.40 5.58Lys72....TT.2.04-1.00 . .F3.06 4.84Arg73....TT.2.33-1.00 . .F2.97 4.32Ser74.....TC2.54-1.01 . .F2.68 3.34Ser75.....TC2.20-1.41 . .F2.59 2.89Pro76....TT.1.39-0.99 . .F2.70 1.46Ser77....TT.0.68-0.30 . .F2.50 0.90Glu78....TT.0.36-0.11 . *F2.25 0.36Gly79....T..0.44-0.07 . .F1.80 0.36Leu80....T..0.40-0.07 . .F1.55 0.42Cys81......C0.58-0.03 . ..0.95 0.24Pro82.....TC0.840.47 * .F0.15 0.33Pro83....TT.-0.04 0.54 * .F0.35 0.54Gly84....TT.0.000.54 * ..0.20 0.70His85.....TC0.810.36 * ..0.30 0.61His86......C1.48-0.07 * ..0.70 0.68Ile87......C1.34-0.50 * *.1.19 1.15Ser88......C1.67-0.50 * *F1.53 0.84Glu89....T..2.01-1.00 * *F2.52 1.21Asp90....T..1.38-1.50 * *F2.86 2.88Gly91....TT.0.52-1.61 * *F3.40 1.15Arg92....TT.1.11-1.31 * *F2.91 0.47Asp93....TT.0.74-0.93 . *F2.57 0.37Cys94....TT.0.79-0.36 . *.1.78 0.20Ile95....T..0.54-0.79 . *.1.54 0.21Ser96....T..0.54-0.03 . *.1.18 0.19Cys97....TT.0.430.40 . *.0.76 0.36Lys98....TT.0.430.23 . ..1.34 0.88Tyr99....TT.0.86-0.46 . *F2.52 1.10Gly100 ....TT.1.44-0.09 . *F2.80 3.22
表2(續(xù))殘基位置 I II III IV VVI VII VIIIIX XXI XII XIIIXIVGln101. ...TT.1.43-0.27 *.F2.522.16Asp102. ...TT.2.070.21**F1.641.99Tyr103. ...TT.1.73-0.04 **F1.962.73Ser104. ...TT.1.980.44*.F0.781.66Thr105. ...T..2.320.44*.F0.301.60His106. ...T..1.510.44*..0.151.70Trp107. ...TT.0.700.37*..0.651.05Asn108. ...TT.0.240.67...0.200.60Asp109. ...TT.-0.12 0.97*..0.200.38Leu110A ....T.-0.62 1.04**.-0.20 0.19Leu111. ..BT..-0.48 0.81**.-0.20 0.10Phe112. ..BT..-0.86 0.41**.-0.20 0.12Cys113. ..BT..-1.17 0.99**.-0.20 0.08Leu114. ..BT..-1.06 0.79.*.-0.20 0.13Arg115. ..BT..-0.91 0.10.*.0.100.30Cys116. ..BT..-0.10 -0.11 ...0.700.30Thr117. ..BT..0.30-0.69 .*.1.000.61Arg118. ..BT..0.62-0.99 ..F1.490.42Cys119. ...TT.1.43-0.56 *.F2.230.77Asp120. ...TT.0.47-1.13 *.F2.570.92Ser121. ...TT.1.13-0.97 .*F2.910.35Gly122. ...TT.0.63-0.97 .*F3.401.13Glu123. A..T..0.22-0.86 .*F2.510.56Val124A A.....0.68-0.47 .*F1.470.56Glu125. A..T..0.01-0.43 .*.1.380.87Leu126. A..T..0.00-0.29 .*.1.040.27Ser127. ....TC0.030.20.*F0.450.52Pro128. ...TT.-0.28 0.04.*F0.930.44Cys129. ...TT.0.690.53.*F0.910.77Thr130. ...TT.0.69-0.16 .*F2.241.12Thr131. ...T..1.19-0.14 .*F2.321.16Thr132. ...TT.0.63-0.09 .*F2.803.13Arg133. ...TT.0.18-0.01 ..F2.521.61Asn134. ...TT.0.840.07..F1.490.60Thr135. ...TT.0.49-0.01 ..F1.810.72Val136. ...T.C0.800.07*..0.580.20Cys137. A..T..1.110.07*..0.100.21Gln138. AB....0.66-0.33 *..0.300.25Cys139. A..T..0.34-0.39 ...0.700.34Glu140A A.....-0.04 -0.54 **F0.750.91Glu141A A.....0.92-0.33 **F0.450.46Gly142. A..T..1.59-0.73 .*F1.301.67Thr143A A.....1.59-1.30 .*F0.901.67Phe144A A.....2.26-1.30 .*F0.901.67Arg145A A.....1.96-1.30 .*F0.902.81Glu146A A.....1.74-1.34 .*F0.902.61Glu147A A.....2.09-1.40 .*F0.904.66Asp148A A.....1.80-2.19 .*F0.904.12Ser149A ....T.1.83-1.57 .*F1.302.35Pro150A ....T.1.83-1.00 ..F1.150.73
表2(續(xù))殘基位置 I IIIII IV VVI VII VIII IX X XI XII XIII XIVGlu15lA....T.1.88 -1.00 * .F1.15 0.85Met152A....T.1.21 -1.00 * *.1.49 1.28Cys153A....T.1.32 -0.81 * *.1.68 0.44Arg154A....T.1.31 -1.24 * ..2.02 0.50Lys155....TT.1.18 -0.76 * *F2.91 0.73Cys156....TT.0.51 -0.94 * .F3.40 1.35Arg157....T..0.90 -0.94 * .F2.71 0.37Thr158....T..1.68 -0.51 * .F2.37 0.28Gly159....T..1.22 -0.51 * .F2.43 1.04Cys160.....TC0.58 -0.66 . *F2.19 0.53Pro161....TT.0.39 -0.04 . *F2.00 0.36Arg162....TT.0.32 0.11. *F1.65 0.27Gly163....TT.-0.22-0.31 * *.2.50 1.01Met164..BB...-0.22-0.24 * *.1.30 0.48Val165..BB...0.44 -0.24 * *.1.30 0.24Lys166..BB...-0.01-0.24 * *.1.30 0.41Val167..B..T.-0.43-0.10 * *F1.85 0.22Gly168....TT.-0.30-0.23 . .F2.25 0.44Asp169....TT.0.01 -0.44 . .F2.50 0.34Cys170....TT.0.57 0.47. *F1.35 0.48Thr171.....TC0.52 0.21. *F1.20 0.65Pro172....TT.0.49 -0.21 . *F1.75 0.65Trp173....TT.0.83 0.47. *F0.60 0.84Ser174A....T.0.17 -0.10 . *F1.00 1.01Asp175AA.....-0.02-0.01 . .F0.45 0.35Ile176AA.....0.26 0.20* *.-0.30 0.25Glu177AA.....0.51 -0.21 * ..0.30 0.25Cys178AA.....0.80 -0.60 * ..0.60 0.30Val179AA.....0.80 -0.60 * *.0.60 0.74His180AA.....0.46 -0.90 . *.0.60 0.58Lys181AA.....0.46 -0.47 * .F0.60 1.06Glu182A....T.-0.43-0.36 * .F1.00 1.00Ser183A....T.-0.66-0.31 . .F0.85 0.52Gly184A...TT.-0.14-0.13 . .F1.25 0.18Ile185A....T.-0.970.30. ..0.10 0.10Ile186..BB...-1.320.94. *.-0.60 0.06Ile187..BB...-2.181.04. ..-0.60 0.08Gly188..BB...-2.471.26. *.-0.60 0.09Val189..BB...-2.711.07. ..-0.60 0.13Thr190A..B...-2.680.89. *.-0.60 0.18Val191A..B...-2.640.84. ..-0.60 0.14Ala192A..B...-2.571.06. *.-0.60 0.14Ala193A..B...-3.111.10. ..-0.60 0.08Val194A..B...-3.111.30. ..-0.60 0.07Val195A..B...-3.391.30. ..-0.60 0.05Leu196A..B...-3.391.30. ..-0.60 0.05Ile197A..B...-3.501.44. ..-0.60 0.05Val198A..B...-3.771.59. ..-0.60 0.06Ala199A..B...-3.581.59. ..-0.60 0.06Val200A..B...-2.681.47. ..-0.60 0.04
表2(續(xù))殘基位置 I IIIII IV VVI VII VIIIIX X XI XII XIII XIVPhe201A . .B...-2.17 0.79. ..-0.60 0.12Val202A . .B...-2.09 0.53. ..-0.60 0.16Cys203A . ...T.-2.04 0.71. ..-0.20 0.17Lys204A . ...T.-1.74 0.76. ..-0.20 0.17Ser205A . ...T.-0.84 0.89. ..-0.20 0.24Leu206A . ...T.-0.10 0.24. ..0.10 0.88Leu207A A .....-0.10 -0.33 . ..0.30 0.88Trp208A A .....-0.24 0.31. ..-0.30 0.49Lys209A A .....-0.50 0.61. ..-0.60 0.49Lys210A A .....-0.44 0.36* ..-0.30 0.91Val211A A .....-0.44 0.43* *.-0.45 1.36Leu212. A B....0.410.20* *.-0.30 0.56Pro213. A B....0.360.20* ..-0.30 0.56Tyr214. . .BT..-0.58 0.63* ..-0.20 0.75Leu215. . .BT..-1.29 0.67* *.-0.20 0.64Lys216. ..BT..-0.73 0.56* ..-0.20 0.22Gly217. .BB...-0.27 0.51* ..-0.60 0.19Ile218. .BB...-0.40 0.19* ..-0.30 0.23Cys219. .B..T.-0.50 -0.07 * ..0.70 0.11Ser220. ...TT.-0.03 0.36. *F0.65 0.11Gly221. ...TT.-0.08 0.36. .F0.65 0.16Gly222. ...TT.0.06-0.33 . .F1.25 0.49Gly223. .....C0.94-0.47 . .F0.85 0.57Gly224. .....C1.72-0.86 * .F1.15 0.99Asp225. ....TC1.17-1.29 . *F1.50 1.97Pro226. ....TC1.51-1.07 * .F1.84 1.47Glu227. .B..T.1.97-1.50 * .F1.98 2.49Arg228. .B..T.2.01-1.93 * .F2.32 2.92Val229. ...T..2.06-1.54 * .F2.86 2.53Asp230. ...TT.2.06-1.59 * .F3.40 1.96Arg231. ...TT.2.38-1.19 * *F3.06 1.73Ser232. ...TT.2.17-1.19 * .F2.72 4.57Ser233. ...TT.1.71-1.40 * *F2.72 4.23Gln234. .....C1.98-0.97 * *F2.32 2.14Arg235. ....TC1.98-0.47 * *F2.22 1.61Pro236. ....TC1.87-0.86 * *F2.86 2.08Gly237. ...TT.2.17-1.24 . *F3.40 2.01Ala238. ....TC1.61-1.24 . *F2.86 1.65Glu239A ......0.80-0.60 . *F1.97 0.79Asp240A ......0.69-0.34 . *F1.33 0.66Asn241A ......0.90-0.37 * ..0.99 1.05Val242A ......0.36-0.87 * ..0.95 1.05Leu243A ......0.09-0.19 * ..0.50 0.44Asn244A ..B...-0.21 0.46* ..-0.60 0.20Glu245A ..B...-1.10 0.44* ..-0.60 0.37Ile246A ..B...-1.91 0.49* ..-0.60 0.31Val247A ..B...-1.06 0.49* ..-0.60 0.16Ser248. .BB...-0.46 0.49* ..-0.60 0.16Ile249. .BB...-0.77 0.91* ..-0.60 0.35Leu250. ..B..C-0.77 0.71. ..-0.40 0.69
表2(續(xù))殘基位置 I IIIII IV VVI VII VIII IX X XI XII XIIIXIVGln251.....TC-0.73 0.47. .F0.150.89Pro252.....TC-0.09 0.73. .F0.150.94Thr253.....TC0.21 0.47. .F0.301.76Gln254.....TC1.10 -0.21 . .F1.201.76Val255.A....C1.91 -0.21 . .F0.801.97Pro256.A....C1.31 -0.64 . .F1.102.37Glu257AA.....1.52 -0.51 . *F0.901.35Gln258AA.....0.98 -0.91 . *F0.903.16Glu259AA.....0.98 -0.91 . *F0.901.51Met260AA.....1.83 -0.94 . *F0.901.51Glu261AA.....1.83 -0.94 . *.0.751.51Val262AA.....1.24 -0.91 . *F0.901.35Gln263AA.....1.24 -0.41 . *F0.601.38Glu264AA.....1.03 -1.03 . *F0.901.38Pro265AA.....1.32 -0.60 . *F1.182.88Ala266AA.....0.98 -0.76 . *F1.462.40Glu267A....T.0.98 -0.73 . *F2.141.37Pro268A....T.0.98 -0.09 . .F1.970.66Thr269....TT.0.38 -0.11 . .F2.801.05Gly270A....T.-0.22 0.00. .F1.370.60Val271A......0.07 0.69. ..0.440.32Asn272..B....-0.14 0.64. ..0.160.30Met273..B....-0.28 0.59. ..0.180.46Leu274......C0.03 0.59. ..0.400.62Ser275.....TC0.08 -0.06 . .F1.950.66Pro276.....TC0.93 -0.07 . .F2.250.90Gly277.....TC0.90 -0.69 . .F3.001.89Glu278A....T.0.69 -0.87 . .F2.501.92Ser279AA.....0.69 -0.57 . .F1.801.02Glu280AA.....0.99 -0.31 . .F1.050.85His281AA.....0.99 -0.74 . .F1.050.85Leu282AA.....0.74 -0.31 . ..0.300.98Leu283AA.....0.74 -0.20 . ..0.300.57Glu284AA.....0.46 -0.20 . .F0.450.73Pro285AA.....0.46 -0.20 . .F0.450.89Ala286AA.....0.60 -0.89 . .F0.901.88Glu287AA.....1.11 -1.57 . .F0.902.13Ala288AA.....1.92 -1.19 . .F0.901.84Glu289AA.....2.03 -1.21 * .F0.903.16Arg290AA.....2.36 -1.71 * .F0.903.57Ser291A....T.3.06 -1.71 * .F1.306.92Gln292A....T.2.24 -2.21 * .F1.307.83Arg293A....T.2.02 -1.53 . .F1.303.30Arg294A....T.1.17 -0.84 . .F1.302.03Arg295...BT..0.84 -0.59 . *F1.150.87Leu296..BB...0.56 -0.56 . *.0.600.69Leu297..BB...0.56 -0.06 . *.0.300.35Val298...B..C0.44 0.34* *.0.200.29Pro299.....TC-0.01 0.34* ..0.900.61Ala300.....TC-0.12 0.09* *F1.350.73
表2(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX X XI XII XIIIXIVAsn301.....TC0.48-0.60 . .F2.701.65Glu302.....TC0.98-0.81 . .F3.001.65Gly303......C1.83-0.76 . .F2.502.35Asp304.....TC1.73-1.26 . .F2.402.54Pro305.....TC1.51-1.17 . *F2.102.11Thr306A....T.1.62-0.49 . *F1.301.76Glu307A....T.1.62-0.91 * *F1.302.07Thr308A..B...1.30-0.51 * *F0.902.31Leu309A..B...0.60-0.37 * *F0.450.86Arg310A..B...0.81-0.07 * *.0.300.43Gln311A..B...1.12-0.07 * *.0.300.50Cys312A....T.0.42-0.56 * *.1.151.01Phe313A....T.0.14-0.46 * *.0.700.45Asp314....TT.0.960.04* *.0.500.26Asp315A....T.0.03-0.36 * *.0.700.81Phe316AA.....-0.82 -0.24 * ..0.300.77Ala317AA.....-0.37 -0.39 * ..0.300.34Asp318AA.....-0.37 0.04* *.-0.30 0.32Leu319AA.....-0.37 0.83. ..-0.60 0.32Val320.A....C-0.67 0.04. ..-0.10 0.52Pro321.A....C-0.26 -0.07 . ..0.500.42Phe322....TT.0.330.84. ..0.200.54Asp323A....T.0.120.16. ..0.251.25Ser324A....T.0.12-0.06 . .F1.001.25Trp325A....T.0.380.20* *F0.401.19Glu326AA.....0.700.03* .F-0.15 0.71Pro327AA.....1.440.03* ..-0.15 1.03Leu328AA.....0.63-0.36 * ..0.451.96Met329AA.....0.59-0.59 * ..0.600.93Arg330AA.....0.07-0.16 * ..0.300.60Lys331AA.....-0.53 0.10* ..-0.30 0.60Lau332AA.....-0.32 0.03* ..-0.30 0.60Gly333AA.....0.49-0.59 * ..0.600.51Leu334AA.....1.09-0.19 * ..0.300.41Met335AA.....0.09-0.19 * *.0.300.86Asp336AA.....0.09-0.19 . *F0.450.61Asn337AA.....0.04-0.6L * *F0.901.48Glu338AA.....-0.20 -0.66 * *F0.901.11Ile339AA.....0.66-0.77 * *F0.750.67Lys340AA.....0.67-0.77 . *F0.750.83Val341AA.....0.67-0.67 . *.0.600.49Ala342AA.....0.08-0.67 . ..0.751.20Lys343AA.....-0.51 -0.86 . *.0.600.61Ala344AA.....0.03-0.36 . *.0.300.83Glu345AA.....-0.04 -0.57 * ..0.600.81Ala346AA.....0.92-0.57 * ..0.600.55Ala347AA.....1.51-0.57 . *.0.751.07Gly348A......1.16-1.07 . *.0.951.03His349A....T.0.93-0.59 . ..1.151.47Arg350A....T.0.69-0.40 . .F1.001.20
表2(續(xù))殘基位置 I II III IV VVI VII VIII IX X XI XII XIII XIVAsp351A ....T.0.97 -0.14 . .F1.00 1.90Thr352A ....T.0.96 -0.09 . .F1.00 2.02Leu353A ..B...0.49 0.03 . ..-0.151.02Tyr354A ..B...-0.370.71 . *.-0.600.50Thr355A ..B...-0.431.40 . *.-0.600.24Met356A ..B...-0.720.91 * ..-0.600.59Leu357A ..B...-1.271.14 * ..-0.600.40Ile358A ..B...-0.461.03 * *.-0.600.20Lys359A ..B...-0.170.94 * *.-0.600.33Trp360A ..B...-0.170.33 * *.0.00 0.81Val361A ..B...0.09 0.13 * *.0.45 1.66Asn362. ....TC1.01 -0.13 * .F1.95 0.82Lys363. ....TC1.90 -0.13 * *F2.40 1.53Thr364. ....TC1.27 -1.04 * .F3.00 3.44Gly365. ....TC1.26 -1.19 * .F2.70 2.16Arg366. A..T..1.26 -1.20 * .F2.20 1.45Asp367. A....C1.22 -0.56 * .F1.55 0.75Ala368A A.....0.87 -0.54 . .F1.20 1.03Ser369A A.....0.37 -0.49 . ..0.30 0.76Val370A A.....-0.100.20 . *.-0.300.37His371A A.....-0.210.89 . *.-0.600.30Thr372A A.....-0.800.39 * *.-0.300.38Leu373A A.....-1.020.50 * *.-0.600.52Leu374A A.....-0.720.54 * ..-0.600.31Asp375A A.....-0.180.04 * ..-0.300.38Ala376A A.....-0.960.04 * ..-0.300.66Leu377A A.....-0.990.04 * ..-0.300.66Glu378A A.....-0.18-0.21 * ..0.30 0.39Thr379A A.....0.74 -0.21 * *F0.45 0.67Leu380A A.....-0.07-0.71 * .F0.90 1.59Gly381A A.....-0.07-0.71 * .F0.75 0.76Glu382A A.....0.79 -0.21 * .F0.45 0.53Arg383A A.....0.79 -0.70 * .F0.90 1.28Leu384A A.....1.14 -0.99 * *F0.90 2.24Ala385A A.....1.07 -1.41 * *F0.90 2.59Lys386A A.....1.41 -0.73 * .F0.75 0.93Gln387A A.....1.41 -0.73 * *F0.90 1.95Lys388A A.....1.27 -1.41 * *F0.90 3.22Ile389A A.....1.27 -1.41 . *F0.90 2.19Glu390A A.....1.04 -0.73 * *F0.90 1.04Asp391A A.....0.70 -0.44 . *F0.45 0.43His392A A.....0.40 -0.06 * *.0.30 0.82Leu393A A.....0.01 -0.36 * *.0.30 0.64Leu394A A.....0.94 0.07 * *F-0.150.38Ser395A ....T.0.24 0.07 * *F0.25 0.55Ser396A ....T.-0.360.36 * *F0.25 0.58Gly397. ...TT.-0.570.29 . .F0.65 0.70Lys398A ....T.-0.570.36 . .F0.25 0.82Phe399A A.....0.24 0.66 . ..-0.600.50Met400. AB....0.20 0.27 . *.-0.300.88
表2(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIII IXX XI XII XIIIXIVTyr401.AB....0.50 0.27 . *.-0.30 0.44Leu402AA.....0.26 0.67 . *.-0.60 0.81Glu403AA.....0.21 0.39 . *.-0.30 0.82Gly404A......0.61 -0.23 . *F0.650.88Asn405A....T.0.62 -0.60 . *F1.301.43Ala406A....T.0.27 -0.79 . *F1.150.83Asp407A....T.0.78 -0.17 . *F0.850.83ser408A....T.0.39 -0.21 . *F0.850.69Ala409A......0.34 -0.19 . *.0.500.88Met410A......-0.04 -0.26 . ..0.500.67Ser411A......0.16 0.17 . ..-0.10 0.64
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，其結(jié)合包含或由TR7一，二，三，四，五或多個(gè)表位攜帶部分組成的肽或多肽。這種多肽部分的表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位?！懊庖咴员砦弧笔侵府?dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)激發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)部分。另一方面，抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域是“抗原性表位”。蛋白質(zhì)的免疫原性表位數(shù)一般少于抗原性表位數(shù)。見，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983)。
為選擇攜帶抗原性表位(即含有抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域)的肽或多肽，本領(lǐng)域熟知模擬蛋白質(zhì)序列一部分的相對(duì)短的合成肽通常能激發(fā)與所述被部分模擬的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗血清。見，例如，J.G.Sutcliffe等，“Antibodies That React With Predetermined Sites onProteins，”Science 219660-666(1983)。。能激發(fā)蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽通常在蛋白質(zhì)的初級(jí)序列中呈現(xiàn)，可以通過(guò)一系列簡(jiǎn)便的化學(xué)規(guī)則定性，而且既不限于完整蛋白質(zhì)的免疫顯性區(qū)域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此攜帶抗原性表位的肽和多肽可用于產(chǎn)生結(jié)合TR7多肽的抗體，包括單克隆抗體。見，例如，Wilson等，Cell 37767-778(1984)的第777頁(yè)所述。攜帶抗原性表位的肽和多肽優(yōu)選含有一種序列，所述序列具有SEQ ID NO3的氨基酸序列中包含的至少7個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)及最優(yōu)選至少大約15至大約30個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合一或多種抗原性TR7多肽或肽，包括但非限于包含或由SEQ ID NO3的大約第62至大約110位，SEQ ID NO3的大約第119至大約164位，SEQ ID NO3的大約第224至大約271位，SEQ ID NO3的大約第275至大約370位，SEQ ID NO3的大約第69至大約80位，SEQ ID NO3的大約第88至大約95位，SEQ IDNO3的大約第99至大約103位，SEQ ID NO3的大約第119至大約123位，SEQ ID NO3的大約第130至大約135位，SEQ ID NO3的大約第152至大約163位，SEQ ID NO3的大約第226至大約238位，SEQ ID NO3的大約第275至大約279位，SEQ ID NO3的大約第301至大約305位氨基酸殘基組成的多肽；和/或包含或由SEQ ID NO3的大約第362至大約367位氨基酸殘基的多肽。文中“大約”包括特別指定的范圍，及在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1個(gè))核苷酸。如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)確定了上述多肽片段是TR7受體蛋白的抗原性區(qū)域。
攜帶表位的TR7肽和多肽可以通過(guò)任何常規(guī)方法產(chǎn)生。R.A.Houghten，“General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis ofLarge Numbers of PeptidesSpecificity of Antigen-Antibody Interactionat the Level of Individual Amino Acids，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA825131-5135(1985)。這個(gè)“同時(shí)多個(gè)肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美國(guó)專利No.4631211中進(jìn)一步描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能意識(shí)到，本發(fā)明所述TR7受體多肽及其攜帶表位的片段(例如相應(yīng)于胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，例如SEQ ID NO3的第52至184位氨基酸殘基)可以與免疫球蛋白(IgG)的恒定結(jié)構(gòu)域的部分組合，產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白便于純化并示出體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)。這已經(jīng)，例如由人CD4多肽的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白示出(EPA394827；Traunecker等，Nature 33184-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白比單獨(dú)的單體TR7蛋白或蛋白質(zhì)片段更有效結(jié)合及中和其它分子(Fountoulakis等，J.Biochem.2703958-3964(1995))。TR7融合蛋白可用作免疫原以激發(fā)抗TR7抗體。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合包含完整或部分TR7多肽的融合蛋白的TR7部分。
本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)可以用于產(chǎn)生新的突變蛋白質(zhì)或“突變蛋白(muteins)”，所述突變蛋白包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。這種修飾的多肽可以示出，例如增強(qiáng)的活性或提高的穩(wěn)定性。另外，至少在一定的純化和貯存條件下，它們可以以較高產(chǎn)量純化，并示出比相應(yīng)的天然多肽更好的溶解性。本發(fā)明的抗體也可以結(jié)合這些修飾的TR7多肽或TR7多肽片段或變體。
例如，就許多蛋白質(zhì)，包括膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域或者分泌蛋白的成熟形式，本領(lǐng)域已知可以在N末端或C末端缺失一或多個(gè)氨基酸而基本不喪失生物學(xué)功能，或者不喪失被特異性抗體結(jié)合的能力。然而，即使蛋白質(zhì)N末端或C末端缺失一或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一或多種生物學(xué)功能被修飾或喪失，但仍可保留其它TR7功能活性。例如，在許多情況中，不管缺失的大小或位置，縮短的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別TR7的抗體(優(yōu)選特異性結(jié)合TR7的抗體)的能力仍保留。事實(shí)上，由少如6個(gè)TR7氨基酸殘基組成的肽通常就可能激發(fā)免疫應(yīng)答。缺失完整蛋白質(zhì)N末端和/或C末端殘基的一種特定多肽是否保留這種免疫學(xué)活性，可以通過(guò)本文所述常規(guī)方法及本領(lǐng)域已知的其它方法容易地確定。
如上所述，即使蛋白質(zhì)N末端缺失一或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一或多種生物學(xué)功能被修飾或喪失，但仍可保留其它功能活性(例如生物學(xué)活性，多聚體化能力，結(jié)合TR7配體的能力)。例如，當(dāng)完整或成熟多肽的少于大部分的殘基從N末端除去時(shí)，縮短的TR7多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別完整或成熟形式多肽的抗體的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端殘基的一種特定多肽是否保留這種免疫學(xué)活性，可以通過(guò)本文所述常規(guī)方法及本領(lǐng)域已知的其它方法容易地確定。大量缺失N末端氨基酸殘基的TR7多肽仍可保留一些生物學(xué)或免疫學(xué)活性不是不可能的。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合多肽的抗體及編碼這種多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO3的TR7氨基酸序列的氨基末端直至第406位丙氨酸殘基缺失一或多個(gè)殘基。特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含SEQ ID NO3的第n5-411位殘基的氨基酸序列，其中n5是相當(dāng)于SEQ ID NO3中氨基酸殘基位置2-406之間的一個(gè)整數(shù)。
更特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合包含或由以下氨基酸序列組成的多肽的抗體SEQ ID NO3所示的TR7序列的E2至S-411；Q-3至S-411；R-4至S-411；G-5至S-411；Q-6至S-411；N-7至S-411；A-8至S-411；P-9至S-411；A-10至S-411；A-11至S-411；S-12至S-411；G-13至S-411；A-14至S-411；R-15至S-411；K-16至S-411；R-17至S-411；H-18至S-411；G-19至S-411；P-20至S-411；G-21至S-411；P-22至S-411；R-23至S-411；E-24至S-411；A-25至S-411；R-26至S-411；G-27至S-411；A-28至S-411；R-29至S-411；P-30至S-411；G-31至S-411；P-32至S-411；R-33至S-411；V-34至S-411；P-35至S-411；K-36至S-411；T-37至S-411；L-38至S-411；V-39至S-411；L-40至S-411；V-41至S-411；V-42至S-411；A-43至S-411；A-44至S-411；V-45至S-411；L-46至S-411；L-47至S-411；L-48至S-411；V-49至S-411；S-50至S-411；A-51至S-411；E-52至S-411；S-53至S-411；A-54至S-411；L-55至S-411；I-56至S-411；T-57至S-411；Q-58至S-411；Q-59至S-411；D-60至S-411；L-61至S-411；A-62至S-411；P-63至S-411；Q-64至S-411；Q-65至S-411；R-66至S-411；A-67至S-411；A-68至S-411；P-69至S-411；Q-70至S-411；Q-71至S-411；K-72至S-411；R-73至S-411；S-74至S-411；S-75至S-411；P-76至S-411；S-77至S-411；E-78至S-411；G-79至S-411；L-80至S-411；C-81至S-411；P-82至S-411；P-83至S-411；G-84至S-411；H-85至S-411；H-86至S-411；I-87至S-411；S-88至S-411；E-89至S-411；D-90至S-411；G-91至S-411；R-92至S-411；D-93至S-411；C-94至S-411；I-95至S-411；S-96至S-411；C-97至S-411；K-98至S-411；Y-99至S-411；G-100至S-411；Q-101至S-411；D-102至S-411；Y-103至S-411；S-104至S-411；T-105至S-411；H-106至S-411；W-107至S-411；N-108至S-411；D-109至S-411；L-110至S-411；L-111至S-411；F-112至S-411；C-113至S-411；L-114至S-411；R-115至S-411；C-116至S-411；T-117至S-411；R-118至S-411；C-119至S-411；D-120至S-411；S-121至S-411；G-122至S-411；E-123至S-411；V-124至S-411；E-125至S-411；L-126至S-411；S-127至S-411；P-128至S-411；C-129至S-411；T-130至S-411；T-131至S-411；T-132至S-411；R-133至S-411；N-134至S-411；T-135至S-411；V-136至S-411；C-137至S-411；Q-138至S-411；C-139至S-411；E-140至S-411；E-141至S-411；G-142至S-411；T-143至S-411；F-144至S-411；R-145至S-411；E-146至S-411；E-147至S-411；D-148至S-411；S-149至S-411；P-150至S-411；E-151至S-411；M-152至S-411；C-153至S-411；R-154至S-411；K-155至S-411；C-156至S-411；R-157至S-411；T-158至S-411；G-159至S-411；C-160至S-411；P-161至S-411；R-162至S-411；G-163至S-411；M-164至S-411；V-165至S-411；K-166至S-411；V-167至S-411；G-168至S-411；D-169至S-411；C-170至S-411；T-171至S-411；P-172至S-411；W-173至S-411；S-174至S-411；D-175至S-411；I-176至S-411；E-177至S-411；C-178至S-411；V-179至S-411；H-180至S-411；K-181至S-411；E-182至S-411；S-183至S-411；G-184至S-411；I-185至S-411；I-186至S-411；I-187至S-411；G-188至S-411；V-189至S-411；T-190至S-411；V-191至S-411；A-192至S-411；A-193至S-411；V-194至S-411；V-195至S-411；L-196至S-411；I-197至S-411；V-198至S-411；A-199至S-411；V-200至S-411；F-201至S-411；V-202至S-411；C-203至S-411；K-204至S-411；S-205至S-411；L-206至S-411；L-207至S-411；W-208至S-411；K-209至S-411；K-210至S-411；V-211至S-411；L-212至S-411；P-213至S-411；Y-214至S-411；L-215至S-411；K-216至S-411；G-217至S-411；I-218至S-411；C-219至S-411；S-220至S-411；G-221至S-411；G-222至S-411；G-223至S-411；G-224至S-411；D-225至S-411；P-226至S-411；E-227至S-411；R-228至S-411；V-229至S-411；D-230至S-411；R-231至S-411；S-232至S-411；S-233至S-411；Q-234至S-411；R-235至S-411；P-236至S-411；G-237至S-411；A-238至S-411；E-239至S-411；D-240至S-411；N-241至S-411；V-242至S-411；L-243至S-411；N-244至S-411；E-245至S-411；I-246至S-411；V-247至S-411；S-248至S-411；I-249至S-411；L-250至S-411；Q-251至S-411；P-252至S-411；T-253至S-411；Q-254至S-411；V-255至S-411；P-256至S-411；E-257至S-411；Q-258至S-411；E-259至S-411；M-260至S-411；E-261至S-411；V-262至S-411；Q-263至S-411；E-264至S-411；P-265至S-411；A-266至S-411；E-267至S-411；P-268至S-411；T-269至S-411；G-270至S-411；V-271至S-411；N-272至S-411；M-273至S-411；L-274至S-411；S-275至S-411；P-276至S-411；G-277至S-411；E-278至S-411；S-279至S-411；E-280至S-411；H-281至S-411；L-282至S-411；L-283至S-411；E-284至S-411；P-285至S-411；A-286至S-411；E-287至S-411；A-288至S-411；E-289至S-411；R-290至S-411；S-291至S-411；Q-292至S-411；R-293至S-411；R-294至S-411；R-295至S-411；L-296至S-411；L-297至S-411；V-298至S-411；P-299至S-411；A-300至S-411；N-301至S-411；E-302至S-411；G-303至S-411；D-304至S-411；P-305至S-411；T-306至S-411；E-307至S-411；T-308至S-411；L-309至S-411；R-310至S-411；Q-311至S-411；C-312至S-411；F-313至S-411；D-314至S-411；D-315至S-411；F-316至S-411；A-317至S-411；D-318至S-411；L-319至S-411；V-320至S-411；P-321至S-411；F-322至S-411；D-323至S-411；S-324至S-411；W-325至S-411；E-326至S-411；P-327至S-411；L-328至S-411；M-329至S-411；R-330至S-411；K-331至S-411；L-332至S-411；G-333至S-411；L-334至S-411；M-335至S-411；D-336至S-411；N-337至S-411；E-338至S-411；I-339至S-411；K-340至S-411；V-341至S-411；A-342至S-411；K-343至S-411；A-344至S-411；E-345至S-411；A-346至S-411；A-347至S-411；G-348至S-411；H-349至S-411；R-350至S-411；D-351至S-411；T-352至S-411；L-353至S-411；Y-354至S-411；T-355至S-411；M-356至S-411；L-357至S-411；I-358至S-411；K-359至S-411；W-360至S-411；V-361至S-411；N-362至S-411；K-363至S-411；T-364至S-411；G-365至S-411；R-366至S-411；D-367至S-411；A-368至S-411；S-369至S-411；V-370至S-411；H-371至S-411；T-372至S-411；L-373至S-411；L-374至S-411；D-375至S-411；A-376至S-411；L-377至S-411；E-378至S-411；T-379至S-411；L-380至S-411；G-381至S-411；E-382至S-411；R-383至S-411；L-384至S-411；A-385至S-411；K-386至S-411；Q-387至S-411；K-388至S-411；I-389至S-411；E-390至S-411；D-391至S-411；H-392至S-411；L-393至S-411；L-394至S-411；S-395至S-411；S-396至S-411；G-397至S-411；K-398至S-411；F-399至S-411；M-400至S-411；Y-401至S-411；L-402至S-411；E-403至S-411；G-404至S-411；N-405至S-411；和/或A-406至S-411。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，TR7多肽的N末端缺失可以用通式n6-184描述，其中n6是相當(dāng)于SEQ ID NO3所鑒別的氨基酸序列的1-179之間的一個(gè)數(shù)。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由以下殘基的氨基酸序列組成的TR7的N末端缺失SEQ ID NO3所示的TR7胞外結(jié)構(gòu)域序列的E-2至G-184；Q-3至G-184；R-4至G-184；G-5至G-184；Q-6至G-184；N-7至G-184；A-8至G-184；P-9至G-184；A-10至G-184；A-11至G-184；S-12至G-184；G-13至G-184；A-14至G-184；R-15至G-184；K-16至G-184；R-17至G-184；H-18至G-184；G-19至G-184；P-20至G-184；G-21至G-184；P-22至G-184；R-23至G-184；E-24至G-184；A-25至G-184；R-26至G-184；G-27至G-184；A-28至G-184；R-29至G-184；P-30至G-184；G-31至G-184；P-32至G-184；R-33至G-184；V-34至G-184；P-35至G-184；K-36至G-184；T-37至G-184；L-38至G-184；V-39至G-184；L-40至G-184；V-41至G-184；V-42至G-184；A-43至G-184；A-44至G-184；V-45至G-184；L-46至G-184；L-47至G-184；L-48至G-184；V-49至G-184；S-50至G-184；A-51至G-184；E-52至G-184；S-53至G-184；A-54至G-184；L-55至G-184；I-56至G-184；T-57至G-184；Q-58至G-184；Q-59至G-184；D-60至G-184；L-61至G-184；A-62至G-184；P-63至G-184；Q-64至G-184；Q-65至G-184；R-66至G-184；A-67至G-184；A-68至G-184；P-69至G-184；Q-70至G-184；Q-71至G-184；K-72至G-184；R-73至G-184；S-74至G-184；S-75至G-184；p-76至G-184；S-77至G-184；E-78至G-184；G-79至G-184；L-80至G-184；C-81至G-184；P-82至G-184；P-83至G-184；G-84至G-184；H-85至G-184；H-86至G-184；I-87至G-184；S-88至G-184；E-89至G-184；D-90至G-184；G-91至G-184；R-92至G-184；D-93至G-184；C-94至G-184；I-95至G-184；S-96至G-184；C-97至G-184；K-98至G-184；Y-99至G-184；G-100至G-184；Q-101至G-184；D-102至G-184；Y-103至G-184；S-104至G-184；T-105至G-184；H-106至G-184；W-107至G-184；N-108至G-184；D-109至G-184；L-110至G-184；L-111至G-184；F-112至G-184；C-113至G-184；L-114至G-184；R-115至G-184；C-116至G-184；T-117至G-184；R-118至G-184；C-119至G-184；D-120至G-184；S-121至G-184；G-122至G-184；E-123至G-184；V-124至G-184；E-125至G-184；L-126至G-184；S-127至G-184；P-128至G-184；C-129至G-184；T-130至G-184；T-131至G-184；T-132至G-184；R-133至G-184；N-134至G-184；T-135至G-184；V-136至G-184；C-137至G-184；Q-138至G-184；C-139至G-184；E-140至G-184；E-141至G-184；G-142至G-184；T-143至G-184；F-144至G-184；R-145至G-184；E-146至G-184；E-147至G-184；D-148至G-184；S-149至G-184；P-150至G-184；E-151至G-184；M-152至G-184；C-153至G-184；R-154至G-184；K-155至G-184；C-156至G-184；R-157至G-184；T-158至G-184；G-159至G-184；C-160至G-184；P-161至G-184；R-162至G-184；G-163至G-184；M-164至G-184；V-165至G-184；K-166至G-184；V-167至G-184；G-168至G-184；D-169至G-184；C-170至G-184；T-171至G-184；P-172至G-184；W-173至G-184；S-174至G-184；D-175至G-184；I-176至G-184；E-177至G-184；C-178至G-184；和/或V-179至G-184。
如上所述，即使蛋白質(zhì)C末端缺失一或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)被修飾而喪失一或多種生物學(xué)功能，但其它功能活性(例如生物學(xué)活性，多聚體化能力，結(jié)合TR7配體(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如當(dāng)從C末端除去完整或成熟多肽的少部分(less than a majority)殘基時(shí)，縮短的TR7多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別完整或成熟形式TR7多肽的抗體的能力仍會(huì)保留。缺失完整多肽C末端殘基的一種特定多肽是否保留這種免疫學(xué)活性可以通過(guò)本文所述常規(guī)方法及本領(lǐng)域已知的其它方法確定。缺失大量C末端氨基酸殘基的TR7多肽仍保留一些生物學(xué)活性或免疫原性活性不是不可能的。事實(shí)上，由少如6個(gè)TR7氨基酸殘基組成的肽通常就能激發(fā)免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽自SEQ ID NO3的TR7多肽氨基酸序列的羧基末端直至第52位谷氨酸殘基缺失一或多個(gè)殘基。特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含SEQ ID NO3的第52-m5位殘基的氨基酸序列，其中m5是相當(dāng)于SEQ ID NO3中氨基酸殘基位置57-410之間的一個(gè)整數(shù)。
更特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合包含或由以下殘基的氨基酸序列組成的多肽的抗體SEQ ID NO3所示的TR7序列的E-52至M-410；E-52至A-409；E-52至S-408；E-52至D-407；E-52至A-406；E-52至N-405；E-52至G-404；E-52至E-403；E-52至L-402；E-52至Y-401；E-52至M-400；E-52至F-399；E-52至K-398；E-52至G-397；E-52至S-396；E-52至S-395；E-52至L-394；E-52至L-393；E-52至H-392；E-52至D-391；E-52至E-390；E-52至I-389；E-52至K-388；E-52至Q-387；E-52至K-386；E-52至A-385；E-52至L-384；E-52至R-383；E-52至E-382；E-52至G-381；E-52至L-380；E-52至T-379；E-52至E-378；E-52至L-377；E-52至A-376；E-52至D-375；E-52至L-374；E-52至L-373；E-52至T-372；E-52至H-371；E-52至V-370；E-52至S-369；E-52至A-368；E-52至D-367；E-52至R-366；E-52至G-365；E-52至T-364；E-52至K-363；E-52至N-362；E-52至V-361；E-52至W-360；E-52至K-359；E-52至I-358；E-52至L-357；E-52至M-356；E-52至T-355；E-52至Y-354；E-52至L-353；E-52至T-352；E-52至D-351；E-52至R-350；E-52至H-349；E-52至G-348；E-52至A-347；E-52至A-346；E-52至E-345；E-52至A-344；E-52至K-343；E-52至A-342；E-52至V-341；E-52至K-340；E-52至I-339；E-52至E-338；E-52至N-337；E-52至D-336；E-52至M-335；E-52至L-334；E-52至G-333；E-52至L-332；E-52至K-331；E-52至R-330；E-52至M-329；E-52至L-328；E-52至P-327；E-52至E-326；E-52至W-325；E-52至S-324；E-52至D-323；E-52至F-322；E-52至P-321；E-52至V-320；E-52至L-319；E-52至D-318；E-52至A-317；E-52至F-316；E-52至D-315；E-52至D-314；E-52至F-313；E-52至C-312；E-52至Q-311；E-52至R-310；E-52至L-309；E-52至T-308；E-52至E-307；E-52至T-306；E-52至P-305；E-52至D-304；E-52至G-303；E-52至E-302；E-52至N-301；E-52至A-300；E-52至P-299；E-52至V-298；E-52至L-297；E-52至L-296；E-52至R-295；E-52至R-294；E-52至R-293；E-52至Q-292；E-52至S-291；E-52至R-290；E-52至E-289；E-52至A-288；E-52至E-287；E-52至A-286；E-52至P-285；E-52至E-284；E-52至L-283；E-52至L-282；E-52至H-281；E-52至E-280；E-52至S-279；E-52至E-278；E-52至G-277；E-52至P-276；E-52至S-275；E-52至L-274；E-52至M-273；E-52至N-272；E-52至V-271；E-52至G-270；E-52至T-269；E-52至P-268；E-52至E-267；E-52至A-266；E-52至P-265；E-52至E-264；E-52至Q-263；E-52至V-262；E-52至E-261；E-52至M-260；E-52至E-259；E-52至Q-258；E-52至E-257；E-52至P-256；E-52至V-255；E-52至Q-254；E-52至T-253；E-52至P-252；E-52至Q-251；E-52至L-250；E-52至I-249；E-52至S-248；E-52至V-247；E-52至I-246；E-52至E-245；E-52至N-244；E-52至L-243；E-52至V-242；E-52至N-241；E-52至D-240；E-52至E-239；E-52至A-238；E-52至G-237；E-52至P-236；E-52至R-235；E-52至Q-234；E-52至S-233；E-52至S-232；E-52至R-231；E-52至D-230；E-52至V-229；E-52至R-228；E-52至E-227；E-52至P-226；E-52至D-225；E-52至G-224；E-52至G-223；E-52至G-222；E-52至G-221；E-52至S-220；E-52至C-219；E-52至I-218；E-52至G-217；E-52至K-216；E-52至L-215；E-52至Y-214；E-52至P-213；E-52至L-212；E-52至V-211；E-52至K-210；E-52至K-209；E-52至W-208；E-52至L-207；E-52至L-206；E-52至S-205；E-52至K-204；E-52至C-203；E-52至V-202；E-52至F-201；E-52至V-200；E-52至A-199；E-52至V-198；E-52至I-197；E-52至L-196；E-52至V-195；E-52至V-194；E-52至A-193；E-52至A-192；E-52至V-191；E-52至T-190；E-52至V-189；E-52至G-188；E-52至I-187；E-52至I-86；E-52至I-185；E-52至G-184；E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至S-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-b1；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58；和/或E-52至T-57。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合可以用通式52-m6描述的TR7多肽的C末端缺失，其中m6是相當(dāng)于SEQ ID NO3所鑒別的氨基酸序列位置57-183之間的一個(gè)數(shù)。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由以下氨基酸殘基組成的TR7多肽的C末端缺失SEQ ID NO3所示TR7胞外結(jié)構(gòu)域序列的E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至S-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-61；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58；和/或E-52至T-57。
本發(fā)明還提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽具有自SEQ IDNO3的TR7多肽的氨基和羧基末端缺失一或多個(gè)氨基酸，其一般可描述為具有SEQ ID NO3的n5-m5和/或n6-m6殘基，其中n5，n6，m5和m6是如上述的整數(shù)。
本發(fā)明還包括結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽由ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所編碼的完整TR7氨基酸序列的一部分組成，其中該部分不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所編碼的完整氨基酸序列的氨基末端的1至約78個(gè)氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所編碼的完整TR7氨基酸序列羧基末端的1至約233個(gè)氨基酸，或者是上述氨基末端和羧基末端缺失的任意組合。
優(yōu)選地，本發(fā)明抗體結(jié)合N末端和C末端缺失突變體，所述突變體僅包含胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，即在SEQ ID NO3的第52至184位殘基內(nèi)，因?yàn)樵诖藲埢秶鷥?nèi)的任何部分均預(yù)期是可溶的。
本領(lǐng)域能意識(shí)到TR7的一些氨基酸序列可以加以變化而不明顯影響該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。如果這種序列差異是預(yù)期的，應(yīng)記得蛋白質(zhì)上應(yīng)存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。這種區(qū)域通常包含組成配體結(jié)合位點(diǎn)或死亡結(jié)構(gòu)域的殘基，或者形成影響這些結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括結(jié)合TR7蛋白變體的抗體，所述變體示出基本的TR7蛋白活性或包括諸如下述蛋白質(zhì)片段的TR7區(qū)域。這些突變體包括缺失，插入，翻轉(zhuǎn)，重復(fù)和典型取代。關(guān)于氨基酸變化可能是表型沉默的指導(dǎo)可見于Bowie，J.U.等，Science 2471306-1310(1990)。
因此，本發(fā)明抗體可以結(jié)合SEQ ID NO3的多肽或者由ATCC保藏物No.97920中的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物。這類片段，變體或衍生物可以是(i)這樣的片段、變體或衍生物，其中至少一或多個(gè)氨基酸殘基由保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基，更優(yōu)選至少1個(gè)但少于10個(gè)保守氨基酸殘基)取代，而且這種取代的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸殘基，或者(ii)這樣的片段、變體或衍生物，其中一或多個(gè)氨基酸殘基包括一個(gè)取代基團(tuán)，或者(iii)這樣的片段、變體或衍生物，其中成熟多肽與另一種化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)這樣的片段、變體或衍生物，其中額外的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，相信這些片段，衍生物和類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)。
特別感興趣的是荷電氨基酸由另一種荷電氨基酸及由中性或負(fù)電荷氨基酸的取代。后者產(chǎn)生正電荷減少的蛋白質(zhì)，以改良TR7蛋白的特性。特別需要防止聚集。蛋白質(zhì)的聚集不僅導(dǎo)致活性喪失，而且當(dāng)制備藥物配方時(shí)也會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兛梢允敲庖咴缘?Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10307-377(1993))。
氨基酸置換也可以改變與細(xì)胞表面受體結(jié)合的選擇性。Ostade等，Nature 361266-268(1993)描述了導(dǎo)致TNF-α只選擇性結(jié)合兩種已知類型TNF受體之一的一些突變。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合一種TR7受體，其含有來(lái)自天然突變或人工操縱的一或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
正如所表明的，氨基酸變化優(yōu)選是性質(zhì)改變小的變化，如不明顯影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸取代(見表3)。
表3保守氨基酸取代

在特異的實(shí)施方案中，SEQ ID NO3的氨基酸序列和/或本發(fā)明所述任何多肽片段(例如胞外結(jié)構(gòu)域)中的取代、添加或缺失數(shù)是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2個(gè)。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體(尤其包含或由TR7的胞外可溶結(jié)構(gòu)域組成的片段)，所述多肽或其片段或變體含有任意一個(gè)或多個(gè)以下TR7中的保守突變SEQID NO3的殘基的如下置換，M1用A，G，I，L，S，T或V代替；E2用D代替；Q3用N代替；R4用H或K代替；G5用A，I，L，S，T，M或V代替；Q6用N代替；N7用Q代替；A8用G，I，L，S，T，M或V代替；A10用G，I，L，S，T，M或V代替；A11用G，I，L，S，T，M或V代替；S12用A，G，I，L，T，M或V代替；G13用A，I，L，S，T，M或V代替；A14用G，I，L，S，T，M或V代替；R15用H或K代替，K16用H或R代替；R17用H或K代替；H18用K或R代替；G19用A，G，I，L，S，T，M或V代替；G21用A，I，L，S，T，M或V代替；R23用H或K代替；E24用D代替；A25用G，I，L，S，T，M或V代替；R26用H或K代替；G27用A，I，L，S，T，M或V代替；A28用G，I，L，S，T，M或V代替；R29用H或K代替；G31用A，I，L，S，T，M或V代替；R33用H或K代替；V34用A，G，I，L，S，T或M代替；K36用H或R代替；T37用A，G，I，L，S，M或V代替；L38用A，G，I，S，T，M或V代替；V39用A，G，I，L，S，T或M代替；L40用A，G，I，S，T，M或V代替；V41用A，G，I，L，S，T或M代替；V42用A，G，I，L，S，T或M代替；A43用G，I，L，S，T，M或V代替；A44用G，I，L，S，T，M或V代替；V45用A，G，I，L，S，T或M代替；L46用A，G，I，S，T，M或V代替；L47用A，G，I，S，T，M或V代替；L48用A，G，I，S，T，M或V代替；V49用A，G，I，L，S，T或M代替；S50用A，G，I，L，T，M或V代替；A51用G，I，L，S，T，M或V代替；E52用D代替；S53用A，G，I，L，T，M或V代替；A54用G，I，L，S，T，M或V代替；L55用A，G，I，S，T，M或V代替；I56用A，G，L，S，T，M或V代替；T57用A，G，I，L，S，M或V代替Q58用N代替；Q59用N代替；D60用E代替；L61用A，G，I，S，T，M或V代替；A62用G，I，L，S，T，M或V代替；Q64用N代替；Q65用N代替；R66用H或K代替；A67用G，I，L，S，T，M或V代替；A68用G，I，L，S，T，M或V代替；Q70用N代替；Q71用N代替；K72用H或R代替；R73用H或K代替；S74用A，G，I，L，T，M或V代替；S75用A，G，I，L，T，M或V代替；S77用A，G，I，L，T，M或V代替；E78用D代替；G79用A，I，L，S，T，M或V代替；L80用A，G，I，S，T，M或V代替；G84用A，I，L，S，T，M或V代替；H85用K或R代替；H86用K或R代替；I87用A，G，L，S，T，M或V代替；S88用A，G，I，L，T，M或V代替；E89用D代替；D90用E代替；G91用A，I，L，S，T，M或V代替；R92用H或K代替；D93用E代替；I95用A，G，L，S，T，M或V代替；S96用A，G，I，L，T，M或V代替；K98用H或R代替；Y99用F或W代替；G100用A，I，L，S，T，M或V代替；Q101用N代替；D102用E代替；Y103用F或W代替；S104用A，G，I，L，T，M或V代替；T105用A，G，I，L，S，M或V代替；H106用K或R代替；W107用F或Y代替；N108用Q代替；D109用E代替；L110用A，G，I，S，T，M或V代替；L111用A，G，I，S，T，M或V代替；F112用W或Y代替；L114用A，G，I，S，T，M或V代替；R115用H或K代替；T117用A，G，I，L，S，M或V代替；R118用H或K代替；D120用E代替；S121用A，G，I，L，T，M或V代替；G122用A，I，L，S，T，M或V代替；E123用D代替；V124用A，G，I，L，S，T或M代替；E125用D代替；L126用A，G，I，S，T，M或V代替；S127用A，G，I，L，T，M或V代替；T130用A，G，I，L，S，M或V代替；T131用A，G，I，L，S，M或V代替；T132用A，G，I，L，S，M或V代替；R133用H或K代替；N134用Q代替；T135用A，G，I，L，S，M或V代替；V136用A，G，I，L，S，T或M代替；Q138用N代替；E140用D代替；E141用D代替；G142用A，I，L，S，T，M或V代替；T143用A，G，I，L，S，M或V代替；F144用W或Y代替；R145用H或K代替；E146用D代替；E147用D代替；D148用E代替；S149用A，G，I，L，T，M或V代替；E151用D代替；M152用A，G，I，L，S，T或V代替；R154用H或K代替；K155用H或R代替；R157用H或K代替；T158用A，G，I，L，S，M或V代替；G159用A，I，L，S，T，M或V代替；R162用H或K代替；G163用A，I，L，S，T，M或V代替；M164用A，G，I，L，S，T或V代替；V165用A，G，I，L，S，T或M代替；K166用H或R代替；V167用A，G，I，L，S，T或M代替；G168用A，I，L，S，T，M或V代替；D169用E代替；T171用A，G，I，L，S，M或V代替；W173用F或Y代替；S174用A，G，I，L，T，M或V代替；D175用E代替；I176用A，G，L，S，T，M或V代替；E177用D代替；V179用A，G，I，L，S，T或M代替；H180用K或R代替；K181用H或R代替；E182用D代替；S183用A，G，I，L，T，M或V代替；G184用A，I，L，S，T，M或V代替；I185用A，G，L，S，T，M或V代替；I186用A，G，L，S，T，M或V代替；I187用A，G，L，S，T，M或V代替；G188用A，I，L，S，T，M或V代替；V189用A，G，I，L，S，T或M代替；T190用A，G，I，L，S，M或V代替；V191用A，G，I，L，S，T或M代替；A192用G，I，L，S，T，M或V代替；A193用G，I，L，S，T，M或V代替；V194用A，G，I，L，S，T或M代替；V195用A，G，I，L，S，T或M代替；L196用A，G，I，S，T，M或V代替；I197用A，G，L，S，T，M或V代替；V198用A，G，I，L，S，T或M代替；A199用G，I，L，S，T，M或V代替；V200用A，G，I，L，S，T或M代替；F201用W或Y代替；V202用A，G，I，L，S，T或M代替；K204用H或R代替；S205用A，G，I，L，T，M或V代替；L206用A，G，I，S，T，M或V代替；L207用A，G，I，S，T，M或V代替；W208用F或Y代替；K209用H或R代替；K210用H或R代替；V211用A，G，I，L，S，T或M代替；L212用A，G，I，S，T，M或V代替；Y214用F或W代替；L215用A，G，I，S，T，M或V代替；K216用H或R代替；G217用A，I，L，S，T，M或V代替；I218用A，G，L，S，T，M或V代替；S220用A，G，I，L，T，M或V代替；G221用A，I，L，S，T，M或V代替；G222用A，I，L，S，T，M或V代替；G223用A，I，L，S，T，M或V代替；G224用A，I，L，S，T，M或V代替；D225用E代替；E227用D代替；R228用H或K代替；V229用A，G，I，L，S，T或M代替；D230用E代替；R231用H或K代替；S232用A，G，I，L，T，M或V代替；S233用A，G，I，L，T，M或V代替；Q234用N代替；R235用H或K代替；G237用A，I，L，S，T，M或V代替；A238用G，I，L，S，T，M或V代替；E239用D代替；D240用E代替；N241用Q代替；V242用A，G，I，L，S，T或M代替；L243用A，G，I，S，T，M或V代替；N244用Q代替；E245用D代替；I246用A，G，L，S，T，M或V代替；V247用A，G，I，L，S，T或M代替；S248用A，G，I，L，T，M或V代替；I249用A，G，L，S，T，M或V代替；L250用A，G，I，S，T，M或V代替；Q251用N代替；T253用A，G，I，L，S，M或V代替；Q254用N代替；V255用A，G，I，L，S，T或M代替；E257用D代替；Q258用N代替；E259用D代替；M260用A，G，I，L，S，T或V代替；E261用D代替；V262用A，G，I，L，S，T或M代替；Q263用N代替；E264用D代替；A266用G，I，L，S，T，M或V代替；E267用D代替；T269用A，G，I，L，S，M或V代替；G270用A，I，L，S，T，M或V代替；V271用A，G，I，L，S，T或M代替；N272用Q代替；M273用A，G，I，L，S，T或V代替；L274用A，G，I，S，T，M或V代替；S275用A，G，I，L，T，M或V代替；G277用A，I，L，S，T，M或V代替；E278用D代替；S279用A，G，I，L，T，M或V代替；E280用D代替；H281用K或R代替；L282用A，G，I，S，T，M或V代替；L283用A，G，I，S，T，M或V代替；E284用D代替；A286用G，I，L，S，T，M或V代替；E287用D代替；A288用G，I，L，S，T，M或V代替；E289用D代替；R290用H或K代替；S291用A，G，I，L，T，M或V代替；Q292用N代替；R293用H或K代替；R294用H或K代替；R295用H或K代替；L296用A，G，I，S，T，M或V代替；L297用A，G，I，S，T，M或V代替；V298用A，G，I，L，S，T或M代替；A300用G，I，L，S，T，M或V代替；N301用Q代替；E302用D代替；G303用A，I，L，S，T，M或V代替；D304用E代替；T306用A，G，I，L，S，M或V代替；E307用D代替；T308用A，G，I，L，S，M或V代替；L309用A，G，I，S，T，M或V代替；R310用H或K代替；Q311用N代替；F313用W或Y代替；D314用E代替；D315用E代替；F316用W或Y代替；A317用G，I，L，S，T，M或V代替；D318用E代替；L319用A，G，I，S，T，M或V代替；V320用A，G，I，L，S，T或M代替；F322用W或Y代替；D323用E代替；S324用A，G，I，L，T，M或V代替；W325用F或Y代替；E326用D代替；L328用A，G，I，S，T，M或V代替；M329用A，G，I，L，S，T或V代替；R330用H或K代替；K331用H或R代替；L332用A，G，I，S，T，M或V代替；M335用A，G，I，L，S，T或V代替；D336用E代替；N337用Q代替；E338用D代替；I339用A，G，L，S，T，M或V代替；K340用H或R代替；V341用A，G，I，L，S，T或M代替；A342用G，I，L，S，T，M或V代替；K343用H或R代替；A344用G，I，L，S，T，M或V代替；E345用D代替；A346用G，I，L，S，T，M或V代替；A347用G，I，L，S，T，M或V代替；G348用A，I，L，S，T，M或V代替；H349用K或R代替；R350用H或K代替；D351用E代替；T352用A，G，I，L，S，M或V代替；L353用A，G，I，S，T，M或V代替；Y354用F或W代替；T355用A，G，I，L，S，M或V代替；M356用A，G，I，L，S，T或V代替；L357用A，G，I，S，T，M或V代替；I358用A，G，L，S，T，M或V代替；K359用H或R代替；W360用F或Y代替；V361用A，G，I，L，S，T或M代替；N362用Q代替；K363用H或R代替；T364用A，G，I，L，S，M或V代替；G365用A，I，L，S，T，M或V代替；R366用H或K代替；D367用E代替；A368用G，I，L，S，T，M或V代替；S369用A，G，I，L，T，M或V代替；V370用A，G，I，L，S，T或M代替；H371用K或R代替；T372用A，G，I，L，S，M或V代替；L373用A，G，I，S，T，M或V代替；L374用A，G，I，S，T，M或V代替；D375用E代替；A376用G，I，L，S，T，M或V代替；L377用A，G，I，S，T，M或V代替；E378用D代替；T379用A，G，I，L，S，M或V代替；L380用A，G，I，S，T，M或V代替；G381用A，I，L，S，T，M或V代替；E382用D代替；R383用H或K代替；L384用A，G，I，S，T，M或V代替；A385用G，I，L，S，T，M或V代替；K386用H或R代替；Q387用N代替；K388用H或R代替；I389用A，G，L，S，T，M或V代替；E390用D代替；D391用E代替；H392用K或R代替；L393用A，G，I，S，T，M或V代替；L394用A，G，I，S，T，M或V代替；S395用A，G，I，L，T，M或V代替；S396用A，G，I，L，T，M或V代替；G397用A，I，L，S，T，M或V代替；K398用H或R代替；F399用W或Y代替；M400用A，G，I，L，S，T或V代替；Y401用F或W代替；L402用A，G，I，S，T，M或V代替；E403用D代替；G404用A，I，L，S，T，M或V代替；N405用Q代替；A406用G，I，L，S，T，M或V代替；D407用E代替；S408用A，G，I，L，T，M或V代替；A409用G，I，L，S，T，M或V代替；M410用A，G，I，L，S，T或V代替；或/和S411用A，G，I，L，T，M或V代替。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體(尤其是包含或由TR7的胞外可溶結(jié)構(gòu)域組成的片段)，所述多肽或其片段或變體含有任意一個(gè)或多個(gè)以下TR7中的非保守突變SEQ ID NO3的殘基的如下置換，M1用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E2用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q3用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R4用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G5用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q6用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N7用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A8用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P9用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A10用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A11用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S12用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G13用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A14用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R15用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K16用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R17用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H18用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G19用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P20用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G21用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，Q，Y，P或C代替；P22用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R23用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E24用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A25用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R26用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G27用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A28用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R29用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P30用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G31用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P32用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R33用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V34用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P35用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；K36用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T37用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C；L38用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V39用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L40用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V41用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V42用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A43用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A44用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V45用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L46用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L47用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L48用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V49用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S50用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A51用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E52用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S53用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A54用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L55用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I56用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T57用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q58用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q59用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D60用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L61用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A62用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P63用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；Q64用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q65用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R66用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A67用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A68用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P69用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；Q70用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q71用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K72用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R73用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S74用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S75用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P76用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；S77用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E78用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G79用D，E，H， K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L80用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C81用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；P82用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；P83用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G84用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H85用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H86用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I87用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S88用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E89用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D90用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G91用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R92用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D93用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C94用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；I95用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S96用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C97用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；K98用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y99用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；G100用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q101用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D102用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y103用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S104用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T105用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H106用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W107用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；N108用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D109用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L110用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L111用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F112用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；C113用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；L114用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R115用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C116用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T117用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R118用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C119用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；D120用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S121用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G122用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E123用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V124用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E125用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L126用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S127用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P128用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；C129用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T130用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T131用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T132用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R133用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N134用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T135用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V136用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C137用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；Q138用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C139用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；E140用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E141用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；0142用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T143用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F144用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R145用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E146用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E147用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D148用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S149用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P150用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；E151用H，K，R，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M152用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C153用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；R154用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K155用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C156用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；R157用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T158用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G159用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C160用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；P161用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R162用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G163用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M164用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V165用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K166用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V167用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G168用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D169用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C170用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T171用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P172用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；W173用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S174用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D175用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I176用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E177用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C178用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；V179用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H180用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V.N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K181用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E182用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S183用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G184用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I185用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I186用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I187用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G188用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V189用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T190用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V191用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A192用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A193用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V194用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V195用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L196用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I197用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V198用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A199用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V200用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F201用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V202用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C203用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；K204用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S205用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L206用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L207用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W208用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；K209用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K210用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V211用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L212用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P213用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；Y214用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L215用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K216用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G217用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I218用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C219用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；S220用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G221用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G222用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G223用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G224用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D225用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P226用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；E227用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R228用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V229用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D230用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R231用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S232用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S233用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q234用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R235用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P236用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G237用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A238用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E239用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D240用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N241用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V242用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L243用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N244用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E245用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I246用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V247用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S248用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I249用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L250用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q251用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P252用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；T253用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q254用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V255用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P256用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；E257用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q258用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E259用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M260用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E261用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V262用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q263用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E264用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P265用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A266用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E267用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P268用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；T269用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G270用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V271用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N272用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M273用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L274用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S275用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P276用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G277用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E278用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S279用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P280用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H281用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L282用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L283用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E284用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P285用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A286用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E287用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A288用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E289用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R290用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S291用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q292用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R293用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R294用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R295用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L296用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L297用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V298用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P299用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A300用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N301用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E302用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G303用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D304用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P305用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C；T306用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E307用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T308用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L309用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R310用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q311用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C312用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；F313用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D314用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D315用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F316用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A317用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D318用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P，或C代替；L319用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V320用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P321用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；F322用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D323用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S324用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W325用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；E326用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P327用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；L328用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M329用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R330用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C；K331用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L332用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G333用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L334用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M335用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D336用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N337用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E338用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I339用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K340用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V341用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A342用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K343用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A344用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E345用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A346用D，R，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A347用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G348用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H349用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，P，W，Y，P或C代替；R350用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D351用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T352用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L353用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y354用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；T355用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M356用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L357用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I358用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K359用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W360用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V361用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N362用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K363用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T364用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G365用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R366用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D367用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A368用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S369用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V370用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H371用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T372用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L373用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L374用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D375用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A376用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L377用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E378用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T379用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L380用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G381用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E382用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R383用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L384用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C，A385用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K386用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q387用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K388用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I389用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E390用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D391用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H392用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L393用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L394用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S395用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S396用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G397用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K398用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F399用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S.T，M，V，P或C代替；M400用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y401用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L402用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E403用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G404用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N405用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A406用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D407用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S408用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A409用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M410用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；和/或S411用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P，或C代替。
本發(fā)明TR7蛋白質(zhì)中為功能所需的氨基酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法鑒別，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))。后一方法是在分子的每個(gè)殘基導(dǎo)入單一的丙氨酸突變。然后將所得突變分子測(cè)試生物學(xué)活性如受體結(jié)合或者體外或體內(nèi)增殖活性。對(duì)配體-受體結(jié)合非常關(guān)鍵的位點(diǎn)也可以通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定，如結(jié)晶，核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等，J.Mol.Biol.224899-904(1992)及de Vos等，Science 255306-312(1992))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR7功能所必需的TR7區(qū)域。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR7功能所必需的TR7區(qū)域并抑制或消除了TR7功能。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR7功能所必需的TR7區(qū)域并增強(qiáng)的TR7功能。
另外，可以應(yīng)用蛋白質(zhì)工程以改良或改變TR7多肽的特性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生新的突變蛋白或多肽，其包括單一或多個(gè)氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。這種修飾的多肽可以示出，例如增強(qiáng)的活性或提高的穩(wěn)定性。另外，至少在一定的純化和貯存條件下，它們可以高產(chǎn)量純化而且比相應(yīng)的天然多肽示出更好的溶解性。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合這種修飾的TR7多肽。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合的非天然發(fā)生的TR7變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生，包括但非限于寡核苷酸介導(dǎo)的誘變，丙氨酸掃描，PCR誘變，定點(diǎn)誘變(見，例如Carter等，Nucl.Acids Res.134331(1986)；及Zoller等，Nucl.Acids Res.106487(1982))，盒式誘變(見例如Wells等，Gene 34315(1985))，限制選擇誘變(見例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
因此，本發(fā)明還涵蓋了結(jié)合TR7衍生物和類似物的抗體，所述衍生物和類似物具有一或多個(gè)氨基酸殘基缺失、添加或取代以產(chǎn)生更適于在所選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)、放大等的TR7多肽。例如，半胱氨酸殘基可以缺失或用另一種氨基酸殘基取代以去除二硫鍵；N連接的糖基化位點(diǎn)可以改變或去除以實(shí)現(xiàn)例如表達(dá)更易于從已知超糖基化N連接位點(diǎn)的酵母宿主中回收及純化的同源產(chǎn)物。為此，在TR7多肽中任一或多個(gè)糖基化識(shí)別序列的第一個(gè)或第三個(gè)氨基酸位置之一或這兩個(gè)位置上的多種氨基酸取代，和/或在任一或多個(gè)這種識(shí)別序列的第二個(gè)位置的氨基酸缺失，將防止TR7在修飾的三肽序列糖基化(見例如Miyajimo等，EMBO J.5(6)1193-1197)。另外，TR7多肽的一或多個(gè)氨基酸殘基(例如精氨酸和賴氨酸殘基)可以缺失或用另一種殘基取代，以消除非所需的蛋白酶加工，例如弗林蛋白酶或kexin加工。
本發(fā)明的抗體還包括結(jié)合如下一種多肽的抗體，所述多肽包含或由包括引導(dǎo)序列的由保藏的cDNA(ATCC保藏號(hào)97920的保藏物)編碼的多肽組成的多肽；包含或由減去引導(dǎo)序列的由保藏的cDNA編碼的成熟多肽(即成熟蛋白)組成的多肽；包含或由SEQ ID NO3的大約1至大約411位氨基酸組成的多肽；包含或由SEQ ID NO3的大約2至大約411位氨基酸組成的多肽；包含或由SEQ ID NO3的大約52至大約411位氨基酸組成的多肽；包含或由TR7胞外結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR7富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR7跨膜結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR7胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的多肽，但所述結(jié)構(gòu)域缺少全部或部分跨膜結(jié)構(gòu)域；及包含或由TR7死亡結(jié)構(gòu)域組成的多肽；以及與上述這些多肽有至少80％相同，更優(yōu)選至少90％或95％相同，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相同的多肽，及還包括這些多肽的至少30個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的部分。
具有與TR7多肽的參比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽序列可以包括每100個(gè)所述TR7多肽的參比氨基酸序列的氨基酸中最多5個(gè)氨基酸變化，除此之外該多肽的氨基酸序列與參比氨基酸序列相同。換而言之，為獲得具有與參比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參比序列中最多有5％的氨基酸殘基可以缺失或用另一種氨基酸取代，或者最多占參比序列中氨基酸總數(shù)5％的氨基酸可以插入?yún)⒈刃蛄兄?。參比序列的這些變化可以發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者在兩個(gè)末端位置之間的任何位置，它們單獨(dú)分散在參比序列的殘基中或在參比序列內(nèi)呈一或多個(gè)連續(xù)的組。
實(shí)際上，任何特定的多肽與例如圖1A-B(SEQ ID NO3)所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列或其片段是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可以使用已知的計(jì)算機(jī)程序常規(guī)確定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix版本8，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575 Science Drive，Madison，WI53711)。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列對(duì)比程序以確定一個(gè)特定序列與本發(fā)明的參比序列是否例如至少95％相同時(shí)，參數(shù)的設(shè)定當(dāng)然是計(jì)算在全長(zhǎng)參比氨基酸序列基礎(chǔ)上的相同性百分率，并最多允許占參比序列氨基酸殘基總數(shù)5％的同源性缺口。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，確定參比(查詢)序列(本發(fā)明的序列)和一個(gè)對(duì)象序列之間的相同性，也稱全局序列比對(duì)，可以利用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))的FASTDB計(jì)算機(jī)程序。FASTDB氨基酸比對(duì)中使用的優(yōu)選參數(shù)為Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列長(zhǎng)度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者對(duì)象氨基酸序列的長(zhǎng)度，取兩者中較短的。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，如果對(duì)象序列因N或C末端缺失而非由于內(nèi)部缺失而比查詢序列短，那么必須對(duì)結(jié)果作手工修正，因?yàn)镕ASTDB程序在計(jì)算全局相同性百分比時(shí)不計(jì)算對(duì)象序列的N和C末端的截短。對(duì)于對(duì)象序列相對(duì)于查詢序列在N或C末端截短，則相同性百分比的修正是通過(guò)計(jì)算和相應(yīng)對(duì)象殘基不匹配的位于對(duì)象序列N或C末端的查詢序列的殘基數(shù)作為查詢序列總堿基數(shù)的百分比而進(jìn)行。通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定一個(gè)殘基是否匹配。然后將此百分比從使用特別參數(shù)通過(guò)上述FASTDB程序計(jì)算的相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比數(shù)值。這一最終相同性百分比分值是用于本實(shí)施方案目的的百分比。進(jìn)行手工調(diào)節(jié)相同性百分比數(shù)值時(shí)，只有在不與查詢序列相匹配的對(duì)象序列的N或C末端的堿基才被考慮，也就是只有在查詢殘基位置位于對(duì)象序列的最N端和C端殘基之外才予以考慮。例如，將一個(gè)90個(gè)氨基酸殘基的對(duì)象序列與一個(gè)100個(gè)殘基的查詢序列比對(duì)以確定相同性百分比。缺失發(fā)生于對(duì)象序列的N末端，因此FASTDB比對(duì)不能顯示出N末端前10個(gè)殘基的匹配/比對(duì)。這10個(gè)不匹配的殘基相當(dāng)于序列的10％(N或C端不匹配的殘基數(shù)/查詢序列中的殘基總數(shù))，因而從FASTDB程序計(jì)算的相同性百分比值中減去這10％。如果剩余的90個(gè)堿基都完全匹配，那么最終的相同性百分比就是90％。在另一個(gè)實(shí)施例中，將一個(gè)90個(gè)堿基的對(duì)象序列與一個(gè)100個(gè)堿基的查詢序列相比較，這時(shí)的缺失是內(nèi)部缺失，因而對(duì)象序列的N或C末端殘基沒(méi)有與查詢序列不匹配的。在這種情況下，F(xiàn)ASTDB計(jì)算的相同性百分比不需手工修正。再?gòu)?qiáng)調(diào)一次，只有如FSATDB對(duì)比中所展示的與查詢序列不匹配的位于對(duì)象序列的N或C末端以外的殘基才需要手工修正。對(duì)于這一實(shí)施方案不需要進(jìn)行其他的手工修正。
本發(fā)明的多肽在SDS-PAGE凝膠上或者在分子篩凝膠過(guò)濾柱上可用作分子量標(biāo)記，及作為生產(chǎn)結(jié)合TR7多肽的抗體的來(lái)源，使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。
本申請(qǐng)還涉及結(jié)合如下蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)含有與本文以n5-m5，和/或n6-m6表示的TR7多肽序列至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及結(jié)合如下蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)含有與具有本文所述特異的TR7 N和C末端缺失的氨基酸序列的多肽至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合本發(fā)明的TR7蛋白，包括上述的融合蛋白，其中TR7多肽是本文所述的n5-m5和/或n6-m6所示的那些。
TR4多肽在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4多肽或其片段或變體。以下段落更詳細(xì)描述了可由本發(fā)明抗體結(jié)合的TR4多肽，片段和變體。可由本發(fā)明抗體結(jié)合的TR4多肽，片段和變體也見于例如國(guó)際公開號(hào)No.WO98/32856和WO00/67793所描述，這些文獻(xiàn)以其全文并入本文作參考。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合TR4多肽。在一些實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR4的抗體可以結(jié)合TR4的片段，變體(包括TR4的同源物)，多聚體或修飾形式。例如，TR4的免疫特異性抗體可以結(jié)合包含全部或部分TR4的融合蛋白的TR4部分。
TR4蛋白可以以單體或多聚體(即二聚體，三聚體，四聚體和更高的多聚體)形式發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及結(jié)合呈單體或多聚體的一部分的TR4蛋白的抗體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4單體，二聚體，三聚體或四聚體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合含有一或多種TR4多肽的至少二聚體，至少三聚體，或至少四聚體。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合TR4同聚體或異聚體。本文所用術(shù)語(yǔ)同聚體是指只含有本發(fā)明TR4蛋白(包括本文所述TR4片段，變體和融合蛋白)的多聚體。這些同聚體可含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白質(zhì)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的同聚體是只含有具有相同多肽序列的TR4蛋白的多聚體。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合含有具有不同多肽序列的TR4蛋白的TR4同聚體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4同源二聚體(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)或同源三聚體(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4的至少一個(gè)同源二聚體，至少一個(gè)同源三聚體或至少一個(gè)同源四聚體。
本文所用術(shù)語(yǔ)異聚體是指這樣的多聚體，其除了含有本發(fā)明TR4蛋白之外，還含有異源蛋白(即含有與TR4基因編碼的多肽序列不相應(yīng)的多肽序列的蛋白質(zhì))。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種異源二聚體，異源三聚體或異源四聚體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合含有一或多個(gè)TR4多肽的至少一個(gè)同源二聚體，至少一個(gè)同源三聚體或至少一個(gè)同源四聚體。
由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以是疏水性、親水性、離子性和/或共價(jià)結(jié)合的，和/或可以間接通過(guò)例如脂質(zhì)體形成而連接。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)TR4蛋白在溶液中互相接觸時(shí)，會(huì)形成由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體例如同源二聚體或同源三聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)與TR4多肽的抗體(包括抗融合蛋白中的異源多肽序列的抗體)在溶液中接觸時(shí)，形成由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的異源多聚體，例如異源三聚體或異源四聚體。在其它實(shí)施方案中，由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體通過(guò)與本發(fā)明TR4蛋白的共價(jià)結(jié)合和/或在本發(fā)明TR4蛋白之間的共價(jià)結(jié)合而形成。這種共價(jià)結(jié)合可以涉及所述蛋白質(zhì)多肽序列(例如SEQ ID NO1所示多肽序列，或由ATCC保藏物97853的cDNA克隆編碼的多肽)中包含的一或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)例子中，所述共價(jià)結(jié)合是位于蛋白質(zhì)多肽序列內(nèi)的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸殘基之間的交聯(lián)。在另一個(gè)例子中，所述共價(jià)結(jié)合是化學(xué)或重組操作的結(jié)果?；蛘?，這種共價(jià)結(jié)合可以涉及TR4融合蛋白中異源多肽序列中包含的一或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，共價(jià)結(jié)合發(fā)生在融合蛋白包含的異源序列之間(見例如美國(guó)專利No.5478925)。在一個(gè)特異的實(shí)施例中，所述共價(jià)結(jié)合發(fā)生在TR4-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的異源序列之間。在另一個(gè)特異的實(shí)施例中，融合蛋白的共價(jià)結(jié)合發(fā)生在異源多肽序列之間，所述異源多肽序列來(lái)自能形成共價(jià)結(jié)合的多聚體的另一個(gè)TNF家族配體/受體成員，例如oseteoprotegerin(見例如國(guó)際公開No.WO98/49305，在此以其全文并入?yún)⒖?。
可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法產(chǎn)生。例如，希望包含于本發(fā)明多聚體中的蛋白質(zhì)可以使用本領(lǐng)域已知的接頭分子和接頭分子長(zhǎng)度優(yōu)化技術(shù)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(見例如美國(guó)專利No.5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。另外，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，以在位于希望包含于多聚體中的蛋白質(zhì)多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基之間形成一或多個(gè)分子間交聯(lián)(見例如美國(guó)專利No.5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。另外，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過(guò)將半胱氨酸或生物素加入所述蛋白質(zhì)多肽序列的C或N末端而常規(guī)修飾，而且可以使用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生含有一或多個(gè)這些修飾蛋白質(zhì)的多聚體(見，例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。再者，可以使用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生含有希望包含于可由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體中的蛋白質(zhì)組分的脂質(zhì)體(見，例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。
或者，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體可以使用本領(lǐng)域已知的基因工程技術(shù)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多聚體中包含的蛋白質(zhì)是使用本文所述的融合蛋白技術(shù)或本領(lǐng)域已知其它技術(shù)重組產(chǎn)生的(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，通過(guò)將編碼TR4多肽的多核苷酸序列與編碼接頭多肽的序列連接，然后進(jìn)一步與一種編碼從起始C末端至N末端的反方向的該多肽翻譯產(chǎn)物(缺失前導(dǎo)序列)的合成多核苷酸連接，產(chǎn)生編碼可以由本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的一種同源二聚體的多核苷酸(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文所述重組技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它方法產(chǎn)生重組TR4多肽，其含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域并可以通過(guò)膜重構(gòu)技術(shù)整合入脂質(zhì)體中(見例如美國(guó)專利5478925，在此以其全文并入?yún)⒖?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩或多個(gè)TR4多肽通過(guò)合成接頭(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接頭)連接。實(shí)施例包括美國(guó)專利No.5073627(在此并入?yún)⒖?中所述那些肽接頭。包含由肽接頭分離的多個(gè)TR4多肽的蛋白質(zhì)可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含由肽接頭分離的多個(gè)TR4多肽的蛋白質(zhì)。
另一種制備多聚體TR4多肽的方法涉及使用融合于亮氨酸拉鏈或異亮氨酸多肽序列的TR4多肽。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是促進(jìn)含有這些結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)多聚體化的多肽。亮氨酸拉鏈最初在一些DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中鑒別(Landschulz等，Science2401759(1988))，至今已經(jīng)在許多不同的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。已知的亮氨酸拉鏈?zhǔn)翘烊淮嬖诘亩垠w化或三聚體化的肽及其衍生物。適于生產(chǎn)可溶多聚體TR4蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的實(shí)施例是PCT申請(qǐng)WO94/10308中所述的那些，在此并入?yún)⒖?。將包含與在溶液中二聚體化或三聚體化的肽融合的可溶TR4多肽的重組融合蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，并使用本領(lǐng)域已知技術(shù)將所得可溶多聚體TR4從培養(yǎng)上清中回收。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4-亮氨酸拉鏈融合蛋白單體和/或TR4-亮氨酸拉鏈融合蛋白多聚體。
據(jù)信蛋白質(zhì)TNF家族的一些成員以三聚體形式存在(Beutler和Huffel，Science 264667，1994；Banner等，Cell 73431，1993)。因此，三聚體TR4可能具有生物活性增強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的亮氨酸拉鏈部分是優(yōu)先形成三聚體的那些部分。一個(gè)實(shí)施例是衍生自肺表面活性劑蛋白D(SPD)的亮氨酸拉鏈，如Hoppe等(FEBSLetters 344191(1994))及美國(guó)專利申請(qǐng)No.08/446922所述，在此并入?yún)⒖肌Ｔ谔禺惖膶?shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4-亮氨酸拉鏈融合蛋白三聚體。
衍生自天然存在的三聚體蛋白質(zhì)的其它肽可以用于制備三聚體TR4。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4融合蛋白單體和/或TR4融合蛋白三聚體。
結(jié)合TR4受體多肽的抗體可以結(jié)合分離的或天然存在狀態(tài)的多肽。“分離多肽”是指從其天然環(huán)境中分離的一種多肽。因此，本發(fā)明中，在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的和/或包含于重組細(xì)胞中的多肽被認(rèn)為是分離的。另外，“分離的多肽”也指已經(jīng)從重組宿主細(xì)胞中部分或基本純化的多肽。例如，一種重組產(chǎn)生的TR4多肽通過(guò)一步方法基本純化，所述方法如Smith和Johnson，Gene 6731-40(1988)所述。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合重組產(chǎn)生的TR4受體多肽。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在一種細(xì)胞表面上表達(dá)的TR4受體，該細(xì)胞包含可操縱地與控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列結(jié)合的編碼SEQ ID NO1的1-468位氨基酸的多核苷酸。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合包含或由一種氨基酸序列組成的TR4多肽片段，所述氨基酸序列包含于SEQ ID NO1中，由ATCC保藏號(hào)97853中包含的cDNA編碼，或者由與ATCC保藏號(hào)97853中包含的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交(例如在嚴(yán)格雜交條件下)的核酸編碼。蛋白質(zhì)片段可以是“游離存在的”，或包含于一個(gè)較大的多肽中，在該較大的多肽中該片段形成其一部分或一個(gè)區(qū)域，最優(yōu)選作為一個(gè)單一的連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合多肽片段，包括例如，包含或由大約以下氨基酸殘基組成的片段SEQ ID NO1的第1-23，24-43，44-63，64-83，84-103，104-123，124-143，144-163，164-183，184-203，204-223，224-238，239-264，265-284，285-304，305-324，325-345，346-366，367-387，388-418，419-439，和/或440-468位氨基酸殘基。文中“大約”包括特別指出的數(shù)值，在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1)氨基酸。另外，由本發(fā)明抗體結(jié)合的多肽片段的長(zhǎng)度可以是至少大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200個(gè)氨基酸。文中“大約”包括特別指出的數(shù)值，在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1)氨基酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合選自以下一組的多肽片段一種包含或由TR4受體胞外結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO1的約第24至約第238位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由兩個(gè)TR4富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可見于由SEQ ID NO1的約第131至約第229位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)片段中)組成的多肽；一種包含或由SEQID NO1的約第131至約第183位氨基酸殘基組成的TR4富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由SEQ ID NO1的約第184至約第229位氨基酸殘基組成的TR4富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由TR4受體跨膜結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO1的約第239至約第264位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由預(yù)測(cè)的成熟TR4多肽的片段組成的多肽，其中所述片段具有TR4功能活性(例如，抗原性活性或生物學(xué)活性)；一種包含或由TR4受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO1的約第265至約第468位氨基酸殘基)組成的多肽；一種包含或由全部或部分缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的TR4受體胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的多肽；一種包含或由TR4受體死亡結(jié)構(gòu)域(預(yù)測(cè)組成SEQ ID NO1的約第379至約第422位氨基酸殘基)組成的多肽；和一種包含或由TR4受體蛋白的1，2，3，4或更多個(gè)表位攜帶部分組成的多肽。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8個(gè)成員的任意組合組成。組成TR4受體胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基由計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到組成這些結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基根據(jù)限定每個(gè)結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)可以略微變化(例如變化大約1至大約15個(gè)氨基酸殘基)。編碼這些多肽的多核苷酸也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
據(jù)信TR4的一或兩個(gè)胞外富半胱氨酸基序?qū)R4與其配體(例如TRAIL)之間的相互作用很重要。因此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由SEQ ID NO1的第131至183位，和/或第184-229位氨基酸殘基組成的TR4多肽片段。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由兩個(gè)胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO1的第131至229位氨基酸殘基)組成的TR4多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由TR4的胞外可溶結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO1的第24至238位氨基酸殘基)組成的TR4多肽。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR4的全部或部分胞外可溶結(jié)構(gòu)域(例如一或兩個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明抗體阻止TRAIL配體與TR4結(jié)合。在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR4的全部或部分胞外可溶結(jié)構(gòu)域(例如一或兩個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明抗體拮抗TR4受體。在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR4的全部或部分胞外可溶結(jié)構(gòu)域(例如一或兩個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明抗體誘導(dǎo)表達(dá)TR4受體細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的抗體還可以結(jié)合包含或由TR4的結(jié)構(gòu)或功能屬性部分組成的片段。這些片段包括包含完整(即全長(zhǎng))TR4的α-螺旋及α-螺旋形成區(qū)(“α-區(qū)”)，β-折疊及β-折疊形成區(qū)(“β-區(qū)”)，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲及卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，親水區(qū)，疏水區(qū)，α兩性區(qū)，β兩性區(qū)，表面形成區(qū)，及高抗原指數(shù)區(qū)(即含有抗原指數(shù)高于或等于1.5的四或多個(gè)連續(xù)氨基酸，使用Jameson-Wolf程序的默認(rèn)參數(shù)鑒別)的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的區(qū)域是表4所述的那些區(qū)域，并包括但非限于通過(guò)分析SEQ ID NO1所示氨基酸序列而鑒別的上述類型的區(qū)域，這些優(yōu)選的區(qū)域包括Gamier-Robson預(yù)測(cè)的α-區(qū)，β-區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)及卷曲區(qū)；Chou-Fasman預(yù)測(cè)的α-區(qū)，β-區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)；Kyte-Doolittle預(yù)測(cè)的親水區(qū)；Eisenbergα和β兩性區(qū)；Emini表面形成區(qū)；及Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)，使用這些計(jì)算機(jī)程序的默認(rèn)參數(shù)預(yù)測(cè)。
表4示出的代表如上所述的TR4的結(jié)構(gòu)和功能屬性的數(shù)據(jù)是使用多種DNA*STAR模塊和算法按默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生的。第I欄表示α螺旋區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第II欄表示α螺旋區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第III欄表示β折疊區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第IV欄表示β折疊區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第V欄表示轉(zhuǎn)角區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第VI欄表示轉(zhuǎn)角區(qū)的Chou-Fasman分析結(jié)果；第VII欄表示卷曲區(qū)的Garnier-Robson分析結(jié)果；第VIII欄表示Kyte-Doolittle親水性圖；第IX欄表示α兩性區(qū)的Eisenberg分析結(jié)果；第X欄表示β兩性區(qū)的Eisenberg分析結(jié)果；第XI欄表示柔性區(qū)的Karplus-Schultz分析結(jié)果；第XII欄表示Jameson-Wolf抗原指數(shù)分值；及第XIII欄表示Emini表面概率圖。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表4中第VIII，XII和XIII欄所示數(shù)據(jù)可以用于確定呈現(xiàn)高度抗原性潛力的TR4區(qū)域。通過(guò)選擇表示在免疫應(yīng)答的初始過(guò)程時(shí)可能發(fā)生抗原識(shí)別的環(huán)境中很可能暴露于多肽表面的多肽區(qū)域的數(shù)值，從第VIII，XII和/或XIII欄所示數(shù)據(jù)中確定高抗原性區(qū)域。
表4所示上述優(yōu)選的區(qū)域包括但非限于通過(guò)分析SEQ ID NO1所示氨基酸序列鑒別的上述類型區(qū)域。如表4所示，這種優(yōu)選的區(qū)域包括Garnier-Robsonα-區(qū)，β-區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)，Chou-Fasmanα-區(qū)，β-區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)，Eisenbergα-和β-兩性區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)及Emini表面形成區(qū)。本發(fā)明的一或多個(gè)抗體結(jié)合的多肽片段優(yōu)選是包含組合一些結(jié)構(gòu)特征的TR4區(qū)域的那些片段，如上述及表4所示一些(例如1，2，3或4個(gè))相同或不同區(qū)域特征。
表4殘基位置 III III IV VVIVII VIII IX XXI XII XIIIMet1 ..B....0.12...-0.10 0.90Ala2 ......C-0.08 **.0.251.08Pro3 ......C0.42**.0.100.86Pro4 .....TC-0.04 **.1.051.69Pro5 A....T.0.31.*F1.001.24Ala6 A....T.0.10.*F1.001.10Arg7 A....T.0.34.*.0.100.58Val8 ..BB...-0.03 .*.-0.30 0.37His9 ..BB...-0.52 .*.-0.30 0.37Leu10..BB...-1.12 .*.-0.60 0.17Gly11..BB...-1.12 .*.-0.60 0.18Ala12..BB...-2.09 .*.-0.60 0.14Phe13..BB...-1.54 .*.-0.60 0.12Leu14..BB...-1.72 ...-0.60 0.18Ala15..BB...-0.91 ...-0.60 0.27Val16..BB...-0.78 ...-0.60 0.51Thr17..BB...-0.53 ..F-0.45 0.95Pro18...B..C-0.13 ..F0.050.93Asn19.....TC0.09..F0.601.69Pro20.....TC0.09..F0.601.18Gly21....TT.0.64..F0.650.77Ser22.....TC0.61..F0.450.64Ala23......C0.51..F0.250.41Ala24.....TC0.51..F0.450.60Ser25..B..T.0.13..F0.850.78Gly26A....T.-0.11 ..F0.850.78Thr27A....T.-0.40 ..F0.850.78Glu28AA.....-0.40 ..F0.450.58Ala29AA.....-0.12 ...0.300.60Ala30AA.....-0.03 ...0.300.60Ala31AA.....0.01...0.300.53Ala32AA.....0.37...-0.30 0.71Thr33A....T.-0.49 *.F1.001.40Pro34A....T.-0.19 ..F1.001.03Ser35..B..T.0.06..F0.401.07Lys36..B..T.0.34..F0.250.73Val37..BB...0.63..F-0.15 0.64Trp38..BB...0.36..F-0.15 0.64Gly39..BB...0.22**F-0.15 0.32Ser40......C0.63**F-0.05 0.43Ser41.....TC-0.30 **F0.450.80Ala42.....TC0.56**F1.050.57Gly43.....TC0.63**F1.350.73Arg44..B..T.1.09**F1.490.84Ile45..B....1.04**F1.781.63Glu46..B....1.00**F2.121.63Pro47..B..T.1.24**F2.510.83Arg48....TT.1.70**F3.401.17Gly49....TT.1.24**F3.061.32Gly50....TT.1.54**F2.570.84
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX XXI XII XIIIGly51.....TC0.73**F2.030.44Arg52.....TC0.73**F1.390.36Gly53..B..T.0.31**F0.850.57Ala54..B..T.0.36.*F0.850.83Leu55..B....0.10.*F0.650.57Pro56..B....0.10.*F-0.25 0.57Thr57..B....-0.01 .*F-0.25 0.55Ser58..B..T.0.30..F0.101.16Met59..B..T.0.54..F0.401.02Gly60..B..T.1.14..F0.250.70Gln61....TT.1.06..F0.650.81His62......C0.78.*F0.401.10Gly63.....TC1.19.*F0.601.12Pro64.....TC1.20.*F1.201.27Ser65.....TC1.66.*F1.050.94Ala66..B..T.1.07.*F1.301.86Arg67..B....0.76**.1.291.22Ala68..B....1.21**.1.480.90Arg69..B..T.0.83.*.2.171.74Ala70..B..T.0.92.*F2.510.90Gly71....TT.1.17.*F3.401.37Arg72.....TC0.84.*F2.710.69Ala73.....TC1.54*.F2.481.06Pro74.....TC1.22*.F2.702.10Gly75.....TC1.22*.F2.621.66Pro76.....TC1.68**F2.241.66Arg77......C1.57*.F2.602.10Pro78.AB....1.57*.F1.943.68Ala79.AB....1.48*.F1.682.40Arg80.AB....1.61**F1.421.64Glu81.AB....1.93**F1.161.64Ala82AA.....1.01**F0.903.19Ser83A....T.1.33**F1.301.34Pro84A....T.1.07**F1.301.52Arg85A....T.0.92**F1.001.12Leu86A....T.0.97.*.0.851.13Arg87A..B...1.24.*.0.751.46Val88A..B...0.84**.0.751.08His89A..B...1.10.*.-0.15 1.13Lys90A..B...0.29**F0.901.16Thr91..BB...0.24**F0.001.35Phe92..BB...-0.72 **.-0.30 0.74Lys93..BB...-0.72 **.-0.30 0.27Phe94..BB...-1.03 *..-0.60 0.14Val95..BB...-1.93 *..-0.60 0.16Val96..BB...-2.43 .*.-0.60 0.06Val97..BB...-2.54 .*.-0.60 0.06Gly98..BB...-2.59 .*.-0.60 0.06Val99..BB...-2.74 ...-0.60 0.15Leu100 ..BB...-2.74 *..-0.60 0.15
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX XXIXIIXIIILeu101..BB...-2.10 *..-0.60 0.11Gln102..BB...-1.54 *..-0.60 0.23Val103..BB...-1.50 ...-0.60 0.37Val104..B..T.-1.23 ...-0.20 0.61Pro105..B..T.-1.01 *.F0.250.35Ser106A....T.-0.51 *.F-0.05 0.48Ser107A....T.-1.40 **F0.250.94Ala108A ..... .-0.50 .*F0.050.43Ala109A......-0.46 .*.0.500.63Thr110A......-0.28 .*.-0.10 0.39Ile111A......0.02.*.-0.10 0.53Lys112..B....0.32.*.0.500.87Leu113..B....0.61.*F1.051.04His114..B....0.31.*F1.301.99Asp115.....TC0.28**F1.800.70Gln116....TT.0.86.*F1.650.84Ser117....TT.0.81..F2.500.89Ile118....TT.1.62..F2.250.92Gly119......C1.37..F1.000.92Thr120......C1.37..F0.450.72Gln121..B...C1.33..F0.651.79Gln122..B....1.33..F0.202.46Trp123..B....2.01...0.052.28Glu124......C1.54...0.252.04His125......C1.51...0.100.97Ser126.....TC1.51..F0.450.91Pro127....TT.0.70..F1.550.91Leu128....TT.0.32..F0.650.55Gly129....TT.0.11..F0.650.22Glu130....T..-0.07 ..F0.450.22Leu131..B....-0.11 *..0.180.42Cys132..B....-0.20 *.F1.210.42Pro133..B..T.0.58**F1.690.32Pro134....TT.1.03.*F1.470.53Gly135....TT.0.73.*F2.801.94Ser136.....TC1.54*.F2.321.68His137......C2.32*.F2.481.88Arg138..B....2.32*.F2.343.72Ser139..B....2.19*.F2.404.29Glu140....T..1.94*.F2.863.12Arg141....TT.1.58*.F3.401.61Pro142....TT.1.61.*F2.910.64Gly143....TT.1.61.*F2.570.60Ala144....TT.1.24.*.2.080.60Cys145....T..0.93.*.1.410.21Asn146..B....0.82.*.0.840.30Arg147..B....0.69*..1.010.52Cys148..B..T.0.18*.F1.830.96Thr149..B..T.0.42*.F1.700.44Glu150..B..T.0.84*.F1.530.22
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX XXIXIIXIIIGly151..B..T.0.53*.F0.760.65Val152..BB...0.42.*F0.190.65Gly153..BB...0.50...-0.13 0.61Tyr154..BB...0.51...-0.60 0.62Thr155..BB...0.51..F-0.30 1.12Asn156...B..C0.86..F0.201.81Ala157....TT.0.90..F0.801.86Ser158....TT.0.54..F0.801.06Asn159....TT.0.20..F0.350.57Asn160....TT.-0.16 *.F0.350.57Leu161.AB....-0.97 *..-0.60 0.23phe162.AB....-0.59 ...-0.60 0.12Ala163.AB....-0.96 ...-0.60 0.11Cys164.AB....-1.27 *..-0.60 0.07Leu165..B..T.-1.86 ...-0.20 0.12Pro166..B..T.-1.71 *..-0.20 0.12Cys167....TT.-0.97 *..0.200.12Thr168A....T.-0.68 ...0.100.30Ala169A......-0.01 ...0.500.26Cys170A....T.0.80...0.700.80Lys171A....T.1.01..F1.150.96Ser172A....T.1.68.*F1.301.65Asp173A....T.2.10.*F1.305.33Glu174AA.....2.39.*F0.905.22Glu175AA.....2.84.*F1.245.22Glu176AA.....2.13.*F1.584.83Arg177.A..T..2.12..F2.321.50Ser178.....TC1.81..F2.861.25Pro179....TT.1.50*.F3.401.04Cys180....TT.1.61*.F2.610.77Thr181....TT.1.61*.F2.671.12Thr182....T..1.19**F2.381.16Thr183....TT.0.90..F2.493.13Arg184....TT.0.44..F2.402.19Asn185....TT.1.11..F2.500.81Thr186....TT.0.76*.F2.250.98Ala187....T..1.11*..1.650.27Cys188....T..1.21*..1.400.33Gln189..B....0.76*..0.750.36Cys190..B....0.44...0.500.35Lys191..B..T.0.06.*F0.850.94Pro192....TT.0.76..F0.650.47Gly193....TT.1.42.*F1.741.72Thr194..B..T.1.42.*F1.681.38Phe195..B....2.09.*F1.821.49Arg196....T..1.74.*F2.562.42Asn197....TT.1.37.*F3.402.25Asp198....TT.1.71.*F3.062.63Asn199.....TC1.42.*F2.522.32Ser200A....T.1.46.*F1.981.43
表4(續(xù))殘基位置III III IV VVI VII VIIIIX XXI XIIXIIIAla201A......1.46.*.1.14 0.46Glu202A......1.50*..0.80 0.56Met203A......0.83*..1.11 0.83Cys204A....T.0.53*..1.62 0.44Arg205....TT.0.52*..2.33 0.34Lys206....TT.0.77*.F2.49 0.50Cys207....TT.0.10*.F3.10 0.92Ser208....T..0.49**F2.59 0.25Thr209....T..1.27**F1.98 0.19Gly210....T..0.81*.F1.67 0.71Cys211..B..T.0.17**F1.16 0.53Pro212....TT.-0.02 **F1.25 0.36Arg213....TT.0.32**F0.65 0.27Gly214..B..T.-0.22 **.0.85 1.01Met215..BB...0.17**.0.30 0.48Val216..BB...0.83**.0.79 0.49Lys217..BB...0.38**.0.98 0.83Val218..BB...-0.04 **F1.32 0.45Lys219..BB...0.09.*F1.51 0.88Asp220..B....0.40.*F1.90 0.68Cys221..B....0.96.*F0.81 0.96Thr222.....TC0.91.*F1.62 0.65Pro223....TT.0.88.*F1.63 0.65Trp224....TT.0.83.*F0.54 0.84Ser225A....T.0.17..F1.00 1.01Asp226AA.....-0.02 ..F0.45 0.35Ile227AA.....0.26*..-0.30 0.25Glu228AA.....0.51*..0.30 0.25Cys229.AB....0.80*..0.60 0.30Val230AA.....0.80**.0.60 0.74His231AA.....0.46**.0.60 0.58Lys232AA.....1.34*.F0.60 1.06Glu233.A..T..1.00*.F1.30 2.30Ser234....TT.1.63*.F1.70 1.68Gly235....TT.2.49*.F1.70 1.14Asn236....TT.1.63*.F1.40 1.06Gly237.....TC1.30*.F0.45 0.55His238...B..C0.44...-0.40 0.59Asn239...B..C-0.14 ...-0.40 0.27Ile240..BB...-0.61 ...-0.60 0.19Trp241..BB...-1.47 ...-0.60 0.12Val242..BB...-1.98 ...-0.60 0.05Ile243..BB...-2.26 ...-0.60 0.06Leu244..BB...-3.07 ...-0.60 0.08Val245..BB...-3.03 ...-0.60 0.09Val246..BB...-3.60 ...-0.60 0.09Thr247..BB...-2.96 ...-0.60 0.08Leu248..BB...-2.88 ...-0.60 0.17Val249..BB...-2.88 .*.-0.60 0.19Val250..BB...-2.83 ...-0.60 0.11
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIII IX XXI XII XIIIPro251..BB...-2.83 ...-0.60 0.11Leu252..BB...-3.11 ...-0.60 0.11Leu253A..B...-3.16 ...-0.60 0.15Leu254A..B...-3.11 ...-0.60 0.07Val255A..B...-3.14 ...-0.60 0.07Ala256A..B...-3.79 ...-0.60 0.06Val257..BB...-3.64 ...-0.60 0.05Leu258..BB...-3.50 ...-0.60 0.04Ile259..BB...-3.36 ...-0.60 0.02Val260..BB...-3.39 ...-0.60 0.02Cys261..BB...-3.14 ...-0.60 0.01Cys262..BB...-2.59 ...-0.60 0.02Cys263..BB...-2.12 ...-0.60 0.03Ile264..BB...-1.90 ...-0.60 0.06Gly265....TT.-1.39 ..F0.350.06Ser266....TT.-1.07 ..F0.350.11Gly267....TT.-0.40 ..F0.650.16Cys268....TT.0.06 ..F1.250.27Gly269....T..0.99 .*F1.390.31Gly270....T..0.67 ..F2.030.62Asp271.....TC0.37 ..F2.370.62Pro272....TT.0.71 **F2.910.62Lys273....TT.1.49 **F3.401.05Cys274..B..T.0.98 **.2.511.23Met275..BB...0.66 **.1.620.59Asp276..BB...-0.04 **.1.280.16Arg277..BB...-0.12 .*.0.040.26Val278..BB...-0.06 .*.-0.60 0.27Cys279..BB...-0.20 ...0.300.32Phe280..BB...0.06 .*.-0.60 0.13Trp281..BB...-0.76 ...-0.60 0.18Arg282..BB...-1.68 ...-0.60 0.28Leu283..BB...-0.71 ...-0.60 0.26Gly284...BT..-0.39 .*.-0.20 0.49Leu285...B..C0.10 .*.0.500.25Leu286...B..C0.04 .*.0.200.46Arg287...B..C-0.66 ..F0.650.46Gly288.....TC0.16 ..F1.350.57Pro289.....TC0.50 .*F2.701.19Gly290.....TC1.31 **F3.001.01Ala291A....T.1.53 .*F2.501.65Glu292A......1.39 ..F2.001.08Asp293A......1.73 ..F1.701.48Asn294A....T.1.94 .*.1.452.36Ala295A....T.1.40 ...1.152.36His296A....T.1.18 *..1.000.99Asn297A....T.0.88 ...0.100.51Glu298A......0.88 *..-0.10 0.67Ile299A......0.29 **.-0.10 0.80Leu300A......0.88 **.-0.10 0.50
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIIIIX XXI XII XIIISer301A......0.61*.F0.650.48Asn302A....T.-0.20 *.F0.250.92Ala303A....T.-0.50 *.F0.250.92Aso304A....T.0.08*.F0.850.92Ser305.....TC0.19*.F1.050.83Leu306...B..C-0.37 *.F0.050.71Ser307..BB...-0.67 *.F-0.15 0.31Thr308..BB...-0.08 *..-0.60 0.31Phe309..BB...-0.08 *..-0.30 0.66Val310A..B...0.22..F-0.15 0.85Ser311AA.....0.43..F0.001.03Glu312AA.....0.73..F0.001.17Gln313AA.....0.74..F0.902.73Gln314AA.....1.44..F0.902.73Met315AA.....2.30..F0.902.73Glu316AA.....2.39..F0.902.73Ser317AA.....1.80.*F0.902.44Gln318AA.....1.80.*F0.902.49Glu319AA.....0.99.*F0.902.40Pro320AA.....1.28.*F0.901.48Ala321AA.....0.93..F0.601.23Asp322AA.B...0.38..F0.450.70Lau323AA.B...0.07..F-0.15 0.34Thr324.ABB...-0.79 ..F-0.15 0.48Gly325.ABB...-0.58 ...-0.30 0.21Val326..BB...-0.29 ...-0.60 0.45Thr327..BB...-0.50 ...-0.60 0.42Val328..BB...-0.03 .*F-0.17 0.65Gln329..BB...0.28.*F0.110.87Ser330.....TC0.03.*F2.041.05Pro331.....TC0.89.*F2.321.42Gly332....TT.0.53.*F2.801.42Glu333A....T.0.58.*F1.970.57Ala334..B....-0.23 .*.0.740.30Gln335..B....-0.28 ...0.460.25Cys336..B....-0.28 ...0.180.14Leu337..B....-0.52 .*.-0.40 0.22Leu338..B....-0.52 .*.-0.40 0.13Gly339.A....C-0.52 .*F0.050.42Pro340AA.....-0.52 .*F-0.15 0.51Ala341AA.....-0.20 .*F0.601.07Glu342AA.....0.31.*F0.901.07Ala343AA.....1.12**F0.750.93Glu344AA.....1.58.*F0.901.60Gly345AA.....1.90.*F0.901.80Ser346A....T.2.60.*F1.303.50Gln347A....T.1.79.*F1.303.96Arg348A....T.1.57.*F1.303.30Arg349..B..T.0.71.*F1.302.03Arg350..BB...0.84.*F0.750.87
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIII IX XXI XII XIIILeu351..BB...0.56 .*.0.600.69Leu352..BB...0.56 .*.0.300.35Val353..BB...0.10 **.-0.30 0.29Pro354..B..T.-0.60 *..-0.20 0.35Ala355....TT.-0.71 .*.0.500.43Asn356.....TC-0.11 ..F1.650.96Gly357.....TC0.39 ..F1.950.96Ala358......C1.24 ..F2.201.37Asp359.....TC1.14 ..F3.001.48Pro360A....T.0.92 *.F2.502.16Thr361A....T.0.32 ..F1.901.76Glu362A....T.-0.14 ..F1.601.04Thr363A..B...-0.26 ..F0.150.56Leu364A..B...-0.96 *..-0.60 0.33Met365A..B...-0.74 *..-0.60 0.17Leu366A..B...-0.39 *..-0.60 0.19Phe367A..B...-1.09 *..-0.60 0.47Phe368A..B...-1.37 *..-0.60 0.41Asp369A..B...-0.56 *..-0.60 0.50Lys370AA.....-0.84 *..-0.30 0.93Phe371AA.B...-0.89 *..-0.30 0.75Ala372AA.B...-0.40 *..-0.30 0.34Asn373.ABB...-0.40 *..-0.60 0.26Ile374.ABB...-0.40 *..-0.60 0.26Val375.ABB...-0.74 ...-0.60 0.43Pro376.A.B..C-0.33 ...-0.10 0.36Phe377....TT.0.26 ...0.200.54Asp378....TT.0.26 ..F0.801.21Ser379....TT.0.33 ..F1.401.35Trp380A....T.0.59 **F0.401.29Asp381AA.....0.91 *.F-0.15 0.76Gln382AA.....1.61 *..-0.15 1.11Leu383AA.....0.80 *..-0.15 1.84Met384AA.....1.10 *..0.300.91Arg385AA.....0.58 *..0.300.87Grn386AA.....0.27 *..-0.30 0.87Leu387AA.....0.31 *..0.451.27ASp388AA.....1.12 *..0.751.30Leu389AA.....1.72 *.F0.601.21Thr390A....T.0.72 *.F1.302.54Lys391A....T.0.72 .*F1.301.07Asn392A....T.0.68 **F1.302.16Glu393A....T.-0.18 *.F1.301.11Ile394..BB...0.74 *.F0.750.41Asp395..BB...0.47 **.0.600.50Val396..BB...0.08 **.0.600.29Val397..BB...-0.23 ...0.510.41Arg398..B..T.-0.82 *..1.120.36Ala399..B..T.-0.28 *..0.730.49Gly400....TT.-0.49 *.F2.090.65
表4(續(xù))殘基位置III III IV VVI VII VIIIIX XXI XII XIIIThr401.....TC0.02**F2.100.51Ala402......C0.88**F1.090.50Gly403.....TC0.18**F1.680.85Pro404.....TC-0.04 ..F1.470.59Gly405.....TC0.06..F1.260.48Asp406A....T.-0.22 ..F0.250.76Ala407AA.....-0.23 ...-0.30 0.50Leu408AA.....-0.70 ...-0.60 0.50Tyr409AA.....-1.09 *..-0.60 0.25Ala410AA.....-0.70 *..-0.60 0.24Met411AA.....-0.99 *..-0.60 0.59Leu412AA.....-1.26 *..-0.60 0.39Met413AA.....-0.44 *..-0.60 0.29Lys414AA.B...-0.16 *..-0.60 0.47Trpo 415AA.B...0.12*..0.151.14Val416AA.B...0.38**.0.451.66Asn417A....T.1.30*.F1.750.82Lys418A....T.1.90*.F2.201.53Thr419.....TC1.27*.F3.003.32Gly420.....TC1.26*.F2.702.08Arg421....T..1.22*.F2.401.40Asn422.....TC1.19*.F1.650.68Ala423..B..T.0.83...1.000.93Ser424..B..T.0.33...0.700.69Ile425..B..T.-0.13 .*.-0.20 0.35His426.AB....-0.24 .*.-0.60 0.29Thr427.AB....-0.83 **.-0.60 0.36Leu428AA.....-1.06 **.-0.60 0.52Leu429AA.....-0.76 **.-0.60 0.31Asp430AA.....0.24**.-0.30 0.38Ala431AA.....-0.32 **.0.300.89Leu432AA.....-0.01 **.0.751.07Glu433AA.....0.80**.0.751.11Arg434AA.....1.72**F0.901.90Met435AA.....1.69**F0.904.52Glu436AA.....1.69**F0.903.55Glu437AA.....2.54*.F0.901.83Arg438AA.....2.54**F0.903.70His439AA.....2.48**F0.903.70Ala440AA.....2.19**F0.904.28Lys441AA.....2.19**F0.901.53Glu442AA.....2.19*.F0.901.95Lys443AA.....1.27**F0.903.22Ile444AA.....0.49**F0.901.33Gln445AA.....0.22**F0.750.63Asp446AA.....0.18**F-0.15 0.23Leu447AA.....-0.12 *..-0.30 0.56Leu448AA.....-0.51 *..0.550.43Val449AA.....0.42*.F0.950.26Asp450A....T.-0.28 *.F1.600.62
表4(續(xù))殘基位置 III III IV VVI VII VIII IX XXI XIIXIIISer451....TT.-1.17 *.F2.250.65Gly452....TT.-0.60 *.F2.500.62Lys453..B..T.-0.60 ..F1.250.58Phe454.AB....0.26 ...0.150.36Ile455.AB....0.26 ...0.200.62Tyr456.AB....0.21 ...0.550.52Leu457.AB....0.24 ...-0.03 0.59Glu458.AB.. .. -0.14 ..F0.541.22Asp459.A..T..0.26 ..F1.660.77Gly460....TT.0.56 ..F2.781.26Thr461.....TC-0.06 *.F2.700.73Gly462.....TC0.46 *.F2.130.33Ser463.....TC-0.36 ..F1.260.44Ala464A......-0.36 ...0.140.25Val465..B....-0.40 ...0.170.44Ser466..B....-0.48 ...-0.10 0.42Leu467..B....-0.52 ...-0.10 0.53Glu468A......-0.61 ...0.500.92
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其結(jié)合包含本發(fā)明所述多肽的攜帶表位部分的一種肽或多肽。這種多肽部分的表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位?！懊庖咴员砦弧笔侵府?dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)激發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)部分。另一方面，抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域是“抗原性表位”。蛋白質(zhì)的免疫原性表位數(shù)一般少于抗原性表位數(shù)。見例如Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983)。
為選擇攜帶抗原性表位(即含有抗體可以結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的區(qū)域)的肽或多肽，本領(lǐng)域熟知的是，模擬蛋白質(zhì)序列一部分的相對(duì)短的合成肽通常能激發(fā)與所述被部分模擬的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗血清。見例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)Antibodies that react with predetermined sites on proteins.Science219660-666。能激發(fā)蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽通常在蛋白質(zhì)的初級(jí)序列中呈現(xiàn)，可以通過(guò)一系列簡(jiǎn)便的化學(xué)規(guī)則定性，而且既不限于完整蛋白質(zhì)的免疫顯性區(qū)域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此攜帶抗原性表位的肽和多肽可用于產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明TR4多肽的抗體，包括單克隆抗體。見，例如Wilson等，Cell 37767-778(1984)的第777頁(yè)所述。攜帶抗原性表位的肽和多肽優(yōu)選含有一種序列，所述序列具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列中包含的至少7個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)及最優(yōu)選至少大約15至大約30個(gè)氨基酸之間。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合一或多種抗原性TR4多肽或肽，包括但非限于包含SEQ ID NO1的大約第35至大約第92位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO1的大約第114至大約第160位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO1的大約第169至大約第240位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO1的大約第267至大約第298位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO1的大約第330至大約第364位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO1的大約第391至大約第404位氨基酸殘基的多肽；和/或包含SEQ ID NO1的大約第418至大約第465位氨基酸殘基的多肽。文中“大約”包括所述特定范圍，及在一端或兩端多或少幾個(gè)(5，4，3，2或1個(gè))氨基酸的范圍。如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)確定了上述多肽片段是TR4蛋白的抗原性區(qū)域。攜帶表位的TR4肽和多肽可以通過(guò)任何常規(guī)方法產(chǎn)生。Houghten，R.A.，“Generalmethod for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptidesspecificity of antigen-antibody interaction at the level of individual aminoacids，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)。這個(gè)“同時(shí)多個(gè)肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美國(guó)專利No.4631211中進(jìn)一步描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能意識(shí)到，本文所述TR4多肽及其攜帶表位的片段(例如相應(yīng)于胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，例如SEQ ID NO1的第1至240位氨基酸殘基)，可以與免疫球蛋白(IgG)的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的部分結(jié)合，產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白便于純化并示出體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)。這已經(jīng)由例如由人CD4多肽的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白示出(EPA394827；Traunecker等，Nature 33184-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白比單獨(dú)的單體TR4蛋白或蛋白質(zhì)片段能夠更有效結(jié)合及中和其它分子(Fountoulakis等，J.Biochem 2703958-3964(1995))。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合包含完整或部分TR4多肽如TR4的融合蛋白。
本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)可以用于產(chǎn)生新的突變蛋白質(zhì)或稱“突變蛋白(muteins)”，所述突變蛋白包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。這種修飾的多肽可以示出例如增強(qiáng)的活性或提高的穩(wěn)定性。另外，至少在一定的純化和貯存條件下，它們可以比相應(yīng)的天然多肽以較高產(chǎn)量純化，并示出更好的溶解性。本發(fā)明的抗體也可以結(jié)合這些修飾的TR4多肽或TR4多肽片段或變體。
例如，就許多蛋白質(zhì)，包括膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域或者分泌蛋白的成熟形式而言，本領(lǐng)域已知可以從N末端或C末端缺失一或多個(gè)氨基酸而基本不喪失生物學(xué)功能，或者不喪失由特異性抗體結(jié)合的能力。例如Ron等，J.Biol.Chem.2682984-2988(1993)報(bào)道了修飾的KGF蛋白，其即使缺失3，8或27個(gè)氨基末端氨基酸仍具有肝素結(jié)合活性。在目前的情況中，由于TR4是含有死亡結(jié)構(gòu)域受體(DDCR)多肽家族的一個(gè)成員，因此N末端氨基酸直至SEQ ID NO1中第109位半胱氨酸殘基的缺失仍可保留一些生物學(xué)活性，如誘導(dǎo)凋亡的能力。具有進(jìn)一步N末端缺失包括SEQ ID NO1中第109位(C-109)的半胱氨酸殘基缺失的多肽不期望保留這種生物學(xué)活性，因?yàn)檫@個(gè)殘基在家族成員中是保守的，而且是形成二硫鍵以提供配體結(jié)合所需要的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性所需的。
然而，即使蛋白質(zhì)的N末端缺失一或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)被修飾或喪失一或多種生物學(xué)功能，但其它功能活性仍可保留(例如生物學(xué)活性，多聚化能力，結(jié)合TR4配體(例如TRAIL)的能力)。例如，當(dāng)完整或成熟多肽的少于大部分的殘基從N末端除去時(shí)，縮短的TR4多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合能識(shí)別完整或成熟形式TR4多肽的抗體的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端殘基的一種特定多肽是否保留這種免疫原性活性，可易于通過(guò)在此所述常規(guī)方法及本領(lǐng)域已知其它方法確定。大量缺失N末端氨基酸殘基的TR4多肽仍保留一些生物學(xué)或免疫原性活性不是不可能的。事實(shí)上，由少如6個(gè)TR4氨基酸殘基組成的肽通常仍可激發(fā)免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合如下多肽的抗體及編碼這種多肽的多核苷酸，所述多肽具有自SEQ ID NO1的TR4氨基酸序列的氨基末端直至第463位絲氨酸殘基缺失一或多個(gè)殘基。特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含SEQ ID NO1的第n1-468位的氨基酸序列，其中n1是相當(dāng)于SEQ ID NO1中氨基酸殘基位置2-463之間的整數(shù)。
更特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含或由以下殘基的氨基酸序列組成SEQ ID NO1的TR4序列的A-2至E-468；P-3至E-468；P-4至E-468；P-5至E-468；A-6至E-468；R-7至E-468；V-8至E-468；H-9至E-468；L-10至E-468；G-11至E-468；A-12至E-468；F-13至E-468；L-14至E-468；A-15至E-468；V-16至E-468；T-17至E-468；P-18至E-468；N-19至E-468；P-20至E-468；G-21至E-468；S-22至E-468；A-23至E-468；A-24至E-468；S-25至E-468；G-26至E-468；T-27至E-468；E-28至E-468；A-29至E-468；A-30至E-468；A-31至E-468；A-32至E-468；T-33至E-468；P-34至E-468；S-35至E-468；K-36至E-468；V-37至E-468；W-38至E-468；G-39至E-468；S-40至E-468；S-41至E-468；A-42至E-468；G-43至E-468；R-44至E-468；I-45至E-468；E-46至E-468；P-47至E-468；R-48至E-468；G-49至E-468；G-50至E-468；G-51至E-468；R-52至E-468；G-53至E-468；A-54至E-468；L-55至E-468；P-56至E-468；T-57至E-468；S-58至E-468；M-59至E-468；G-60至E-468；Q-61至E-468；H-62至E-468；G-63至E-468；P-64至E-468；S-65至E-468；A-66至E-468；R-67至E-468；A-68至E-468；R-69至E-468；A-70至E-468；G-71至E-468；R-72至E-468；A-73至E-468；P-74至E-468；G-75至E-468；P-76至E-468；R-77至E-468；P-78至E-468；A-79至E-468；R-80至E-468；E-81至E-468；A-82至E-468；S-83至E-468；P-84至E-468；R-85至E-468；L-86至E-468；R-87至E-468；V-88至E-468；H-89至E-468；K-90至E-468；T-91至E-468；F-92至E-468；K-93至E-468；F-94至E-468；V-95至E-468；V-96至E-468；V-97至E-468；G-98至E-468；V-99至E-468；L-100至E-468；L-101至E-468；Q-102至E-468；V-103至E-468；V-104至E-468；P-105至E-468；S-106至E-468；S-107至E-468；A-108至E-468；A-109至E-468；T-110至E-468；I-111至E-468；K-112至E-468；L-113至E-468；H-114至E-468；D-115至E-468；Q-116至E-468；S-117至E-468；I-118至E-468；G-119至E-468；T-120至E-468；Q-121至E-468；Q-122至E-468；W-123至E-468；E-124至E-468；H-125至E-468；S-126至E-468；P-127至E-468；L-128至E-468；G-129至E-468；E-130至E-468；L-131至E-468；C-132至E-468；P-133至E-468；P-134至E-468；G-135至E-468；S-136至E-468；H-137至E-468；R-138至E-468；S-139至E-468；E-140至E-468；R-141至E-468；P-142至E-468；G-143至E-468；A-144至E-468；C-145至E-468；N-146至E-468；R-147至E-468；C-148至E-468；T-149至E-468；E-150至E-468；G-151至E-468；V-152至E-468；G-153至E-468；Y-154至E-468；T-155至E-468；N-156至E-468；A-157至E-468；S-158至E-468；N-159至E-468；N-160至E-468；L-161至E-468；F-162至E-468；A-163至E-468；C-164至E-468；L-165至E-468；P-166至E-468；C-167至E-468；T-168至E-468；A-169至E-468；C-170至E-468；K-171至E-468；S-172至E-468；D-173至E-468；E-174至E-468；E-175至E-468；E-176至E-468；R-177至E-468；S-178至E-468；P-179至E-468；C-180至E-468；T-181至E-468；T-182至E-468；T-183至E-468；R-184至E-468；N-185至E-468；T-186至E-468；A-187至E-468；C-188至E-468；Q-189至E-468；C-190至E-468；K-191至E-468；P-192至E-468；G-193至E-468；T-194至E-468；F-195至E-468；R-196至E-468；N-197至E-468；D-198至E-468；N-199至E-468；S-200至E-468；A-201至E-468；E-202至E-468；M-203至E-468；C-204至E-468；R-205至E-468；K-206至E-468；C-207至E-468；S-208至E-468；T-209至E-468；G-210至E-468；C-211至E-468；P-212至E-468；R-213至E-468；G-214至E-468；M-215至E-468；V-216至E-468；K-217至E-468；V-218至E-468；K-219至E-468；D-220至E-468；C-221至E-468；T-222至E-468；P-223至E-468；W-224至E-468；S-225至E-468；D-226至E-468；I-227至E-468；E-228至E-468；C-229至E-468；V-230至E-468；H-231至E-468；K-232至E-468；E-233至E-468；S-234至E-468；G-235至E-468；N-236至E-468；G-237至E-468；H-238至E-468；N-239至E-468；I-240至E-468；W-241至E-468；V-242至E-468；I-243至E-468；L-244至E-468；V-245至E-468；V-246至E-468；T-247至E-468；L-248至E-468；V-249至E-468；V-250至E-468；P-251至E-468；L-252至E-468；L-253至E-468；L-254至E-468；V-255至E-468；A-256至E-468；V-257至E-468；L-258至E-468；I-259至E-468；V-260至E-468；C-261至E-468；C-262至E-468；C-263至E-468；I-264至E-468；G-265至E-468；S-266至E-468；G-267至E-468；C-268至E-468；G-269至E-468；G-270至E-468；D-271至E-468；P-272至E-468；K-273至E-468；C-274至E-468；M-275至E-468；D-276至E-468；R-277至E-468；V-278至E-468；C-279至E-468；F-280至E-468；W-281至E-468；R-282至E-468；L-283至E-468；G-284至E-468；L-285至E-468；L-286至E-468；R-287至E-468；G-288至E-468；P-289至E-468；G-290至E-468；A-291至E-468；E-292至E-468；D-293至E-468；N-294至E-468；A-295至E-468；H-296至E-468；N-297至E-468；E-298至E-468；I-299至E-468；L-300至E-468；S-301至E-468；N-302至E-468；A-303至E-468；D-304至E-468；S-305至E-468；L-306至E-468；S-307至E-468；T-308至E-468；F-309至E-468；V-310至E-468；S-311至E-468；E-312至E-468；Q-313至E-468；Q-314至E-468；M-315至E-468；E-316至E-468；S-317至E-468；Q-318至E-468；E-319至E-468；P-320至E-468；A-321至E-468；D-322至E-468；L-323至E-468；T-324至E-468；G-325至E-468；V-326至E-468；T-327至E-468；V-328至E-468；Q-329至E-468；S-330至E-468；P-331至E-468；G-332至E-468；E-333至E-468；A-334至E-468；Q-335至E-468；C-336至E-468；L-337至E-468；L-338至E-468；G-339至E-468；P-340至E-468；A-341至E-468；E-342至E-468；A-343至E-468；E-344至E-468；G-345至E-468；S-346至E-468；Q-347至E-468；R-348至E-468；R-349至E-468；R-350至E-468；L-351至E-468；L-352至E-468；V-353至E-468；P-354至E-468；A-355至E-468；N-356至E-468；G-357至E-468；A-358至E-468；D-359至E-468；P-360至E-468；T-361至E-468；E-362至E-468；T-363至E-468；L-364至E-468；M-365至E-468；L-366至E-468；F-367至E-468；F-368至E-468；D-369至E-468；K-370至E-468；F-371至E-468；A-372至E-468；N-373至E-468；I-374至E-468；V-375至E-468；P-376至E-468；F-377至E-468；D-378至E-468；S-379至E-468；W-380至E-468；D-381至E-468；Q-382至E-468；L-383至E-468；M-384至E-468；R-385至E-468；Q-386至E-468；L-387至E-468；D-388至E-468；L-389至E-468；T-390至E-468；K-391至E-468；N-392至E-468；E-393至E-468；I-394至E-468；D-395至E-468；V-396至E-468；V-397至E-468；R-398至E-468；A-399至E-468；G-400至E-468；T-401至E-468；A-402至E-468；G-403至E-468；P-404至E-468；G-405至E-468；D-406至E-468；A-407至E-468；L-408至E-468；Y-409至E-468；A-410至E-468；M-411至E-468；L-412至E-468；M-413至E-468；K-414至E-468；W-415至E-468；V-416至E-468；N-417至E-468；K-418至E-468；T-419至E-468；G-420至E-468；R-421至E-468；N-422至E-468；A-423至E-468；S-424至E-468；I-425至E-468；H-426至E-468；T-427至E-468；L-428至E-468；L-429至E-468；D-430至E-468；A-431至E-468；L-432至E-468；E-433至E-468；R-434至E-468；M-435至E-468；E-436至E-468；E-437至E-468；R-438至E-468；H-439至E-468；A-440至E-468；K-441至E-468；E-442至E-468；K-443至E-468；I-444至E-468；Q-445至E-468；D-446至E-468；L-447至E-468；L-448至E-468；V-449至E-468；D-450至E-468；S-451至E-468；G-452至E-468；K-453至E-468；F-454至E-468；I-455至E-468；Y-456至E-468；L-457至E-468；E-458至E-468；D-459至E-468；G-460至E-468；T-461至E-468；G-462至E-468；和/或S-463至E-468。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，TR4多肽的N末端缺失可以用通式n2-238描述，其中n2是相當(dāng)于SEQ ID NO1所鑒別的氨基酸序列的2-238位的一個(gè)數(shù)目。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含或由以下殘基的氨基酸序列組成的TR4的N末端缺失SEQ ID NO1的TR4胞外結(jié)構(gòu)域序列的A-2至H-238；P-3至H-238；P-4至H-238；P-5至H-238；A-6至H-238；R-7至H-238；V-8至H-238；H-9至H-238；L-10至H-238；G-11至H-238；A-12至H-238；F-13至H-238；L-14至H-238；A-15至H-238；V-16至H-238；T-17至H-238；P-18至H-238；N-19至H-238；P-20至H-238；G-21至H-238；S-22至H-238；A-23至H-238；A-24至H-238；S-25至H-238；G-26至H-238；T-27至H-238；E-28至H-238；A-29至H-238；A-30至H-238；A-31至H-238；A-32至H-238；T-33至H-238；P-34至H-238；S-35至H-238；K-36至H-238；V-37至H-238；W-38至H-238；G-39至H-238；S-40至H-238；S-41至H-238；A-42至H-238；G-43至H-238；R-44至H-238；I-45至H-238；E-46至H-238；P-47至H-238；R-48至H-238；G-49至H-238；G-50至H-238；G-51至H-238；R-52至H-238；G-53至H-238；A-54至H-238；I-55至H-238；P-56至H-238；T-57至H-238；S-58至H-238；M-59至H-238；G-60至H-238；Q-61至H-238；H-62至H-238；G-63至H-238；P-64至H-238；S-65至H-238；A-66至H-238；R-67至H-238；A-68至H-238；R-69至H-238；A-70至H-238；G-71至H-238；R-72至H-238；A-73至H-238；P-74至H-238；G-75至H-238；P-76至H-238；R-77至H-238；P-78至H-238；A-79至H-238；R-80至H-238；E-81至H-238；A-82至H-238；S-83至H-238；P-84至H-238；R-85至H-238；L-86至H-238；R-87至H-238；V-88至H-238；H-89至H-238；K-90至H-238；T-91至H-238；F-92至H-238；K-93至H-238；F-94至H-238；V-95至H-238；V-96至H-238；V-97至H-238；G-98至H-238；V-99至H-238；L-100至H-238；L-101至H-238；Q-102至H-238；V-103至H-238；V-104至H-238；P-105至H-238；S-106至H-238；S-107至H-238；A-108至H-238；A-109至H-238；T-110至H-238；I-111至H-238；K-112至H-238；L-113至H-238；H-114至H-238；D-115至H-238；Q-116至H-238；S-117至H-238；I-118至H-238；G-119至H-238；T-120至H-238；Q-121至H-238；Q-122至H-238；W-123至H-238；E-124至H-238；H-125至H-238；S-126至H-238；P-127至H-238；L-128至H-238；G-129至H-238；E-130至H-238；L-131至H-238；C-132至H-238；P-133至H-238；P-134至H-238；G-135至H-238；S-136至H-238；H-137至H-238；R-138至H-238；S-139至H-238；E-140至H-238；R-141至H-238；P-142至H-238；G-143至H-238；A-144至H-238；C-145至H-238；N-146至H-238；R-147至H-238；C-148至H-238；T-149至H-238；E-150至H-238；G-151至H-238；V-152至H-238；G-153至H-238；Y-154至H-238；T-155至H-238；N-156至H-238；A-157至H-238；S-158至H-238；N-159至H-238；N-160至H-238；L-161至H-238；F-162至H-238；A-163至H-238；C-164至H-238；L-165至H-238；P-166至H-238；C-167至H-238；T-168至H-238；A-169至H-238；C-170至H-238；K-171至H-238；S-172至H-238；D-173至H-238；E-174至H-238；E-175至H-238；E-176至H-238；R-177至H-238；S-178至H-238；P-179至H-238；C-180至H-238；T-181至H-238；T-182至H-238；T-183至H-238；R-184至H-238；N-185至H-238；T-186至H-238；A-187至H-238；C-188至H-238；Q-189至H-238；C-190至H-238；K-191至H-238；P-192至H-238；G-193至H-238；T-194至H-238；F-195至H-238；R-196至H-238；N-197至H-238；D-198至H-238；N-199至H-238；S-200至H-238；A-201至H-238；E-202至H-238；M-203至H-238；C-204至H-238；R-205至H-238；K-206至H-238；C-207至H-238；S-208至H-238；T-209至H-238；G-210至H-238；C-211至H-238；P-212至H-238；R-213至H-238；G-214至H-238；M-215至H-238；V-216至H-238；K-217至H-238；V-218至H-238；K-219至H-238；D-220至H-238；C-221至H-238；T-222至H-238；P-223至H-238；W-224至H-238；S-225至H-238；D-226至H-238；I-227至H-238；E-228至H-238；C-229至H-238；V-230至H-238；H-231至H-238；K-232至H-238；和/或E-233至H-238。
如上所述，即使蛋白質(zhì)C末端缺失一或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)被修飾而喪失一或多種生物學(xué)功能，但其它功能活性(例如生物學(xué)活性，多聚體化能力，結(jié)合DR4配體(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如當(dāng)從C末端除去完整或成熟多肽的一少部分(less than the majority)殘基時(shí)，縮短的TR4多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識(shí)別完整或成熟形式TR4多肽的抗體的能力仍保留。缺失完整多肽C末端殘基的一種特定多肽是否保留這種免疫學(xué)活性可以通過(guò)本發(fā)明所述常規(guī)方法及本領(lǐng)域已知的其它方法確定。缺失大量C末端氨基酸殘基的TR4多肽仍保留一些生物學(xué)活性或免疫原性活性不是不可能的。事實(shí)上，由少如6個(gè)TR4氨基酸殘基組成的肽通常就能激發(fā)免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合如下多肽的抗體及編碼這種多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至第30位丙氨酸殘基缺失一或多個(gè)殘基。特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含SEQ ID NO1的24-m1殘基的氨基酸序列，其中m1是相當(dāng)于SEQ ID NO1中氨基酸殘基位置30-467之間的一個(gè)整數(shù)。
更特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽包含或由以下殘基的氨基酸序列組成SEQ ID NO1的TR4序列的A-24至L-467；A-24至S-466；A-24至V-465；A-24至A-464；A-24至S-463；A-24至G-462；A-24至T-461；A-24至G-460；A-24至D-459；A-24至E-458；A-24至L-457；A-24至Y-456；A-24至I-55；A-24至F-454；A-24至K-453；A-24至G-452；A-24至S-451；A-24至D-450；A-24至V-449；A-24至L-448；A-24至L-447；A-24 D-446；A-24至Q-445；A-24至I-444；A-24至K-443；A-24至E-442；A-24至K-441；A-24至A-440；A-24至H-439；A-24至R-438；A-24至E-437；A-24至E-436；A-24至M-435；A-24至R-434；A-24至E-433；A-24至L-432；A-24至A-431；A-24至D-430；A-24至L-429；A-24至L-428；A-24至T-427；A-24至H-426；A-24至I-425；A-24至S-424；A-24至A-423；A-24至N-422；A-24至R-421；A-24至G-420；A-24至T-419；A-24至K-418；A-24至N-417；A-24至V-416；A-24至W-415；A-24至K-414；A-24至M-413；A-24至L-412；A-24至M-411；A-24至A-410；A-24至Y-409；A-24至L-408；A-24至A-407；A-24至D-406；A-24至G-405；A-24至P-404；A-24至G-403；A-24至A-402；A-24至T-401；A-24至G-400；A-24至A-399；A-24至R-398；A-24至V-397；A-24至V-396；A-24至D-395；A-24至I-394；A-24至E-393；A-24至N-392；A-24至K-391；A-24至T-390；A-24至L-389；A-24至D-388；A-24至L-387；A-24至Q-386；A-24至R-385；A-24至M-384；A-24至L-383；A-24至Q-382；A-24至D-381；A-24至W-380；A-24至S-379；A-24至D-378；A-24至F-377；A-24至P-376；A-24至V-375；A-24至I-374；A-24至N-373；A-24至A-372；A-24至F-371；A-24至K-370；A-24至D-369；A-24至F-368；A-24至F-367；A-24至L-366；A-24至M-365；A-24至L-364；A-24至T-363；A-24至E-362；A-24至T-361；A-24至P-360；A-24至D-359；A-24至A-358；A-24至G-357；A-24至N-356；A-24至A-355；A-24至P-354；A-24至V-353；A-24至L-352；A-24至L-351；A-24至R-350；A-24至R-349；A-24至R-348；A-24至Q-347；A-24至S-346；A-24至G-345；A-24至E-344；A-24至A-343；A-24至E-342；A-24至A-341；A-24至P-340；A-24至G-339；A-24至L-338；A-24至L-337；A-24至C-336；A-24至Q-335；A-24至A-334；A-24至E-333；A-24至G-332；A-24至P-331；A-24至S-330；A-24至Q-329；A-24至V-328；A-24至T-327；A-24至V-326；A-24至G-325；A-24至T-324；A-24至L-323；A-24至D-322；A-24至A-321；A-24至P-320；A-24至E-319；A-24至Q-318；A-24至S-317；A-24至E-316；A-24至M-315；A-24至Q-314；A-24至Q-313；A-24至E-312；A-24至S-311；A-24至V-310；A-24至F-309；A-24至T-308；A-24至S-307；A-24至L-306；A-24至S-305；A-24至D-304；A-24至A-303；A-24至N-302；A-24至S-301；A-24至L-300；A-24至I-299；A-24至E-298；A-24至N-297；A-24至H-296；A-24至A-295；A-24至N-294；A-24至D-293；A-24至E-292；A-24至A-291；A-24至G-290；A-24至P-289；A-24至G-288；A-24至R-287；A-24至L-286；A-24至L-285；A-24至G-284；A-24至L-283；A-24至R-282；A-24至W-281；A-24至F-280；A-24至C-279；A-24至V-278；A-24至R-277；A-24至D-276；A-24至M-275；A-24至C-274；A-24至K-273；A-24至P-272；A-24至D-271；A-24至G-270；A-24至G-269；A-24至C-268；A-24至G-267；A-24至S-266；A-24至G-265；A-24至I-264；A-24至C-263；A-24至C-262；A-24至C-261；A-24至V-260；A-24至I-259；A-24至L-258；A-24至V-257；A-24至A-256；A-24至V-255；A-24至L-254；A-24至L-253；A-24至L-252；A-24至P-251；A-24至V-250；A-24至V-249；A-24至L-248；A-24至T-247；A-24至V-246；A-24至V-245；A-24至L-244；A-24至I-243；A-24至V-242；A-24至W-241；A-24至I-240；A-24至N-239；A-24至H-238；A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-24至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31；和/或A-24至A-30。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合可以用通式24-m2描述的TR4多肽的C末端缺失體，其中m2是相當(dāng)于SEQ ID NO1所鑒別的氨基酸序列的30-238位的一個(gè)數(shù)。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合包含或由以下殘基氨基酸序列組成的TR4多肽的抗體SEQ ID NO1的TR4胞外結(jié)構(gòu)域序列的A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31；和/或A-24至A-30。
本發(fā)明還提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽具有SEQ IDNO1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至SEQ ID NO1的C-221的一或多個(gè)氨基酸殘基。特別地，本發(fā)明提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的1-m9殘基的氨基酸序列，其中m9是221-468之間的任何整數(shù)，而且殘基C-221確信是TR4蛋白的受體結(jié)合活性所需的完整TR4多肽(SEQ ID NO1所示)的C末端的第一個(gè)殘基位。
本發(fā)明還提供了結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽具有自TR4多肽氨基和羧基末端缺失一或多個(gè)氨基酸，其可以一般描述為具有SEQID NO1的第n1-m1位殘基和/或第n2-m2位殘基，其中n1，n2，m1和m2是如上所述的整數(shù)。
本發(fā)明還包括結(jié)合如下多肽的抗體，所述多肽由ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆編碼的完整TR4氨基酸序列的一部分組成，其中該部分不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列的氨基末端的1至大約108個(gè)氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列羧基末端的1至大約247個(gè)氨基酸，或者上述氨基末端和羧基末端缺失的任意組合。
優(yōu)選地，本發(fā)明抗體結(jié)合包含一部分胞外結(jié)構(gòu)域；即在SEQ IDNO1的第24-238位殘基內(nèi)的TR4片斷，因?yàn)樵诖朔秶g的任何部分均預(yù)期是可溶的。
本領(lǐng)域意識(shí)到TR4的一些氨基酸序列可以加以變化而不明顯影響該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。如果這種序列差異是預(yù)期的，應(yīng)記得蛋白質(zhì)之上應(yīng)存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。這種區(qū)域通常包含組成配體結(jié)合位點(diǎn)或死亡結(jié)構(gòu)域的殘基，或者形成影響這些結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括結(jié)合TR4蛋白變體的抗體，所述變體示出基本的TR4蛋白活性或包括TR4區(qū)域如下述蛋白質(zhì)片斷。這種突變體包括缺失，插入，翻轉(zhuǎn)，重復(fù)和典型取代。關(guān)于氨基酸變化可以是表型沉默的指導(dǎo)可見于Bowie，J.U.等，Science 2471306-1310(1990)。
因此，本發(fā)明抗體可以結(jié)合SEQ ID NO1所示多肽的片段，衍生物或類似物，或者由ATCC保藏物97853中cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物。這種片段，變體或衍生物可以是(i)這樣的片段、變體或衍生物，其中至少一或多個(gè)氨基酸殘基由保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基，更優(yōu)選至少1個(gè)但少于10個(gè)保守氨基酸殘基)取代，而且這種取代的氨基酸殘基可以由或不由遺傳密碼編碼，或者(ii)這樣的片段、變體或衍生物，其中一或多個(gè)氨基酸殘基包括一個(gè)取代基團(tuán)，或者(iii)這樣的片段、變體或衍生物，其中成熟多肽與另一種化合物，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)這樣的片段、變體或衍生物，其中附加的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或前蛋白序列。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，這些片段，衍生物和類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的范圍內(nèi)。
特別感興趣的是一種荷電氨基酸由另一種荷電氨基酸及中性或負(fù)電氨基酸取代。后者產(chǎn)生正電荷減少的蛋白質(zhì)，以改良TR4蛋白的特性。特別需要防止聚集。蛋白質(zhì)的聚集不僅導(dǎo)致活性喪失，而且當(dāng)制備藥物配方時(shí)也存在問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兛梢允敲庖咴缘?Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystem10307-377(1993))。
氨基酸置換也可以改變與細(xì)胞表面受體結(jié)合的選擇性。Ostade等，Nature 361266-268(1993)描述了導(dǎo)致TNF-α只選擇性結(jié)合兩種已知類型TNF受體之一的一些突變。因此，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合一種TR4受體，該受體含有來(lái)自天然突變或人工操縱的一或多個(gè)氨基酸取代，缺失或添加。
正如所表明的，變化優(yōu)選是微小的，如不明顯影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸取代(見上表3)。
在特異的實(shí)施方案中，SEQ ID NO1的氨基酸序列和/或本發(fā)明所述任何多肽片段(例如胞外結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)中的取代、添加或缺失的數(shù)目是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2個(gè)。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4多肽或其片段或變體(尤其包含或由TR4的胞外可溶結(jié)構(gòu)域組成的片段)，所述多肽或片段或變體含有任一個(gè)或多個(gè)以下TR4中的保守突變SEQ IDNO1的M1用A，G，I，L，S，T或V代替；A2用G，I，L，S，T，M或V代替；A6用G，I，L，S，T，M或V代替；R7用H或K代替；V8用A，G，I，L，S，T或M代替；H9用K或R代替；L10用A，G，I，S，T，M或V代替；G11用A，I，L，S，T，M或V代替；A12用G，I，L，S，T，M或V代替；F13用W或Y代替；L14用A，G，I，S，T，M或V代替；A15用G，I，L，S，T，M或V代替；V16用A，G，I，L，S，T或M代替；T17用A，G，I，L，S，M或V代替；N19用Q代替；G21用A，I，L，S，T，M或V代替；S22用A，G，I，L，T，M或V代替；A23用G，I，L，S，T，M或V代替；A24用G，I，L，S，T，M或V代替；S25用A，G，I，L，T，M或V代替；G26用A，I，L，S，T，M或V代替；T27用A，G，I，L，S，M或V代替；E28用D代替；A29用G，I，L，S，T，M或V代替；A30用G，I，L，S，T，M或V代替；A31用G，I，L，S，T，M或V代替；A32用G，I，L，S，T，M或V代替；T33用A，G，I，L，S，M或V代替；S35用A，G，I，L，T，M或V代替；K36用H或R代替；V37用A，G，I，L，S，T或M代替；W38用F或Y代替；G39用A，I，L，S，T，M或V代替；S40用A，G，I，L，T，M或V代替；S41用A，G，I，L，T，M或V代替；A42用G，I，L，S，T，M或V代替；G43用A，I，L，S，T，M或V代替；R44用H或K代替；I45用A，G，L，S，T，M或V代替；E46用D代替；R48用H或K代替；G49用A，I，L，S，T，M或V代替；G50用A，I，L，S，T，M或V代替；G51用A，I，L，S，T，M或V代替；R52用H或K代替；G53用A，I，L，S，T，M或V代替；A54用G，I，L，S，T，M或V代替；L55用A，G，I，S，T，M或V代替；T57用A，G，I，L，S，M或V代替；S58用A，G，I，L，T，M或V代替；M59用A，G，I，L，S，T或V代替；G60用A，I，L，S，T，M或V代替；Q61用N代替；H62用K或R代替；G63用A，I，L，S，T，M或V代替；S65用A，G，I，L，T，M或V代替；A66用G，I，L，S，T，M或V代替；R67用H或K代替；A68用G，I，L，S，T，M或V代替；R69用H或K代替；A70用G，I，L，S，T，M或V代替；G71用A，I，L，S，T，M或V代替；R72用H或K代替；A73用G，I，L，S，T，M或V代替；G75用A，I，L，S，T，M或V代替；R77用H或K代替；A79用G，I，L，S，T，M或V代替；R80用H或K代替；E81用D代替；A82用G，I，L，S，T，M或V代替；S83用A，G，I，L，T，M或V代替；R85用H或K代替；L86用A，G，I，S，T，M或V代替；R87用H或K代替；V88用A，G，I，L，S，T或M代替；H89用K或R代替；K90用H或R代替；T91用A，G，I，L，S，M或V代替；F92用W或Y代替；K93用H或R代替；F94用W或Y代替；V95用A，G，I，L，S，T或M代替；V96用A，G，I，L，S，T或M代替；V97用A，G，I，L，S，T或M代替；G98用A，I，L，S，T，M或V代替；V99用A，G，I，L，S，T或M代替；L100用A，G，I，S，T，M或V代替；L101用A，G，I，S，T，M或V代替；Q102用N代替；V103用A，G，I，L，S，T或M代替；V104用A，G，I，L，S，T或M代替；S106用A，G，I，L，T，M或V代替；S107用A，G，I，L，T，M或V代替；A108用G，I，L，S，T，M或V代替；A109用G，I，L，S，T，M或V代替；T110用A，G，I，L，S，M或V代替；I111用A，G，L，S，T，M或V代替；K112用H或R代替；L113用A，G，I，S，T，M或V代替；H114用K或R代替；D115用E代替；Q116用N代替；S117用A，G，I，L，T，M或V代替；I118用A，G，L，S，T，M或V代替；G119用A，I，L，S，T，M或V代替；T120用A，G，I，L，S，M或V代替；Q121用N代替；Q122用N代替；W123用F或Y代替；E124用D代替；H125用K或R代替；S126用A，G，I，L，T，M或V代替；L128用A，G，I，S，T，M或V代替；G129用A，I，L，S，T，M或V代替；E130用D代替；L131用A，G，I，S，T，M或V代替；G135用A，I，L，S，T，M或V代替；S136用A，G，I，L，T，M或V代替；H137用K或R代替；R138用H或K代替；S139用A，G，I，L，T，M或V代替；E140用D代替；R141用H或K代替；G143用A，I，L，S，T，M或V代替；A144用G，I，L，S，T，M或V代替；N146用Q代替；R147用H或K代替；T149用A，G，I，L，S，M或V代替；E150用D代替；G151用A，I，L，S，T，M或V代替；V152用A，G，I，L，S.T或M代替；G153用A，I，L，S，T，M或V代替；Y154用F或W代替；T155用A，G，I，L，S，M或V代替；N156用Q代替；A157用G，I，L，S，T，M或V代替；S158用A，G，I，L，T，M或V代替；N159用Q代替；N160用Q代替；L161用A，G，I，S，T，M或V代替；F162用W或Y代替；A163用G，I，L，S，T，M或V代替；L165用A，G，I，S，T，M或V代替；T168用A，G，I，L，S，M或V代替；A169用G，I，L，S，T，M或V代替；K171用H或R代替；S172用A，G，I，L，T，M或V代替；D173用E代替；E174用D代替；E175用D代替；E176用D代替；R177用H或K代替；S178用A，G，I，L，T，M或V代替；T181用A，G，I，L，S，M或V代替；T182用A，G，I，L，S，M或V代替；T183用A，G，I，L，S，M或V代替；R184用H或K代替；N185用Q代替；T186用A，G，I，L，S，M或V代替；A187用G，I，L，S，T，M或V代替；Q189用N代替；K191用H或R代替；G193用A，I，L，S，T，M或V代替；T194用A，G，I，L，S，M或V代替；F195用W或Y代替；R196用H或K代替；N197用Q代替；D198用E代替；N199用Q代替；S200用A，G，I，L，T，M或V代替；A201用G，I，L，S，T，M或V代替；E202用D代替；M203用A，G，I，L，S，T或V代替；R205用H或K代替；K206用H或R代替；S208用A，G，I，L，T，M或V代替；T209用A，G，I，L，S，M或V代替；G210用A，I，L，S，T，M或V代替；R213用H或K代替；G214用A，I，L，S，T，M或V代替；M215用A，G，I，L，S，T或V代替；V216用A，G，I，L，S，T或M代替；K217用H或R代替；V218用A，G，I，L，S，T或M代替；K219用H或R代替；D220用E代替；T222用A，G，I，L，S，M或V代替；W224用F或Y代替；S225用A，G，I，L，T，M或V代替；D226用E代替；I227用A，G，L，S，T，M或V代替；E228用D代替；V230用A，G，I，L，S，T或M代替；H231用K或R代替；K232用H或R代替；E233用D代替；S234用A，G，I，L，T，M或V代替；G235用A，I，L，S，T，M或V代替；N236用Q代替；G237用A，I，L，S，T，M或V代替；H238用K或R代替；N239用Q代替；I240用A，G，L，S，T，M或V代替；W241用F或Y代替；V242用A，G，I，L，S，T或M代替；I243用A，G，L，S，T，M或V代替；L244用A，G，I，S，T，M或V代替；V245用A，G，I，L，S，T或M代替；V246用A，G，I，L，S，T或M代替；T247用A，G，I，L，S，M或V代替；L248用A，G，I，S，T，M或V代替；V249用A，G，I，L，S，T或M代替；V250用A，G，I，L，S，T或M代替；L252用A，G，I，S，T，M或V代替；L253用A，G，I，S，T，M或V代替；L254用A，G，I，S，T，M或V代替；V255用A，G，I，L，S，T或M代替；A256用G，I，L，S，T，M或V代替；V257用A，G，I，L，S，T或M代替；L258用A，G，I，S.T，M或V代替；I259用A，G，L，S，T，M或V代替；V260用A，G，I，L，S，T或M代替；I264用A，G，L，S，T，M或V代替；G265用A，I，L，S，T，M或V代替；S266用A，G，I，L，T，M或V代替；G267用A，I，L，S，T，M或V代替；G269用A，I，L，S，T，M或V代替；G270用A，I，L，S，T，M或V代替；D271用E代替，K273用H或R代替；M275用A，G，I，L，S，T或V代替；D276用E代替；R277用H或K代替；V278用A，G，I，L，S，T或M代替；F280用W或Y代替；W281用F或Y代替；R282用H或K代替；L283用A，G，I，S，T，M或V代替；G284用A，I，L，S，T，M或V代替；L285用A，G，I，S，T，M或V代替；L2186用A，G，I，S，T，M或V代替；R287用H或K代替；G288用A，I，L，S，T，M或V代替；G290用A，I，L，S，T，M或V代替；A291用G，I，L，S，T，M或V代替；E292用D代替；D293用E代替；N294用Q代替；A295用G，I，L，S，T，M或V代替；H296用K或R代替；N297用Q代替；E298用D代替；I299用A，G，L，S，T，M或V代替；L300用A，G，I，S，T，M或V代替；S301用A，G，I，L，T，M或V代替；N302用Q代替；A303用G，I，L，S，T，M或V代替；D304用E代替；S305用A，G，I，L，T，M或V代替；L306用A，G，I，S，T，M或V代替；S307用A，G，I，L，T，M或V代替；T308用A，G，I，L，S，M或V代替；F309用W或Y代替；V310用A，G，I，L，S，T或M代替；S311用A，G，I，L，T，M或V代替；E312用D代替；Q313用N代替；Q314用N代替；M315用A，G，I，L，S，T或V代替；E316用D代替；S317用A，G，I，L，T，M或V代替；Q318用N代替；E319用D代替；A321用G，I，L，S，T，M或V代替；D322用E代替；L323用A，G，I，S，T，M或V代替；T324用A，G，I，L，S，M或V代替；G325用A，I，L，S，T，M或V代替；V326用A，G，I，L，S，T或M代替；T327用A，G，I，L，S，M或V代替；V328用A，G，I，L，S，T或M代替；Q329用N代替；S330用A，G，I，L，T，M或V代替；G332用A，I，L，S，T，M或V代替；E333用D代替；A334用G，I，L，S，T，M或V代替；Q335用N代替；L337用A，G，I，S，T，M或V代替；L338用A，G，I，S，T，M或V代替；G339用A，I，L，S，T，M或V代替；A341用G，I，L，S，T，M或V代替；E342用D代替；A343用G，I，L，S，T，M或V代替；E344用D代替；G345用A，I，L，S，T，M或V代替；S346用A，G，I，L，T，M或V代替；Q347用N代替；R348用H或K代替；R349用H或K代替；R350用H或K代替；L351用A，G，I，S，T，M或V代替；L352用A，G，I，S，T，M或V代替；V353用A，G，I，L，S，T或M代替；A355用G，I，L，S，T，M或V代替；N356用Q代替；G357用A，I，L，S，T，M或V代替；A358用G，I，L，S，T，M或V代替；D359用E代替；T361用A，G，I，L，S，M或V代替；E362用D代替；T363用A，G，I，L，S，M或V代替；L364用A，G，I，S，T，M或V代替；M365用A，G，I，L，S，T或V代替；L366用A，G，I，S，T，M或V代替；F367用W或Y代替；F368用W或Y代替；D369用E代替；K370用H或R代替；F371用W或Y代替；A372用G，I，L，S，T，M或V代替；N373用Q代替；I374用A，G，L，S，T，M或V代替；V375用A，G，I，L，S，T或M代替；F377用W或Y代替；D378用E代替；S379用A，G，I，L，T，M或V代替；W380用F或Y代替；D381用E代替；Q382用N代替；L383用A，G，I，S，T，M或V代替；M384用A，G，I，L，S，T或V代替；R385用H或K代替；Q386用N代替；L387用A，G，I，S，T，M或V代替；D388用E代替；L389用A，G，I，S，T，M或V代替；T390用A，G，I，L，S，M或V代替；K391用H或R代替；N392用Q代替；E393用D代替；I394用A，G，L，S，T，M或V代替；D395用E代替；V396用A，G，I，L，S，T或M代替；V397用A，G，I，L，S，T或M代替；R398用H或K代替；A399用G，I，L，S，T，M或V代替；G400用A，I，L，S，T，M或V代替；T401用A，G，I，L，S，M或V代替；A402用G，I，L，S，T，M或V代替；G403用A，I，L，S，T，M或V代替；G405用A，I，L，S，T，M或V代替；D406用E代替；A407用G，I，L，S，T，M或V代替；L408用A，G，I，S，T，M或V代替；Y409用F或W代替；A410用G，I，L，S，T，M或V代替；M411用A，G，I，L，S，T或V代替；L412用A，G，I，S，T，M或V代替；M413用A，G，I，L，S，T或V代替；K414用H或R代替；W415用F或Y代替；V416用A，G，I，L，S，T或M代替；N417用Q代替；K418用H或R代替；T419用A，G，I，L，S，M或V代替；G420用A，I，L，S，T，M或V代替；R421用H或K代替；N422用Q代替；A423用G，I，L，S，T，M或V代替；S424用A，G，I，L，T，M或V代替；I425用A，G，L，S，T，M或V代替；H426用K或R代替；T427用A，G，I，L，S，M或V代替；L428用A，G，I，S，T，M或V代替；L429用A，G，I，S，T，M或V代替；D430用E代替；A431用G，I，L，S，T，M或V代替；L432用A，G，I，S，T，M或V代替；E433用D代替；R434用H或K代替；M435用A，G，I，L，S，T或V代替；E436用D代替；E437用D代替；R438用H或K代替；H439用K或R代替；A440用G，I，L，S，T，M或V代替；K441用H或R代替；E442用D代替；K443用H或R代替；I444用A，G，L，S，T，M或V代替；Q445用N代替；D446用E代替；L447用A，G，I，S，T，M或V代替；L448用A，G，I，S，T，M或V代替；V449用A，G，I，L，S，T或M代替；D450用E代替；S451用A，G，I，L，T，M或V代替；G452用A，I，L，S，T，M或V代替；K453用H或R代替；F454用W或Y代替；I455用A，G，L，S，T，M或V代替；Y456用F或W代替；L457用A，G，I，S，T，M或V代替；E458用D代替；D459用E代替；G460用A，I，L，S，T，M或V代替；T461用A，G，I，L，S，M或V代替；G462用A，I，L，S，T，M或V代替；S463用A，G，I，L，T，M或V代替；A464用G，I，L，S，T，M或V代替；V465用A，G，I，L，S，T或M代替；S466用A，G，I，L，T，M或V代替；L467用A，G，I，S，T，M或V代替；和/或E468用D代替。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR4多肽或其片段或變體(特別是包含或由TR4的胞外可溶結(jié)構(gòu)域組成的片段)，所述多肽或其片段或變體含有以下任一或多個(gè)TR4中的非保守突變；SEQID NO；1的M1用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A2用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P3用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；P4用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；P5用D，B，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A6用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R7用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V8用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H9用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L10用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G11用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A12用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F13用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L14用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A15用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V16用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T17用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P18用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；N19用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P20用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G21用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S22用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A23用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A24用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S25用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G26用D，B，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T27用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E28用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A29用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A30用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A31用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A32用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T33用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P34用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；S35用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K36用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V37用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W38用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；G39用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S40用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S41用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A42用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G43用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R44用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；I45用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E46用H，K，R，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P47用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R48用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G49用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C，G50用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C，G51用D，B，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R52用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G53用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A54用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L55用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P56用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；T57用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S58用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M59用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G60用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q61用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H62用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G63用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P64用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；S65用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A66用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R67用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A68用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R69用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A70用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G71用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R72用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A73用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P，或C代替；P74用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G75用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P76用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R77用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P78用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A79用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R80用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E81用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A82用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P，或C代替；S83用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P84用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R85用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L86用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R87用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V88用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H89用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K90用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T91用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F92用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；K93用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F94用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V95用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V96用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V97用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G98用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V99用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L100用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L101用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q102用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V103用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V104用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P105用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；S106用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S107用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A108用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A109用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T110用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I111用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K112用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L113用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H114用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D115用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q116用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S117用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I118用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G119用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T120用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q121用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q122用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W123用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；E124用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H125用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S126用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P127用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；L128用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G129用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E130用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L131用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C132用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；P133用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；P134用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G135用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S136用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H137用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R138用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S139用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E140用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R141用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P142用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G143用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A144用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C145用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；N146用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R147用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C148用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T149用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E150用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G151用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V152用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G153用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y154用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；T155用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N156用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A157用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S158用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N159用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N160用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L161用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F162用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A163用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C164用D，E，H，K，R，A，G，I，I，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；L165用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P166用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；C167用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T168用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A169用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C170用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；K171用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S172用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D173用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E174用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E175用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E176用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R177用D，E，A，G，l，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S178用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P179用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；C180用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T181用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T182用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T183用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；R184用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N185用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T186用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A187用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C188用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；Q189用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C190用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；K191用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P192用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G193用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T194用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F195用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R196用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N197用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D198用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N199用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S200用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A201用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E202用H，K，R，A，G，I，L，ST，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M203用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C204用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；R205用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K206用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C207用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；S208用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T209用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G210用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C211用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；P212用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；R213用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G214用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M215用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；V216用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K217用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V218用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K219用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D220用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C221用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；T222用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P223用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，Y，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；W224用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S225用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D226用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I227用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E228用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C229用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；V230用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H231用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K32用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E233用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S234用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G235用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N236用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G237用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H238用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N239用D，B，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I240用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W241用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V242用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I243用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L244用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V245用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V246用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T247用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L248用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V249用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V250用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P251用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；L252用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L253用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L254用D，B，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；V255用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A256用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V257用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L258用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I259用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V260用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C261用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；C262用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；C263用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；I264用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G265用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S266用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G267用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C268用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；G269用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G270用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D271用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P272用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；K273用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C274用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；M275用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D276用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R277用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V278用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C279用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；F280用D，E，H，K，R，N，Q，A，U，I，L，S，T，M，V，P或C代替；W281用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R282用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；L283用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G284用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L285用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L286用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R287用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G288用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P289用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G290用D，E，H，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A291用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E292用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D293用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N294用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A295用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H296用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N297用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；B298用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I299用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P，或C代替；L300用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S301用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N302用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A303用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D304用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S305用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L306用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S307用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T308用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F309用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V310用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S311用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E312用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q313用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q314用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M315用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E316用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S317用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q318用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E319用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P320用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A321用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D322用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L323用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T324用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G325用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V326用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T327用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V328用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q329用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，，VF，W，Y，P或C代替；S330用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P331用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G332用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E333用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A334用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q335用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；C336用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，I，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或P代替；L337用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L338用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G339用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P340用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A341用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E342用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A343用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E344用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；O345用D，B，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S346用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q347用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R348用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R349用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R350用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L351用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L352用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V353用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P354用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；A355用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N356用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G357用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；A358用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D359用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P360用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；T361用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E362用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T363用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L364用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M365用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L366用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F367用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；F368用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D369用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K370用D，E，A，U，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P371用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A372用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P.或C代替；N373用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I374用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V375用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P376用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；F377用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D378用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S379用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W380用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D381用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q382用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L383用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M384用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R385用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q386用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L387用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D388用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L389用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T390用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K391用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N392用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E393用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I394用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D395用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V396用D，B，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V397用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R398用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A399用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G400用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T401用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A402用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G403用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；P404用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y或C代替；G405用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D406用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A407用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L408用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y409用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A410用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M411用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L412用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M413用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K414用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；W415用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，VP或C代替；V416用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N417用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K418用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T419用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G420用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R421用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；N422用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A423用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S424用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I425用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H426用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T427用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L428用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L429用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D430用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A431用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L432用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E433用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R434用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；M435用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E436用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E437用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；R438用D，E，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；H439用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A440用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K441用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E442用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K443用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；I444用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Q445用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D446用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L447用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L448用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V449用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D450用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S451用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G452用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；K453用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；F454用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；I455用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；Y456用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L457用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；E458用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；D459用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G460用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；T461用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；G462用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S463用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；A464用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；V465用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；S466用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；L467用D，E，H，K，R，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替；和/或E468用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F(xiàn)，W，Y，P或C代替。
本發(fā)明TR4蛋白質(zhì)中為功能所需的氨基酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法鑒別，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))。后一方法是在分子的每個(gè)殘基導(dǎo)入單丙氨酸突變。然后測(cè)試所得突變分子生物學(xué)活性如受體結(jié)合或者體外或體內(nèi)增殖活性。對(duì)配體-受體結(jié)合非常關(guān)鍵的位點(diǎn)也可以通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定，如結(jié)晶，核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith等，J.Mol.Biol.224899-904(1992)及de Vos等，Science 255306-312(1992))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR4功能所必需的TR4區(qū)域。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR4功能所必需的TR4區(qū)域并抑制或消除TR4的功能。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合為TR4功能所必需的TR4區(qū)域并增強(qiáng)TR4的功能。
另外，可以應(yīng)用蛋白質(zhì)工程以改良或改變TR4多肽的特性。可以使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生新的突變蛋白質(zhì)或多肽，其包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。這種修飾的多肽可以示出例如增強(qiáng)的活性或提高的穩(wěn)定性。另外，它們至少在一定的純化和貯存條件下可以高產(chǎn)量純化而且比相應(yīng)的天然多肽示出更好的溶解性。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合這種修飾的TR4多肽。
TR4的非天然發(fā)生的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生，包括但非限于寡核苷酸介導(dǎo)的誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變、定點(diǎn)誘變(見例如Carter等，Nucl.Acids Res.134331(1986)；及Zoller等，Nucl.Acids Res.106487(1982))、盒式誘變(見例如Wells等，Gene 34315(1985))、限制選擇誘變(見例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
因此，本發(fā)明還涵蓋了結(jié)合TR4衍生物和類似物的抗體，所述衍生物和類似物具有一或多個(gè)氨基酸殘基缺失，添加或取代，以產(chǎn)生更適于在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)、放大等的TR4多肽。例如，半胱氨酸殘基可以缺失或用另一種氨基酸殘基取代以去除二硫鍵；N連接的糖基化位點(diǎn)可以改變或去除以實(shí)現(xiàn)例如更易于從已知超糖基化N連接位點(diǎn)的酵母宿主中回收及純化的一種同源產(chǎn)物的表達(dá)。結(jié)果，在TR4多肽中任一或多個(gè)糖基化識(shí)別序列的第一個(gè)或第三個(gè)氨基酸位置之一或這兩個(gè)位置上的多種氨基酸取代和/或在任一或多個(gè)這種識(shí)別序列的第二個(gè)位置的一個(gè)氨基酸缺失將防止TR4在修飾的三肽序列糖基化(見例如Miyajimo等，EMBO J.5(6)1193-1197)。另外，TR4多肽的一或多個(gè)氨基酸殘基(例如精氨酸和賴氨酸殘基)可以缺失或用另一種殘基取代，以去除由蛋白酶例如弗林蛋白酶或kexin的非希望的處理。
本發(fā)明的抗體還包括結(jié)合如下一種多肽的抗體，所述多肽包含或由包括前導(dǎo)序列的保藏的cDNA(ATCC保藏號(hào)97853)編碼的多肽組成的多肽；包含或由保藏的cDNA編碼的成熟多肽減去前導(dǎo)序列組成的多肽(即成熟蛋白)；包含或由包括前導(dǎo)序列的SEQ ID NO1多肽組成的多肽；包含或由SEQ ID NO1多肽減去氨基末端甲硫氨酸組成的多肽；包含或由SEQ ID NO1多肽減去前導(dǎo)序列組成的多肽；包含或由TR4胞外結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR4富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR4跨膜結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由TR4死亡結(jié)構(gòu)域組成的多肽；包含或由包含全部或部分胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域但缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶多肽組成的多肽；以及與上述多肽(例如保藏的cDNA克隆(具有ATCC保藏號(hào)97853的保藏物)編碼的多肽)，SEQ ID NO1所示的多肽及具有至少30個(gè)氨基酸及更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的這些多肽的部分有至少80％相同，更優(yōu)選至少90％或95％相同，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相同的多肽。
具有與TR4多肽的參比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽的氨基酸序列除了所述多肽可以包括在TR4多肽的參比氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸中最多5個(gè)氨基酸變化之外，與參比序列相同。換言之，為獲得具有與參比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參比序列中最多有5％的氨基酸殘基可以缺失或用另一種氨基酸取代，或者占參比序列中氨基酸總數(shù)最多5％的氨基酸可以插入?yún)⒈刃蛄兄小⒈刃蛄械倪@些變化可以發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者在兩個(gè)末端位置之間的任何位置，單獨(dú)分散在參比序列殘基中或在參比序列內(nèi)呈連續(xù)的一或多組。
實(shí)際上，任何特定的多肽與例如SEQ ID NO1所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同可以使用已知的計(jì)算機(jī)程序常規(guī)測(cè)定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix版本8，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列對(duì)比程序以確定一個(gè)特定序列與本發(fā)明的參比序列是否例如95％相同時(shí)，參數(shù)的設(shè)定當(dāng)然是計(jì)算在全長(zhǎng)參比氨基酸序列基礎(chǔ)上的相同性百分率，并允許占參比序列中氨基酸殘基總數(shù)最多5％的同源性缺口。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，確定參比(查詢)序列(本發(fā)明的序列)和一個(gè)對(duì)象序列之間的相同性，也稱全局序列比對(duì)，可以利用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))的FASTDB計(jì)算機(jī)程序。FASTDB氨基酸比對(duì)中使用的優(yōu)選參數(shù)為Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列長(zhǎng)度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者對(duì)象氨基酸序列的長(zhǎng)度，取兩者中較短的。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，如果對(duì)象序列因N或C末端缺失而非由于內(nèi)部缺失而比查詢序列短，那么必須對(duì)結(jié)果作手工修正，這是因?yàn)镕ASTDB程序在計(jì)算全局相同性百分比時(shí)不計(jì)算對(duì)象序列N或C末端的截短。對(duì)于對(duì)象序列相對(duì)于查詢序列的N或C末端的截短，相同性百分比的修正是通過(guò)計(jì)算與相應(yīng)對(duì)象殘基不匹配/比對(duì)的位于對(duì)象序列N或C末端的查詢序列的殘基數(shù)，作為查詢序列總堿基數(shù)的百分比。通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定一個(gè)殘基是否匹配。然后將此百分?jǐn)?shù)從使用特定參數(shù)通過(guò)FASTDB程序計(jì)算的相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比分值結(jié)果。這一最終相同性百分比分值結(jié)果是用于這一實(shí)施方案的目的的。只有不與查詢序列相匹配/比對(duì)的對(duì)象序列N或C末端的堿基才用于手工調(diào)節(jié)相同性百分比分值結(jié)果。也就是僅位于對(duì)象序列最N端和最C端殘基之外的查詢殘基位置。例如，一個(gè)90個(gè)堿基的對(duì)象序列與一個(gè)100個(gè)殘基的查詢序列比對(duì)以確定相同性百分比。缺失發(fā)生于對(duì)象序列的N末端，因此，F(xiàn)ASTDB比對(duì)不顯示N末端前10個(gè)堿基的匹配/比對(duì)。這10個(gè)不匹配的殘基相當(dāng)于序列的10％(N和C端不匹配的殘基數(shù)/查詢序列中的堿基總數(shù))，因而從FASTDB程序計(jì)算的相同性百分比分值中減去這10％。如果剩余的90個(gè)堿基都完全匹配，那么最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個(gè)90個(gè)殘基的對(duì)象序列與一個(gè)100個(gè)殘基的查詢序列相比較。這時(shí)的缺失是內(nèi)部缺失，因而對(duì)象序列的N或C末端堿基沒(méi)有與查詢序列不匹配的。在這種情況下，F(xiàn)ASTDB程序計(jì)算的相同性百分比不需手工修正。再?gòu)?qiáng)調(diào)一次，只有位于對(duì)象序列的N和C末端外側(cè)的殘基位置，如FSATDB對(duì)比中所展示，與查詢序列不匹配/比對(duì)的才需要手工修正。這一實(shí)施方案不需要進(jìn)行其他的手工修正。
本申請(qǐng)還涉及結(jié)合如下蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)含有與本文中用n1-m1和/或n2-m2表示的TR4多肽序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及結(jié)合如下蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)含有與具有本文所述的特異TR4 N末端和C末端缺失的氨基酸序列的多肽有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合上述TR4融合蛋白，其中融合蛋白的TR4部分是如n1-m1和/或n2-m2所描述的那些序列。
本發(fā)明的抗體可以結(jié)合修飾的TRAIL受體多肽應(yīng)特別理解的是本發(fā)明的抗體可以結(jié)合修飾形式的TR7蛋白(SEQ ID NO3)。在本發(fā)明抗體特異性結(jié)合TR7(SEQ ID NO3)和TR4(SEQ ID NO1)的那些實(shí)施方案中，還應(yīng)特別理解的是那些抗體可以結(jié)合修飾形式的TR7和/或TR4。TR4的修飾形式包括例如相應(yīng)于下述TR7修飾形式的TR4修飾形式。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽(如上述那些)，包括但非限于天然純化的TR7多肽，經(jīng)化學(xué)合成方法生產(chǎn)的TR7多肽，及通過(guò)重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生的TR7多肽，所述宿主包括例如細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使用例如上述重組組合物和方法進(jìn)行。根據(jù)在重組生產(chǎn)方法中應(yīng)用的宿主，多肽可以是糖基化或非糖基化的。另外，TR7多肽還可以包括一個(gè)最初的修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況中是宿主介導(dǎo)的過(guò)程的結(jié)果。
另外，由本發(fā)明抗體結(jié)合的TR7蛋白可以使用本領(lǐng)域已知方法化學(xué)合成(例如見Creighton，ProteinStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.1983)，及Hunkapiller等，Nature 310105-111(1984))。例如，相應(yīng)于TR7多肽片段的一種肽可以使用肽合成儀合成。另外，如果需要，非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可以作為取代或添加導(dǎo)入TR7多肽序列中。非經(jīng)典氨基酸包括但非限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，設(shè)計(jì)氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸及氨基酸類似物。另外，所述氨基酸可以是D氨基酸(右旋)或L氨基酸(左旋)。
本發(fā)明另外涵蓋了結(jié)合如下TR7多肽的抗體，所述多肽在翻譯期間或之后被差異修飾，例如通過(guò)糖基化，乙?；?，磷酸化，酰胺化，通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化，蛋白酶解，連接于抗體分子或其它細(xì)胞配體等。任何多種化學(xué)修飾均可以通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行，包括但非限于通過(guò)溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4，乙酰化，甲酰化，氧化，還原，在衣霉素存在情況下的代謝合成等的特異性化學(xué)裂解。
對(duì)TR7多肽的額外翻譯后修飾例如N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈，N或C末端加工，將化學(xué)部分附著于氨基酸主鏈，化學(xué)修飾N連接的或O連接的碳水化合物鏈，及作為原核宿主細(xì)胞表達(dá)的結(jié)果而加入或缺失N末端甲硫氨酸殘基。所述多肽也可以用一種可檢測(cè)標(biāo)記修飾，如酶標(biāo)記，熒光標(biāo)記，同位素標(biāo)記或親和標(biāo)記，以檢測(cè)及分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了結(jié)合經(jīng)化學(xué)修飾的TR7多肽衍生物的抗體，所述修飾的衍生物可提供另外的優(yōu)勢(shì)如多肽的溶解性、穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間增加，或者免疫原性降低(見美國(guó)專利No.4179337)。用于衍生的化學(xué)部分可以選自水溶性聚合物如聚乙二醇，1，2-亞乙基二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇及類似的等。所述多肽可以在分子內(nèi)的隨機(jī)位置修飾，或者在分子內(nèi)預(yù)定位置修飾，而且可以包括1、2、3或多個(gè)附著的化學(xué)部分。
所述聚合物可以是任何分子量的，而且可以是分支或不分支的。針對(duì)聚乙二醇，優(yōu)選的分子量為大約1kDa至大約100kDa(術(shù)語(yǔ)“大約”是指在制備聚乙二醇中，一些分子比規(guī)定分子量多或少)之間，以易于處理和生產(chǎn)。根據(jù)所需治療方案(例如所希望的持續(xù)釋放時(shí)間、對(duì)生物學(xué)活性作用(如果有)、處理的簡(jiǎn)便性、抗原性程度或喪失、及聚乙二醇對(duì)治療性蛋白質(zhì)或類似物的其它已知作用)，可以使用其它大小的分子。例如，所述聚乙二醇的平均分子量可以為大約200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100000kDa。
如上所述，所述聚乙二醇可以具有分支結(jié)構(gòu)。分支的聚乙二醇例如美國(guó)專利No.5643575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.5659-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 182745-2750(1999)；及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10638-646(1999)所述，所述內(nèi)容在此并入?yún)⒖肌?br> 考慮到對(duì)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)構(gòu)域的作用，所述聚乙二醇分子(或其它化學(xué)部分)應(yīng)附著于蛋白質(zhì)。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的附著方法，例如EP0401384所述，在此并入?yún)⒖?將PEG與G-CSF偶聯(lián))，也見于Malik等，Exp Hematol.201028-1035(1992)(使用tresyl氯化物對(duì)GM-CSF進(jìn)行PEG化)。例如，聚乙二醇可以通過(guò)一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)與氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合，所述反應(yīng)性基團(tuán)例如游離的氨基或羧基基團(tuán)。反應(yīng)性基團(tuán)是激活的聚乙二醇分子可以結(jié)合的那些基團(tuán)。具有游離氨基基團(tuán)的氨基酸殘基可以包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基；具有游離羧基基團(tuán)的那些殘基可以包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基基團(tuán)也可以用作反應(yīng)性基團(tuán)以附著聚乙二醇分子。針對(duì)治療目的優(yōu)選在氨基基團(tuán)附著，如在N末端或賴氨酸基團(tuán)附著。
如上所提示，聚乙二醇可以通過(guò)與任何數(shù)目的氨基酸殘基連接而附著于蛋白質(zhì)。例如，聚乙二醇可以通過(guò)與賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸殘基的共價(jià)鍵而與蛋白質(zhì)連接。可以應(yīng)用一或多種化學(xué)反應(yīng)以將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的特異氨基酸殘基(例如賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或者附著于蛋白質(zhì)的一種以上類型的氨基酸殘基(例如賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸及其組合)。
可能特別希望在N末端經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。使用聚乙二醇作為該組合物的例證，可以選擇多種聚乙二醇分子(通過(guò)分子量，分支等)，反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)(或肽)分子的比例，要進(jìn)行的peg化反應(yīng)類型，及獲得所選擇的N末端peg化蛋白的方法。獲得N末端peg化制品的方法(即如果需要從其它非peg化部分中分離這種部分)，可以從一群peg化蛋白質(zhì)分子中純化N末端peg化物質(zhì)。在N末端經(jīng)選擇性化學(xué)修飾可以通過(guò)還原烷化作用而實(shí)現(xiàn)，其使用不同類型的初級(jí)氨基酸基團(tuán)的不同反應(yīng)性(賴氨酸對(duì)N末端)以在特定蛋白質(zhì)中發(fā)生衍生作用。在適當(dāng)反應(yīng)條件下，用含有羰基基團(tuán)的聚合物在N端實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)充分的選擇性衍生作用。
如上所示，本發(fā)明蛋白質(zhì)的peg化可以通過(guò)許多方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以將聚乙二醇直接或通過(guò)一個(gè)間插接頭而附著于蛋白質(zhì)。將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的無(wú)接頭系統(tǒng)見Delgado等，Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys 9249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.681-18(1998)；美國(guó)專利No.4002531；美國(guó)專利No.5349052；WO95/06058及WO98/32466所述，所述文獻(xiàn)在此并入?yún)⒖肌?br> 將聚乙二醇不用間插接頭而直接附著于蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的一個(gè)系統(tǒng)是應(yīng)用tresylated MPEG，其是通過(guò)使用tresyl氯(ClSO2CH2CF3)修飾單甲氧基聚乙二醇(MPEG)而產(chǎn)生的。在蛋白質(zhì)與tresylated MPEG反應(yīng)時(shí)，聚乙二醇直接附著于蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)。因此，本發(fā)明包括蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物，其通過(guò)本發(fā)明蛋白質(zhì)與具有2，2，2-三氟乙烷磺酰(2，2，2-trifluoreothane)基團(tuán)的聚乙二醇分子反應(yīng)而產(chǎn)生。
聚乙二醇也可以使用一些不同的間插接頭附著于蛋白質(zhì)。例如，在此并入?yún)⒖嫉拿绹?guó)專利No.5612460揭示了連接聚乙二醇與蛋白質(zhì)的氨基甲酸乙酯接頭。聚乙二醇通過(guò)接頭附著于蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物也可以通過(guò)將蛋白質(zhì)與化合物反應(yīng)而產(chǎn)生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸、用1，1’-羰酰二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸酯(MPEG-2，4，5-trichloropenylcarbonate)、MPEG-p-硝基酚碳酸酯及多種MPEG-琥珀酸衍生物。將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的一些另外的聚乙二醇衍生物及反應(yīng)化學(xué)見WO98/32466所述，其全部?jī)?nèi)容在此并入?yún)⒖?。使用本文所述反?yīng)化學(xué)產(chǎn)生的peg化蛋白質(zhì)產(chǎn)物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
附著于每一TR7多肽的聚乙二醇部分的數(shù)目(即取代的程度)也可以變化。例如，本發(fā)明peg化蛋白質(zhì)可以連接于平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多個(gè)聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在每個(gè)蛋白質(zhì)分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19或18-20個(gè)聚乙二醇部分的范圍內(nèi)。確定取代程度的方法見例如Delgado等，Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys.9249-304(1992)所述。
如所提及的，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合如下TR7多肽，所述TR7多肽通過(guò)天然加工修飾，如翻譯后加工，或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾。應(yīng)意識(shí)到，相同類型的修飾可以以相同或不同程度在給定的TR7多肽中的一些位點(diǎn)存在。TR7多肽可以是分支的，例如作為遍在蛋白化的結(jié)果，而且其可以是有或無(wú)分支的環(huán)形。環(huán)形、分支及分支環(huán)形的TR7多肽可得自翻譯后天然加工，或可以通過(guò)合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙?；?，?；?，ADP-核糖基化，酰胺化，共價(jià)附著黃素，共價(jià)附著血紅素部分，共價(jià)附著一種核苷酸或核苷酸衍生物，共價(jià)附著一種脂或脂衍生物，共價(jià)附著磷脂酰肌醇，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，去甲基化，共價(jià)交聯(lián)形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲?；?，γ-羧化，糖基化，GPI錨形成，羥化，碘化，甲基化，肉豆蔻?；?，氧化，peg化，蛋白酶解加工，磷酸化，異戊二烯化，外消旋化，硒化(selenoylation)，硫化，轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的將氨基酸加入蛋白質(zhì)如精氨酰化，及遍在蛋白化(見例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROTEINS，，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson編輯，Academic Press，紐約，pgs.1-12(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Rattan等，Ann.NYAcad Sci 66348-62(1992))。
抗TR7抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合TR7(SEQ IDNO3)或其片段或變體的抗體(例如，包含通過(guò)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的抗體)，其中所述重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列與由表1所示一或多個(gè)scFv或細(xì)胞系表達(dá)的重鏈和輕鏈的氨基酸序列相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體(均由通過(guò)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成以形成抗體)，其中所述重鏈氨基酸序列或輕鏈氨基酸序列與由表1所示一或多個(gè)scFv或細(xì)胞系表達(dá)的重鏈或輕鏈的氨基酸序列相同。與TR7多肽的免疫特異性結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域已知或者在此描述的免疫分析確定，以分析特異性抗體-抗原結(jié)合。包含或由免疫特異性結(jié)合TR7的這些抗體的片段或變體組成的分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些抗體分子，片段和/或變體(例如SEQ IDNO57-71)的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體包含一種多肽，所述多肽具有由表1所示至少一種scFv或細(xì)胞系表達(dá)的任一重鏈的氨基酸序列和/或表1所示至少一種scFv或細(xì)胞系表達(dá)的任一輕鏈的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體包含一種多肽，所述多肽具有由表1所示至少一種scFv的任一VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和/或表1所示至少一種scFv的任一VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含表1所示一個(gè)單一scFv的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含表1所示不同scFv的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。免疫特異性結(jié)合TR7的包含或由表1所示至少一種scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的抗體片段或變體組成的分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些VH和VL結(jié)構(gòu)域，分子，片段和/或變體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了免疫特異性結(jié)合一種TR7多肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域中含有的任意1，2，3或多個(gè)VH CDR的氨基酸序列。特別地，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合TRAIL受體的抗體，所述抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域中含有的VH CDR1的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7的抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域中含有的VHCDR2的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7的抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域中含有的VH CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特異性結(jié)合TR7或TR7片段或其變體的這些抗體或抗體片段或其變體組成的分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些抗體，分子，片段和/或變體(SEQ ID NO57-71)的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了免疫特異性結(jié)合一種TR7多肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VL結(jié)構(gòu)域中含有的任意1，2，3或多個(gè)VL CDR的氨基酸序列。特別地，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合TR7的抗體，所述抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VL結(jié)構(gòu)域中含有的VL CDR1的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7的抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VL結(jié)構(gòu)域中含有的VL CDR2的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7的抗體包含或由一種多肽組成，所述多肽具有表1所示一或多個(gè)scFv的VL結(jié)構(gòu)域中含有的VL CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特異性結(jié)合TR7或TR7片段或其變體的這些抗體或抗體片段或其變體組成的分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些抗體，分子，片段和/或變體(SEQID NO57-71)的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了免疫特異性結(jié)合TR7多肽或TR7片段或變體的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，其中所述抗體包含或由表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中含有的1，2，3或多個(gè)VH CDR和1，2，3或多個(gè)VL CDR組成。特別地，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合一種TR7多肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含或由表1所示一或多個(gè)scFv的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中含有的VH CDRs和VL CDRs的VH CDR1和VL CDR1，VH CDR1和VL CDR2，VH CDR1和VL CDR3，VH CDR2和VLCDR1，VH CDR2和VL CDR2，VH CDR2和VL CDR3，VH CDR3和VH CDR1，VH CDR3和VL CDR2，VH CDR3和VL CDR3，或者其任意組合組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一或多種這些組合來(lái)自表1所示相同的scFv。包含或由免疫特異性結(jié)合TR7的這些抗體的片段或變體組成的分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些抗體，分子，片段或變體(SEQ ID NO57-71)的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
編碼抗TR7抗體的核酸分子本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)的核酸分子，其一般是分離的。在特異的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明抗體的核酸分子包含或由SEQ ID NO57-71或其片段或變體組成。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼一種抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，所述抗體包含或由具有表1所示至少一種scFv的任一VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域及具有表1所示至少一種scFv的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼一種抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，所述抗體包含或由具有表1所示至少一種scFv的任一VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域或具有表1所示至少一種scFv的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域組成。
本發(fā)明還提供了包含或由在此所述抗體分子(例如VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域)的變體(包括衍生物)組成的抗體，該抗體免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在編碼本發(fā)明分子的核苷酸序列中導(dǎo)入突變，包括例如導(dǎo)致氨基酸取代的定點(diǎn)誘變及PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，所述變體(包括衍生物)編碼與參比VH結(jié)構(gòu)域，VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VL結(jié)構(gòu)域，VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3相比少于50，少于40，少于30，少于25，少于20，少于15，少于10，少于5，少于4，少于3或少于2個(gè)氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲邪被釟埢删哂邢嗨齐姾蓚?cè)鏈的氨基酸殘基置換的取代。具有相似電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已經(jīng)確定。這些家族包括具堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，具酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具有無(wú)電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰氨，谷氨酰氨，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)及具芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。或者，如通過(guò)飽和誘變，突變可以隨機(jī)在全部或部分編碼序列中產(chǎn)生，并可以篩選所得突變體的生物學(xué)活性以鑒別保留活性的突變體(例如結(jié)合TR7的能力)。
例如，可以只在抗體分子的構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)域內(nèi)進(jìn)行突變。產(chǎn)生的突變可以是沉默或中性錯(cuò)義突變，即對(duì)抗體結(jié)合抗原的能力無(wú)影響或很小影響。這些類型的突變可以用于最佳化密碼子使用，或者改良雜交瘤抗體的產(chǎn)生?；蛘?，非中性錯(cuò)義突變可以改變抗體結(jié)合抗原的能力。大多數(shù)沉默及中性錯(cuò)義突變的位置很可能在構(gòu)架區(qū)內(nèi)，而大多數(shù)非中性錯(cuò)義突變的位置很可能在CDR內(nèi)，盡管這不是絕對(duì)要求的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計(jì)并測(cè)試具有希望性質(zhì)的突變體分子，如抗原結(jié)合活性無(wú)改變或者結(jié)合活性改變(例如抗原結(jié)合活性改進(jìn)或抗體特異性改變)。在誘變后，編碼的蛋白質(zhì)可以常規(guī)表達(dá)，而且編碼的蛋白質(zhì)的功能和/或生物學(xué)活性(例如免疫特異性結(jié)合TR7的能力)可以使用在此所述方法或通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)修飾方法確定。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)包含或由一種核苷酸序列編碼的氨基酸序列組成，所述核苷酸序列與互補(bǔ)于編碼表1所示一或多種scFv的一個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸的核苷酸序列雜交，所述雜交在嚴(yán)格條件下，在高嚴(yán)格條件下，或在其它嚴(yán)格條件下進(jìn)行，所述嚴(yán)格條件例如在大約45℃在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，隨后在大約50-65℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌一或多次；高嚴(yán)格雜交條件例如在大約45℃在6×SSC中與濾膜結(jié)合的核酸雜交，隨后在大約68℃在0.1×SSC/0.2％SDS中洗滌一或多次；其它嚴(yán)格雜交條件為本領(lǐng)域已知那些(見例如Ausubel，F(xiàn).M.等編輯，1989，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，及John Wiley &Sons公司，紐約，在第6.3.1-6.3.6和2.10.3頁(yè)所述)。編碼這些抗體的核酸分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
本領(lǐng)域熟知具有相似氨基酸序列的多肽或其片段或變體通常具有相似結(jié)構(gòu)及許多相同的生物學(xué)活性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7或TR7片段或變體的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)，包含或由具有與表1所示至少一種scFv的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合TR7或TR7片段或變體的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，包含或由具有與表1所示至少一種scFv的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域組成。
生產(chǎn)抗體的方法本發(fā)明的抗體優(yōu)選利用噬菌體scFv展示文庫(kù)制備。用于實(shí)現(xiàn)此目的的方法見于在此揭示的專利，申請(qǐng)及參考文獻(xiàn)所述。
在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)域在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面展示。特別地，編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列從動(dòng)物cDNA文庫(kù)(例如人或鼠淋巴組織的cDNA文庫(kù))或合成的cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增。編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA通過(guò)一個(gè)scFv接頭經(jīng)PCR連接在一起，并克隆入一個(gè)噬菌粒載體中(例如pCANTAB6或pComb3 HSS)。將該載體電穿孔入大腸桿菌中，并將該大腸桿菌用輔助噬菌體感染。這些方法中使用的噬菌體典型是包括fd和M13的絲狀噬菌體，VH和VL結(jié)構(gòu)域通常重組融合于噬菌體基因III或基因VIII。表達(dá)與感興趣的抗原(即TRAIL受體多肽或其片段)結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體可以用抗原選擇或鑒別，例如使用標(biāo)記的抗原或與一種固體表面或珠結(jié)合或捕捉的抗原?？梢杂糜谏a(chǎn)本發(fā)明抗體的噬菌體展示方法的實(shí)施例包括但非限于Brinkman等，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT申請(qǐng)No.PCT/GB91/O1 134；PCT公開WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 97/13844及美國(guó)專利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516717；5780225；5658727；5735743及5969108所揭示，所述文獻(xiàn)在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 針對(duì)一些應(yīng)用，如本發(fā)明抗體的體外親和性成熟，有利的是表達(dá)表1所示一或多種scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域，作為噬菌體展示文庫(kù)中的單鏈抗體或Fab片段。例如，編碼表1所示scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域的cDNA可以使用噬菌體展示文庫(kù)以所有可能的組合表達(dá)，以選擇具有優(yōu)選的結(jié)合特性如改進(jìn)的親和性或改善的解離速率的結(jié)合TR7多肽的VH/VL組合。另外，VH和VL片段，特別是表1所示scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域的CDR區(qū)域，可以在體外突變。在噬菌體展示文庫(kù)中具有“突變”CDR的VH和VL結(jié)構(gòu)域的表達(dá)使得能選擇具有優(yōu)選的結(jié)合特性如改進(jìn)的親和性或改善的解離速率的結(jié)合TR7多肽的VH/VL組合。
生產(chǎn)抗體的其它方法本發(fā)明的抗體(包括抗體片段或變體)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法生產(chǎn)。例如，應(yīng)意識(shí)到本發(fā)明的抗體可以在雜交瘤細(xì)胞系以外的細(xì)胞系中表達(dá)。編碼特定抗體的cDNA或基因組克隆的序列可以例如用于轉(zhuǎn)化一種合適的哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，或者用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)。另外，本發(fā)明的多肽抗體可以經(jīng)化學(xué)合成或通過(guò)使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。
生產(chǎn)本發(fā)明抗體的一種方式是克隆表1所示scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。為從用含有scFv的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌中分離VH和VL結(jié)構(gòu)域，可以使用互補(bǔ)于VH或VL核苷酸序列的PCR引物(見實(shí)施例4)以擴(kuò)增VH和VL序列。PCR產(chǎn)物然后可以使用載體克隆，所述載體例如具有由5’和3’單個(gè)T核苷酸突出端(overhang)組成的PCR產(chǎn)物克隆位點(diǎn)，所述突出端與通過(guò)用于PCR反應(yīng)的許多DNA聚合酶加入到PCR產(chǎn)物的5’和3’末端上的突出的單個(gè)腺苷酸互補(bǔ)。VH和VL結(jié)構(gòu)域然后可以使用本領(lǐng)域已知常規(guī)方法測(cè)序?；蛘撸琕H和VL結(jié)構(gòu)域可以使用設(shè)計(jì)為擴(kuò)增全部scFv(即VH結(jié)構(gòu)域，接頭和VL結(jié)構(gòu)域)的載體特異性引物擴(kuò)增。
克隆的VH和VL基因可以置于一或多種合適的表達(dá)載體中。作為非限制性實(shí)施例，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點(diǎn)及保護(hù)限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列的PCR引物擴(kuò)增VH或VL序列。利用本領(lǐng)域已知的克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增的VH結(jié)構(gòu)域可以克隆入表達(dá)適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍缀愣▍^(qū)的載體中，所述恒定區(qū)例如分別是VH結(jié)構(gòu)域的人IgG1或IgG4恒定區(qū)，κ和λVL結(jié)構(gòu)域的人κ或λ恒定區(qū)。優(yōu)選地，表達(dá)VH或VL結(jié)構(gòu)域的載體包含一個(gè)適于指導(dǎo)在選擇的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重鏈和輕鏈的啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、用于免疫球蛋白可變區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記如新霉素。VH和VL結(jié)構(gòu)域還可以克隆入表達(dá)必需恒定區(qū)的單個(gè)載體中。重鏈轉(zhuǎn)化載體和輕鏈轉(zhuǎn)化載體然后使用本領(lǐng)域已知的方法共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系中以產(chǎn)生穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)全長(zhǎng)抗體例如IgG的細(xì)胞系(見例如Guo等，J.Clin.Endocrinol.Metab.82925-31(1997)，及Ames等，J.Immunol.Methods 184177-86(1995)所述，在此以其全文并入?yún)⒖?。
本發(fā)明提供了包含或由編碼本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)的核苷酸序列組成的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋了在高度嚴(yán)格雜交條件下或者在中等或較低嚴(yán)格雜交條件下(如前述)，與互補(bǔ)于具有編碼本發(fā)明抗體或其片段或變體的多核苷酸序列的核酸的多核苷酸雜交的多核苷酸。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，可以獲得所述多核苷酸及確定所述多核苷酸的核苷酸序列。如果已知VH結(jié)構(gòu)域，VL結(jié)構(gòu)域及其CDR的氨基酸序列，則可以使用本領(lǐng)域熟知的方法確定編碼這些抗體的核苷酸序列，即以這種方式裝配已知編碼特定氨基酸的核苷酸密碼子以產(chǎn)生編碼本發(fā)明抗體的核酸。編碼所述抗體的這種多核苷酸可以從化學(xué)合成的寡核苷酸中裝配(例如Kutmeier等，BioTechniques 17242(1994)所述)，簡(jiǎn)而言之，這包括合成含有部分編碼所述抗體的序列的重疊寡核苷酸，退火并連接那些寡核苷酸，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增連接的寡核苷酸。
或者，編碼一種抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)的多核苷酸可以從合適來(lái)源的核酸中產(chǎn)生。如果不能獲得含有編碼特定抗體的核酸的克隆，但已知所述抗體分子的序列，則編碼免疫球蛋白的核酸可以化學(xué)合成或得自一個(gè)合適來(lái)源(例如抗體cDNA文庫(kù)，或者從表達(dá)所述抗體的任何組織或細(xì)胞中產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)，或從中分離的核酸優(yōu)選poly A+RNA，所述組織或細(xì)胞如表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞或Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系)，通過(guò)使用與所述序列3’和5’末端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者通過(guò)使用特異于特定基因序列的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆，以例如從編碼所述抗體的cDNA文庫(kù)中鑒別cDNA克隆。通過(guò)PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸然后可以使用本領(lǐng)域熟知的任何方法克隆入可復(fù)制克隆載體中。
一旦確定抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)的核苷酸序列，則該抗體的核苷酸序列可以使用本領(lǐng)域熟知的操作核苷酸序列的方法進(jìn)行操作，例如重組DNA技術(shù)，定點(diǎn)誘變，PCR等(見例如Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY及Ausubel等編輯，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY，在此均以其全文并入?yún)⒖?以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸取代，缺失和/或插入。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)將表1所示一或多種scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體插入構(gòu)架區(qū)中。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)將表1所示一或多種scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的1，2，3，4，5，6或多個(gè)CDR或其片段或變體插入構(gòu)架區(qū)中。該構(gòu)架區(qū)可以是天然發(fā)生的或共有的構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選人構(gòu)架區(qū)(見例如Chothia等，J.Mol.Biol.278457-479(1998)所列出的人構(gòu)架區(qū)表，其全部?jī)?nèi)容在此并入?yún)⒖?。優(yōu)選地，通過(guò)將所述構(gòu)架區(qū)與CDR組合產(chǎn)生的多核苷酸編碼一種抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，所述抗體特異性結(jié)合TRAIL受體。優(yōu)選地，如前所述，編碼具有一或多個(gè)氨基酸取代的所述抗體變體或抗體片段的多核苷酸可以在構(gòu)架區(qū)內(nèi)產(chǎn)生，優(yōu)選所述氨基酸取代不明顯改變抗體與抗原的結(jié)合。另外，這種方法可以用于產(chǎn)生參與鏈內(nèi)二硫鍵的一或多個(gè)可變區(qū)半胱氨酸殘基的氨基酸取代或缺失，以產(chǎn)生缺失一或多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子或抗體片段或抗體變體。多核苷酸的其它改變也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。
在YAC中克隆并重建兆堿基(Mb)大小的人基因座并將它們導(dǎo)入小鼠種系中的能力提供了一種有力方法以闡明非常大的或粗略作圖的基因座的功能成分以及產(chǎn)生人體疾病的有用模型。另外，利用這種用其人等價(jià)物取代小鼠基因座的技術(shù)可以提供關(guān)于人體基因產(chǎn)物在發(fā)育期間的表達(dá)和調(diào)節(jié)，其與其它系統(tǒng)的通訊及其參與疾病產(chǎn)生和進(jìn)展的獨(dú)特認(rèn)識(shí)。
這種策略的一個(gè)重要的實(shí)際應(yīng)用是“人源化”小鼠體液免疫系統(tǒng)。將人免疫球蛋白(Ig)基因座導(dǎo)入內(nèi)源性Ig基因已經(jīng)失活的小鼠中，可以有機(jī)會(huì)研究抗體的程序化表達(dá)及裝配機(jī)制，以及其在B細(xì)胞產(chǎn)生中的作用。另外，這種策略可以提供一種理想來(lái)源以產(chǎn)生完全人單克隆抗體(Mabs)，這是實(shí)現(xiàn)用抗體治療人體疾病的一個(gè)重要里程碑。
完全人抗體預(yù)期使對(duì)小鼠或小鼠衍生的單克隆抗體固有的免疫原性和變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答最小化，并因此提高施用的抗體的效力和安全性。完全人抗體的應(yīng)用可以預(yù)期在治療需要反復(fù)施用抗體的人體慢性及復(fù)發(fā)疾病如癌癥中提供大的優(yōu)勢(shì)。
關(guān)于這個(gè)目的的一個(gè)方案是用人Ig基因座的大量片段工程化小鼠抗體產(chǎn)生缺陷的小鼠品系，預(yù)期這種小鼠在無(wú)小鼠抗體的情況下產(chǎn)生大量的人抗體。大的人Ig片段可以保持大量可變基因多樣性以及抗體產(chǎn)生和表達(dá)的適當(dāng)調(diào)節(jié)。通過(guò)使用小鼠抗體多樣化和選擇機(jī)制及對(duì)人體蛋白喪失免疫學(xué)耐受性，在這些小鼠品系中再生產(chǎn)的人抗體應(yīng)產(chǎn)生對(duì)包括人抗原在內(nèi)的任何感興趣的抗原的高親和性抗體。使用雜交瘤技術(shù)，可以易于生產(chǎn)并選擇具有所需特異性的抗原特異性人單克隆抗體。
這種一般策略因1994年公布的第一個(gè)XenoMouseTM品系的產(chǎn)生而證明。見Green等，Nature Genetics 713-21(1994)。XenoMouseTM品系用酵母人工染色體(YAC)工程化，所述YAC分別含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245kb和10190kb大小的種系構(gòu)型片段，其含有核心可變區(qū)和恒定區(qū)序列。文獻(xiàn)同上。已證實(shí)含有YAC的人Ig與小鼠系統(tǒng)在抗體重排和表達(dá)方面均相容，而且能取代失活的小鼠Ig基因。這通過(guò)其誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)育，產(chǎn)生完全人抗體的類成人所有組成成分，及產(chǎn)生抗原特異性人單克隆抗體的能力而證實(shí)。這些結(jié)果還提示導(dǎo)入含有較多V基因的人Ig基因座的較大部分，額外的調(diào)節(jié)元件及人Ig恒定區(qū)，可以基本上重現(xiàn)全部的所有組成成分，這是人體對(duì)感染和免疫的體液應(yīng)答的特征。Green等的研究最近延伸到通過(guò)分別導(dǎo)入兆堿基大小的人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的種系構(gòu)型YAC片段而導(dǎo)入大約80％以上的人體抗體所有組成成分，以產(chǎn)生XenoMouseTM小鼠。見Mendez等，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits，J Exp.Med.188483-495(1998)，Green，Journal of Immunological Methods 23111-23(1999)及1996年12月3日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)No.08/759620，所述文獻(xiàn)在此全文并入?yún)⒖肌?br> 這種方法在以下文獻(xiàn)進(jìn)一步論述及描繪1990年1月12日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/466008，1990年11月8日申請(qǐng)的07/710515，1992年7月24日申請(qǐng)的07/919297，1992年7月30日申請(qǐng)的07/922649，1993年3月15日申請(qǐng)的08/031801，1993年8月27日申請(qǐng)的08/112848，1994年4月28日申請(qǐng)的08/234145，1995年1月20日申請(qǐng)的08/376279，1995年4月27日申請(qǐng)的08/430938，1995年6月5日申請(qǐng)的08/464584，1995年6月5日申請(qǐng)的08/464582，1995年6月5日申請(qǐng)的08/471191，1995年6月5日申請(qǐng)的08/462837，1995年6月5日申請(qǐng)的08/486853，1995年6月5日申請(qǐng)的08/486857，1995年6月5日申請(qǐng)的08/486859，1995年6月5日申請(qǐng)的08/462513，1996年10月2日申請(qǐng)的08/724752，及1996年12月3日申請(qǐng)的08/759620。也見于Mendez等，Nature Genetics 15146-156(1997)，及Green和Jakobovits，J Exp.Med.188483-495(1998)。也見于1996年6月12日授權(quán)公布的歐洲專利No.EP 047115181，1994年2月3日公布的國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/02602，1996年10月31日公布的國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO 96/34096，及1998年6月11日公布的WO98/24893所述。上述專利，申請(qǐng)及參考文獻(xiàn)在此均以其全文并入?yún)⒖肌?br> 人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答導(dǎo)致業(yè)界制備嵌合的或其它人源化抗體。盡管嵌合抗體具有人恒定區(qū)和鼠可變區(qū)，但預(yù)期可以觀測(cè)到一些人抗嵌合抗體(HACA)應(yīng)答，尤其在長(zhǎng)期或多劑量利用這些抗體的情況中。因此，需要提供抗TR7多肽的完全人抗體以降低HAMA或HACA應(yīng)答的關(guān)注和/或影響。
特異于TR7多肽的單克隆抗體可以使用雜交瘤技術(shù)制備(Kohler等，Nature 256495(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6292(1976)；Hammerling等，inMonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp571-681(1981))。簡(jiǎn)而言之，XenoMouseTM小鼠可以用TR7多肽免疫。在免疫后，提取該小鼠的脾細(xì)胞并與一種合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何合適的骨髓瘤細(xì)胞系；然而，優(yōu)選應(yīng)用得自ATCC的親代骨髓瘤細(xì)胞系(SP2O)。在融合后，所得雜交瘤細(xì)胞選擇性地保持在HAT培養(yǎng)基中，然后通過(guò)限制性稀釋克隆，如Wands等所述(Gastroenterology 80225-232(1981))。然后分析通過(guò)這種選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞，以鑒別分泌能結(jié)合TR7多肽的抗體的克隆。
對(duì)于一些應(yīng)用，包括在人體體內(nèi)應(yīng)用抗體及在體外檢測(cè)分析中的應(yīng)用，優(yōu)選使用人或嵌合抗體。特別需要完全人抗體用于治療人類患者。也見于美國(guó)專利4444887和4716111；及PCT公開WO 98/46645，WO 98/50435，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO96/35735及WO 91/10741；所述文獻(xiàn)在此均以全文并入?yún)⒖?。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含本發(fā)明的一或多個(gè)VH和VL結(jié)構(gòu)域及來(lái)自另一種免疫球蛋白分子優(yōu)選人免疫球蛋白分子的恒定區(qū)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含一或多個(gè)相應(yīng)于本發(fā)明VH和VL結(jié)構(gòu)域的CDR及來(lái)自另一種免疫球蛋白分子優(yōu)選人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含相應(yīng)于表1所示一或多種scFv的一或多個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域的1，2，3，4，5，6或更多個(gè)VL CDR或VH CDR或其片段或變體，及來(lái)自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(及任選不是衍生自表1所示scFv表達(dá)的抗體的一或多個(gè)CDR)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含相應(yīng)于選自表1所示scFv的相同的scFv或不同的scFv的VHCDR3，VL CDR3或兩者，或其片段或變體，及來(lái)自人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)。
嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子，如具有衍生自人抗體的可變區(qū)及非人(例如鼠)免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體或反之的抗體。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)嵌合抗體的方法。見例如Morrison，Science 2291202(1985)；Oi等，BioTechniques 4214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125191-202(1989)；美國(guó)專利No.5807715；4816567及4816397，在此以其全文并入?yún)⒖肌０宋锓N的一或多個(gè)CDR及非人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(例如來(lái)自鼠，犬或貓免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū))的嵌合抗體(或相反情況的嵌合抗體)可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法生產(chǎn)，包括例如CDR移植(grafting)(EP239400；PCT公開WO9I/09967；美國(guó)專利No.5225539；5530101和5585089)，鑲嵌(veneering)或表面再處理(resurfacing)(EP592106；EP519596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering7(6)805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91969-973(1994))，及鏈改組(shuffling)(美國(guó)專利No.5565352)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合抗體包含一個(gè)人CDR3和非人構(gòu)架區(qū)或不同于表1所示相應(yīng)的scFv中的構(gòu)架區(qū)的人構(gòu)架區(qū)，所述人CDR3具有表1所示一或多種scFv的VH或VL結(jié)構(gòu)域的任一VH CDR3或VL CDR3的氨基酸序列。通常，構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基用來(lái)自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代以改變，優(yōu)選改良抗原結(jié)合性。這些構(gòu)架取代通過(guò)本領(lǐng)域熟知方法鑒別，例如通過(guò)建立CDR與構(gòu)架殘基的相互作用的模型以鑒別對(duì)抗原結(jié)合而言重要的構(gòu)架殘基，以及進(jìn)行序列對(duì)比以鑒別在特定位置的不尋常的構(gòu)架殘基(見，例如Queen等，美國(guó)專利No.5585089；Riechmann等，Nature 352323(1988)，在此以其全文并入?yún)⒖?。
內(nèi)抗體(Intrabody)是從重組核酸分子中表達(dá)并被工程化而保留在胞內(nèi)(例如保留在胞質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或周質(zhì)中)的抗體，通常為scFvs?？梢允褂脙?nèi)抗體例如消除內(nèi)抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的功能。內(nèi)抗體的表達(dá)還可以通過(guò)使用包含所述內(nèi)抗體的核酸表達(dá)載體中的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明的內(nèi)抗體可以使用本領(lǐng)域已知方法生產(chǎn)，參見如下文獻(xiàn)Chen等，Hum.Gene Ther.5595-601(1994)；Marasco，W.A.，Gene Ther.411-15(1997)；Rondon和Marasco，Annu.Rev.Microbiol.51257-283(1997)；Proba等，J.Mol.Biol.275245-253(1998)；Cohen等，Oncogene 172445-2456(1998)；Ohage和Steipe，J.Mol.Biol.2911119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.2911129-1134(1999)；Wirtz和Steipe，Protein Sci.82245-2250(1999)；Zhu等，J.Immunol.Methods 231207-222(1999)，及這些文獻(xiàn)所引述的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明抗體的重組表達(dá)(包括抗體片段或其變體(例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈))，需要構(gòu)建含有編碼該抗體的多核苷酸的一種表達(dá)載體。一旦獲得編碼本發(fā)明抗體分子(例如完整抗體，抗體的重鏈或輕鏈，或其部分(優(yōu)選但非必需含有重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域))的多核苷酸，則可以使用本領(lǐng)域熟知技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)所述抗體分子的載體。因此，在此描述了通過(guò)表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸而制備蛋白質(zhì)的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建含有抗體編碼序列及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)及體內(nèi)遺傳重組。本發(fā)明因此提供了可復(fù)制的載體，所述載體包含編碼本發(fā)明抗體分子(例如完整抗體，抗體的重鏈或輕鏈，抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或其部分，或重鏈或輕鏈CDR，單鏈Fv，或其片段或變體)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操縱地連接于一個(gè)啟動(dòng)子。這種載體可包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列(見例如PCT公開WO86/05807；PCT公開WO89/01036；及美國(guó)專利5122464，所述文獻(xiàn)在此以其全文并入?yún)⒖?，抗體的可變結(jié)構(gòu)域可克隆入這種載體中以表達(dá)完整重鏈，完整輕鏈，或完整的重鏈和輕鏈。
將表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)方法移至宿主細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)以產(chǎn)生本發(fā)明抗體。因此，本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明抗體(例如完整抗體，其重鏈或輕鏈，或其部分，或單鏈抗體，或其片段或變體)的多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸可操縱地連接于一個(gè)異源啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為表達(dá)完整的抗體分子，編碼重鏈和輕鏈的載體可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，以表達(dá)完整的免疫球蛋白分子，如以下詳細(xì)描述。
可以利用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這種宿主表達(dá)系統(tǒng)代表可以用以產(chǎn)生并隨后純化感興趣的編碼序列的載體，但也代表當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可以原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。這些載體包括但非限于工程化表達(dá)抗體片段或其變體(單鏈抗體)的噬菌體顆粒，微生物如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌，枯草芽抱桿菌(B.subtilis))；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces，Pichia))；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)，或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS，CHO，BHK，293，3T3，NSO胞)，所述構(gòu)建體含有衍生自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)，或衍生自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)。優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，及更優(yōu)選地，尤其是表達(dá)完整重組抗體分子的真核細(xì)胞，用于表達(dá)重組抗體分子。例如，結(jié)合了一種載體如來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的主要立即早期基因啟動(dòng)子元件的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是一種抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，Gene 45101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 82(1990)；Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992)；Keen和Hale，Cytotechnology 18207(1996))。這些參考文獻(xiàn)在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以有利地根據(jù)待表達(dá)的抗體分子的應(yīng)用，選擇一些表達(dá)載體。例如，當(dāng)需產(chǎn)生大量這種蛋白質(zhì)時(shí)，為產(chǎn)生抗體分子的藥物組合物，需要指導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)的載體。這種載體包括但非限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，EMBO1.21791(1983))，其中所述抗體編碼序列可以單獨(dú)連接于載體中使其與具有l(wèi)acZ編碼區(qū)同框，以便產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye& Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；Van Heeke &Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509(1989))和類似的。pGEX載體也可以用于將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常地，這種融合蛋白是可溶的，而且，通過(guò)吸附并結(jié)合于基質(zhì)谷胱甘肽瓊脂糖珠，隨后在存在游離谷胱甘肽的情況下洗脫而易于從裂解的細(xì)胞中純化。pGEX載體設(shè)計(jì)為包含凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶解位點(diǎn)，以便克隆的靶基因產(chǎn)物可以從GST部分中釋防出來(lái)。
在一個(gè)昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)可以用作表達(dá)外源基因的載體。所述病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)?？贵w編碼序列可以單獨(dú)克隆入病毒的非必需區(qū)域(例如多角蛋白基因)，并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角蛋白啟動(dòng)子)的控制下。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況中，感興趣的抗體編碼序列可以連接于一個(gè)腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。這個(gè)嵌合的基因然后可以通過(guò)體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。在病毒基因組的一個(gè)非必需區(qū)域中(例如E1或E3區(qū))的插入將產(chǎn)生能在感染的宿主中存活并表達(dá)所述抗體分子的重組病毒(例如參見Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359(1984))。特異性起始信號(hào)也可以是有效翻譯插入的抗體編碼序列所需的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。另外，所述起始密碼子必須與所需編碼序列的讀框同相，以保證完整插入體的翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是多種來(lái)源的，可以是天然的和合成的。表達(dá)效率可以通過(guò)包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等而加強(qiáng)(見例如Bittner等，Methods in Enzymol.15351-544(1987))。
另外，可以選擇以所需特異方式調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或者修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如裂解)對(duì)所述蛋白質(zhì)的功能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有特有的和特異的翻譯后加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證正確修飾和加工表達(dá)的外源蛋白。為此，可以使用具有合適的加工原始轉(zhuǎn)錄物，糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但非限于CHO，VERY，BHK，Hela，COS，NSO，MDCK，293，3T3，W138，尤其乳腺癌細(xì)胞系如BT483，Hs578T.HTB2，BT2O和T47D，及正常乳腺細(xì)胞系如CRL7O3O和HsS78Bst。
為長(zhǎng)期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組的蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以將穩(wěn)定表達(dá)所述抗體的細(xì)胞系工程化。除了使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以用由適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和一個(gè)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化。在導(dǎo)入外源DNA后，可以使工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中可選擇的標(biāo)記產(chǎn)生對(duì)選擇條件的抗性，并使細(xì)胞穩(wěn)定地將所述質(zhì)粒整合入其染色體中，并生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化灶(foci)，然后將所述轉(zhuǎn)化灶克隆及擴(kuò)展入細(xì)胞系中。這個(gè)方法可用于工程化表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。這種工程化細(xì)胞系可特別用于篩選和評(píng)價(jià)與所述抗體分子直接或間接相互作用的組合物。
可以使用許多篩選系統(tǒng)，包括但非限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11223(1977))，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，Cell 22817(1980))基因，它們可以分別用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞中。同樣，抗代謝物抗性可以用作以下基因的選擇基礎(chǔ)dhfr，其產(chǎn)生對(duì)氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；gpt，其產(chǎn)生對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))；neo，其產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy 12488-505；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；TIB TECH11(5)155-215(May，1993))；及hygro，其產(chǎn)生對(duì)潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30147(1984))?？梢猿Ｒ?guī)使用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域已知的常規(guī)方法選擇所需的重組克隆，這種方法見例如Ausubel等(編輯)，Current Protocols in Molecualr Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton出版社NY(1990)；及Dracopoli等(編輯)，Current Protocolsin Human Genetics，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.1501(1981)，這些文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌?br> 抗體分子的表達(dá)水平可以通過(guò)載體擴(kuò)增而提高(參見Bebbington和Hentschel，″The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells″in DNA Cloning，第3卷(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的一個(gè)標(biāo)記是可擴(kuò)增的時(shí)候，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平的提高將會(huì)提高標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增的區(qū)域與抗體的編碼序列相關(guān)，因此抗體的產(chǎn)生也將增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3257(1983))。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標(biāo)記的載體可以在分別存在藥物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲蝶呤的情況下擴(kuò)增?；诠劝滨０泛厦傅妮d體的優(yōu)勢(shì)是可利用谷氨酰胺合酶陰性的細(xì)胞系(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NS0)。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)還可以在谷氨酰胺合酶表達(dá)細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中發(fā)揮作用，其通過(guò)提供另外的抑制劑阻止內(nèi)源基因的作用而起作用。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其成分詳見于PCT公開WO87/04462，WO86/05807，WO89/01036，WO89/10404，和WO91/06657所述，這些文獻(xiàn)在此全文并入?yún)⒖?。另外，本發(fā)明可以使用的谷氨酰胺合酶表達(dá)載體可商購(gòu)自供應(yīng)商，例如Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)。使用GS表達(dá)系統(tǒng)在鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)及產(chǎn)生單克隆抗體見Bebbington等，Bio/technology 10169(1992)及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.111(1995)所述，這些文獻(xiàn)全文并入?yún)⒖肌?br> 所述宿主細(xì)胞可以用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可以含有相同的選擇標(biāo)記，其能等量表達(dá)重鏈和輕鏈多肽?；蛘?，可以使用編碼而且能同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈多肽的一個(gè)載體。在這種情況中，輕鏈優(yōu)選置于重鏈之前，以避免毒性游離重鏈過(guò)量(Proudfoot，Nature 32252(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772 197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。
一旦本發(fā)明的抗體分子(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)已經(jīng)通過(guò)化學(xué)合成或重組表達(dá)，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的純化免疫球蛋白分子的方法純化，或更普遍地，使用純化蛋白質(zhì)分子的方法純化，例如層析(例如離子交換，親和性，特別是在蛋白質(zhì)A及大小排阻層析后對(duì)特異性抗原的親和性)，離心，不同的溶解性，或純化蛋白質(zhì)的任何其它標(biāo)準(zhǔn)方法。另外，本發(fā)明的抗體可以與本發(fā)明所述或本領(lǐng)域已知的其它異源多肽序列融合以易于純化。
本發(fā)明的抗體包括天然純化的產(chǎn)物，化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，及通過(guò)重組方法從原核或真核宿主中產(chǎn)生的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)在重組生產(chǎn)方法中應(yīng)用的宿主，本發(fā)明的抗體可以是糖基化或非糖基化的。另外，本發(fā)明的抗體還可以包括一個(gè)最初的修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況中是宿主介導(dǎo)的過(guò)程的結(jié)果。
本發(fā)明的抗體可以使用本領(lǐng)域已知方法化學(xué)合成(例如見Creighton，1983，ProteinsStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.及Hunkapiller等，1984 Narure 310105-111)。例如，相應(yīng)于本發(fā)明抗體片斷的一種肽可以使用肽合成儀合成。另外，如果需要，非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可以作為取代或添加導(dǎo)入抗體多肽序列中。非經(jīng)典氨基酸包括但非限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟氨基酸，設(shè)計(jì)氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸及氨基酸類似物。另外，所述氨基酸可以是D氨基酸(右旋)或L氨基酸(左旋)。
本發(fā)明涵蓋了在翻譯期間或之后被差異修飾的抗體，例如通過(guò)糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化，蛋白酶解，連接于抗體分子或其它細(xì)胞配體等。任何化學(xué)修飾均可以通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行，包括但非限于通過(guò)以下物質(zhì)的特異性化學(xué)裂解溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4，乙?；柞；?，氧化，還原，在存在衣霉素情況下代謝合成等。
本發(fā)明涵蓋的額外翻譯后修飾包括例如N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈，N或C末端加工，將化學(xué)部分附著于氨基酸主鏈，化學(xué)修飾N連接的或O連接的碳水化合物鏈，及作為原核宿主細(xì)胞表達(dá)的結(jié)果而加入或缺失一個(gè)N末端甲硫氨酸殘基。所述抗體也可以用一種可檢測(cè)標(biāo)記修飾，如酶標(biāo)記，熒光標(biāo)記，同位素標(biāo)記或親和標(biāo)記，以檢測(cè)及分離所述抗體。
合適的酶的實(shí)施例包括辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖氧化酶或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)妮o基復(fù)合物的實(shí)施例包括鏈親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適當(dāng)?shù)臒晒獠牧系膶?shí)施例包括生物素，傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，二氯三嗪胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料實(shí)施例包括魯米諾；生物發(fā)光材料實(shí)施例包括螢光素酶，螢光素，和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)實(shí)施例包括放射性金屬離子，例如α-發(fā)射物例如213Bi，或者其它放射性同位素例如碘(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(115mIn，113mIn，112In，111In)，和锝(99Tc，99mTc)，鉈(201Ti)，鎵(68Ga，67Ga)，鈀(103Pd)，鉬(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn和117Tin。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用銪標(biāo)記。例如，本發(fā)明的抗體可以使用DELFIA Eu-標(biāo)記試劑盒(目錄號(hào)#1244-302，PerkinElmer Life Sciences，Boston，MA)根據(jù)廠商指導(dǎo)用銪標(biāo)記。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體附著于大環(huán)類螯合劑，用于將放射性金屬離子包括但非限于111In，177Lu，90Y，166Ho，153Sm，215Bi和225Ac綴合于多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與附著于本發(fā)明抗體的大環(huán)類螯合劑相關(guān)的放射性金屬離子是111In。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與附著于本發(fā)明抗體多肽的大環(huán)類螯合劑相關(guān)的放射性金屬離子是90Y。在特異的實(shí)施方案中，大環(huán)類螯合劑是1，4，7，10-四氮環(huán)化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在特異的實(shí)施方案中，大環(huán)類螯合劑是α-(5-異硫氰酸-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮環(huán)化十二烷-1，4，7，10-四乙酸。在其它特異的實(shí)施方案中，DOTA通過(guò)一個(gè)接頭分子附于本發(fā)明抗體。用于將大環(huán)類螯合劑如DOTA綴合于多肽的接頭分子的實(shí)施例是本領(lǐng)域已知的，見例如DeNardo等，Clin CancerRes.4(10)2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌Ａ硗?，美?guó)專利5652361和5756065揭示了可與抗體綴合的螯合劑及生產(chǎn)和使用它們的方法，在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用生物素標(biāo)記。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，生物素標(biāo)記的本發(fā)明的抗體可以例如用作一種顯影劑或作為鑒別一或多個(gè)TRAIL受體共同受體或配體分子的一種手段。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明抗體的化學(xué)修飾的衍生物，所述修飾的衍生物可提供另外的優(yōu)勢(shì)如多肽的溶解性、穩(wěn)定性及體內(nèi)或體外循環(huán)時(shí)間增加，或者免疫原性降低(見美國(guó)專利No.4179337)。用于衍生的化學(xué)部分可以選自水溶性聚合物如聚乙二醇，1，2亞乙基二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇等。所述抗體可以在分子內(nèi)的隨機(jī)位置修飾，或者在分子內(nèi)預(yù)定位置修飾，而且可以包括1、2、3或多個(gè)附著的化學(xué)部分。
所述聚合物可以是任何分子量的，而且可以是分支或不分支的。針對(duì)聚乙二醇，優(yōu)選的分子量為大約1kDa至大約100kDa(術(shù)語(yǔ)“大約”是指在制備聚乙二醇中，一些分子比規(guī)定分子量多或少)之間，以易于處理和生產(chǎn)。根據(jù)所需治療方案(例如所希望的持續(xù)釋放時(shí)間、對(duì)生物學(xué)活性作用(如果有)、處理的簡(jiǎn)便性、抗原性程度或喪失、及聚乙二醇對(duì)治療性蛋白質(zhì)或類似物的其它已知作用)，可以使用其它大小的分子。例如，所述聚乙二醇的平均分子量為大約200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100000kDa。
如上所述，所述聚乙二醇可以具有分支結(jié)構(gòu)。分支的聚乙二醇例如美國(guó)專利No.5643575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.5659-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 182745-2750(1999)；及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10638-646(1999)所述，所述內(nèi)容在此并入?yún)⒖肌?br> 考慮到對(duì)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)構(gòu)域的作用，所述聚乙二醇分子(或其它化學(xué)部分)應(yīng)附著于所述抗體。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的附著方法，例如EP0401384所述，在此并入?yún)⒖?將PEG與G-CSF偶聯(lián))，也見于Malik等，Exp Hematol 201028-1035(1992)(使用tresyl氯化物對(duì)GM-CSF進(jìn)行PEG化)。例如，聚乙二醇可以通過(guò)一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)與氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合，所述反應(yīng)性基團(tuán)例如一種游離的氨基或羧基基團(tuán)。反應(yīng)性基團(tuán)是激活的聚乙二醇分子可以結(jié)合的那些基團(tuán)。具有游離氨基基團(tuán)的氨基酸殘基可以包括，例如賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基；具有游離羧基基團(tuán)的那些殘基可以包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基基團(tuán)也可以用作反應(yīng)性基團(tuán)以附著聚乙二醇分子。針對(duì)治療目的優(yōu)選在氨基基團(tuán)附著，如在N末端或賴氨酸基團(tuán)附著。
如上所提示，聚乙二醇可以通過(guò)與任何數(shù)目的氨基酸殘基連接而附著于蛋白質(zhì)，例如，抗體。例如，聚乙二醇可以通過(guò)與賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸殘基的共價(jià)鍵而與蛋白質(zhì)連接。可以應(yīng)用一或多種反應(yīng)化學(xué)以將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的特異氨基酸殘基(例如賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或者附著于蛋白質(zhì)的一種以上類型的氨基酸殘基(例如賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸及其組合)。
特別希望的是在重鏈或輕鏈或這兩者的N末端經(jīng)化學(xué)修飾的抗體。使用聚乙二醇作為例證，可以從多種聚乙二醇分子(通過(guò)分子量，分支等)，反應(yīng)混合物中聚乙二醇與蛋白質(zhì)(或肽)分子的比例，進(jìn)行peg化反應(yīng)類型，及獲得所選擇的N末端peg化蛋白的方法中加以選擇。獲得N末端peg化制品的方法(即如果需要從其它單peg化部分中分離這種部分)可以通過(guò)從一群peg化蛋白質(zhì)分子中純化N末端peg化材料進(jìn)行。在N末端的選擇性化學(xué)修飾可以通過(guò)還原烷化而實(shí)現(xiàn)，其使用不同類型的初級(jí)氨基酸基團(tuán)的不同反應(yīng)性(賴氨酸和N末端)以在特殊蛋白質(zhì)中衍生化。在適當(dāng)反應(yīng)條件下，用含有羰基基團(tuán)的聚合物實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)N端基本上選擇性的衍生化。
如上所示，本發(fā)明抗體的peg化可以通過(guò)許多方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以將聚乙二醇直接或通過(guò)一個(gè)間插接頭而附著于抗體。將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的無(wú)接頭系統(tǒng)見Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug CarrierSys.9249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.681-18(1998)；美國(guó)專利No.4002531；美國(guó)專利No.5349052；WO95/06058及WO98/32466所述，所述文獻(xiàn)在此并入?yún)⒖肌?br> 將聚乙二醇不用間插接頭而直接附著于抗體的氨基酸殘基的一個(gè)系統(tǒng)是應(yīng)用tresylated MPEG，其是通過(guò)使用tresyl氯(ClSO2CH2CF3)修飾單甲氧基聚乙二醇(MPEG)而產(chǎn)生的。在蛋白質(zhì)與tresylated MPEG反應(yīng)時(shí)，聚乙二醇直接附著于蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)。因此，本發(fā)明包括抗體-聚乙二醇綴合物，其通過(guò)本發(fā)明抗體與具有2，2，2-三氟乙烷磺?；鶊F(tuán)的聚乙二醇分子反應(yīng)而產(chǎn)生。
聚乙二醇也可以使用一些不同的間插接頭而附著于抗體。例如，在此并入?yún)⒖嫉拿绹?guó)專利No.5612460揭示了連接聚乙二醇與蛋白質(zhì)的氨基甲酸乙酯接頭。聚乙二醇通過(guò)接頭附著于抗體的抗體-聚乙二醇綴合物也可以通過(guò)將抗體與化合物反應(yīng)而產(chǎn)生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亞氨基琥珀酸酯、用1，1’-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸酯、MPEG-p-硝基酚碳酸酯及多種MPEG-琥珀酸酯衍生物。將聚乙二醇附著于蛋白質(zhì)的一些另外的聚乙二醇衍生物及反應(yīng)化學(xué)見WO98/32466所述，其全部?jī)?nèi)容在此并入?yún)⒖?。使用本文所述反?yīng)化學(xué)產(chǎn)生的peg化抗體產(chǎn)物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
附著于本發(fā)明每一抗體的聚乙二醇部分的數(shù)目(即取代的程度)也可以變化。例如，本發(fā)明peg化抗體可以連接于平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多個(gè)聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在每個(gè)抗體分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19或18-20個(gè)聚乙二醇部分的范圍內(nèi)。確定取代程度的方法見例如Delgado等，Crit.Rev.Thera.CarrierSys.9249-304(1992)所述。
抗TR7抗體的定性本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)還可以根據(jù)其與TR7多肽或TR7多肽片段或變體的結(jié)合而描述或說(shuō)明。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離常數(shù)KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離常數(shù)或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M或10-8M。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離常數(shù)或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M。本發(fā)明涵蓋了以解離常數(shù)或KD在每個(gè)具體列出數(shù)值之間任一范圍內(nèi)結(jié)合TR7多肽的抗體。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離速率(off rate)(koff)小于或等于5×10-2/秒，10-2/秒，5×10-3/秒或10-3/秒。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離速率(koff)小于或等于5×10-4/秒，10-4/秒，5×10-5/秒或10-5/秒，5×10-6/秒，10-6/秒，5×10-7/秒或10-7/秒。本發(fā)明涵蓋了以解離速率(koff)在每個(gè)具體列出的數(shù)值之間的任一范圍內(nèi)結(jié)合TR7多肽的抗體。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，結(jié)合速率(on rate，kon)高于或等于103M-1/秒，5×103M-1/秒，104M-1/秒或5×104M-1/秒。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，結(jié)合速率(kon)高于或等于105M-1/秒，5×105M-1/秒，106M-1/秒，或5×106M-1/秒或107M-1/秒。本發(fā)明涵蓋了以結(jié)合速率(kon)在每個(gè)具體列出的數(shù)值之間的任一范圍內(nèi)結(jié)合TR7多肽的抗體。
本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)免疫特異性結(jié)合人TR7多肽(SEQ ID NO3)或多肽片段或變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合猿TR7多肽或多肽片段或變體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合鼠TR7多肽或多肽片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合人和猿TR7多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合人TR7多肽和鼠TR7多肽。更優(yōu)選地，與鼠TR7多肽相比，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合人TR7多肽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)免疫特異性結(jié)合TR7，但與任何其它抗原不交叉反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合TR7多肽(例如SEQ ID NO3或其片段或變體)，但與腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子受體家族多肽(例如TR1，TR5，TR10 BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，F(xiàn)as和NGFR)的一或多個(gè)成員不交叉反應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)免疫特異性結(jié)合TR7多肽并與其它抗原交叉反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體免疫特異性結(jié)合TR7多肽(例如SEQ ID NO3或其片段或變體)，并與腫瘤壞死因子受體家族(例如TR1，TR5，TR10，BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，F(xiàn)as及NGFR)的一或多個(gè)另外的成員交叉反應(yīng)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于結(jié)合TR1，TR4，TR5或TR10(SEQ ID NO5，1，2和4)或其片段或變體的能力，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合TR7多肽(SEQ ID NO3)或其片段或變體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于結(jié)合TR1，TR5或TR10(SEQ ID NO5，2和4)或其片段或變體的能力，本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合TR7和TR4(SEQ IDNO3和1)或其片段或變體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR1，TR7，TR5，TR4和TR10(SEQ ID NO5，1，2，3，和4)。與另一種抗原相比，抗體優(yōu)先結(jié)合一種抗原的能力可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定。
非限制性的實(shí)施例是，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的解離常數(shù)(KD)低于該抗體結(jié)合第二種抗原的KD，則認(rèn)為其優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的親和性(即KD)比該抗體與第二種抗原的KD至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)，則認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的親和性(即KD)比該抗體與第二種抗原的KD至少低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，則認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。
在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的解離速率(koff)低于該抗體與第二種抗原的koff，則認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的koff比該抗體與第二種抗原的koff至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)，則認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，如果一種抗體結(jié)合第一種抗原的koff比該抗體與第二種抗原的koff至少低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，則認(rèn)為該抗體優(yōu)先結(jié)合第一種抗原。
本發(fā)明還涵蓋了與本發(fā)明所述一或多種抗體具有一或多種相同生物學(xué)特征的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。“生物學(xué)特征”是指所述抗體在體外或體內(nèi)的活性或性質(zhì)，例如結(jié)合TR7多肽(例如膜包埋的TRAIL受體)的能力，刺激TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性的能力(例如刺激TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡，見實(shí)施例3)，基本阻斷TR7配體(例如TRAIL(SEQ ID NO72)，也稱為AIM-I，國(guó)際申請(qǐng)No.WO97/35899和美國(guó)專利申請(qǐng)5771223)的能力，或其片段、變體或融合蛋白的結(jié)合TRAIL受體的能力，見實(shí)施例2；或上調(diào)TR7在細(xì)胞表面表達(dá)的能力。TR7多肽的抗體的其它生物學(xué)活性可包括但非限于抑制TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性的能力(例如抑制TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡)，或者下調(diào)TR7在細(xì)胞表面表達(dá)的能力。任選地，本發(fā)明的抗體與在此特別描述的至少一種抗體結(jié)合相同的表位。這種表位結(jié)合可以使用本領(lǐng)域已知的分析常規(guī)確定。
本發(fā)明還提供了刺激TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，刺激TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性的抗體包含或由表1所示至少一種scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，刺激TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性的抗體包含或由表1所示任一種scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。編碼這些抗體的核酸分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體(包含包含或由抗體片段或變體組成的分子)(見實(shí)施例3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體包含或由表1所示至少一種scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體包含或由表1所示任一種scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。編碼這些抗體的核酸分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了在有或無(wú)抗體交聯(lián)劑的情況下均同等良好地刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，所述交聯(lián)劑如抗IgFc反應(yīng)細(xì)胞(見例如實(shí)施例3)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在有或無(wú)抗IgFc抗體交聯(lián)劑的情況下均等同良好地刺激HeLa細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在存在2μg/ml環(huán)己酰亞胺、有或無(wú)抗IgFc抗體交聯(lián)劑的情況下均等同良好地刺激HeLa細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在有或無(wú)抗IgFc抗體交聯(lián)劑的情況下均等同良好地刺激SW480細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在存在2μg/ml環(huán)己酰亞胺、有或無(wú)抗IgFc抗體交聯(lián)劑的情況下均等同良好地刺激SW480細(xì)胞凋亡。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，其與等濃度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，變體或融合蛋白)刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的程度至少相同(見例如實(shí)施例3)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的程度好于等濃度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，變體或融合蛋白)刺激的TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體刺激HeLa細(xì)胞凋亡的程度好于等濃度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，變體或融合蛋白)刺激的TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，在存在2μg/ml環(huán)己酰亞胺下，本發(fā)明的抗體刺激HeLa細(xì)胞凋亡的程度好于等濃度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，變體或融合蛋白)刺激的TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)，當(dāng)其與一種化療藥物組合施用時(shí)，其刺激的TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡比單獨(dú)施用化療藥物或由所述抗體單獨(dú)刺激受體表達(dá)細(xì)胞的凋亡要多。在特異的實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的抗體與Topotecan組合施用時(shí)，與Topotecan或抗體單獨(dú)刺激受體表達(dá)細(xì)胞凋亡相比，其刺激更多的TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡。在特異的實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的抗體與環(huán)己酰亞胺組合施用時(shí)，與環(huán)己酰亞胺或所述抗體單獨(dú)刺激受體表達(dá)細(xì)胞的凋亡相比，其刺激更多的TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明還提供了阻斷或抑制TRAIL與TR7多肽結(jié)合的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)(見實(shí)施例2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷或抑制TRAIL與TR7多肽結(jié)合的抗體包含或由表1所示至少一種scFv的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，阻斷或抑制TRAIL與TR7結(jié)合的抗體包含或由表1所示任一種scFv的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其片段或變體組成。編碼這些抗體的核酸分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了融合蛋白，其包含或由免疫特異性結(jié)合TR7的一種抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)和一個(gè)異源多肽。優(yōu)選地，與抗體融合的所述異源多肽對(duì)發(fā)揮功能或?qū)Χㄏ騎R7表達(dá)細(xì)胞是有用的。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了雙特異性抗體，其中一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)特異于TR7而第二個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)特異于一種異源多肽如TR4或腫瘤特異性抗原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與抗體融合的異源多肽定位抗體于腫瘤細(xì)胞是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或由一種多肽和一個(gè)異源多肽序列組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任一或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或者本發(fā)明抗體的任一或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其片段或變體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或由一種多肽和一個(gè)異源多肽序列組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或多個(gè)VH CDR的氨基酸序列，或本發(fā)明抗體的任一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或多個(gè)VL CDR的氨基酸序列或其片段或變體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含或由一種多肽和一個(gè)異源多肽序列組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的VH CDR3的氨基酸序列或其片段或變體，這種融合蛋白免疫特異性結(jié)合TR7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含或由一種多肽和一個(gè)異源多肽序列組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的至少一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和本發(fā)明抗體的至少一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其片段或變體組成。優(yōu)選地，融合蛋白的VH和VL結(jié)構(gòu)域相當(dāng)于本發(fā)明的一個(gè)單一抗體(或scFv或Fab片段)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含或由一種多肽和一個(gè)異源多肽序列組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或多個(gè)VH CDR的氨基酸序列及本發(fā)明抗體的任一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或多個(gè)VL CDR的氨基酸序列或其片段或變體。優(yōu)選地，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)或多個(gè)VH CDR(s)或VLCDR(s)相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)單一抗體(或scFv或Fab片段)。編碼這些融合蛋白的核酸分子也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明的抗體(包括抗體片段或其變體)可以通過(guò)多種方式定性。特別地，可以分析本發(fā)明的抗體和相關(guān)分子免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的能力，使用在此所述技術(shù)或本領(lǐng)域已知方法的常規(guī)修改的技術(shù)而進(jìn)行。分析本發(fā)明抗體免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的能力，可以在溶液中(例如Houghten，Bio/Techniques 13412-421(1992))，在珠上(例如Lam，Nature 35482-84(1991))，在芯片上(例如Fodor，Nature 364555-556(1993))，在細(xì)菌上(例如美國(guó)專利No.5223409)，在孢子上(例如專利號(hào)No.5571698，5403484和5223409)，在質(zhì)粒上(例如Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869(1992))或在噬菌體上(例如Scott和Smith，Science249386-390(1990)；Devlin，Science 249404-406(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877178-7182(1990)；及Felici，J.Mol.Biol.222301-310(1991))進(jìn)行，在此所有文獻(xiàn)并入?yún)⒖?。然后可以分析已?jīng)鑒別為免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體對(duì)TR7或其片段或變體的特異性和親和性，使用本發(fā)明所述或本領(lǐng)域已知的技術(shù)或加以常規(guī)修飾的技術(shù)進(jìn)行。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法分析本發(fā)明的抗體與TR7多肽的免疫特異性結(jié)合及與其它抗原的交叉反應(yīng)性?？梢杂糜诜治雒庖咛禺愋越Y(jié)合及交叉反應(yīng)性的免疫分析包括但非限于競(jìng)爭(zhēng)性及非競(jìng)爭(zhēng)性分析系統(tǒng)，使用如下技術(shù)BIAcore分析(見例如實(shí)施例1)，F(xiàn)ACS(熒光激活的細(xì)胞分選儀)分析(見例如實(shí)施例3)，免疫熒光，免疫細(xì)胞化學(xué)，放射免疫分析，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，“夾心”(sandwich)免疫分析，免疫沉淀分析，western印跡，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)，免疫擴(kuò)散分析，凝集分析，補(bǔ)體固定分析，免疫放射分析，熒光免疫分析及蛋白質(zhì)A免疫分析等。這種分析是本領(lǐng)域常規(guī)使用并熟知的(見例如Ausubel等編輯1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，在此以其全文并入?yún)⒖?。以下簡(jiǎn)要闡述了舉例的免疫分析(非限制性)。
ELISA包括制備抗原，用所述抗原包被一個(gè)96孔酶標(biāo)板，洗去未結(jié)合孔的抗原，在所述孔中加入綴合于一種可檢測(cè)化合物如酶底物(例如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)的感興趣的抗體，并溫育一段時(shí)間，洗去未結(jié)合的抗體或非特異性結(jié)合的抗體，并檢測(cè)特異性結(jié)合包被孔的抗原的抗體的存在情況。在ELISAs中，感興趣的抗體不用綴合于可檢測(cè)化合物；取而代之，將綴合于可檢測(cè)化合物的第二抗體(其識(shí)別感興趣的抗體)加入所述孔中?；蛘?，不用所述抗原直接包被孔，而是用抗Ig Fc抗體包被ELISA平板，這種形式的抗原或TRAIL受體-Fc融合蛋白可以結(jié)合包被平板的該抗Ig-Fc。這是需要的，因?yàn)榭梢跃S持所述抗原蛋白(例如TR7多肽)比其直接包被于平板時(shí)呈更天然的構(gòu)象。另外，與抗原包被孔相反，所述抗體可以包被孔。在這種情況中，可檢測(cè)分子可以是綴合可檢測(cè)化合物如酶底物(例如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知對(duì)參數(shù)可以加以修改，以提高檢測(cè)信號(hào)以及本領(lǐng)域已知的其它ELISA變化。關(guān)于ELISA的進(jìn)一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，在11.2.1章節(jié)。
抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的scFv或其它分子)與抗原的結(jié)合親和性，和抗體-抗原相互作用的解離速率，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析的一個(gè)實(shí)施例是放射免疫分析，包括將感興趣抗體在未標(biāo)記抗原數(shù)量增加的情況下，與標(biāo)記的抗原(例如用3H或125I標(biāo)記的抗原)或其片段或變體孵育，并檢測(cè)與標(biāo)記的抗原結(jié)合的抗體。本發(fā)明抗體對(duì)TR7的親和性及結(jié)合解離速率可以從Scatchard作圖分析的數(shù)據(jù)確定。與第二抗體的競(jìng)爭(zhēng)也可以使用放射免疫分析測(cè)定。在這種情況中，TR7多肽在未標(biāo)記的第二抗TR7抗體量增加的情況下，與綴合于標(biāo)記的化合物(例如3H或125I標(biāo)記的化合物)的本發(fā)明抗體孵育。兩種抗體之間的這種競(jìng)爭(zhēng)性分析也可以用于確定這兩種抗體是否結(jié)合相同或不同的表位。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用BIAcore動(dòng)力學(xué)分析確定抗體(包括抗體片段或其變體)與TRAIL受體或其片段的結(jié)合速率及解離速率。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析包括分析來(lái)自芯片的抗體與其表面上固定的TRAIL受體的結(jié)合和解離，詳見于實(shí)施例1所述。
免疫沉淀方法通常包括在裂解緩沖液中裂解一群細(xì)胞，所述裂解緩沖液如是補(bǔ)加了蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如EDTA，PMSF，抑酶肽，釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％ SDS，0.15 M NaCl，0.01 M磷酸鈉pH 7.2，1％抑肽酶(Trasylol))，將感興趣的抗體加入細(xì)胞裂解物中，在40℃孵育一段時(shí)間(例如1-4小時(shí))，在所述細(xì)胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠，在40℃孵育大約1或更長(zhǎng)，在裂解緩沖液中洗滌珠，并將珠重懸于SDS/樣品緩沖液中。感興趣的抗體免疫沉淀一種特定抗原的能力可以通過(guò)例如Western印跡分析測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以對(duì)參數(shù)加以修改，以提高抗體與抗原的結(jié)合并降低背景(例如用瓊脂糖珠預(yù)先清潔細(xì)胞裂解物)。關(guān)于免疫沉淀方法的進(jìn)一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，在10.16.1章節(jié)。
Western印跡分析一般包括制備蛋白質(zhì)樣品，將所述蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中電泳(例如，根據(jù)所述抗原的分子量采用8％-20％ SDS-PAGE)，將來(lái)自聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)樣品移至一個(gè)膜上，如硝酸纖維素膜，PVDF或尼龍膜上，在封閉溶液(例如具有3％BSA或脫脂奶的PBS)中將此膜封閉，在洗滌緩沖液(例如PBS-Tween20)洗滌此膜，在封閉溶液中用稀釋的初級(jí)抗體(感興趣的抗體)封閉此膜，在洗滌緩沖液中洗滌此膜，在封閉溶液中用稀釋的第二抗體(其識(shí)別初級(jí)抗體，例如抗人抗體)封閉此膜，所述第二抗體綴合于酶底物(例如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)，將此膜在洗滌緩沖液中洗滌，并檢測(cè)抗原的存在情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以對(duì)參數(shù)加以修改，以提高信號(hào)檢測(cè)并降低背景干擾。關(guān)于Western印跡的進(jìn)一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994.Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley &Sons公司，紐約，在10.8.1章。
抗體綴合物本發(fā)明涵蓋了抗體(包括抗體片段或其變體)，其重組融合或化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)于一種異源多肽(或其一部分，優(yōu)選所述多肽的至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，至少80，至少90，或至少100個(gè)氨基酸)，以產(chǎn)生融合蛋白。所述融合非必需是直接產(chǎn)生的，可以通過(guò)接頭序列產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的抗體可以用于將異源多肽在體外或體內(nèi)定向于特定的細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞)，這通過(guò)將所述異源多肽與本發(fā)明抗體融合或綴合進(jìn)行，所述的本發(fā)明抗體特異于特定細(xì)胞表面抗原，或與結(jié)合特定細(xì)胞表面受體的抗原結(jié)合。本發(fā)明的抗體還可以融合于白蛋白(包括但非限于重組人血清白蛋白(見例如1999年3月2日授權(quán)的美國(guó)專利No.5876969，EP專利0413622及1998年6月16日授權(quán)的美國(guó)專利No.5766883所述，在此全文并入?yún)⒖?)，產(chǎn)生嵌合多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和/或抗體(包括其片段或變體)與成熟形式的人血清白蛋白(即EP專利0322094的圖1和圖2所示人血清白蛋白的1-585位氨基酸，在此全文并入?yún)⒖?融合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和/或抗體(包括其片段或變體)與如下多肽片段融合，所述多肽片段包含或由美國(guó)專利5766883所述的人血清白蛋白的第1-z位氨基酸殘基組成，其中z是369-419之間的一個(gè)整數(shù)，該專利全文并入?yún)⒖肌１景l(fā)明的多肽和/或抗體(包括其片段或變體)可以融合于異源蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端。編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這種融合蛋白可例如易于純化并提高體內(nèi)半衰期。融合或綴合于異源多肽的抗體還可以用于使用本領(lǐng)域已知的方法的體外免疫分析和純化方法中。見例如Harbor等，如前，和PCT公開WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美國(guó)專利No.5,474,981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等，J.Immunol.1462446-2452(1991)所述，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌?br> 本發(fā)明還包括組合物，所述組合物包含或由融合或綴合于抗體片段的異源多肽組成。例如，所述異源多肽可以融合或綴合于Fab片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn)(ab)2片段，或其一部分。本領(lǐng)域已知將多肽融合或綴合于抗體部分的方法。見例如美國(guó)專利Nos.5,356,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公開WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.1545590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911357-11341(1992)(所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖?。
本發(fā)明的另外的融合蛋白可以通過(guò)基因改組(gene shuffling)，基序改組，外顯子改組和/或密碼子改組方法產(chǎn)生(統(tǒng)稱為“DNA改組”)?？梢圆捎肈NA改組以調(diào)節(jié)抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)的活性，可以使用這種方法產(chǎn)生活性改變的抗體(例如具有高親和性和低解離速率的抗體)。見美國(guó)專利Nos.5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458及Patten等，Curr.OpinionBiotechnol.8724-35(1997)；Harayama，Trends Biotechnol.16(2)76-82(1998)；Hansson等，J.Mol.Biol.287265-76(1999)；及Lorenzo和Blasco，Biotechniques 24(2)308-13(1998)(每個(gè)專利和出版物在此均以全文并入?yún)⒖?。在一個(gè)實(shí)施方案中，在重組前可以通過(guò)錯(cuò)誤傾向的PCR，隨機(jī)核苷酸插入或其它方法進(jìn)行隨機(jī)誘變以改變編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼部分免疫特異性結(jié)合TR7的抗體的多核苷酸的一或多個(gè)部分可以與一或多個(gè)異源分子的一或多個(gè)成分，基序，節(jié)段，部分，結(jié)構(gòu)域，片段等重組。
另外，本發(fā)明的抗體(包括抗體片段或其變體)可以融合于標(biāo)記序列，如一種促進(jìn)純化的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記氨基酸序列是一個(gè)6組氨酸多肽，如pQE載體中提供的標(biāo)簽(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，許多標(biāo)記是可以商購(gòu)的。例如如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)所述，提供6組氨酸以方便純化融合蛋白。用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但非限于血凝素“HA”標(biāo)簽，其相應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白的一個(gè)表位(Wilson等，Cell37767(1984))，和FLAG_標(biāo)記(Stratagene，LaJolla，CA)。
本發(fā)明還涵蓋了綴合于一種診斷或治療劑的抗體(包括抗體片段或其變體)。所述抗體可以診斷性用于例如監(jiān)測(cè)或預(yù)后腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，以作為臨床測(cè)試程序的一部分，以例如確定給予的治療方案的效力。可以通過(guò)將所述抗體偶聯(lián)于一種可檢測(cè)物質(zhì)而易于檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)施例包括但非限于多種酶，輔基，熒光材料，發(fā)光材料，生物發(fā)光材料，放射性物質(zhì)，使用多種正電子發(fā)射X線斷層術(shù)的正電子發(fā)射金屬，和非放射性順磁性金屬離子?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法，將所述可檢測(cè)物質(zhì)直接偶聯(lián)于或綴合于所述抗體，或間接通過(guò)中間物(例如本領(lǐng)域已知的接頭)偶聯(lián)或綴合于所述抗體。見例如美國(guó)專利No.4,741,900闡述了本發(fā)明的可以用作診斷劑的可以綴合于抗體的金屬離子。適當(dāng)?shù)拿傅膶?shí)施例包括但非限于辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)妮o基復(fù)合物實(shí)施例包括但非限于鏈親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適當(dāng)?shù)臒晒獠牧蠈?shí)施例包括但非限于傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，二氯三嗪胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料實(shí)施例包括但非限于魯米諾；生物發(fā)光材料實(shí)施例包括但非限于螢光素酶，螢光素，和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的實(shí)施例包括但非限于碘(121I，123I，125I，131I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(111mIn，112mIn，113In，115In)，和锝(99Tc，99mTc)，鉈(201Ti)，鎵(68Ga，67Ga)，鈀(103Pd)，鉬(99Mo)，氙(135Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh和97Ru。
另外，本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的scFv和其它分子)可以偶聯(lián)或綴合于一種治療部分如胞毒素，例如抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的或殺細(xì)胞的制劑，一種治療劑或一種放射性金屬離子，例如α發(fā)射體，例如213Bi，或其它放射性同位素例如103Pd，135Xe，131I，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，35S，90Y，153Sm，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，90Y，117Tin，186Re，188Re和166Ho。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段附著于大環(huán)類螯合劑，用于將放射性金屬離子包括但非限于177Lu，90Y，166Ho和153Sm綴合于多肽。在特異的實(shí)施方案中，大環(huán)類螯合劑是1，4，7，10-四氮環(huán)化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在其它特異的實(shí)施方案中，DOTA通過(guò)一個(gè)接頭分子附著于本發(fā)明抗體或其片段。用于將DOTA綴合于多肽的接頭分子的實(shí)施例是本領(lǐng)域已知的，見例如DeNardo等，Clin Cancer Res.4(10)2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌?br> 螯合分子是本領(lǐng)域已知的。螯合分子可以附著于本發(fā)明的抗體以便于用金屬離子包括熒光標(biāo)記或放射性核素標(biāo)記所述抗體。例如見Subramanian，R.和Meares，C.F.，“Bifunctional Chelating Agents forRadiometal-labeled monoclonal Antibodies”，Cancer Imaging withRadiolabeled Antibodies(D.M.Goldenberg編輯)，Kluwer AcademicPublications，Boston；Saji，H.，“Targeted delivery of radiolabeled imagingand therapeutic agentsbifunctional radiopharmaceuticals”，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16209-244(1999)；Srivastava S.C.和Mease R.C.，“Progress in research on ligands，nuclides and techniques forlabeling monoclonal antibodies”，Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 18589-603(1991)；及Liu，S.和Edwards，D.S.，“Bifunctional chelators fortherapeutic lanthanide radiopharmaceuticals”，Bioconjug.Chem.127-34(2001)。根據(jù)本發(fā)明可以使用與抗體共價(jià)結(jié)合的任何螯合劑。所述螯合劑還進(jìn)一步包含將螯合部分與所述抗體連接的一個(gè)接頭部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體附著于無(wú)環(huán)螯合劑如二亞乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸(DPTA)，DPTA的類似物及DPTA的衍生物。非限制性實(shí)施例是螯合劑可以是2-(p-異硫氰基芐基)-6-甲基二亞乙基三胺五乙酸(1B4M-DPTA，也稱為MX-DTPA)，2-甲基-6-(rho-硝基芐基)-1，4，7-三氮雜庚烷-N，N，N’，N”，N”-5乙酸(硝基-1B4M-DTPA或硝基-MX-DTPA)；2-(p-異硫氰基芐基)-環(huán)己基二亞乙基三胺五乙酸(CHX-DTPA)或N-[2-氨基-3-(rho-硝基苯基)丙基]-反式-環(huán)己烷-1，2-二胺-N，N’，N”-五乙酸(硝基-CHX-A-DTPA)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體附著于一個(gè)無(wú)環(huán)三聯(lián)吡啶(terpyridine)螯合劑如6，6”-雙[[N，N，N”，N”-四(羧甲基)氨基]甲基-4’-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(TMT-胺)。
在特異的實(shí)施方案中，與本發(fā)明抗體附著的大環(huán)類螯合劑是1，4，7，10-四氮環(huán)化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在其它特異的實(shí)施方案中，DOTA通過(guò)一個(gè)接頭分子附于本發(fā)明抗體。用于將DOTA綴合于多肽的接頭分子的實(shí)施例是本領(lǐng)域已知的，見例如DeNardo等，Clin.Cancer Res.4(10)2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖?。另外，美?guó)專利5652361和5756065揭示了可與抗體綴合的螯合劑及生產(chǎn)和使用它們的方法，在此以其全文并入?yún)⒖?。盡管美國(guó)專利5652361和5756065針對(duì)螯合劑與抗體的綴合，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能易于改變所述方法以將螯合劑與其它多肽綴合。
可以應(yīng)用基于大環(huán)類配體的雙功能的螯合劑，其中綴合通過(guò)一個(gè)激活臂或功能基團(tuán)與所述配體的碳骨架附著，如M.Moi.等，J.Amer.Chem.Soc.492639(1989)(2-p-硝基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸)；S.V.Deshpande等，J.Nucl.Med.31473(1990)；G.Ruser等，Bioconj.Chem.1345(1990)；C.J.Broan等，J.C.S.Chem.Comm.231739(1990)；及C.J.Anderson等，J.Nucl.Med.36850(1995)所述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一種大環(huán)類螯合劑，如任選含有一或多個(gè)羧基，氨基，氧肟酸(Hydroxamate)，磷酸酯或磷酸鹽基團(tuán)的多氮(polyaza)大環(huán)類螯合劑與本發(fā)明的抗體附著。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述螯合劑是選自由DOTA，DOTA類似物及DOTA衍生物組成的一組的螯合劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以與本發(fā)明抗體附著的合適的螯合劑分子包括DOXA(1-oxa-4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸)，NOTA(1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸)，TETA(1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸)和THT(4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-雙(N’，N’-二羧甲基-N-甲肼)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶)，及其類似物和衍生物。見例如Ohmono等，J.Med.Chem.35157-162(1992)；Kung等，J.Nucl.Med.25326-332(1984)；Jurisson等，Chem.Rev.931137-1156(1993)，及美國(guó)專利No.5367080。其它合適的螯合劑包括美國(guó)專利No.4647447，4687659，4885363，EP-A-71564，WO89/00557，及EP-A-232751所揭示的螯合劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明中的合適的大環(huán)類羧酸螯合劑包括1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮雜環(huán)十五烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N’，N”-三乙酸(9N3)；1，5，9-三氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”-三乙酸(12N3)及6-溴乙酰氨基-芐基-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(BAT)。
可與本發(fā)明抗體附著的優(yōu)選的螯合劑是α-(5-異硫氰基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，其也稱為MeO-DOTA-NCS。也可以使用α-(5-異硫氰基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的鹽或酯。
螯合劑如所描述的那些螯合劑共價(jià)附著于本發(fā)明抗體的可以用適于治療，診斷或治療與診斷目的的放射性核素標(biāo)記(通過(guò)螯合劑的配位點(diǎn)(coordination site))。合適的金屬實(shí)施例包括Ag，At，Au，Bi，Cu，Ga，Ho，In，Lu，Pb，Pd，Pm，Pr，Rb，Re，Rh，Sc，Sr，Tc，Tl，Y和Yb。用于診斷目的的放射性核素實(shí)施例是Fe，Gd，111In，67Ga或68Ga。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是111In或67Ga。用于治療目的的放射性核素實(shí)施例是166Ho，165Dy，90Y，115mIn，52Fe或72Ga。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于診斷目的的放射性核素是166Ho或90Y。用于治療和診斷目的的放射性核素實(shí)施例包括153Sm，177Lu，159Gd，175Yb，或47Sc。在一個(gè)實(shí)施方案中，放射性核素是153Sm，177Lu，175Yb或159Gd。
優(yōu)選的金屬放射性核素包括選自90Y，99mTc，111In，47Sc，67Ga，51Cr，177mSn，67Cu，167Tm，97Ru，188Re，177Lu，199Au，47Sc，67Ga，51Cr，177mSn，67Cu，167Tm，95Ru，188Re，177Lu，199Au，203Pb和141Ce的放射性核素。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，螯合劑共價(jià)附著的本發(fā)明抗體可以用選自90Y，111In，177Lu，166Ho，215Bi和225Ac的金屬離子標(biāo)記。
另外，發(fā)射γ射線的放射性核素如99mTc，111In，67Ga和169Yb可用于診斷顯影，而發(fā)射β射線的放射性核素如67Cu，111Ag，186Re和90Y用于腫瘤治療。其它有用的放射性核素還包括發(fā)射γ射線的放射性核素如99mTc，111In，67Ga，和169Yb，及發(fā)射β射線的放射性核素如67Cu，111Ag，186Re，188Re和90Y，以及感興趣的其它放射性核素如211At，212Bi，177Lu，86Rb，105Rh，153Sm，198Au，149Pm，85Sr，142Pr，214Pb，109Pd，166Ho，208Tl和44Sc。螯合劑共價(jià)附著的本發(fā)明抗體可以用上述放射性核素標(biāo)記。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑共價(jià)附著的本發(fā)明抗體可以用順磁性的金屬離子標(biāo)記，所述順磁性的金屬離子包括過(guò)渡態(tài)和鑭系金屬，如具有原子數(shù)21-29，42，43，44，或57-71的金屬，特別是離子Cr，V，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb和Lu。用于核磁共振顯影的組合物中的順磁性金屬包括具有原子數(shù)22到29，42，44和58-70的元素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑共價(jià)附著的本發(fā)明抗體可以用熒光金屬離子標(biāo)記，所述熒光金屬離子包括鑭系金屬，特別是La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu(例如152Eu)，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，和Lu。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑共價(jià)附著的本發(fā)明抗體可以用包括Mo，Bi，Si和W原子的含有重金屬的報(bào)道分子標(biāo)記。
放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體不僅可以用于殺死其結(jié)合的細(xì)胞，還可以用于殺死相鄰細(xì)胞。例如，TR7的表達(dá)不是在腫瘤的所有細(xì)胞上遍在。然而，因?yàn)槟承┓派湫运プ兊哪芰靠梢猿^(guò)細(xì)胞直徑，因此放射標(biāo)記的本發(fā)明抗體可用于殺死不表達(dá)TR7的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞，但細(xì)胞附近的表達(dá)TR7的細(xì)胞也被殺死了。
細(xì)胞毒素或胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何制劑。實(shí)施例包括但非限于paclitaxol，細(xì)胞松弛素B，短桿菌肽D，溴化乙啶，吐根堿，絲裂霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，鬼臼噻吩甙，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，秋水仙素，阿霉素，道諾霉素，二羥基炭疽菌素dione，米托蒽醌，光神霉素，放線菌素D，1-脫氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，胸苷激酶，核酸內(nèi)切酶，RNAse，和嘌呤霉素及其片段，變體或類似物。治療劑包括但非限于抗代謝物(例如氨甲蝶呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(例如二氯甲基二乙酸(mechlorethamine)，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亞硝基脲氮芥(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)，二甲磺酸丁酯，二溴甘露醇，鏈脲菌素，絲裂霉素C，和順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑，蒽環(huán)霉素(蒽環(huán)類)(例如道諾霉素(從前的道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放線菌素(從前的放線菌素)，博來(lái)霉素，光神霉素和氨茴霉素(AMC))，及抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。
可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)標(biāo)記本發(fā)明的抗體。這種技術(shù)包括但非限于使用雙功能綴合劑(見例如美國(guó)專利Nos.5,756,065；5,714,711；5,696,239；5,652,371；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560和5,808,003所述；所述文獻(xiàn)均以全文并入?yún)⒖?及直接偶聯(lián)反應(yīng)(例如Bolton-Hunter和氯胺-T反應(yīng))。
綴合的本發(fā)明的抗體可以用于修飾給定的生物應(yīng)答，治療劑或藥物部分不必受傳統(tǒng)化學(xué)治療劑的限制。例如，所述藥物部分可以是具有所需生物學(xué)活性的一種蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可以包括但非限于例如毒素，例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，α毒素，假單胞菌外毒素，或白喉毒素，皂草素，木鱉子皂苷，白樹素(gelonin)，美洲商陸抗病毒蛋白，α-八疊球菌和霍亂毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子，α-干擾素，β-干擾素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子，組織纖溶酶原激活物，凋亡介質(zhì)例如TNF-α，TNF-β，AIMI(見，國(guó)際公開No.WO 97/35899)，AIM II(見國(guó)際公開No.WO 97/34911)，F(xiàn)as配體(Takahashi等，Int.Immunol.61567-1574(1994))，VEGI(見國(guó)際公開No.WO 99/23105)，血栓形成劑或抗血管發(fā)生劑，例如制管張素或血管抑制素(endostatin)；或者生物應(yīng)答修飾因子例如淋巴因子，白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，或其它生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的抗體(包括抗體片段或其變體)還可以附于固體支持物，其對(duì)于免疫分析或靶抗原純化特別有用。這種固體支持物包括但非限于玻璃，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
將治療部分綴合于抗體的技術(shù)是熟知的，見例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(編輯)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“AntibodiesFor Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(編輯)，pp.623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，Monoclonal Antibodies‘84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(eds.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編輯)，pp.303-16(學(xué)術(shù)出版社1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates”，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
或者，本發(fā)明的抗體可以綴合于第二抗體形成抗體異源綴合物，如Segal在美國(guó)專利No.4,676,980中所述，以其全文并入?yún)⒖肌?br> 單獨(dú)或與胞毒因子和/或細(xì)胞因子組合施用的有或無(wú)治療部分綴合于其的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的其它分子)可以用作一種治療劑。
本發(fā)明抗體的應(yīng)用本發(fā)明的抗體可以用于例如但非限于包括在體外和體內(nèi)診斷和治療方法中純化，檢測(cè)及定向本發(fā)明的多肽。例如，抗體可用于免疫分析中以定性和定量測(cè)定生物學(xué)樣品中TR7多肽水平。見例如Harlow等，AntibodiesAlaboratory Manual(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第2版，1988)(在此全文并入?yún)⒖?。
免疫分型本發(fā)明的抗體可以用于對(duì)細(xì)胞系和生物學(xué)樣品進(jìn)行免疫分型(見例如實(shí)施例3)。本發(fā)明基因的翻譯產(chǎn)物可用作細(xì)胞特異性標(biāo)記，或更特別地用作細(xì)胞標(biāo)記，其在特殊類型細(xì)胞尤其腫瘤和癌細(xì)胞的分化和/或成熟的不同階段差異表達(dá)。抗一個(gè)特異表位或表位組合的單克隆抗體可以篩選表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞群?？梢岳枚喾N技術(shù)使用單克隆抗體篩選表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞群，包括使用抗體包被磁珠磁性分離，用附于固體基質(zhì)(即平板)的抗體“淘選(panning)”，及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(見例如美國(guó)專利5985660；及Morrison等，Cell 96737-49(1999))。
這些技術(shù)可篩選特殊的細(xì)胞群，如可以發(fā)現(xiàn)血液惡性腫瘤細(xì)胞(即急性白血病患者中的最小存活疾病(MRD))，及移植中的“非自身”細(xì)胞以預(yù)防移植物抗宿主疾病(GVHD)?；蛘?，這些技術(shù)可以篩選能增殖和/或分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，可在人臍帶血中發(fā)現(xiàn)。
表位作圖本發(fā)明提供了可用于鑒別TR7多肽表位的抗體(包括抗體片段或其變體)。特別地，本發(fā)明的抗體可用于鑒別以下多肽的表位人TR7多肽(例如，SEQ ID NO3)或在人體細(xì)胞上表達(dá)的TR7多肽；小鼠TR7或在小鼠細(xì)胞上表達(dá)的TR7多肽；大鼠TR7多肽受體或在大鼠細(xì)胞上表達(dá)的TR7多肽；或者猴TR7多肽或在猴細(xì)胞上表達(dá)的TR7多肽，使用本發(fā)明所述和本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)進(jìn)行。作為表位的片段可以通過(guò)任何常規(guī)方式產(chǎn)生(見例如Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，另外見于美國(guó)專利No.4,711,211)。鑒別的本發(fā)明抗體的表位可例如用作疫苗候選物，即免疫一個(gè)個(gè)體以激發(fā)抗天然發(fā)生形式的TR7多肽的抗體。
抗體的診斷性應(yīng)用特異性結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明標(biāo)記的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)可以用于診斷目的以檢測(cè)，診斷，預(yù)后或監(jiān)測(cè)疾病和/或紊亂。在特異的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明標(biāo)記的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以用于診斷目的以檢測(cè)，診斷，預(yù)后或監(jiān)測(cè)與TR7異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病和/或紊亂。
TR7在原代細(xì)胞及組織樣品上表達(dá)，其包括T細(xì)胞(靜止和激活的T細(xì)胞，例如用重組IL-2激活的T細(xì)胞)，靜止和激活的單核細(xì)胞，例如用GM-CSF激活的單核細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。TR7也在一些細(xì)胞系上表達(dá)，所述細(xì)胞系包括但非限于人纖維肉瘤細(xì)胞系HT-1080，人宮頸癌細(xì)胞系ME-180和HeLa，人惡性黑素瘤細(xì)胞系RPMI-7951，SK-MEL-1和G361，成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat，人子宮癌細(xì)胞系SK-UT-1和RL-95，人肺癌細(xì)胞系SK-MES-1，人結(jié)腸癌細(xì)胞系，LS174T，HT29，和HCT116，su.86.86和CFPAC胰腺癌細(xì)胞系，人卵巢癌細(xì)胞系TOV21G，及人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2和SNU449，及人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH。用本發(fā)明的抗體組合物可以診斷或治療組織癌癥以及其它疾病，所述組織相應(yīng)于這些細(xì)胞系衍生自其中的組織。
本發(fā)明提供了檢測(cè)TR7多肽表達(dá)的方法，包括(a)使用免疫特異性結(jié)合TR7的一或多種本發(fā)明抗體分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中TR7多肽的表達(dá)；(b)將生物學(xué)樣品中TR7多肽的水平與TR7多肽標(biāo)準(zhǔn)水平(例如正常生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平)進(jìn)行對(duì)比。
本發(fā)明提供了檢測(cè)TR7多肽異常表達(dá)的方法，包括(a)使用免疫特異性結(jié)合TR7多肽的一或多種本發(fā)明抗體分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中TR7多肽的表達(dá)；(b)將生物學(xué)樣品中TR7多肽的水平與TR7多肽標(biāo)準(zhǔn)水平(例如正常生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平)進(jìn)行對(duì)比，從而分析的TR7多肽水平與標(biāo)準(zhǔn)TR7多肽水平相比提高或降低，表明異常表達(dá)。
“生物學(xué)樣品”是指得自個(gè)體，體液，機(jī)體組織，機(jī)體細(xì)胞，細(xì)胞系，組織培養(yǎng)物，或含有TR7多肽蛋白或mRNA的其它來(lái)源的任何液體和/或細(xì)胞。體液包括但非限于血清，血漿，尿液，滑液，腦脊液，唾液和粘液。組織樣品可以取自機(jī)體的任何組織。組織樣品還可以得自尸檢。本領(lǐng)域熟知從哺乳動(dòng)物中獲得活檢組織和體液的方法。在所述生物樣品包括mRNA時(shí)，活檢組織是優(yōu)選的來(lái)源。
特異性結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)可以用于診斷目的以檢測(cè)，診斷，預(yù)后或監(jiān)測(cè)癌癥或其它過(guò)度增殖性紊亂，和/或與其相關(guān)的疾病或狀態(tài)。本發(fā)明提供了檢測(cè)TR7多肽異常表達(dá)的方法，包括(a)使用免疫特異性結(jié)合TR7多肽的一或多種本發(fā)明抗體分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中TR7多肽的表達(dá)；(b)將TR7多肽水平與TR7多肽標(biāo)準(zhǔn)水平(例如正常生物學(xué)樣品中的)進(jìn)行對(duì)比，從而分析的TR7多肽水平與標(biāo)準(zhǔn)TR7多肽水平相比提高或降低，表示存在癌癥和/或過(guò)度增殖性紊亂。
TRAIL已經(jīng)示出在一些情況中選擇性殺死腫瘤細(xì)胞(見例如，Oncogene 193363-71(2000))。這也許是TRAIL受體在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞上的表達(dá)不同所致。因此，在特異性實(shí)施方案中，分析的TR7多肽水平提高表明存在癌癥和/或過(guò)度增殖性紊亂。
其它報(bào)道提示腫瘤細(xì)胞表達(dá)TR7水平降低也許是腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的機(jī)制(見例如，Int.J.Oncol.16917-25(2000))。因此，在其它特異實(shí)施方案中，分析的TR7多肽水平降低表明存在癌癥和/或過(guò)度增殖性紊亂。
本發(fā)明的一方面是檢測(cè)及診斷與動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物更優(yōu)選人體內(nèi)TR7多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷包括a)為對(duì)象施用(例如非腸道，皮下或腹膜內(nèi)施用)有效量的免疫特異性結(jié)合TR7多肽的標(biāo)記的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)；b)施用后等待一段時(shí)間，使標(biāo)記的抗體優(yōu)先在所述對(duì)象的TR7多肽表達(dá)部位濃縮(并將未結(jié)合的標(biāo)記的分子從背景水平中清除)；c)確定背景水平；及d)檢測(cè)所述對(duì)象中標(biāo)記的抗體，這樣檢測(cè)標(biāo)記的抗體或其片段高于背景水平及高于或低于在沒(méi)有疾病或紊亂的人體內(nèi)觀測(cè)到的水平，表明所述對(duì)象患有與TR7多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂。背景水平可以通過(guò)多種方法確定，包括將檢測(cè)的標(biāo)記的分子數(shù)量與針對(duì)特定系統(tǒng)預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)值對(duì)比而確定。
本領(lǐng)域知曉所述對(duì)象的大小和所用的成像系統(tǒng)決定產(chǎn)生診斷性成像需要的成像部分的數(shù)量。在放射性同位素部分的情況下，針對(duì)人，注射的放射活性物質(zhì)數(shù)量通常為大約5到20毫居里范圍的99Tc。然后所述標(biāo)記的抗體優(yōu)先在含有特異蛋白質(zhì)的細(xì)胞特定區(qū)域積累。體內(nèi)腫瘤成像如S.W.Burchiel等，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments”(Tumor ImagingTheRadiochemical Detection of Cancer，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編輯，Masson出版公司(1982)所述。
根據(jù)一些變量，包括所用標(biāo)記的類型和施用模式，施用后間隔一段時(shí)間以使標(biāo)記的分子優(yōu)先在對(duì)象的部位積累并將未結(jié)合的標(biāo)記分子從背景中清除，所述間隔為6-48小時(shí)，或6-24小時(shí)或6-12小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用后的時(shí)間間隔為5-20天或5-10天。
在一個(gè)實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)疾病或紊亂是通過(guò)重復(fù)診斷疾病和紊亂的方法進(jìn)行的，例如，在初次診斷一個(gè)月后，在初次診斷六個(gè)月后，在初次診斷一年后等重復(fù)進(jìn)行。
標(biāo)記分子的存在可以通過(guò)用本領(lǐng)域已知的體內(nèi)掃描方法在患者體內(nèi)檢測(cè)。這些方法依賴于所用標(biāo)記的類型。技術(shù)人員能確定檢測(cè)特殊標(biāo)記的合適方法?？梢杂糜诒景l(fā)明診斷方法中的方法和設(shè)備包括但非限于計(jì)算機(jī)X線斷層攝影(CT)，整體掃描如正電子發(fā)射X線斷層攝影(PET)，磁共振成像(MRI)，及超聲波掃描術(shù)。
在特異的實(shí)施方案中，所述分子是用放射性同位素標(biāo)記的，并使用輻射響應(yīng)外科設(shè)備在患者體內(nèi)檢測(cè)(Thurston等，美國(guó)專利No.5,441,050)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子是用一種熒光化合物標(biāo)記的，并用熒光響應(yīng)掃描設(shè)備在患者體內(nèi)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子是用一種正電子發(fā)射金屬標(biāo)記的，并用正電子發(fā)射X線斷層攝影在患者體內(nèi)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子是用一種順磁性標(biāo)記標(biāo)記的，并用磁共振成像(MRI)在患者體內(nèi)檢測(cè)。
抗體的治療應(yīng)用免疫特異性結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明的一或多種抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以作為治療劑局部或系統(tǒng)使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于抗體的治療方法，包括將本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)施用于動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人，以預(yù)防或治療一或多種所述疾病，紊亂或狀態(tài)。本發(fā)明的治療化合物包括但非限于本發(fā)明的抗體及編碼本發(fā)明抗體(及抗獨(dú)特型抗體)的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于治療，緩解或預(yù)防疾病，紊亂或狀態(tài)，包括但非限于本文所述的任一種或多種疾病，紊亂或狀態(tài)。疾病，紊亂或狀態(tài)的治療和/或預(yù)防包括但非限于減輕與那些疾病相關(guān)的征狀。本發(fā)明的抗體可以在本領(lǐng)域已知的或本發(fā)明所述的藥劑學(xué)可接受的組合物中提供。在某些實(shí)施方案中，在以下實(shí)施例中詳細(xì)描述的本發(fā)明抗體的性質(zhì)使所述抗體是比先前所述的TR7結(jié)合抗體更好的治療劑。
抗體在治療癌癥中的應(yīng)用在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善癌癥。在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7多肽的本發(fā)明的抗體用于治療，預(yù)防活改善癌癥。在特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于抑制癌癥及其它相關(guān)紊亂的進(jìn)展或轉(zhuǎn)移。癌癥及相關(guān)紊亂包括但非限于結(jié)腸癌，宮頸癌，白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細(xì)胞性白血病，急性髓細(xì)胞性白血病(包括成髓細(xì)胞性白血病，早幼粒細(xì)胞性白血病，髓單核細(xì)胞性白血病，單核細(xì)胞性白血病及紅白血病))及慢性白血病(例如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)性白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病))，真性紅細(xì)胞增多，淋巴瘤(例如Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)，多發(fā)性骨髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血癥，重鏈病變，及固體腫瘤包括但非限于肉瘤和癌如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索癌，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤，滑膜肉瘤，間皮瘤，Ewing′s腫瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳突癌，乳突腺癌，囊腺癌，骨髓癌，原發(fā)性支氣管癌，腎細(xì)胞癌，肝細(xì)胞癌，膽管癌，絨毛膜癌，精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，Wilms′腫瘤，睪丸腫瘤，肺癌，小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，上皮細(xì)胞癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室鼓膜瘤，松果體瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽神經(jīng)瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腦膜瘤(menangioma)，黑素瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，和眼癌。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善腎癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善腎癌。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善黑素瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善黑素瘤在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善肝癌如肝細(xì)胞癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善肝癌如肝細(xì)胞癌。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌如成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌如成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善多發(fā)性骨髓瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善多發(fā)性骨髓瘤。
在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善非Hodgkin’s淋巴瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善非Hodgkin’s淋巴瘤。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善前列腺癌和前列腺轉(zhuǎn)移癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善前列腺癌和前列腺轉(zhuǎn)移癌。
與本發(fā)明一致，已經(jīng)證實(shí)TRAIL受體TR7在肺癌組織，膀胱癌組織和卵巢癌組織上的表達(dá)。另外，與本發(fā)明一致，已經(jīng)證實(shí)TRAIL受體TR7在原代乳腺，結(jié)腸，肺和胃癌組織上表達(dá)。
因此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療肺癌，包括但非限于非小細(xì)胞肺癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療肺癌，包括但非限于非小細(xì)胞肺癌。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療膀胱癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療膀胱癌。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療卵巢癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療卵巢癌。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療乳腺癌及已經(jīng)轉(zhuǎn)移的乳腺癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療乳腺癌及已經(jīng)轉(zhuǎn)移的乳腺癌。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療結(jié)腸癌或結(jié)腸直腸癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療結(jié)腸癌或結(jié)腸直腸癌。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療胃癌。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療胃癌。
在其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善腎癌，黑素瘤，胰腺癌及肝癌如肝細(xì)胞瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善腎癌，黑素瘤，胰腺癌及肝癌如肝細(xì)胞瘤。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善白血病。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善白血病。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善骨髓發(fā)育不良綜合征。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善骨髓發(fā)育不良綜合征。
在另外的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善骨癌包括但非限于Ewing’s肉瘤和骨肉瘤。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體用于治療，預(yù)防或改善骨癌包括但非限于Ewing’s肉瘤和骨肉瘤。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合TR7并任選地刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的本發(fā)明抗體用于治療與細(xì)胞存活力提高或抑制凋亡相關(guān)的疾病和/或紊亂，包括癌癥(如濾泡淋巴瘤，p53突變癌，激素依賴性腫瘤，包括但非限于結(jié)腸癌，心肌瘤(cardiac tumors)，胰腺癌，黑素瘤，眼癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，肺癌，腸癌，睪丸癌，胃癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，內(nèi)皮瘤，成骨細(xì)胞瘤，破骨細(xì)胞瘤，骨肉瘤，軟骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫紊亂(如多發(fā)性硬化，Siogren’s綜合征，Hashimoto’s甲狀腺炎，膽囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡及免疫相關(guān)的血管球性腎炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，及病毒感染(如皰疹病毒，痘病毒和腺病毒)，移植物抗宿主病變，急性移植物排斥及慢性移植物排斥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物用于抑制癌癥的生長(zhǎng)，進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移，特別是上述那些。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物在體外或體內(nèi)均是非肝毒性的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于治療，預(yù)防或改善上述癌癥的本發(fā)明抗體特異性和/或優(yōu)先結(jié)合TR7。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于治療，預(yù)防或改善上述癌癥的本發(fā)明抗體特異性和/或優(yōu)先結(jié)合TR7和TR4。
抗體的其它治療性應(yīng)用在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制TR7表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死其的方法和組合物，包括或由為其中需要抑制TR7表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死TR7表達(dá)細(xì)胞的動(dòng)物施用有效抑制TR7表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死TR7表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量的本發(fā)明抗體或抗體組合物(例如本發(fā)明的抗體片段和變體，抗體混合物，抗體多聚物，融合蛋白，及抗體與其它治療化合物如化療劑的組合)組成。
一方面，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)通過(guò)TNF家族配體(尤其是TRAIL(SEQ ID NO72))誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，其包括對(duì)表達(dá)TR7多肽的細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選能誘導(dǎo)或提高TR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的一種興奮性的抗TR7抗體。另一方面，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)通過(guò)TNF家族配體(尤其是TRAIL(SEQ ID NO72))誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，其包括對(duì)表達(dá)TR7和/或TR4多肽的細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選能誘導(dǎo)或提高TR7和/或TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的特異性結(jié)合TR7和TR4的一種興奮性的抗體。優(yōu)選地，TR7和/或TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)本發(fā)明抗體提高或誘導(dǎo)以治療呈現(xiàn)凋亡降低或細(xì)胞因子和粘附分子表達(dá)降低的疾病。
一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)TR7和/或TR4表達(dá)細(xì)胞凋亡的方法，包括為表達(dá)TR7和/或TR4的細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選興奮性抗TR7，和/或抗TR7和TR4抗體(即免疫特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體)，所述抗體能誘導(dǎo)或提高TRAIL受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，特別是TR7和TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制TNF家族配體(尤其是TRAIL(SEQ ID NO72))誘導(dǎo)的凋亡的方法，包括為表達(dá)TR7多肽的細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選能降低TR7介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的一種拮抗性的抗TR7抗體。另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制TNF家族配體(尤其是TRAIL(SEQ ID NO72))誘導(dǎo)的凋亡的方法，包括為表達(dá)TR7和/或TR4多肽的細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選能降低TR7和/或TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的特異性結(jié)合TR7和TR4的一種拮抗性抗體。優(yōu)選地，降低TR7和/或TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)以治療表現(xiàn)為凋亡或NFκB表達(dá)增加的疾病。
一方面，本發(fā)明涉及抑制TR7和/或TR4表達(dá)細(xì)胞凋亡的一種方法，包括為表達(dá)TR7和/或TR4細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明抗體，優(yōu)選拮抗性抗TR7，和/或抗TR7和TR4抗體(即免疫特異性結(jié)合TR7和TR4的抗體)，所述抗體能降低TRAIL受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，尤其是TR7和TR4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。
TR7“興奮劑”是指能增強(qiáng)或加強(qiáng)TRAIL受體介導(dǎo)的凋亡的天然發(fā)生的及合成的化合物。TR7“拮抗劑”是指能抑制TRAIL受體介導(dǎo)的凋亡的天然發(fā)生的及合成的化合物。本發(fā)明的任何候選“興奮劑”或“拮抗劑”是否能分別增強(qiáng)或抑制細(xì)胞凋亡可以使用本領(lǐng)域已知的TNF家族配體/受體細(xì)胞應(yīng)答分析而確定，包括在以下詳細(xì)描述的那些方法。
本發(fā)明的抗體可以用于治療，改善或預(yù)防與TR7或TR7配體異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病，紊亂或狀態(tài)，包括但非限于在此所述那些疾病，紊亂或狀態(tài)。治療和/或預(yù)防與異常TR7表達(dá)和/活性或異常TR7配體表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病，紊亂或狀態(tài)包括但非限于那些疾病，紊亂或狀態(tài)相關(guān)的減輕的癥狀。本發(fā)明的抗體可以以藥劑學(xué)可接受的組合物形式提供，如本領(lǐng)域已知或如本發(fā)明所述。
另外，激活TRAIL受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性(例如在TRAIL受體表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡)的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善在此所述疾病或紊亂，特別是癌癥及其它過(guò)度增殖性紊亂。這些抗體可以加強(qiáng)或激活TRAIL受體的所有或一部分生物學(xué)活性，例如通過(guò)誘導(dǎo)TRAIL受體構(gòu)象變化而進(jìn)行。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善疾病或紊亂，所述抗體使TR7活性在無(wú)所述抗體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體組合，抗體片段組合，抗體變體組合，或抗體，抗體片段和/或抗體變體的組合施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善疾病或紊亂，所述組合使TR7活性在無(wú)所述抗體或抗體片段和/或抗體變體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
另外，激活TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性(例如在TR7表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。這些抗體可以加強(qiáng)或激活TRAIL受體的所有或一部分生物學(xué)活性，例如通過(guò)誘導(dǎo)TRAIL受體構(gòu)象變化而進(jìn)行。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述抗體使TR7活性在無(wú)所述抗體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體組合，抗體片段組合，抗體變體組合，或抗體，抗體片段和/或抗體變體的組合施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述組合使TR7活性在無(wú)所述抗體或抗體片段和/或抗體變體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
作為TRAIL受體優(yōu)選TR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的興奮劑或拮抗劑的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。例如，全部或部分模擬TRAIL與TR7結(jié)合作用的本發(fā)明抗體，TR7興奮劑，可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。再例如，阻斷或阻止TR7與其配體之間的相互作用或者抑制，降低或阻止通過(guò)TR7的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明抗體可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。不阻止TR7與其配體結(jié)合但抑制或下調(diào)TR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明抗體可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。本發(fā)明抗體增強(qiáng)，抑制，上調(diào)或下調(diào)TR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力可以通過(guò)在此所述技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)確定。例如，TRAIL誘導(dǎo)的受體激活和信號(hào)分子的激活可以通過(guò)免疫沉淀隨后進(jìn)行Western印跡分析檢測(cè)銜接(adapter)蛋白如FADD和TRADD與TR7的關(guān)系而確定(例如本發(fā)明所述)。
另外，激活TR7介導(dǎo)的生物學(xué)活性(例如在TR7表達(dá)細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡)的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂。這些抗體可以加強(qiáng)或激活TRAIL受體的所有或一部分生物學(xué)活性，例如通過(guò)誘導(dǎo)TRAIL受體構(gòu)象變化而進(jìn)行。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述抗體使TR7活性在無(wú)所述抗體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體組合，抗體片段組合，抗體變體組合，或抗體，抗體片段和/或抗體變體的組合施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，缺乏TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或缺乏TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述組合使TR7活性在無(wú)所述抗體或抗體片段和/或抗體變體施用時(shí)提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％.60％，65％，70％.75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少兩倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，全部或部分抑制或下調(diào)TR7活性(例如刺激凋亡)的本發(fā)明抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，過(guò)度TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或過(guò)度TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述抗體使TR7活性在無(wú)所述抗體施用時(shí)抑制或下調(diào)至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％或至少10％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體組合，抗體片段組合，抗體變體組合，或抗體，抗體片段和/或抗體變體的組合施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與TR7異常表達(dá)，過(guò)度TR7功能，TR7配體異常表達(dá)，或過(guò)度TR7配體功能相關(guān)的疾病或紊亂，所述組合使TR7活性在無(wú)所述抗體，抗體片段和/或抗體變體施用時(shí)抑制或下調(diào)至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％，45％，40％，45％，35％，30％，25％，20％或至少10％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療或藥物組合物施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)的疾病或紊亂，包括但非限于AIDS，神經(jīng)退行性紊亂(如阿耳茨海默病，Parkinson’s病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化，色素性視網(wǎng)膜炎，小腦退化)，骨髓發(fā)育不良綜合征(如再生障礙性貧血)，缺血性損傷(如由心梗，休克和再灌注損傷引起的)，毒素導(dǎo)致的肝病(如由乙醇導(dǎo)致的)，膿毒性休克，惡病質(zhì)和厭食。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的治療或藥物組合物施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善骨髓病變，例如再生障礙性貧血和骨髓發(fā)育不良綜合征。
還可以施用本發(fā)明的治療或藥物組合物以治療，預(yù)防或改善器官排斥或移植物抗宿主疾病(GVHD)和/或與之相關(guān)的狀態(tài)。宿主免疫細(xì)胞通過(guò)免疫應(yīng)答破壞移植的組織而發(fā)生器官排斥。相似地，免疫應(yīng)答還包含在GVHD中，但在這種情況中，外源移植的免疫細(xì)胞破壞宿主組織。由免疫細(xì)胞效應(yīng)功能誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是凋亡。因此，施用本發(fā)明抗體(例如抑制凋亡的那些抗體)在預(yù)防器官排斥或GVHD時(shí)可以是一種有效療法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的治療或藥物組合物施用于動(dòng)物以治療，預(yù)防或改善感染性疾病。感染性疾病包括與酵母，真菌，病毒和細(xì)菌感染相關(guān)的疾病。與可以根據(jù)本發(fā)明治療或預(yù)防的病毒感染相關(guān)的病毒包括但非限于逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如I型和II型人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))，皰疹病毒(例如I型和II型單純皰疹病毒(HSV)，Epstein-Barr病毒，HHV6-HHV8，和巨細(xì)胞病毒)，沙粒病毒(例如拉沙熱病毒)，副粘病毒(例如麻疹病毒，人呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，和肺病毒)，腺病毒，布尼奧羅病毒(bunyavirus)(例如漢坦病毒)，冠狀病毒，線狀病毒(例如Ebola病毒)，黃病毒(例如丙肝病毒(HCV)，黃熱病病毒，和日本腦炎病毒)，嗜肝DNA病毒(例如乙肝病毒(HBV))，正粘病毒(例如流感病毒A，B和C)，乳多空病毒(例如乳頭瘤病毒)，小核糖核酸病毒(例如鼻病毒，腸道病毒和甲肝病毒)，痘病毒，呼腸弧病毒(例如輪狀病毒)，外衣病毒(例如風(fēng)疹病毒)，棒狀病毒(例如狂犬病毒)。和細(xì)菌感染相關(guān)的微生物病原包括但非限于化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoea)，腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)，白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，破傷風(fēng)桿菌(Clostridiumtetani)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種(Klebsiellaozaenae)，克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種(Klebsiella rhinoscleromotis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，大腸桿菌(Escherichia coli)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，胚胎彎曲桿菌(弧菌)(Campylobacter(Vibrio)fetus)，空腸彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacter jejuni)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)，假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志賀氏(Shigella flexneri)，索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，梅毒密螺旋體(Treponemapallidum)，極細(xì)密螺旋體(Treponema pertenue)，Treponemacarateneum，奮森氏疏螺旋體(Borrelia vincentii)，布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohemorrhagiae)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，Toxoplasma gondii，Pneumocystis carinii，土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)，流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)，豬布魯氏菌(Brucella suis)，馬爾他布魯氏菌(Brucella melitensis)，枝原體屬(Mycoplasma spp.)，普氏立克次氏體(Rickettsia prowazeki)，恙蟲熱立克次氏體(Rickettsia tsutsugumushi)，衣原體屬(Chlamydiaspp.)，和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物用于治療，預(yù)防或改善與凋亡提高相關(guān)的疾病，包括但非限于AIDS，神經(jīng)退行性紊亂(如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化，色素性視網(wǎng)膜炎，小腦退化)，腦腫瘤或朊病毒相關(guān)疾病)；自身免疫紊亂(如多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Sjogren’s綜合征，Hashimoto’s甲狀腺炎，膽囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡及免疫相關(guān)的血管球性腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，骨髓發(fā)育不良綜合征(如再生障礙性貧血)，移植物抗宿主病，缺血性損傷(如由心梗，休克和再灌注損傷引起的)，肝臟損傷(如肝炎相關(guān)的肝臟損傷，缺血/再灌注損傷，膽固醇沉著病(cholestosis)(膽管損傷)和肝癌)；毒素誘導(dǎo)的肝病(如乙醇所致)，膿毒性休克，惡病質(zhì)和厭食。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗TR7拮抗性抗體阻止TRAIL結(jié)合抗體結(jié)合的TRAIL受體，但不轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生凋亡的生物信號(hào)，可用于治療上述疾病和紊亂。
許多與HIV相關(guān)的病理學(xué)是由凋亡介導(dǎo)的，包括HIV誘導(dǎo)的腎病及HIV腦炎。因此，在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體優(yōu)選拮抗性抗TR7抗體用于治療AIDS及與AIDS相關(guān)的病變。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明抗體在HIV感染的患者中降低TRAIL介導(dǎo)的T細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體尤其拮抗性抗TR7抗體與T細(xì)胞凋亡的其它抑制劑組合施用。例如，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡與HIV個(gè)體的T細(xì)胞喪失有關(guān)(Katsikis等，J.Exp.Med.1812029-2036，1995)。因此，對(duì)Fas配體介導(dǎo)的和TRAIL介導(dǎo)的T細(xì)胞死亡均敏感的患者可以既可用阻斷TRAIL/TR7相互作用的制劑治療，也可以用阻斷Fas配體/Fas相互作用的制劑治療。阻斷Fas配體與Fas結(jié)合的合適制劑包括但非限于可溶的Fas多肽；可溶的Fas多肽的多聚體形式(例如sFas/Fc的二聚體)；結(jié)合Fas但不轉(zhuǎn)導(dǎo)引起凋亡的生物信號(hào)的抗Fas抗體；阻斷Fas配體結(jié)合Fas的抗Fas配體抗體；及結(jié)合Fas但不轉(zhuǎn)導(dǎo)引起凋亡的生物信號(hào)的Fas配體突變蛋白。優(yōu)選地，根據(jù)這種方法應(yīng)用的抗體是單克隆抗體。阻斷Fas配體/Fas相互作用的合適制劑包括阻斷抗Fas單克隆抗體的制劑，例如國(guó)際申請(qǐng)公開WO95/10540所描述，在此并入?yún)⒖肌?br> 可以與本發(fā)明抗體施用的也阻斷TRAIL與TR7結(jié)合的合適制劑包括但非限于可溶的TR7多肽(例如可溶形式的OPG，TR5(國(guó)際申請(qǐng)公開WO98/30693)；可溶形式的TR7(國(guó)際公開WO98/32856)；TR4/DR5(國(guó)際申請(qǐng)公開WO98/41629)；及TR10(國(guó)際申請(qǐng)公開WO98/54202))；多聚體形式的可溶TR7多肽；及結(jié)合TR7但不轉(zhuǎn)導(dǎo)引起凋亡的生物信號(hào)的TR7抗體，阻斷TRAIL與一或多個(gè)TRAIL受體結(jié)合的抗TRAIL抗體，及結(jié)合TRAIL受體但不轉(zhuǎn)導(dǎo)引起凋亡的生物信號(hào)的TRAIL的突變蛋白。
在異源移植的排斥中，受體動(dòng)物的免疫系統(tǒng)未預(yù)先引發(fā)應(yīng)答，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)大部分只由環(huán)境抗原引發(fā)。來(lái)自相同物種其它成員的組織未以例如病毒和細(xì)菌呈遞的相同方式呈遞。在異源移植排斥情況中，設(shè)計(jì)免疫抑制方案以防止免疫系統(tǒng)達(dá)到效應(yīng)狀態(tài)。然而，異種移植排斥的免疫情況比異源移植更類似于疾病復(fù)發(fā)。在疾病復(fù)發(fā)的情況中，免疫系統(tǒng)已經(jīng)激活，由天然小島(islet)細(xì)胞破壞而證實(shí)。因此，在疾病復(fù)發(fā)情況中，免疫系統(tǒng)已經(jīng)處于效應(yīng)狀態(tài)。本發(fā)明的抗體(例如本發(fā)明的興奮性抗體)能抑制對(duì)異源移植和異種移植的免疫應(yīng)答，因?yàn)榧せ畹暮头只癁樾?yīng)細(xì)胞的淋巴細(xì)胞表達(dá)TR7多肽，從而對(duì)增強(qiáng)凋亡的化合物敏感。因此，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生具有免疫特權(quán)的組織。本發(fā)明的拮抗劑進(jìn)一步可用于治療炎癥性腸道疾病。
本發(fā)明的抗體和抗體組合物可用于治療炎癥性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，銀屑癬，敗血病及炎癥性腸道疾病。
另外，由于成淋巴細(xì)胞表達(dá)TR7多肽，因此本發(fā)明的抗體和抗體組合物可用于治療這種形式的癌癥。另外，本發(fā)明的抗體和抗體組合物可用于治療多種慢性和急性形式的炎癥，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，銀屑癬，敗血病和炎癥性腸道疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物可用于治療心血管疾病，包括周圍動(dòng)脈疾病如肢體缺血。
心血管疾病包括心血管畸形，如動(dòng)脈-動(dòng)脈瘺，動(dòng)脈-靜脈瘺，腦動(dòng)靜脈畸形，先天性心臟病，肺動(dòng)脈閉鎖及Scimitar綜合征。先天性心臟病包括主動(dòng)脈縮窄，cor triatriatum，冠狀動(dòng)脈異常，十字形心，右位心，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，Ebstein’s異常，Eisenmenger復(fù)合征，左心發(fā)育不全綜合征，左位心，法樂(lè)(fallot)四聯(lián)癥，大血管錯(cuò)位，右心室雙出口，三尖瓣閉鎖，持續(xù)軀干動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，及心間隔缺損如主動(dòng)脈肺動(dòng)脈間隔缺損，心內(nèi)膜墊缺損，Lutembacher’s綜合征，法樂(lè)三聯(lián)癥，心室間隔缺損。
心血管疾病還包括心臟病，如心律不齊，類癌瘤心臟病，高心輸出量，低心輸出量，心包填塞，心內(nèi)膜炎(包括細(xì)菌性)，心動(dòng)脈瘤，心搏停止，充血性心衰，充血性心肌病，發(fā)作性呼吸困難，心源性水腫，心肌肥大，充血性心肌病，左心室肥大，右心室肥大，心肌梗塞后破裂，心室間隔破裂，心瓣膜病，心肌病，心肌缺血，心包積液(pericardiac effusion)，心包炎(包括縮窄性心包炎和結(jié)核性心包炎)，心包積氣，心包膜切開術(shù)后綜合征，肺心病，風(fēng)濕性心臟病，心室機(jī)能不良，充血，妊娠心血管復(fù)合征，Scimitar綜合征，梅毒心血管疾病，結(jié)核性心血管疾病。
心律不齊包括竇性心律不齊，心房纖維性顫動(dòng)，心房撲動(dòng)，心動(dòng)過(guò)緩，期前收縮，Adams-Stokes綜合征，束支傳導(dǎo)阻滯，竇房阻滯，長(zhǎng)QT綜合征，并行收縮，Lown-Ganong-Levine綜合征，Mahaim型預(yù)激綜合征，Wolff-Parkinson-White綜合征，病態(tài)竇房結(jié)綜合征，心動(dòng)過(guò)速，及心室顫動(dòng)。心動(dòng)過(guò)速包括陣發(fā)性心動(dòng)過(guò)速，室上性心動(dòng)過(guò)速，心室自身節(jié)律加速，房室結(jié)再活動(dòng)心動(dòng)過(guò)速，異位房性心動(dòng)過(guò)速，異位房室交界處心動(dòng)過(guò)速，竇房結(jié)再活動(dòng)心動(dòng)過(guò)速，竇性心動(dòng)過(guò)速，尖端扭轉(zhuǎn)性室速及室性心動(dòng)過(guò)速。
心瓣膜病包括主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全，主動(dòng)脈瓣狹窄，心臟雜音，主動(dòng)脈瓣脫垂，二尖瓣脫垂，三尖瓣脫垂，二尖瓣關(guān)閉不全，二尖瓣狹窄，肺動(dòng)脈閉鎖，肺動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全，肺動(dòng)脈瓣狹窄，三尖瓣閉鎖，三尖瓣關(guān)閉不全及三尖瓣狹窄。
心肌病包括乙醇性心肌病，充血性心肌病，肥大性心肌病，主動(dòng)脈瓣下狹窄，肺動(dòng)脈瓣下狹窄，限制性心肌病，Chagas心肌病，心內(nèi)膜彈力纖維增生癥，心內(nèi)膜心肌纖維化，Kearns綜合征，心肌再灌注損傷，及心肌炎。
心肌缺血包括冠心病如心絞痛，冠狀動(dòng)脈瘤，冠狀動(dòng)脈硬化，冠狀動(dòng)脈血栓形成，冠狀動(dòng)脈痙攣，心肌梗塞及心肌頓抑。
心血管疾病還包括血管疾病如動(dòng)脈瘤(aneurysms)，血管發(fā)育異常，血管瘤，血管瘤桿菌，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber綜合征，Sturge-Weber綜合征，血管神經(jīng)性水腫，主動(dòng)脈病變，Takayasu’s主動(dòng)脈炎，Leriche’s綜合征，動(dòng)脈閉塞疾病，動(dòng)脈炎，動(dòng)脈內(nèi)膜炎(enarteritis)，多動(dòng)脈炎結(jié)節(jié)，腦血管疾病，糖尿病血管病變，糖尿病視網(wǎng)膜病，栓塞，血栓癥，紅斑性肢痛病，痔，肝靜脈閉塞疾病，高血壓，低血壓，缺血，周圍血管疾病，靜脈炎，肺靜脈閉塞疾病，Raynaud’s疾病，CREST綜合征，視網(wǎng)膜血管閉塞，Scimitar綜合征，上腔靜脈綜合征，毛細(xì)血管擴(kuò)張，共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張，遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張，精索靜脈曲張，靜脈曲張，靜脈曲張潰瘍，脈管炎及靜脈閉鎖不全(venous insufficiency)。
動(dòng)脈瘤包括分割性動(dòng)脈瘤，疑似動(dòng)脈瘤，感染性動(dòng)脈瘤，破裂的動(dòng)脈瘤，主動(dòng)脈瘤，腦動(dòng)脈瘤，冠狀動(dòng)脈瘤，心動(dòng)脈瘤和髂動(dòng)脈瘤。
動(dòng)脈閉塞疾病包括動(dòng)脈硬化，間歇性跛行，頸動(dòng)脈狹窄，纖維肌性發(fā)育不良，腸系膜血管閉塞，Moyamoya疾病，腎動(dòng)脈阻塞，視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞及閉塞性血栓血管炎。
腦血管疾病包括頸動(dòng)脈系疾病，腦血管淀粉樣血管病，腦動(dòng)脈瘤，腦缺氧，腦動(dòng)脈硬化，腦動(dòng)靜脈畸形，腦動(dòng)脈疾病，腦梗塞及腦血栓形成，頸動(dòng)脈血栓形成，竇血栓形成，Wallenberg’s綜合征，腦出血，硬膜外血腫，硬膜下血腫，subaraxhnoid出血，腦梗塞，腦缺血(包括瞬時(shí)腦缺血)，鎖骨下竊血癥狀，腦室周圍白質(zhì)軟化，血管性頭痛，簇發(fā)性頭痛，偏頭痛，及基底動(dòng)脈供血不足。
栓塞包括氣體栓塞，羊水栓塞，膽固醇栓塞，藍(lán)趾綜合征，脂肪栓塞，肺栓塞及血栓性栓塞(thromoboembolism)。血栓形成包括冠脈血栓形成，肝靜脈血栓形成，視網(wǎng)膜靜脈閉塞，頸動(dòng)脈血栓形成，竇(sinus)血栓形成，Wallenberg’s綜合征及血栓性靜脈炎。
缺血包括腦缺血，缺血性大腸炎，腔隙綜合征(compartmentsyndromes)，前腔隙綜合征，心肌缺血，再灌注損傷及周圍肢體缺血。脈管炎包括主動(dòng)脈炎，動(dòng)脈炎，Behcet’s綜合征，Churg-Strauss綜合征，粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，閉塞性血栓脈管炎，超敏性脈管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，過(guò)敏性皮膚脈管炎及Wegener’s肉芽腫病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物用于治療血栓形成性微血管病。一個(gè)這種病是血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hematol.2471(1987)；Thompson等，Blood801890(1992))。TTP相關(guān)的死亡率增加已經(jīng)由美國(guó)疾病控制中心(U.S.Centers for Disease Control)報(bào)道(Torok等，Am.J.Hematol.5084(1995))。來(lái)自患有TTP患者(包括HIV+和HIV-患者)的血漿誘導(dǎo)人皮膚微血管起源而非大血管起源的人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(Laurence等，Blood 873245(1996))。TTP患者的血漿因此認(rèn)為含有一或多種直接或間接誘導(dǎo)凋亡的因子。如國(guó)際專利申請(qǐng)書WO97/01715所述(在此全文并入?yún)⒖?，TRAIL存在于TTP患者血清中，而且很可能在誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起作用。另一種血栓形成性微血管病是溶血性尿毒癥綜合征(HUS)(Moake，J.L.，Lancet，343393(1994))；Melnyk等，(Arch.Intern.Med.1552077(1995)；Thompson等，如前)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明抗體和抗體組合物在治療通常稱為“成人HUS”的病變(盡管其也可以侵犯兒童)中的應(yīng)用。稱為兒童/腹瀉相關(guān)的HUS的紊亂與成人HUS在病因?qū)W方面不同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特征在于小血管血栓的病變可以用本發(fā)明的抗體和抗體組合物治療。這種病變包括但非限于在此所述那些病變。例如，在大約5-10％小兒AIDS患者中可見的心臟問(wèn)題確信包含小血管血栓。在多發(fā)性硬化患者中已經(jīng)報(bào)道心臟中微血管破壞。再例如，本發(fā)明抗體和抗體組合物預(yù)期可以治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物，優(yōu)選本發(fā)明的拮抗性抗TR7抗體，可以在體內(nèi)施用于患有血栓形成性微血管病的患者。因此，本發(fā)明提供了治療血栓形成性微血管病的一種方法，包括應(yīng)用有效量的本發(fā)明抗體或抗體組合物。
本發(fā)明抗體和抗體組合物可以與治療特殊紊亂的其它制劑組合應(yīng)用。例如，在由Laurence等(Blood 873245(1996))報(bào)道的體外研究中，通過(guò)使用抗Fas阻斷抗體，金精三羧酸或耗空冷凝蛋白質(zhì)的正常血漿可以減少TTP血漿介導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此，患者可以用本發(fā)明抗體或抗體組合物組合抑制Fas配體介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的制劑進(jìn)行治療，所述制劑如上述那些制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體和抗Fas阻斷抗體均施用于患有特征在于血栓形成性微血管病的患者，如TTP或HUS?？笷as抗原的阻斷單克隆抗體(CD95)的實(shí)施例如國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO95/10540所述，在此并入?yún)⒖肌?br> 在血管發(fā)生的內(nèi)源性刺激因子和抑制因子之間天然出現(xiàn)的平衡是抑制影響占優(yōu)勢(shì)的平衡(Rastinejad等，Cell 56345-355(1989))。在正常生理?xiàng)l件下出現(xiàn)新血管化的那些極少情況中，如傷口愈合，器官再生，胚胎發(fā)育及雌性生殖過(guò)程中，血管發(fā)生是嚴(yán)密調(diào)控的并受時(shí)間和空間限制。在病理性血管發(fā)生的情況下，如特征為固體腫瘤生長(zhǎng)的情況下，這些調(diào)節(jié)控制失敗。未調(diào)節(jié)的血管發(fā)生成為病理性的并持續(xù)進(jìn)展為許多腫瘤性或非腫瘤性疾病。許多嚴(yán)重的疾病顯現(xiàn)為異常的新血管化，包括固體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，關(guān)節(jié)炎，一些類型的眼部病變，及銀屑癬。見例如Moses等，Biotech.9710-714(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.3531757-1771(1995)；Auerbach等，J.Microvasc.Res.29401-411(1985)；Folkman，Advances in CancerResearch，Klein和Weinhouse編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約，pp175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol 94715-743(1982)；及Folkman等，Science 221719-725(1983)。在許多病理學(xué)狀態(tài)中，血管發(fā)生的過(guò)程決定了疾病狀態(tài)。例如，已經(jīng)積累了許多有意義的數(shù)據(jù)提示固體腫瘤的生長(zhǎng)依賴于血管發(fā)生。Folkman和Klagsbrun，Science 235442-447(1987)。
本發(fā)明提供了通過(guò)施用本發(fā)明的抗體或抗體組合物治療與新血管化相關(guān)的疾病或病變的方法?？梢杂帽景l(fā)明多核苷酸和多肽治療的惡性腫瘤和癌轉(zhuǎn)移包括但非限于那些本發(fā)明所述及本領(lǐng)域已知的其它的惡性腫瘤，固體腫瘤及癌癥(這種病變綜述見Fishman等，Medicine，第2版，J.B.Lippincott公司，Philadelphia(1985))。
另外，可以用本發(fā)明抗體或抗體組合物治療的與新血管化相關(guān)的眼部病變包括但非限于新血管化青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，晶狀體后纖維素增生，眼色素層炎，早熟斑推行性視網(wǎng)膜病，角膜移植新血管化，以及其它眼部炎癥疾病，眼部腫瘤及與脈絡(luò)膜或虹膜新血管化相關(guān)的疾病。見例如Waltman等，Am.J.Opthalmol85704-710(1978)，及Gartner等，Surv.Ophthal 22.291-312(1978)所述。
另外，可以用本發(fā)明抗體或抗體組合物治療的病變包括但非限于血管瘤，關(guān)節(jié)炎，銀屑癬，血管纖維瘤，動(dòng)脈粥樣硬化斑，傷口愈合延遲，肉芽發(fā)生(granulation)，血友病性關(guān)節(jié)，肥大性疤痕，骨不連骨折(nonunion fractures)，Osler-Weber綜合征，化膿性肉芽腫，硬皮病，沙眼，及血管粘連。
本發(fā)明的抗體和抗體組合物在許多疾病和/或病變的診斷和治療或預(yù)防中有用。這種疾病和病變包括但非限于癌癥(例如免疫細(xì)胞相關(guān)的癌癥，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，濾泡淋巴瘤，與p53突變或改變相關(guān)的癌癥，腦腫瘤，膀胱癌，子宮子宮頸癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，胃癌等)，淋巴增殖性病變(例如淋巴結(jié)病)，微生物(例如病毒，細(xì)菌等)感染(例如HIV-1感染，HIV-2感染，皰疹病毒感染(包括但非限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，痘病毒感染，人乳頭瘤病毒感染，肝炎感染(例如HAV，HBV，HCV等)，幽門螺桿菌感染，侵染性葡萄球菌(Staphylococcia)等感染)，寄生蟲感染，腎炎，骨疾病(例如骨質(zhì)疏松)，動(dòng)脈粥樣硬化，疼痛，心血管病變(例如新血管化，血管化減少或循環(huán)血量減少(例如缺血性疾病(例如心肌梗塞，中風(fēng)等)))，AIDS，過(guò)敏，炎癥，神經(jīng)退行性疾病(例如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化，色素性視網(wǎng)膜炎，小腦退化)，移植排斥(急性和慢性)，移植物抗宿主病，由于骨髓發(fā)育不良所致疾病(例如再生障礙性貧血等)，風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)組織破壞，肝病(例如急性和慢性肝炎，肝損傷和肝硬化)，自身免疫疾病(例如多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，自身免疫性淋巴增殖綜合征(ALPS)，免疫復(fù)合物血管球性腎炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫性血小板減少性紫癜，Grave’s疾病，Hashimoto’s甲狀腺炎等)，心肌病(例如擴(kuò)張性心肌病)，糖尿病，糖尿病并發(fā)癥(例如糖尿病腎病，糖尿病神經(jīng)病變，糖尿病視網(wǎng)膜病)，流感，哮喘，銀屑癬，血管球性腎炎，敗血病休克及潰瘍性大腸炎。
本發(fā)明的抗體和抗體組合物在促進(jìn)血管發(fā)生，傷口愈合(例如創(chuàng)傷，燒傷和骨折)中有用。
本發(fā)明的抗體和抗體組合物在作為增強(qiáng)對(duì)特異抗原免疫應(yīng)答如抗病毒免疫應(yīng)答的佐劑中有用。
更一般地，本發(fā)明的抗體和抗體組合物在調(diào)節(jié)(即增強(qiáng)或降低)免疫應(yīng)答中有用。例如，本發(fā)明的抗體和抗體組合物可在預(yù)備或從手術(shù)，外傷，放療，化療和移植中恢復(fù)時(shí)有用，或者可用于在老年人和免疫應(yīng)答損傷的個(gè)體中加強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或恢復(fù)應(yīng)答。或者，本發(fā)明的抗體和抗體組合物用作免疫抑制劑，例如在治療或預(yù)防自身免疫疾病中。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物用于治療或預(yù)防慢性炎癥，過(guò)敏性或自身免疫性病變，如在此所述那些及本領(lǐng)域已知的其它病變。
治療/預(yù)防組合物及施用本發(fā)明提供了通過(guò)為對(duì)象施用有效量的本發(fā)明抗體(或其片段或變體)或藥物組合物，優(yōu)選本發(fā)明抗體的治療，抑制和預(yù)防方法。在優(yōu)選的一方面，抗體或其片段或變體是基本純化的(即基本上沒(méi)有限制其作用或產(chǎn)生非所需副作用的物質(zhì))。所述對(duì)象優(yōu)選是動(dòng)物，包括但非限于如牛，豬，馬，雞，貓，狗，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。
當(dāng)所述化合物包含一種核酸或免疫球蛋白時(shí)可以應(yīng)用的配方和施用方法如上述；其它合適的配方和施用途徑可以選自以下所述那些。
本領(lǐng)域已知許多輸送系統(tǒng)并可以用于施用本發(fā)明抗體或其片段或變體，例如在脂質(zhì)體中形成膠囊，微顆粒，微囊，能表達(dá)抗體或抗體片段的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的胞吞(見例如Wu和Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))，構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸等。導(dǎo)入方法包括但非限于皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，腦內(nèi)，硬腦膜外及口服途徑。所述組合物可以通過(guò)任何常規(guī)途徑施用，例如通過(guò)灌輸或丸劑注射，通過(guò)上皮或皮膚粘膜分界線(mucocutaneous linings)吸收(例如口腔粘膜，直腸和小腸粘膜等)，并可以與其它生物活性劑一起施用。施用可以是系統(tǒng)或局部施用。另外，也許需要將本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩綄?dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可以通過(guò)心室內(nèi)導(dǎo)管輔助進(jìn)行，例如所述導(dǎo)管附于一個(gè)貯器(reservoir)如Ommaya貯器上。也可以應(yīng)用肺部施用，例如通過(guò)使用吸入器或噴霧器，及含有霧狀制劑的配方。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，需要將本發(fā)明的藥物組合物局部施用需要治療的部位；這可以通過(guò)例如但非限于以下方式實(shí)現(xiàn)在手術(shù)期間局部灌注，局部應(yīng)用，例如在手術(shù)后與傷口敷料一起應(yīng)用，通過(guò)注射，利用導(dǎo)管，利用栓劑，或者利用移植體，所述移植體是有孔，無(wú)孔或凝膠物質(zhì)，包括膜，如sialastic膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用一種蛋白質(zhì)包括本發(fā)明抗體時(shí)，必須注意施用蛋白質(zhì)不吸附的材料。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以在載體(vesicle)中輸送，特別是在脂質(zhì)體中(見Langer，Science 2491527-1535(1990)；Treat等，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(編輯)，Liss，紐約，pp353-365(1989)；Lopez-Berestein，如前，pp317-327；見如前)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以在控制釋放系統(tǒng)中輸送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用一個(gè)泵(見Langer，如前；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(見Medical Applications of ControlledRelease，Langer和Wise(編輯)，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(編輯)，Wiley，紐約(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；另見Levy等，Science 228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一種控制釋放的系統(tǒng)置于接近治療靶位即腦的附近，這樣只需要全身用量的一部分(見例如Goodson，Medical Applications ofControlled Release，如前，第2卷pp.115-138(1984))。
其它控制釋放系統(tǒng)見于Langer所述(Science 2491527-1533(1990))。
在本發(fā)明組合物是一種編碼抗體的核酸的一個(gè)特異實(shí)施方案中，所述核酸可以體內(nèi)施用以促進(jìn)其編碼的抗體的表達(dá)，通過(guò)將其構(gòu)建為一種適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)載體的一部分并施用，以便成為胞內(nèi)的，例如通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見美國(guó)專利No.4,980,286)，或通過(guò)直接注射，或通過(guò)使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過(guò)將其與已知進(jìn)入核的一種類同源框肽(homeobox-like peptide)連接而施用(見例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868(1991))等。或者，可以通過(guò)同源重組將核酸導(dǎo)入胞內(nèi)并摻入宿主細(xì)胞DNA內(nèi)表達(dá)。
本發(fā)明還提供了藥物組合物。這種組合物包含一種治療有效量的抗體或其片段，及一種藥物可接受的載體。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的”是指聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可的或美國(guó)藥典或其它認(rèn)可的藥典里列出的可以使用于動(dòng)物尤其人體。術(shù)語(yǔ)“載體(carrier)”是指通過(guò)其施用治療劑的一種稀釋劑，佐劑，賦形劑或運(yùn)載體。這種藥物載體可以是無(wú)菌液體如水和油，包括那些源于石油，動(dòng)物，植物或合成來(lái)源的，如花生油，豆油，礦物油，芝麻油等。當(dāng)所述藥物組合物靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，尤其是可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝膠，麥芽，米，面粉，石灰，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙烯，水，乙醇等。如果需要，本發(fā)明的組合物還可以包含微量增濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以是溶液，懸浮液，乳化液，片劑，藥丸，膠囊，粉末，緩釋配方等。所述組合物可以配制為栓劑，用傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體如甘油三酸酯配制?？诜浞娇梢园?biāo)準(zhǔn)載體如藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體實(shí)施例見E.W.Martin“Remington′s Pharmaceutical Sciences”所述。這種組合物含有治療有效量的抗體或其片段，優(yōu)選是純化形式，及適量的載體以為患者提供正確的施用方式。所述配方應(yīng)適于施用模式。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物是根據(jù)配制靜脈內(nèi)施用于人體的藥物組合物的常規(guī)方式配制的。典型地，靜脈內(nèi)施用的組合物是于無(wú)菌等滲水相緩沖液中的溶液。如果需要，所述組合物還可以包括一種增溶劑和一種局部麻醉劑如lignocamne，以減輕注射部位的疼痛。通常地，所述成分在單位劑量中是單獨(dú)或混合在一起，例如在密封容器的凍干粉末或無(wú)水濃縮物，所述容器如是指示活性劑數(shù)量的安瓿或小袋(sachette)。在所述組合物是通過(guò)灌注施用時(shí)，其可以灌注瓶分配，所述灌注瓶中含有無(wú)菌藥物級(jí)水或鹽水。在所述組合物是通過(guò)注射施用時(shí)，提供一安瓿的注射用水或鹽水，以便所述成分可以在施用之前混合。
本發(fā)明的組合物可以配制為中性或鹽形式。藥物可接受的鹽包括與陰離子形成的鹽，如鹽酸鹽，磷酸鹽，乙酸鹽，草酸鹽，酒石酸鹽等，及與陽(yáng)離子形成的鹽如來(lái)自鈉鹽，鉀鹽，銨鹽，鈣鹽，氫氧化鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，組氨酸，普魯卡因等。
有效治療，抑制和預(yù)防與本發(fā)明多肽異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或紊亂的本發(fā)明組合物的數(shù)量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。另外，可任選地應(yīng)用體外分析以助于鑒別最佳劑量范圍。配方中應(yīng)用的準(zhǔn)確劑量還依賴于施用途徑，及疾病或紊亂的嚴(yán)重性，而且應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個(gè)患者的情況確定。有效劑量可以從體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)產(chǎn)生的劑量應(yīng)答曲線中推斷出。
就抗體而言，施用于患者的劑量典型地為0.1mg/kg體重至100mg/kg體重。優(yōu)選地，施用于患者的劑量在0.1mg/kg和20mg/kg體重之間，更優(yōu)選在1mg/kg至10mg/kg(例如，3mg/kg或5mg/kg)體重之間。通常地，人抗體在人體內(nèi)比其它物種抗體的半衰期長(zhǎng)，這歸因于對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答。因此，使用較低劑量的人抗體和較少的施用頻率通常是可能的。另外，本發(fā)明的治療或藥物組合物的施用劑量和頻率可以通過(guò)增強(qiáng)抗體的吸收和組織滲透力(例如進(jìn)入腦)而降低，這可以通過(guò)對(duì)抗體加以修飾例如通過(guò)脂化而進(jìn)行。
本發(fā)明的抗體可以在藥物可接受的載體中配制。本發(fā)明抗體的配方可包含一種緩沖液。緩沖液是本領(lǐng)域熟知的并可常規(guī)應(yīng)用以保持本發(fā)明組合物溶液的所需pH值。用于制備本發(fā)明藥物組合物的合適緩沖液包括例如如下所述那些。
用于制備本發(fā)明抗體組合物的合適緩沖液可包括但非限于檸檬酸鹽，乙酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽，二磷酸鹽，氨基乙酰-甘氨酸-哌嗪-2HCl-NaOH；MES-NaOH-NaCl；TRIS-蘋果酸-NaOH；MES-NaOH；ACES-NaOH-NaCl；BES-NaOH-NaCl；MOPS-NaOH-NaCl；TES-NaOH-NaCl；MOPS-KOH；HEPES-NaOH-NaCl；TRIS-HCl；HEPPSO-NaOH；TAPS-NaOH-NaCl；HEPPS(EPPS)-NaOH；檸檬酸-磷酸氫二鈉；硼酸-檸檬酸-KH2PO4-二乙基-巴比妥酸-NaOH；檸檬酸-檸檬酸鈉；乙酸鈉-乙酸；組氨酸；磷酸；鄰苯二甲酸氫鉀-NaOH；二甲基砷酸鈉-HCl；KH2PO4-Na2HPO4；KH2PO4-NaOH；NaH2PO4-Na2HPO4；咪唑-HCl；四硼酸鈉-硼酸；2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇-HCl；二乙醇胺-HCl；KCl-硼酸-NaOH；硼酸-NaOH-KCl；甘氨酸-NaOH；及碳酸鈉-碳酸氫鈉。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液或乙酸鹽緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液包括濃度為大約1到大約50mM的乙酸鹽緩沖液及NaCl濃度為大約1到大約500mM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液包括濃度為大約10mM的乙酸鹽緩沖液，及NaCl濃度為大約140mM。合適的乙酸鹽緩沖液包括濃度為大約1，20，25，50，75，100，200，250，300，400或500mM的乙酸鹽緩沖液。合適的緩沖液和溶液包括NaCl濃度為大約1，50，75，100，125，140，150，175，200，225，250，275，300，350，400，450，或500mM的那些緩沖液。另一種合適的緩沖液是HEPES緩沖液，尤其是濃度為大約10，20，30，40，50，60，70，80，90或100mM的HEPES緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液包括濃度為大約50mM的HEPES緩沖液。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH為5.5-6.5范圍的檸檬酸鹽緩沖溶液中配制。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH接近或正好為6.0的檸檬酸鹽緩沖溶液中配制。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH為5.5-6.5并還含有0-2.0％，優(yōu)選0-0.1％及更優(yōu)選低于0.05％的表面活性劑如Tween 80或聚山梨醇酯80的檸檬酸鹽緩沖溶液中配制。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在10mM檸檬酸鈉，1.9％甘氨酸，0.5％蔗糖，0.02％聚山梨醇酯80，pH6.5中配制。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH為6.5-7.5之間的組氨酸緩沖溶液中配制。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH為6.5-7.5并還含有0-2.0％，優(yōu)選0-0.1％及更優(yōu)選低于0.05％的表面活性劑如Tween 80或聚山梨醇酯80的組氨酸緩沖溶液中配制。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH7.0-8.0之間的磷酸鹽緩沖溶液中配制。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在pH為7.0-8.0并還含有0-2.0％，優(yōu)選0-0.1％及更優(yōu)選低于0.05％的表面活性劑如Tween 80或聚山梨醇酯80的磷酸鹽緩沖溶液中配制。
通常優(yōu)選施用與患者相同物種起源或物種反應(yīng)性(在抗體情況下)的產(chǎn)物。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將人抗體，其片段或變體(例如衍生物)或核酸施用于人類患者以進(jìn)行治療或預(yù)防。
針對(duì)免疫分析及治療與TR7多核苷酸或多肽包括其片段相關(guān)的紊亂，優(yōu)選使用免疫特異性結(jié)合TR7的本發(fā)明高親和性和/或強(qiáng)力體內(nèi)抑制和/或中和抗體(包括包含或由抗體片段或其變體組成的分子)，或者編碼免疫特異性結(jié)合TR7的抗體的多核苷酸編碼。這種抗體優(yōu)選與TR7和/或TR7多肽片段具有親和性。優(yōu)選的結(jié)合親和性包括解離常數(shù)或KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M的那些。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離常數(shù)或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M或10-8M。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合TR7多肽或其片段或變體，解離常數(shù)或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡。
如以下更詳細(xì)闡述，本發(fā)明的抗體可單獨(dú)或與其它組合物組合使用。所述抗體還可以進(jìn)一步重組融合于一種異源多肽的N或C末端或者化學(xué)綴合于(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)多肽或其它組合物。例如，本發(fā)明抗體可以重組融合于或綴合于在檢測(cè)分析中用作標(biāo)記的分子及效應(yīng)分子如異源多肽，藥物，放射性核素或毒素。見例如PCT公開WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國(guó)專利No.5314995及EP396387。
本發(fā)明的抗體和抗體組合物可以單獨(dú)或與其它治療劑組合施用，包括但非限于化療劑，抗生素，抗病毒劑，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑，甾類和非甾類抗炎劑，常規(guī)免疫治療劑和細(xì)胞因子。所述組合可以伴隨施用，例如作為混合物，單獨(dú)但同時(shí)施用；或者相繼施用。這包括其中組合制劑作為治療混合物一起施用的說(shuō)明書，及其中組合制劑單獨(dú)但同時(shí)施用的步驟，例如通過(guò)單獨(dú)的靜脈通道進(jìn)入同一個(gè)體。“組合”施用還包括首先單獨(dú)施用給定的化合物或制劑之一，然后再施用另一種。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用于動(dòng)物優(yōu)選人以進(jìn)行治療的本發(fā)明抗體是多聚體抗體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是同源二聚體IgG分子。在其它特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是同源二聚體IgG1分子。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是同源三聚體IgG分子。在其它特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是同源三聚體IgG1分子。在其它特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是IgG分子的更高等級(jí)多聚體(例如四聚體，五聚體和六聚體)。在更特異的實(shí)施方案中，包含IgG分子更高等級(jí)多聚體的IgG分子的抗體是IgG1分子。
或者，用于治療目的的本發(fā)明抗體可以與本領(lǐng)域已知的交聯(lián)劑組合施用，包括但非限于抗IgG抗體。
與抗TR4抗體，TRAIL，凋亡誘導(dǎo)肽和/或化療劑的組合治療抗TR7抗體可以與其它抗TR7抗體，TRAIL和/或化療劑組合施用。
在特異的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合TR7的本發(fā)明抗體與另一種特異性結(jié)合TR4的抗體組合使用或施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異于TR7和TR4的抗體是誘導(dǎo)TR7和/或TR4表達(dá)細(xì)胞(例如表達(dá)TR7和TR4的細(xì)胞)凋亡的興奮性抗體。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，與單獨(dú)施用抗TR7抗體或抗TR4抗體治療相比，抗TR7治療與抗TR4治療的組合誘導(dǎo)更多的TR7和TR4表達(dá)細(xì)胞的凋亡?？筎R7和抗TR4抗體可以同時(shí)，相繼施用或者根據(jù)劑量方案組合同時(shí)或相繼施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，抗TR7和抗TR4抗體與化療藥物組合施用或使用，所述化療藥物如本發(fā)明所述那些(見例如下文和實(shí)施例3所述)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，當(dāng)抗TR7和抗TR4抗體與化療藥物和/或交聯(lián)劑組合使用或施用時(shí)，得自抗TR7和抗TR4抗體治療的協(xié)同誘導(dǎo)的凋亡更明顯或更顯著。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與一種化療劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明組合物組合施用的化療劑包括但非限于抗生素衍生物(例如阿霉素(亞德里亞霉素)，博來(lái)霉素，道諾霉素，和更生霉素)；抗雌激素(例如三苯氧胺)；抗代謝物(例如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲蝶呤，5-氟脫氧尿苷，干擾素α-2b，谷氨酸，普卡霉素，巰基嘌呤和6-硫鳥嘌呤)；胞毒劑(例如亞硝基脲氮芥，BCNU，洛莫司汀(lomustine)，CCNU，胞核嘧啶阿拉伯糖苷，環(huán)磷酰胺，雌莫司汀(estramustine)，羥基脲，甲基芐肼，絲裂霉素，甲磺酸丁二醇二酯，順鉑和硫酸長(zhǎng)春新堿)；激素(例如甲孕酮，雌莫司汀磷酸鈉，乙炔雌二醇，雌二醇，醋酸甲地孕酮，甲基睪酮，二乙基乙烯雌酚二磷酸酯(diethylstilbestrol diphosphate)，三對(duì)甲氧苯氯乙烯和睪內(nèi)酪)；氮芥衍生物(例如mephalen，chorambucil，二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷)；類固醇及組合物(例如bethamethasone磷酸鈉)；及其它物質(zhì)(例如dicarbazine，天冬酰胺酶，米托坦(mitotane)，硫酸長(zhǎng)春新堿，硫酸長(zhǎng)春堿和表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)，拓?fù)涮婵?Topotecan)，5-氟尿嘧啶，太平洋紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇)，順鉑，阿糖胞苷及IFN-γ，伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)，伊立替康類似物，吉西他汀(gemcitabine)(GEMZARTM)及奧沙利鉑(oxaliplatin)，nitosourea化合物)。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與CHOP(環(huán)磷酰胺，阿霉素，長(zhǎng)春新堿，和強(qiáng)的松)或CHOP組分的任意組合組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與美羅華(Rituximab)組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與美羅華和CHOP，或者美羅華與CHOP組分的任意組合組合施用。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與TRAIL多肽或其片段或變體組合施用，尤其是TRAIL的胞外可溶結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與其它TNF家族成員或特異于TNF受體家族成員的抗體組合施用?？梢耘c本發(fā)明組合物施用的TNF，TNF相關(guān)的或類TNF分子包括但非限于可溶形式的TNF-o，淋巴毒素-α(LT-α，也稱為TNF-β)，LT-β(見于異源三聚體復(fù)合物L(fēng)T-α2-β中)，OPGL，F(xiàn)asL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(國(guó)際公開No.WO 96/14328)，TRAIL，AIM-II(國(guó)際公開No.WO 97/34911)，APRIL(J.Exp.Med.188(6)1185-1190(1998))，內(nèi)因子-α(國(guó)際公開No.WO98/07880)，TR6(國(guó)際公開WO98/30694)，OPG，及Neutrokine-α(國(guó)際申請(qǐng)公開No.WO98/18921)，OX40，和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，及可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(國(guó)際公開No.WO 96/34095)，DR3(國(guó)際公開No.WO97/35904)，TR5(國(guó)際公開No.WO98/30693)，TR6(國(guó)際公開No.WO98/30694)，TR4(國(guó)際公開No.WO98/41629)，TRANK，TR9(國(guó)際公開No.WO98/56892)，TR10(國(guó)際公開No.WO98/54202)，312C2(國(guó)際公開No.WO98/06842)，和TR12，及可溶形式的CD154，CD70，和CD153。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體組合物與凋亡誘導(dǎo)多肽組合施用。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與Smac(caspases的二級(jí)線粒體衍生的激活劑)蛋白組合施用，所述Smac蛋白也稱為DIABLO(低pI的直接IAP(凋亡抑制劑)結(jié)合蛋白(GenBank AccessionNo.NP_063940，在此以其全部?jī)?nèi)容并入?yún)⒖?。Smac是一種239個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。N末端的55個(gè)氨基酸作為線粒體定向序列，其在進(jìn)入線粒體后被切割。凋亡誘導(dǎo)多肽可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)輸送。例如，輸送Smac蛋白的一個(gè)途徑是通過(guò)輸送編碼全長(zhǎng)或成熟形式Smac(GenBank Accession No.NP_063940的56-239位的氨基酸，通過(guò)線粒體加工的胞質(zhì)形式)的核酸而進(jìn)行?；蛘?，本發(fā)明的抗體組合物可以與細(xì)胞可通透的合成的Smac肽組合施用，所述肽能抑制IAP蛋白(例如含有GenBank Accession No.NP_063940的52-62位氨基酸殘基的那些蛋白質(zhì)，AVPIAQK，如Chai等(2000)，Nature406855-862和Fulda等(2002)Nature Medicine 8808-815，所述文獻(xiàn)在此均以全文并入?yún)⒖肌?br> 其它治療組合在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物是與一種抗瘧藥，氨甲蝶呤，抗TNF抗體，ENBRELTM和/或硫酸水楊嗪(suflasalazine)組合施用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與氨甲蝶呤組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與抗TNF抗體組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與氨甲蝶呤和抗TNF抗體組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與硫酸水楊嗪組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物是與氨甲蝶呤，抗TNF抗體，和硫酸水楊嗪組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ENBRELTM組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ENBRELTM和氨甲蝶呤組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水楊嗪組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水楊嗪組合施用。在其它實(shí)施方案中，一或多種抗瘧藥與上述組合之一組合施用。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與一種抗瘧藥(例如羥化氯喹)，ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水楊嗪組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與一種抗瘧藥(例如羥化氯喹)，硫酸水楊嗪，抗TNF抗體和氨甲蝶呤組合施用。
本發(fā)明的抗體(包括包含或由抗體片段或變體組成的分子)可以單獨(dú)施用或與其它治療或預(yù)防方案(例如放療，化療，激素治療，免疫治療，抗腫瘤劑，抗血管發(fā)生劑和抗炎劑)組合施用。這種組合治療可以相繼和/或伴隨施用。
可以與本發(fā)明抗體或抗體組合物組合施用的常規(guī)非特異性免疫抑制劑包括但非限于類固醇，環(huán)孢霉素，環(huán)孢霉素類似物環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺IV，甲基強(qiáng)的松龍，脫氫皮質(zhì)甾醇，咪唑硫嘌呤，F(xiàn)K-506，15-脫氧精胍啉(deoxyspergualin)，及通過(guò)抑制反應(yīng)性T細(xì)胞功能而起作用的其它免疫抑制劑。
在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與免疫抑制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的免疫抑制劑制品包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(環(huán)孢霉素)，PROGRAFTM(他克莫司(tacrolimus))，CELLCEPTTM(霉酚酸酯)，硝基咪唑硫嘌呤，糖皮質(zhì)激素(glucorticosteroid)和RAPAMUNETM(西羅莫司(sirolimus))。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，可以使用免疫抑制劑防止器官或骨髓移植排斥。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與類固醇治療組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的類固醇包括但非限于口服皮質(zhì)類固醇，強(qiáng)的松和甲基強(qiáng)的松龍(例如甲基強(qiáng)的松龍IV)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與強(qiáng)的松組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與強(qiáng)的松和一種免疫抑制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物和強(qiáng)的松組合施用的免疫抑制劑是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺IV。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與甲基強(qiáng)的松龍組合施用。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與甲基強(qiáng)的松龍和一種免疫抑制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的免疫抑制劑是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺IV。
本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明多核苷酸和/或多肽(和/或其激動(dòng)劑或拮抗劑)與其它提議或常規(guī)的造血療法的組合。因此，例如本發(fā)明多核苷酸和/或多肽(和/或其激動(dòng)劑或拮抗劑)可以與只具有紅細(xì)胞生成刺激作用的化合物組合，所述化合物如紅細(xì)胞生成素，睪酮，祖細(xì)胞刺激因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子，前列腺素，5-羥色胺，環(huán)AMP，泌乳刺激素和三碘甲腺原氨酸(triiodothyzonine)。本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明抗體和抗體組合物與一般用于治療再生障礙性貧血的化合物組合施用，所述化合物例如是methenolene，司坦唑(stanozolol)和諾龍(nandrolone)；治療缺鐵性貧血的化合物組合施用，所述化合物例如鐵制品；治療惡性貧血的化合物組合施用，所述化合物例如維生素B12和/或葉酸；及治療溶血性貧血的化合物組合施用，所述化合物例如腎上腺皮質(zhì)激素例如腎上腺皮質(zhì)類脂醇。見例如Resegotti等，Panminerva Medica，23243-248(1981)；Kurtz，F(xiàn)EBSLetters，14a105-108(1982)；McGonigle等，Kidney Int.25437-444(1984)；及Pavlovic-Kantera，Expt.Hematol.，8(supp.8)283-291(1980)，所述文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌?br> 增強(qiáng)或協(xié)同紅細(xì)胞生成素作用的化合物在此也用作佐劑，包括但非限于腎上腺素激動(dòng)劑，甲狀腺素，雄激素，肝紅細(xì)胞生成因子，和紅細(xì)胞生成素，見例如Dunn，″Current Concepts in Erythropoiesis″，John Wiley及Sons(英格蘭奇切斯特，1983)；Kalmani，Kidney Int.22383-391(1982)；Shahidi，New Eng.J.Med.，28972-80(1973)；Urabe等，J.Exp.Med.1491314-1325(1979)；Billat等，Expt.Hematol.，10135-140(1982)；Naughton等，Acta Haemat，69171-179(1983)；Cognote等，abstract 364，Proceedings 7th Intl.Cong.of Endocrinology(Quebec City，Quebec，July 1-7，1984)；及Rothman等，1982，J.Surg.Oncol.20105-108(1982)。刺激紅細(xì)胞生成的方法包括為患者施用一種造血有效量(即影響血細(xì)胞形成的量)的藥物組合物，所述組合物含有本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽(和/或其激動(dòng)劑或拮抗劑)。通過(guò)任何適當(dāng)技術(shù)將本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽和/或其激動(dòng)劑或拮抗劑施用于患者，包括但非限于非腸道，舌下，局部，肺內(nèi)和鼻內(nèi)施用，及那些本發(fā)明進(jìn)一步揭示的方法。所述藥物組合物任選地含有選自以下的一或多種成分紅細(xì)胞生成素，睪丸激素，原細(xì)胞刺激因子(progenitor cell stimulator)，胰島素樣生長(zhǎng)因子，前列腺素，5-羥色胺，環(huán)AMP，泌乳刺激素，三碘甲腺原氨酸，methenolene，司坦唑，和諾龍，鐵制品，維生素B12，葉酸和/或腎上腺皮質(zhì)類脂醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體和抗體組合物與造血生長(zhǎng)因子組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的造血生長(zhǎng)因子包括但非限于LEUKINETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物單獨(dú)施用或與一種抗血管發(fā)生劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的抗血管發(fā)生劑，包括但非限于血管抑制素(angiostatin)(Entremed，Rockville，MD)，肌鈣蛋白-1(Boston Life Sciences，Boston，MA)，抗侵襲因子(anti-invasive factor)，維甲酸及其衍生物，太平洋紫杉醇(紫杉醇)，蘇拉明，金屬蛋白酶-1的組織抑制劑，金屬蛋白酶-2的組織抑制劑，VEGI，血纖溶酶原激活物抑制劑-1，血纖溶酶原激活物抑制劑-2，及多種形式的較輕的“d組”過(guò)渡金屬。
較輕的“d組”過(guò)渡金屬包括例如釩，鉬，鎢，鈦，鈮，和鉭。這種過(guò)渡金屬可以形成過(guò)渡金屬?gòu)?fù)合物。上述過(guò)渡金屬的適當(dāng)復(fù)合物包括含氧過(guò)渡金屬?gòu)?fù)合物。
釩復(fù)合物的代表性實(shí)施例包括含氧釩復(fù)合物如釩酸鹽和氧釩復(fù)合物。適當(dāng)?shù)拟C酸鹽復(fù)合物包括偏釩酸鹽和原釩酸鹽復(fù)合物例如偏釩酸銨，偏釩酸鈉和原釩酸鈉。適當(dāng)?shù)难踱C復(fù)合物包括例如乙酰丙酮氧釩，硫酸氧釩包括硫酸氧釩水合物如硫酸單氧釩(vanadyl sulfatemono-)和三水合物。
鎢和鉬復(fù)合物的代表性實(shí)施例包括含氧復(fù)合物。適當(dāng)?shù)暮蹑u復(fù)合物包括鎢酸鹽和鎢氧化物復(fù)合物。適當(dāng)?shù)逆u酸鹽復(fù)合物包括鎢酸銨，鎢酸鈣，鎢酸鈉二水合物，和鎢酸。適當(dāng)?shù)逆u氧化物包括鎢(四價(jià))氧化物和鎢(六價(jià))氧化物。適當(dāng)?shù)暮蹉f復(fù)合物包括鉬酸鹽，鉬氧化物，和氧鉬基復(fù)合物。適當(dāng)?shù)你f酸鹽復(fù)合物包括鉬酸銨及其水合物，鉬酸鈉及其水合物，及鉬酸鉀及其水合物。適當(dāng)?shù)你f氧化物包括鉬(六價(jià))氧化物，和鉬酸。適當(dāng)?shù)难蹉f基復(fù)合物包括，例如氧鉬基乙酰丙酮。其它適當(dāng)?shù)逆u和鉬復(fù)合物包括衍生自，例如甘油，酒石酸和糖的hydroxo衍生物。
許多其它抗血管發(fā)生因子也可用于本發(fā)明中。代表性實(shí)施例包括但非限于血小板因子4；硫酸魚精蛋白；硫酸殼多糖衍生物(從雪花蟹殼中制備的)(Murata等，Cancer Res.5122-26，1991)；硫酸多糖肽聚糖復(fù)合物(SP-PG)(這個(gè)化合物的功能可以通過(guò)類固醇如雌激素和三苯氧胺檸檬酸鹽加強(qiáng))；星形孢菌素；基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑包括例如脯氨酸類似物，順羥脯氨酸，d，L-3，4-脫羥脯氨酸，硫脯氨酸(Thiaproline)，α-α-二吡啶基，氨基丙腈延胡索酸鹽；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌(Mitoxantrone)；肝素；干擾素；2血清巨球蛋白；ChIMP-3(Pavloff等，J.Bio.Chem.26717321-17326，1992)；胰凝乳蛋白酶抑制劑(chymostatin)(Tomkinson等，Biochem J.286475-480，1992)；環(huán)式糊精十四烷硫酸酯；Eponemycin；喜樹堿；煙曲霉素(Ingber等，Nature 348555-557，1990)；硫代蘋果酸鈉金(″GST″；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.791440-1446，1987)；抗膠原酶血清；α2-抗血纖溶酶(Holmes等，J.Biol.Chem.262(4)1659-1664，1987)；Bisantrene(National CancerInstitute)；Lobenzarit二鈉(N-(2)-羧基苯基-4-氯蒽酮酸二鈉(Lobenzaritdisodium(N-(2)-carboxyphenyl-4-chloroanthronilic acid disodium))，或“CCA”；(Takeuchi等，Agents Actions 36312-316，1992)；和金屬蛋白酶抑制劑如BB94。
也可以用于本發(fā)明的其它抗血管發(fā)生因子包括Thalidomide，(Celgene，Warren，NJ)；血管抑制素激素；AGM-1470(H.Brem和J.Folkman，J.Pediatr.Surg.28445-51(1993))；一種整合素αvβ3拮抗劑(C.Storgard等，J.Clin.Invest.10347-54(1999))；carboxynaminolmidazole；羧基氨基三唑(CAI)(National CancerInstitute，Bethesda，MD)；Conbretastatin A-4(CA4P)(OXiGENE，Boston，MA)；角鯊胺(Squalamine)(Magainin Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)；TNP-470，(Tap Pharmaceuticals，Deerfield，IL)；ZD-0101 AstraZeneca(London，UK)；APRA(CT2584)；氟草胺(Benefin)，Byrostatin-1(SC359555)；CGP-41251(PKC 412)；CM101；Dexrazoxane(ICRF187)；DMXAA；血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；Iressa(ZD1839)；奧曲肽(Octreotide)(生長(zhǎng)激素抑制素)；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；Prinomastat(AG-3340)Purlytin；Suradista(FCE26644)；三苯氧胺(Nolvadex)；Tazarotene；四硫鉬酸鹽；Xeloda(Capecitabine)；和5-氟尿嘧啶。
可以與本發(fā)明化合物組合施用的抗血管發(fā)生劑可以通過(guò)多種機(jī)制起作用，包括但非限于抑制胞外基質(zhì)的蛋白酶解，阻斷內(nèi)皮細(xì)胞-胞外基質(zhì)粘附分子的功能，通過(guò)拮抗血管發(fā)生誘導(dǎo)劑如生長(zhǎng)因子的功能，及抑制在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的整合素受體。干擾胞外基質(zhì)蛋白酶解，及可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗血管發(fā)生抑制劑實(shí)施例包括但非限于AG-3540(Agouron，La Jolla，CA)，BAY-12-9566(Bayer，West Haven，CT)，BMS-275291(Bristol MyersSquibb，Princeton，NJ)，CGS-27032A(Novartis，East Hanover，NJ)，Marimastat(British Biotech，Oxford，UK)，和Metastat(Aeterna，St-Foy，Quebec)。通過(guò)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞-胞外基質(zhì)粘附分子的功能而起作用，及可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗血管發(fā)生抑制劑實(shí)施例包括但非限于EMD-121974(Merck KcgaA Darmstadt，Germany)和Vitaxin(Ixsys，La Jolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD)。通過(guò)直接拮抗或抑制血管發(fā)生誘導(dǎo)劑而起作用，及可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗血管發(fā)生劑實(shí)施例包括但非限于Angiozyme(Ribozyme，Boulder，CO)，抗-VEGF抗體(Genentech，S.San Francisco，CA)，PTK-787/ZK-225846(Novartis，Basel，Switzerland)，SU-101(Sugen，S.San Francisco，CA)，SU-5416(Sugen/Pharmacia Upjohn，Bridgewater，NJ)和SU-6668(Sugen)。其它抗血管發(fā)生劑通過(guò)間接抑制血管發(fā)生而起作用。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的血管發(fā)生的間接抑制劑實(shí)施例包括但非限于IM-862(Cytran，Kirkland，WA)，α-干擾素，IL-12(Roche，Nutley，NJ)，和多硫酸戊聚糖酯(Georgetown University，華盛頓DC)。
在特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與抗血管發(fā)生劑的組合施用預(yù)期可以治療，預(yù)防和/或改善癌癥及其它過(guò)渡增殖性紊亂。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與抗病毒劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗病毒劑包括但非限于阿昔洛韋(acyclovir)，三唑核苷，金剛烷胺和remantidine。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑，核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)，和/或蛋白酶抑制劑(PIs)組合施用?？梢耘c本發(fā)明治療劑組合施用的NRTIs包括但非限于RETROVIRTM(疊氮胸苷/AZT)，VIDEXTM(去羥肌苷/ddI)，HIVIDTM(扎西他濱(zalcitabine)/ddC)，ZERITTM(司他夫定(stavudine)/d4T)，EPIVIRTM(拉米夫定(lamivudine)/3TC)，和COMBIVIRTM(疊氮胸苷/拉米夫定)?？梢耘c本發(fā)明治療劑組合施用的NNRTIs包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可以與本發(fā)明治療劑組合施用的蛋白酶抑制劑包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在特異的實(shí)施方案中，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑，核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，和/或蛋白酶抑制劑，可以與本發(fā)明治療劑任意組合使用，以治療AIDS和/或預(yù)防或治療HIV感染。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與抗生素制劑組合施用。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗生素制劑包括但非限于羥氨芐青霉素(amoxicillin)，氨基糖苷，β-內(nèi)酰胺(糖肽)，β-內(nèi)酰胺酶，氯潔霉素，氯霉素，頭孢菌素，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，紅霉素，氟喹啉酮，大環(huán)內(nèi)酯類藥物，甲硝噠唑，青霉素，喹啉酮，，利福霉素，鏈霉素，磺胺類藥物，四環(huán)素，甲氧芐啶，甲氧芐啶-聯(lián)磺甲氧芐啶(sulfamthoxazole)，和萬(wàn)古霉素。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體和抗體組合物可以與抗機(jī)會(huì)感染制劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗機(jī)會(huì)感染劑包括但非限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，F(xiàn)OSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，F(xiàn)LUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，F(xiàn)AMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF)和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物可以與TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，和/或ATOVAQUONETM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)肺部機(jī)會(huì)感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，和/或ETHAMBUTOLTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)復(fù)合物機(jī)會(huì)感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，和/或AZITHROMYCINTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性肺結(jié)核桿菌感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與GANCICLOVIRTM，F(xiàn)OSCARNETTM，和/或CIDOFOVIRTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性巨細(xì)胞病毒感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性真菌感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性I型和II型單純皰疹病毒感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性剛地弓形體(Toxoplasma gondii)感染。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意組合施用，以預(yù)防性治療，預(yù)防和/或診斷機(jī)會(huì)性細(xì)菌感染。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物單獨(dú)施用或與抗炎劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗炎劑包括但非限于糖皮質(zhì)激素和非甾類抗炎劑，氨基芳香基羧酸(aminoarylcarboxylic)衍生物，芳香基乙酸衍生物，芳香基丁酸衍生物，芳香基羧酸，芳香基丙酸衍生物，吡唑，吡唑啉酮，水楊酸衍生物，噻嗪氨甲酰(thiazinecarboxamides)，e-乙酰氨基己酸，S-腺苷甲硫氨酸，3-氨基-4-羥丁酸，amixetrine，芐達(dá)酸(bendazac)，芐達(dá)明(benzydamine)，布可隆(bucolome)，吡啶基聯(lián)苯基乙酰胺，ditazol，emorfazone，guaiazulene，萘丁美酮(nabumetone)，nimesulide，orgotein，oxaceprol，paranyline，哌立索唑(perisoxal)，哌福肟(pifoxime)，proquazone，普羅沙唑(proxazole)，和tenidap。
本發(fā)明的抗體或抗體組合物可以單獨(dú)施用或與其它佐劑組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體和抗體組合物一起施用的佐劑包括但非限于明礬，明礬加上脫氧膽酸鹽(ImmunoAg)，MTP-PE(Biocine公司)，QS21(Genentech公司)，BCG，和MPL。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與明礬組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與QS-21組合施用。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的其它佐劑包括但非限于單磷脂免疫調(diào)節(jié)劑，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，鋁鹽，MF-59，和仿病毒顆粒佐劑技術(shù)。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的疫苗包括但非限于保護(hù)性直接抗MMR(麻疹，腮腺炎，風(fēng)疹)，脊髓灰質(zhì)炎，水痘，破傷風(fēng)/白喉，甲肝，乙肝，流感嗜血桿菌B，百日咳，肺炎，流感，Lyme′s病，輪狀病毒，霍亂，黃熱病，日本腦炎，脊髓灰質(zhì)炎，狂犬病，傷寒癥，和百日咳，和/或PNEUMOVAX-23TM的疫苗。組合物可以例如作為混合物，單獨(dú)但同時(shí)伴隨施用；或相繼施用。這包括其中所述組合的制劑作為治療混合物一起施用，也包括其中所述組合的制劑單獨(dú)但同時(shí)施用，例如通過(guò)單獨(dú)的靜脈內(nèi)途徑進(jìn)入相同個(gè)體內(nèi)?！敖M合”施用還包括首先單獨(dú)施用一種給定的化合物或制劑，隨后再施用第二種。
在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PNEUMOVAX-23TM組合施用，以治療，預(yù)防和/或診斷感染和/或相關(guān)的任何疾病，紊亂和/或病變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PNEUMOVAX-23TM組合施用，以治療，預(yù)防和/或診斷任何革蘭氏陽(yáng)性菌感染和/或任何相關(guān)的疾病，紊亂和/或病變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PNEUMOVAX-23TM組合施用，以治療，預(yù)防和/或診斷與腸球菌屬和/或鏈球菌屬的一或多個(gè)成員相關(guān)的感染和/或任何疾病，紊亂和/或病變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PNEUMOVAX-23TM組合施用，以治療，預(yù)防和/或診斷與鏈球菌B組的一或多個(gè)成員相關(guān)的感染和/或任何疾病，紊亂和/或病變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與PNEUMOVAX-23TM組合施用，以治療，預(yù)防和/或診斷肺炎鏈球菌感染和/或任何疾病，紊亂和/或病變。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與以下物質(zhì)組合施用CD40配體(CD40L)，可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)，CD40L的生物活性片段，變體或衍生物，抗CD40L抗體(例如興奮性抗體或拮抗性抗體)，和/或抗CD40抗體(例如興奮性抗體或拮抗性抗體)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與一種抗凝血?jiǎng)┙M合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的抗凝血?jiǎng)┌ǖ窍抻诟嗡?，殺鼠靈(warfarin)和阿斯匹林。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與肝素和/或殺鼠靈組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與殺鼠靈組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與殺鼠靈和阿斯匹林組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與肝素組合施用。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與肝素和阿斯匹林組合施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與抑制抗心磷脂抗體產(chǎn)生的一種制劑組合施用。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸與一種制劑組合施用，所述制劑阻斷和/或降低抗心磷脂抗體與磷脂結(jié)合血漿蛋白β2-糖蛋白I(b2GPI)的結(jié)合能力。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與一種抗瘧疾藥物組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的抗瘧藥包括但非限于羥化氯喹，氯喹和/或奎納克林。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與NSAID組合施用。
在一個(gè)非唯一的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物是與一，二，三，四，五，十或多種以下藥物組合施用的NRD-101(HoechstMarion Roussel)，雙氯芬酸(Dimethaid)，惡丙嗪鉀(Monsanto)，mecasermin(Chiron)，T-614(Toyama)，培美曲塞二鈉(EliLilly)，atreleuton(Abbott)，valdecoxib(Monsanto)，eltenac(Byk Gulden)，campath，AGM-1470(Takeda)，CDP-571(Celltech Chiroscience)，CM-101(CarboMed)，ML-3000(Merckle)，CB-2431(KS Biomedix)，CBF-BS2(KS Biomedix)，IL-1Ra基因治療(Valentis)，JTE-522(日本煙草)，太平洋紫杉醇(Angiotech)，DW-166HC(Dong Wha)，darbufelone mesylate(Warner-Lambert)，可溶的TNF受體1(synergen；Amgen)，IPR-6001(Institute for Pharmaceutical Research)，trocade(Hoffman-La Roche)，EF-5(Scotia Pharmaceuticals)，BIIL-284(Boehringer Ingelheim)，BIIF-1149(Boehringer Ingelheim)，LeukoVax(Inflammatics)，MK-663(Merck)，ST-1482(Sigma-Tau)和butixocortpropionate(WarnerLambert)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物是與一，二，三，四，五或多種以下藥物組合施用的氨甲蝶呤，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，金硫丁二鈉(sodium aurothiomalate)，auranofin，環(huán)孢霉素，青霉胺，咪唑硫嘌呤，一種抗瘧藥(例如本文所述)，環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥，金，ENBRELTM(Etanercept)，抗-TNF抗體，LJP 394(La Jolla Pharmaceutical Company，San Diego，California)和強(qiáng)的松龍。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物單獨(dú)施用或與一或多種靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品包括但非限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARDS/DTM，和GAMIMUNETM。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物在移植治療(例如骨髓移植)中與靜脈內(nèi)免疫球蛋白制品組合施用。
CD40配體(CD40L)，一種可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)))))，CD40L的生物活性片段，變體或衍生物，抗CD40L抗體(例如興奮性抗體或拮抗性抗體)，和/或抗CD40抗體(例如興奮性抗體或拮抗性抗體)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與細(xì)胞因子組合施用?？梢耘c本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的細(xì)胞因子包括但非限于GM-CSF，G-CSF，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40，CD40L，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，和TNF-β。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與TRAIL受體組合施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物可以與任何白細(xì)胞介素組合施用，所述白細(xì)胞介素包括但非限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，和IL-22。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與IL4和IL10組合施用。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與IL2組合施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與G-CSF組合施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物是與一或多種趨化因子組合施用的。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與選自以下的α(CxC)趨化因子組合施用γ干擾素可誘導(dǎo)蛋白-10(γIP-10)，白細(xì)胞介素-8(IL-8)，血小板因子4(PF4)，嗜中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP-2)，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，嗜中性粒細(xì)胞激活肽(ENA-78)，粒細(xì)胞趨化蛋白-2(GCP-2)，和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1，或前-B細(xì)胞刺激因子(PBSF))；和/或一種β(CC)趨化因子組合施用，選自RANTES(調(diào)節(jié)活化，正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β(MIP-1β)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，單核細(xì)胞趨化蛋白-2(MCP-2)，單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)，單核細(xì)胞趨化蛋白-4(MCP-4)巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1γ(MIP-1γ)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α(MIP-3α)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3β(MIP-3β)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC)，eotaxin，Exodus和I-309；和/或γ(C)趨化因子，淋巴細(xì)胞趨化因子組合施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與提高INF-γ和/或caspase活性尤其caspase-8活性的制劑組合施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與趨化因子β-8，趨化因子β-1，和/或巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-4組合施用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與趨化因子β-8組合施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與IL-4拮抗劑組合施用。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物一起施用的IL-4拮抗劑包括但非限于可溶的IL-4受體多肽，聚合形式的可溶IL-4受體多肽；結(jié)合IL-4而不轉(zhuǎn)導(dǎo)由IL-4激發(fā)的生物信號(hào)的抗IL-4受體抗體，阻斷IL-4與一或多種IL-4受體結(jié)合的抗IL4抗體，和結(jié)合IL-4受體但不轉(zhuǎn)導(dǎo)由IL-4激發(fā)的生物信號(hào)的IL-4突變蛋白。優(yōu)選地，根據(jù)這種方法應(yīng)用的抗體是單克隆抗體(包括抗體片段，例如本發(fā)明所述)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體組合物與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組合施用。可以與本發(fā)明抗體和抗體組合物組合施用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括但非限于FGF-1，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)GF-3，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-5，F(xiàn)GF-6，F(xiàn)GF-7，F(xiàn)GF-8，F(xiàn)GF-9，F(xiàn)GF-10，F(xiàn)GF-11，F(xiàn)GF-12，F(xiàn)GF-13，F(xiàn)GF-14和FGF-15。
論證組合物的治療或預(yù)防用途本發(fā)明的化合物優(yōu)選在體外測(cè)試，然后在體內(nèi)測(cè)試希望的治療或預(yù)防活性，之后用于人體。例如，可以用于確定是否需要施用本發(fā)明特異抗體或組合物的體外分析，包括體外細(xì)胞培養(yǎng)分析，其中將患者組織樣品在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并暴露于或另外施用本發(fā)明的抗體或組合物，觀測(cè)本發(fā)明這種抗體或組合物對(duì)所述組織樣品的作用。在多種特異的實(shí)施方案中，可以用患者病變中包含的代表性細(xì)胞進(jìn)行體外分析，以確定本發(fā)明的抗體或組合物對(duì)這種細(xì)胞是否具有希望的作用。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或組合物也在體外分析和動(dòng)物模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試，之后施用于人體。
用于治療的本發(fā)明抗體或組合物可以在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試其毒性，包括但非限于大鼠，小鼠，雞，牛，猴和兔。針對(duì)體內(nèi)測(cè)試抗體或組合物毒性，可以使用本領(lǐng)域已知的任何動(dòng)物模型系統(tǒng)。
可以在體外，源于體內(nèi)(ex vivo)和體內(nèi)分析中測(cè)試本發(fā)明抗體或組合物降低腫瘤形成的能力。還可以在體外和體內(nèi)分析中測(cè)試本發(fā)明抗體或組合物抑制病毒復(fù)制或降低病毒荷載的能力。還可以在本領(lǐng)域已知的體外和體內(nèi)分析中測(cè)試本發(fā)明抗體或組合物降低細(xì)菌數(shù)目的能力。還可以測(cè)試本發(fā)明的抗體或組合物減輕與癌癥，免疫紊亂(例如炎癥疾病)，神經(jīng)紊亂或感染性疾病相關(guān)的一或多種癥狀的能力。還可以測(cè)試本發(fā)明抗體或組合物降低感染性疾病時(shí)程的能力。另外，還可以測(cè)試本發(fā)明的抗體或組合物提高患病動(dòng)物的存活期的能力，所患疾病包括癌癥，免疫紊亂或感染性疾病?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)分析本發(fā)明抗體或組合物在體內(nèi)的功能。
治療或預(yù)防病毒感染的效力，可以通過(guò)檢測(cè)本發(fā)明抗體或組合物抑制病毒復(fù)制，抑制傳播或阻止病毒在其宿主中安置，或預(yù)防，改善或減輕疾病進(jìn)展的能力而證實(shí)。如果在施用本發(fā)明抗體或組合物后，病毒荷載減少，改善一或多個(gè)癥狀，或死亡率和/或發(fā)病率降低，則認(rèn)為所述處理具有治療效力。
可以測(cè)試本發(fā)明抗體或組合物調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞生物活性的能力，通過(guò)將免疫細(xì)胞優(yōu)選人免疫細(xì)胞(例如T細(xì)胞，B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞)與本發(fā)明的抗體或組合物或一種對(duì)照化合物接觸，并確定本發(fā)明抗體或組合物調(diào)節(jié)(即提高或降低)免疫細(xì)胞生物活性的能力。本發(fā)明抗體或組合物調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞生物活性的能力可以通過(guò)檢測(cè)抗原的表達(dá)，檢測(cè)免疫細(xì)胞的增殖(即B細(xì)胞增殖)，檢測(cè)信號(hào)分子的活化，檢測(cè)免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，或檢測(cè)免疫細(xì)胞的分化而確定?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)定這些活性。例如，細(xì)胞增殖可以通過(guò)3H-胸苷摻入分析和臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)細(xì)胞計(jì)數(shù)確定?？乖磉_(dá)可以通過(guò)例如免疫分析確定，所述分析包括但非限于競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性分析系統(tǒng)，使用如Werstern印跡，免疫組織化學(xué)放射免疫分析，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，“夾心”免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)，免疫擴(kuò)散分析，凝集反應(yīng)，補(bǔ)體固定分析，免疫放射性分析，熒光免疫分析，蛋白A免疫分析和FACS分析。信號(hào)分子的活化可以通過(guò)例如激酶分析和電泳遷移分析(EMSAs)確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定本發(fā)明的抗體或組合物誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖的能力。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定本發(fā)明的抗體或組合物調(diào)節(jié)免疫球蛋白表達(dá)的能力。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象/混合物本發(fā)明還提供了免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體混合物(包括scFvs及包含或由抗體片段或變體組成的其它分子)，其中所述混合物具有至少1，2，3，4，5或多種不同的本發(fā)明抗體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了至少2種，優(yōu)選至少4，至少6，至少8，至少10，至少12，至少15，至少20或至少25種免疫特異性結(jié)合TR7的不同抗體或其片段或變體，其中混合物的至少1，至少2，至少4，至少6，或至少10種抗體是本發(fā)明的抗體。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，混合物的每種抗體均是本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明還提供了免疫特異性結(jié)合TR7或其片段或變體的抗體(包括scFvs及包含或由抗體片段或變體組成的其它分子)實(shí)驗(yàn)組，其中所述實(shí)驗(yàn)組具有至少1，2，3，4，5或多種不同的本發(fā)明抗體。在特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體實(shí)驗(yàn)組，其對(duì)TRAIL受體的具有不同親和性，對(duì)TRAIL受體的具有不同特異性，或不同的解離速度。本發(fā)明提供了至少10種，優(yōu)選至少25，至少50，至少75，至少100，至少125，至少150，至少175，至少200，至少250，至少300，至少350，至少400，至少450，至少500，至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850，至少900，至少950，或至少1000種抗體?？贵w實(shí)驗(yàn)組可以用于例如96孔平板中進(jìn)行分析，例如ELISA。
本發(fā)明還提供了包含一或多種抗體(包括包含或由本發(fā)明抗體片段或變體組成的分子)的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的任一或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的VH結(jié)構(gòu)域的任一或多個(gè)VH CDR1的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的VH結(jié)構(gòu)域的任一或多個(gè)VH CDR2的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的VH結(jié)構(gòu)域的任一或多個(gè)VH CDR3的氨基酸序列的多肽或其變體組成。
本發(fā)明提供了包含一或多種抗體(包括包含或由本發(fā)明抗體片段或變體組成的分子)的組合物的其它實(shí)施方案，如下所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的任一或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的任一或多個(gè)VL CDR1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的任一或多個(gè)VL CDR2的氨基酸序列的多肽或其變體組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含1，2，3，4，5或多種抗體，所述抗體包含或由具有表1所示一或多種scFvs的任一或多個(gè)VL CDR3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多肽或其變體組成。
試劑盒本發(fā)明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其包含一或多個(gè)充填一或多種本發(fā)明藥物組合物成分的容器。任選地與這種容器相關(guān)的是一個(gè)由管理藥物或生物制品的生產(chǎn)，使用和銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的告示，其告知了針對(duì)人體施用的生產(chǎn)，使用或銷售機(jī)構(gòu)的許可。
本發(fā)明提供了可用于上述方法中的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)試劑盒在一或多個(gè)容器中含有本發(fā)明的抗體，優(yōu)選純化的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有免疫特異性結(jié)合TR7多肽或其片段或變體的抗體片段。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一種基本分離的TR7多肽或其片段或變體作為對(duì)照。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含與任何，一些或全部TRAIL受體不反應(yīng)的一種對(duì)照抗體。在另一個(gè)特異的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一種檢測(cè)抗體與TR7多肽結(jié)合的手段(例如抗體可以綴合于一種可檢測(cè)底物如熒光化合物，酶底物，放射性化合物或發(fā)光化合物，或識(shí)別第一種抗體的第二種抗體可綴合于一種可檢測(cè)底物)。在特異的實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包括一種重組產(chǎn)生的或化學(xué)合成的TRAIL受體。試劑盒中的TR7多肽還可以附著于一種固體支持物。在一個(gè)更特異的實(shí)施方案中，所述試劑盒的檢測(cè)手段包括TR7多肽附著的一種固體支持物。這種試劑盒還可以包括一種未附著的報(bào)道子標(biāo)記的抗人抗體。在這個(gè)實(shí)施方案中，抗體與TR7的結(jié)合可以通過(guò)所述報(bào)道子標(biāo)記的抗體的結(jié)合而檢測(cè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種診斷試劑盒，用于篩選含有本發(fā)明多肽的抗原的血清。所述診斷試劑盒包括與TARIL受體特異性免疫反應(yīng)的一種基本分離的抗體，及檢測(cè)TR7多肽與抗體結(jié)合的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體附著于一種固體支持物。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，所述抗體可以是一種單克隆抗體。所述試劑盒的檢測(cè)方法可以包括另一種標(biāo)記的單克隆抗體?；蛘撸蛄硗?，所述檢測(cè)方法可以包括一種標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抗原。
在一個(gè)診斷性方法中，將測(cè)試血清與一種固相試劑反應(yīng)，所述固相試劑具有通過(guò)本發(fā)明方法獲得的表面結(jié)合的TRAIL受體。在TR7多肽與特異性抗體結(jié)合后，通過(guò)沖洗除去未結(jié)合的血清成分，加入報(bào)道子標(biāo)記的抗人抗體，通過(guò)沖洗除去未結(jié)合的抗人抗體，將一種試劑與報(bào)道子標(biāo)記的抗人抗體反應(yīng)，報(bào)道子與所述試劑的結(jié)合與在固體支持物上結(jié)合的抗TR7多肽抗體的數(shù)量成比例。典型地，所述報(bào)道子是一種酶，其是通過(guò)在存在適當(dāng)?shù)臒晒?，發(fā)光或顯色底物的情況下，孵育所述固相試劑而檢測(cè)的。
上述分析中的所述固相表面試劑是通過(guò)本領(lǐng)域已知的將蛋白質(zhì)物質(zhì)吸附于固相物質(zhì)如聚合物珠，蘸棒，96孔平板或?yàn)V膜的方法制備的。這些附著方法通常包括將所述蛋白質(zhì)非特異性吸附于支持物，或蛋白質(zhì)的共價(jià)附著，典型地通過(guò)一個(gè)游離氨基基團(tuán)附著于固相支持物上的一個(gè)化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，如激活的羧基，羥基或醛基基團(tuán)?；蛘撸溣H和素包被的平板可以與生物素化的抗原聯(lián)合使用。
因此，本發(fā)明提供了一種分析系統(tǒng)或試劑盒以進(jìn)行這種診斷方法。所述試劑盒一般包括表面結(jié)合有重組TRAIL受體的支持物，和報(bào)道子標(biāo)記的抗人抗體，以檢測(cè)表面結(jié)合的抗TR7抗體。
TRAIL受體的胎盤表達(dá)腫瘤壞死因子家族受體和配體在整個(gè)胎盤及胎盤巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞系中的表達(dá)已經(jīng)進(jìn)行仔細(xì)檢測(cè)。示出表達(dá)TR7和TR5但不表達(dá)TR10滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)通過(guò)重組TRAIL的殺傷具有完全抗性，而表達(dá)TR4，TR7和TR10但不表達(dá)TR5的巨噬細(xì)胞是敏感的(Phillips等，J.Immunol.156053-9(1999)，在此以其全文并入?yún)⒖?。因此，使用所述抗TR7抗體的方法也可以用于胎盤和胎盤細(xì)胞類型上(例如巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞)，以預(yù)防，治療，診斷，改善或監(jiān)測(cè)胎盤細(xì)胞類型的疾病或紊亂。
基因治療在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，通過(guò)基因治療，施用包含編碼抗體或其功能衍生物的序列的核酸以治療，抑制或預(yù)防與TRAIL受體和/或其配體(例如TRAIL)異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或紊亂?；蛑委熓侵竿ㄟ^(guò)為對(duì)象施用一種表達(dá)的或可表達(dá)的核酸進(jìn)行治療。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸產(chǎn)生其編碼的介導(dǎo)治療作用的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域可用的基因治療的任何方法。例如以下闡述了一些方法。
針對(duì)基因治療的一般方法，參見Goldspiel等，Clinical Pharmacy12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science260926-932(1993)；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993)所述?？梢允褂玫闹亟MDNA技術(shù)領(lǐng)域已知的的方法見于Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；及Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton出版社，NY(1990)。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明的組合物包含或者由編碼抗體的核酸組成，所述核酸是在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達(dá)載體的一部分。特別地，這種核酸具有啟動(dòng)子，優(yōu)選異源啟動(dòng)子，可操縱地連于抗體編碼區(qū)，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，并任選地是組織特異性的。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所使用的核酸分子其中所述抗體編碼序列和任何其它所需序列在兩側(cè)存在促進(jìn)在基因組中希望位點(diǎn)同源重組的區(qū)域，因此提供抗體編碼核酸在染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體分子是scFv；或者，所述核酸序列包括編碼抗體重鏈和輕鏈或其片段或變體的序列。
將所述核酸可以直接或間接輸送進(jìn)入患者，直接輸送是將患者直接暴露于所述核酸或攜帶核酸的載體，間接輸送是將細(xì)胞首先用所述核酸在體外轉(zhuǎn)化，然后移植入患者體內(nèi)。這兩種方法分別稱為體內(nèi)或源于體內(nèi)基因治療。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，所述核酸序列直接在體內(nèi)施用，其中其表達(dá)產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法完成，例如通過(guò)將它們構(gòu)建為適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)載體的一部分，并施用以使其成為胞內(nèi)的，例如通過(guò)使用缺陷的或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體感染(見美國(guó)專利No.4,980,286)，或通過(guò)直接注射裸DNA，或通過(guò)使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，包裝在脂質(zhì)體，微?；蛭⒛抑?，或通過(guò)將其與已知進(jìn)入核的肽連接施用，通過(guò)將其與配體連接進(jìn)行受體介導(dǎo)的胞吞(見例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(其可以用于定向特異性表達(dá)所述受體的細(xì)胞)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中所述配體包含一種融合(fusogenic)病毒肽以破壞內(nèi)涵體，使所述核酸免于被溶酶體降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸可以在體內(nèi)定向以進(jìn)行細(xì)胞特異性吸收和表達(dá)，通過(guò)定向一個(gè)特異性受體進(jìn)行(見例如PCT公開WO 92/06 180；WO92/22715；WO92/203 16；WO93/14188，WO 93/20221)。或者，所述核酸可以導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并摻入宿主細(xì)胞DNA內(nèi)以表達(dá)，通過(guò)同源重組進(jìn)行(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989))。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，使用含有編碼本發(fā)明抗體或其片段或變體的核酸序列的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見Miller等，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒含有正確包裝病毒基因組及整合入宿主細(xì)胞DNA所必需的成分。將編碼基因治療中所用抗體的核酸序列克隆入一或多個(gè)載體中，所述載體促進(jìn)所述基因輸送至患者體內(nèi)。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更詳細(xì)闡述可見于Boesen等，Biotherapy 629 1-302(1994)，其闡述了使用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdr1基因輸送至造血干細(xì)胞中，以使所述干細(xì)胞對(duì)化療更有抗性。其它例證了在基因治療中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的參考文獻(xiàn)見于Clowes等，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Klein等，Blood831467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，Human Gene Therapy4129-141(1993)；及Grossman和Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治療中的其它病毒載體。腺病毒是將基因輸送于呼吸道上皮的特別有效的運(yùn)載體。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在此其導(dǎo)致輕微的疾病?；谙俨《镜妮斔拖到y(tǒng)的其它靶位是肝，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)皮細(xì)胞和肌。腺病毒具有能感染非分裂的細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky和Wilson，Current Opinion in Genetics and Development3499-503(1993)提出了一種關(guān)于基于腺病毒的基因治療的回顧。Bout等，Human Gene Therapy 53-10(1994)論證了腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至恒河猴呼吸道上皮的應(yīng)用。腺病毒在基因治療中應(yīng)用的其它例子可見于Rosenfeld等，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell68143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公開WO94/12649；及Wang，等，Gene Therapy 2775-783(1995)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用腺病毒載體。
腺病毒相關(guān)病毒(AAV)已經(jīng)被提議用于基因治療中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美國(guó)專利No.5,436,146)。
基因治療的另一種方法包括將基因通過(guò)如電穿孔，脂染，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒感染等方法移至組織培養(yǎng)的細(xì)胞中。通常地，所述轉(zhuǎn)移方法包括將一個(gè)可選擇標(biāo)記移至所述細(xì)胞。然后將此細(xì)胞置于選擇條件下以分離已經(jīng)吸收并表達(dá)轉(zhuǎn)移的基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞輸送于患者。
在這個(gè)實(shí)施方案中，在體內(nèi)施用所得重組細(xì)胞之前，將所述核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。這種導(dǎo)入可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，包括但非限于轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，用含有所述核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細(xì)胞融合，染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)體融合等。本領(lǐng)域已知許多將外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)(見例如Loeffler和Behr，Meth.Enzymol.217599-718(1993)；Cohen等，Meth.Enzymol.217718-644(1993)；Clin.Pharma.Ther.2969-92m(1985))，根據(jù)本發(fā)明可以使用這些方法，使受體細(xì)胞的必需發(fā)育和生理功能不被破壞。所述技術(shù)應(yīng)穩(wěn)定地將所述核酸移至細(xì)胞，以便所述核酸由細(xì)胞表達(dá)，及優(yōu)選地可由其子代繼承和表達(dá)。
所得重組細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法輸送于患者。重組的血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)注射施用。所用細(xì)胞數(shù)量依賴于所希望的效果，患者狀態(tài)等，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
將核酸導(dǎo)入其中以進(jìn)行基因治療的細(xì)胞涵蓋了任何希望的可獲得的細(xì)胞類型，包括但非限于上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，角化細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肌細(xì)胞，肝細(xì)胞；血細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞，巨核細(xì)胞，粒細(xì)胞；多種干細(xì)胞或原細(xì)胞，尤其造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如得自骨髓，臍帶血，周圍血，胎兒肝臟的細(xì)胞等。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞與患者是自體同源的。
在一個(gè)使用重組細(xì)胞進(jìn)行基因治療的實(shí)施方案中，將編碼抗體或其片段的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞中，這樣其可由該細(xì)胞或其子代表達(dá)，然后將所述重組的細(xì)胞體內(nèi)施用以進(jìn)行治療。在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，使用可以在體外分離并維持的任何干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞(見例如PCT公開WO94/08598；Stemple和Anderson，Cell 71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A229(1980)；及Pittelkow和Scott，Mayo ClinicProc.61771(1986))。
在一個(gè)特異的實(shí)施方案中，導(dǎo)入的以進(jìn)行基因治療的核酸包含一個(gè)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其可操縱地連接于編碼區(qū)，這樣可通過(guò)控制存在或不存在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子而控制所述核酸的表達(dá)。
實(shí)施例實(shí)施例1TR7結(jié)合多肽的親和性和特異性的Biacore分析材料BIAcore2000設(shè)備BIAcore2000控制軟件，版本3.1.1BIAevaluation，版本3.1BIAcore CM5傳感器芯片，Cat#BR-1000-14Lot#0364(BIAcore)HBS-EP緩沖液胺偶聯(lián)試劑盒Cat#BR-1000-50(BIAcore)EDC，#1048-950345(BIAcore)NHS，#1048-950345(BIAcore)乙醇胺，#1048-950345(BIAcore)10mM乙酸，pH4.0，Cat#BR1003-50 Lot#1821-9503844(BIAcore)TRAIL-FLAG(Alexis Biochemical Cat#522-003-C010#L04793/a)所有實(shí)驗(yàn)溫度均為25℃。
一般方法以下方案是可用于確定抗TR7抗體與TR7多肽的親和性的方案的一個(gè)實(shí)例。另外，以下方案可用于確定本發(fā)明抗體的特異性。
將TR4，TR5，TR7和TR10(Fc融合蛋白形式)固定于BIAcore傳感器芯片的各個(gè)流式(flow)細(xì)胞上。TR7-Fc融合蛋白包含TR7(SEQ ID NO3)的E52-G184殘基。這種蛋白質(zhì)在利用GP信號(hào)肽的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。因此，這種融合蛋白的翻譯后加工產(chǎn)生TR7-Fc融合蛋白，其包含融合于TR5(SEQ ID NO3)的E52-G184殘基的GP信號(hào)肽的后3個(gè)殘基(Ala-Asp-Pro)，所述殘基融合于Fc區(qū)域。TR4-Fc融合蛋白包含TR4(SEQ ID NO1)的M1-I240殘基。這種融合蛋白質(zhì)的翻譯后加工產(chǎn)生TR4-Fc融合蛋白，其包含TR4(SEQ ID NO1)的A109-I240殘基。TR5-Fc融合蛋白包含TR5(SEQ ID NO2)的R70-S282殘基。這種蛋白質(zhì)在利用GP信號(hào)肽的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。因此，這種融合蛋白的翻譯后加工產(chǎn)生TR5-Fc融合蛋白，其包含融合于TR5(SEQ ID NO2)的R70-S282殘基的GP信號(hào)肽的后3個(gè)殘基(Ala-Asp-Pro)，所述殘基融合于Fc區(qū)域。TR10-Fc融合蛋白包含TR10(SEQ ID NO4)的M1-G204殘基。這種融合蛋白的翻譯后加工產(chǎn)生TR10-Fc融合蛋白，其包含TR10(SEQ ID NO4)的A56-G204殘基。
胺偶聯(lián)用于將每個(gè)受體(Fc)共價(jià)結(jié)合于CM5傳感器芯片上的葡聚糖基質(zhì)。這種偶聯(lián)的最佳pH使用在pH4-7范圍進(jìn)行的預(yù)選實(shí)驗(yàn)分析，并基于結(jié)合斜率確定。
使用手工注射模式進(jìn)行實(shí)際偶聯(lián)。針對(duì)所有流式細(xì)胞設(shè)定目標(biāo)為大約2000RU的靶水平(根據(jù)受體的分子量可以在2000-3100范圍內(nèi)變化)。進(jìn)行固定的所有受體濃度為10mM乙酸(pH4.0)中10μg/ml。在5μl/分鐘流速進(jìn)行全部固定實(shí)驗(yàn)。EDC/NHS注射的接觸時(shí)間為7分鐘。注射乙醇胺7分鐘。
用以下程序進(jìn)行篩選。完整結(jié)合循環(huán)的流速為25μl/分鐘。相當(dāng)于scFvs的抗體在HBS-EP中稀釋，并流經(jīng)具有固定的TRAIL受體的所有四種細(xì)胞。將每種樣品與受體接觸4分鐘。使用15μl的25mMNaOH進(jìn)行再生。成功的再生認(rèn)為不僅除去抗體，而且還不變性固定的受體。
這種篩選實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照是同樣(流速和時(shí)間長(zhǎng)度)注射可溶的TRAIL配體。濃度為1μg/ml。陰性對(duì)照是在HBS-EP中1:10稀釋的抗體稀釋劑。使用BIAevaluation軟件包分析數(shù)據(jù)。
抗TR7抗體的Biacore分析在基于上述一般方法的以下實(shí)驗(yàn)中，某些抗體(相當(dāng)于本發(fā)明的scFvs)與TR7的親和性使用“雙參考扣除(double referencesubtraction)”方法確定，在實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞中使用TR7-Fc受體，TR2-Fc(包含TR2的1-192位氨基酸，也稱為皰疹病毒進(jìn)入介導(dǎo)子(Herpes Virus Entry Mediator)(HVEM)，如WO96/34095所揭示，其全文并入?yún)⒖?作為陰性對(duì)照。
將TR7-Fc和TR2-Fc固定于BIAcore傳感器芯片(BIAcore，Cat#BR-1000-14)的各個(gè)流式細(xì)胞上。胺偶聯(lián)(BIAcore，Cat#BR-1000-50)用來(lái)將每個(gè)受體共價(jià)結(jié)合于傳感器芯片上的葡聚糖基質(zhì)。這種偶聯(lián)的最佳pH使用在pH4-7范圍進(jìn)行的預(yù)選實(shí)驗(yàn)分析，并基于結(jié)合斜率確定為pH4.0。使用手工注射模式進(jìn)行實(shí)際偶聯(lián)。針對(duì)這兩種流式細(xì)胞設(shè)定目標(biāo)為大約200相對(duì)單位(RU)的靶水平。1000RU的應(yīng)答與大約1ng/mm2蛋白質(zhì)的表面濃度中的變化相關(guān)。TR7和TR2融合蛋白的分子量幾乎相同。進(jìn)行固定的這兩種受體濃度為于10mM乙酸中5μg/ml，pH4.0(BIAcore，Cat#BR-1003-49)。以5μL/分鐘流速進(jìn)行全部實(shí)驗(yàn)。鹽酸N-乙基-N’-(3-二甲基胺丙基)鹽酸碳二亞胺/鹽酸乙醇胺-NaOH，pH8.5(EDC/NHS)注射的接觸時(shí)間為3分鐘。注射乙醇胺3分鐘。
使用BIAcore 2000設(shè)備，用2000控制軟件版本3.1.1進(jìn)行CM005G08動(dòng)力學(xué)分析。全部結(jié)合循環(huán)的流速為25μL/分鐘。純化的抗體于0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性劑P20(HBS-EP運(yùn)行緩沖液；BIAcoore，Cat#BR-1001-88)中從3.75μg/mL(25nM)稀釋到0.023μg/mL(0.015nM)。每個(gè)濃度，重復(fù)3次，在5分鐘的結(jié)合相過(guò)程中和兩個(gè)受體接觸。CM005G08的解離速度通過(guò)將該復(fù)合物在存在HBS-EP緩沖液的情況下洗滌10分鐘而確定。在每次循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行再生，使用可變體積(5-12μL)的25mM NaOH以50μL/分鐘流速進(jìn)行。全部分析的溫度保持恒定在25℃。
結(jié)合數(shù)據(jù)使用BIAevaluation軟件版本3.1進(jìn)行分析。使用1∶1Langmuir結(jié)合模型。由于相對(duì)高的結(jié)合和解離速度，使用適應(yīng)結(jié)合及解離相的單獨(dú)曲線而不使用總體適應(yīng)的曲線。結(jié)合數(shù)據(jù)通過(guò)減去對(duì)照流式細(xì)胞以及緩沖液注射針對(duì)特異性作用進(jìn)行校準(zhǔn)，稱為雙參考扣除(Myszka，(1999)Improving BiosensorAnalysis.J.Molec.Recognition12，1-6)。以下符號(hào)和解釋用于描述結(jié)合參數(shù)的特性(BIAevaluationSoftware Handbook，第三版，1997，BIAcore)。
RU BIAcore設(shè)備的原始讀數(shù)，表示共振信號(hào)的強(qiáng)度，與傳感器芯片結(jié)合的物質(zhì)的重量成比例RL 定性與芯片結(jié)合的TR7量的共振信號(hào)值ka(M-1s-1)結(jié)合速度常數(shù)kd(s-1)解離速度常數(shù)KA(1/M) 平衡結(jié)合常數(shù)KD(M) 平衡解離常數(shù)Rmax(RU)被分析的芯片的最大結(jié)合能力為保證準(zhǔn)確評(píng)估不同批次的CM005G08或TRAIL與共價(jià)固定在葡聚糖基質(zhì)上的TR7的結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次?；陬A(yù)備的最佳化實(shí)驗(yàn)選擇傳感器芯片的密度和流速，以避免抗體的二價(jià)結(jié)合及質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制作用。觀測(cè)的結(jié)合特異于TR7，因?yàn)獒槍?duì)CM005G08與對(duì)照蛋白TR2-Fc的結(jié)合未觀測(cè)到共振信號(hào)(圖A.1)。所述結(jié)合遵循第一級(jí)動(dòng)力學(xué)并適應(yīng)1∶1 Langmuir結(jié)合模型?；谌齻€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)估計(jì)抗體與TRAIL2的整體親和性。所有動(dòng)力學(xué)參數(shù)以三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)值±STD表示。兩種獨(dú)立的CM005G08分別定性為KD值為0.25±0.013nM和0.33±0.003nM，解離速度為2.66×10-3±0.12×10-3/s及2.68×10-3±0.05×10-3/s。與CM005G08相比，TRAIL以較高整體親和性與TR7結(jié)合(KD＝0.04±0.003nM)，主要因?yàn)榻怆x速度較慢(kd＝1.37×10-4±0.10×10-4/s)。
實(shí)施例2抑制生物素化的TRAIL與TR7結(jié)合I.材料10×PBS(Quality Biological Cat 130-069-161，Lot 708712)Immulon4微平板(Dynex Cat 3855，Lot ND540319)牛血清白蛋白級(jí)分V(Sigma，#58H0456)三羥基甲基氨基甲烷(TRIS BASE)Tween20(Sigma)羊抗人Fc(Sigma，I-2136，#89H4871)TR-7Fc(如上述)生物素化的TRAIL(AM100200-Peprotech)HRP-鏈親和素(載體，#L0328)TMB過(guò)氧化酶微孔底物系統(tǒng)(KPL，Kirkegaard&Perry實(shí)驗(yàn)室公司)H2SO4(Fisher)96孔稀釋平板(Costar)II.緩沖液包被緩沖液(1×PBS)封閉緩沖液(于PBS中3％BSA)通用稀釋劑(于PBST中1％BSA)洗滌緩沖液(0.1％Tween20和1×PBS)III.方法將羊抗人Fc在包被緩沖液中稀釋為0.1μg/ml。將Immulon 4微平板用100μl/孔的羊抗人Fc溶液包被，并在4℃孵育過(guò)夜。從平板中輕輕倒出包被溶液，并以200μl/孔加入封閉溶液。將平板在室溫孵育1小時(shí)。孵育1小時(shí)后，從平板中輕輕倒出封閉溶液，并以100μl/孔加入1μg/mL的TR7-Fc，在室溫孵育2小時(shí)。孵育后，將平板用Wheaton manifold人工洗滌5次。
相當(dāng)于本發(fā)明scFvs的抗體在低結(jié)合稀釋平板中使用稀釋劑(預(yù)先)制備。制備兩份該抗體并針對(duì)隨后的7個(gè)孔從原液濃度以2.5倍稀釋。如果獲得純化形式的抗體，起始濃度為5μg/mL。將陽(yáng)性對(duì)照(TR7-Fc)從5μg/mL稀釋。將100μl移至ELISA平板中，并在室溫預(yù)孵育30分鐘。向100μL上清中加入20μl的5μg/mL生物素化的TRAIL并混合。將組合的120μl溶液在室溫孵育2小時(shí)。
孵育2小時(shí)后，重復(fù)洗滌循環(huán)并將平板輕輕倒出及印跡。將HRP-鏈親和素以1∶2000稀釋并加入100μl/孔。在室溫孵育1小時(shí)。同時(shí)，組合等量的TMB過(guò)氧化酶底物和過(guò)氧化酶溶液B，將溶液在室溫下平衡。
孵育1小時(shí)后，輕輕倒空平板并用PBST洗滌5次及印跡。組合TMB過(guò)氧化酶底物和過(guò)氧化酶溶液B，并在每個(gè)孔中加入100μl。在室溫生色15分鐘。向每個(gè)孔中加入50μl的1M H2SO4中止生色。使用得自Molecular Devices的分光計(jì)在450nm立即讀數(shù)平板。
然后測(cè)定IC-50，即引起平臺(tái)結(jié)合抑制50％的純化的抗體濃度。為進(jìn)行對(duì)比，在該分析中使用TR7多肽作為樣品。
使用上述分析示出包含CM005G08的VH和VL結(jié)構(gòu)域的完整IgGl抗體強(qiáng)烈抑制生物素化的TRAIL與TR7結(jié)合，表明CM005G08和TRAIL競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TR7。兩組CM005G08的IC-50值為5.30和6.89nM，對(duì)比之下，TRAIL的IC-50值為1.77nM。IC-50值的不同反映了CM005G08與TRAIL相比對(duì)TR7具有較低結(jié)合親和性的事實(shí)。
實(shí)施例3分析抗TRAIL-TR7抗體誘導(dǎo)凋亡的能力一般方法測(cè)試抗TR7抗體單獨(dú)或者組合環(huán)己酰亞胺，化療劑或交聯(lián)劑誘導(dǎo)TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的能力。簡(jiǎn)而言之，測(cè)試抗體誘導(dǎo)TR7介導(dǎo)的TR7表達(dá)細(xì)胞系，SW480，MDA-MB-231和Colo205凋亡的活性。不表達(dá)TR7的細(xì)胞系用作陰性對(duì)照。
為誘導(dǎo)凋亡，將MDA-MB-231，SW480或Colo205細(xì)胞用指定濃度的本發(fā)明單克隆抗體或人對(duì)照抗體孵育。在分析前一天，將細(xì)胞(1.5×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞/ml；4×105個(gè)SW480個(gè)細(xì)胞/ml或者4×105個(gè)Colo205個(gè)細(xì)胞/ml；100μl/孔)種植于96孔平板的孔中并使其貼壁過(guò)夜。第二天，在有或無(wú)環(huán)己酰亞胺(1.0-2.0μg/ml，Sigma R75010-7)情況下加入測(cè)試抗體。在一些實(shí)驗(yàn)中，將抗TR7單克隆抗體的效力與rhuTRAIL-FLAG蛋白(Alexis Biochemicals)或在HGS中產(chǎn)生的非標(biāo)簽的可溶rhuTRAIL對(duì)比。在存在2μg/ml抗FLAG增強(qiáng)子抗體的情況下以指定濃度使用rhuTRAIL-FLAG。二級(jí)交聯(lián)的作用通過(guò)測(cè)定單克隆抗體單獨(dú)或者存在二級(jí)羊抗人IgFc特異性抗體(SIGMA)情況下殺死細(xì)胞的能力而確定。二級(jí)交聯(lián)抗體以與測(cè)試的單克隆抗體相同濃度加入細(xì)胞中。
用MDA-MB-231或SW480的分析在37℃進(jìn)行16-18小時(shí)，之后使用試劑Alamar Blue(Biosource，cat.#DAL1100)顯示存活，使用廠商建議的條件。Alamar Blue熒光使用CytoFluor熒光讀數(shù)器在530nm激發(fā)和590nm發(fā)射下檢測(cè)。結(jié)果以與未用抗體處理的細(xì)胞對(duì)比的存活百分率表示。用Colo205的分析在37℃進(jìn)行48小時(shí)，之后使用生色試劑CellTiter96_AqueousOne Solution(Promega，cat.#G3581)顯示存活，使用廠商建議的條件。使用96孔SPECTRAmax Plus384Molecular Devices平板讀數(shù)器(或等價(jià)物)在490nm檢測(cè)吸光度。
可以在這個(gè)分析中使用(及用于結(jié)合本發(fā)明抗體的治療方案中)的其它化療劑包括例如5-氟尿嘧啶，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，紫杉醇，順鉑，Cytabarine(Cytosar)，IFN-γ，喜樹堿，irinotecan(camptosar，CPT-11)，阿霉素，氨甲蝶呤，paraplatinin，α-干擾素，β-干擾素，太平洋紫杉醇，docetaxel，NF-κ-B抑制劑SN50，及gemcitabine(GemzarTM)。可以在這個(gè)分析中可以使用的其它細(xì)胞系包括例如人纖維肉瘤細(xì)胞系HT-1080，人宮頸癌細(xì)胞系ME-180和HeLa，人惡性黑素瘤細(xì)胞系RPMI-7951，SK-MEL-1和G361；人成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat，人子宮癌細(xì)胞系SK-UT-1和RL-95，人肺癌細(xì)胞系SK-MES-1，人結(jié)腸癌細(xì)胞系，LS174T，HT29和HCT116，su.86.86和CFPAC胰腺癌細(xì)胞系，人卵巢癌細(xì)胞系TOV21G，及人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2和SNU449及人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH。相當(dāng)于這些癌細(xì)胞衍生自其中的組織的組織癌癥可以用本發(fā)明的治療組合物治療。
抗TR7抗體分析使用上述分析，對(duì)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)檎麄€(gè)IgG1分子的本發(fā)明的一些scFvs測(cè)試其誘導(dǎo)TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡的能力。在上述分析中測(cè)試相當(dāng)于scFvs CM083C12，CM014C10，CM088F10，CM084G02，CM084A02，CM005G08和CM059H03的IgG1抗體。不相關(guān)特異性的人IgG1抗體用作陰性對(duì)照，TRAIL用作陽(yáng)性對(duì)照。
CM005G08，CM084A02和CM084G02的IgG1形式在存在1μg/ml環(huán)己酰亞胺的情況下誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231凋亡。在沒(méi)有環(huán)己酰亞胺的情況下，在這個(gè)分析中觀測(cè)到抗TR7抗體或TRAIL很少或不殺死MDA-MB231或SW480細(xì)胞，除了TRAIL在沒(méi)有環(huán)己酰亞胺的情況下能殺死MDA-MBA231細(xì)胞之外。針對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo205，測(cè)試的抗TR7抗體，CM005G08，CM084A02和CM059H03在沒(méi)有環(huán)己酰亞胺和額外的交聯(lián)劑的情況下誘導(dǎo)凋亡。TRAIL還在Colo205細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡(見圖1A-1D，數(shù)據(jù)未示出)?？筎R7抗體降低測(cè)試細(xì)胞存活的能力通過(guò)加入交聯(lián)劑而增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未示出)。
另外，這個(gè)實(shí)施例中描述的分析還可用于測(cè)試一種以上抗TRAIL受體抗體對(duì)TRAIL受體表達(dá)細(xì)胞的作用。例如，細(xì)胞可以用特異性結(jié)合TR4的抗體和特異性結(jié)合TR7的抗體處理。如上所述，可以在有或無(wú)一或多種化療劑或交聯(lián)劑的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在另一種變化的實(shí)驗(yàn)中，可以測(cè)試本發(fā)明的抗體當(dāng)在存在TRAIL的情況下使用時(shí)誘導(dǎo)凋亡的能力。與單獨(dú)用抗TR4或抗TR7處理相比，用抗TR4和抗TR7雙重處理誘導(dǎo)的凋亡的數(shù)量更多。當(dāng)在存在化療劑和/或交聯(lián)劑的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，這種作用更明顯。
實(shí)施例4鑒別及克隆VH和VL結(jié)構(gòu)域從表達(dá)特殊抗體的細(xì)胞系中鑒別和克隆VH和VL結(jié)構(gòu)域的一種方法是使用VH和VL特異性引物對(duì)從抗體表達(dá)細(xì)胞中產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行PCR。簡(jiǎn)而言之，從所述細(xì)胞系中分離RNA，并用作RT-PCR的模板，所述RT-PCR設(shè)計(jì)為擴(kuò)增EBV細(xì)胞系表達(dá)的抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞可以在TRIzol_試劑(Life Technologies，Rockville，MD)中裂解，并用1/5體積的氯仿提取。在加入氯仿后，將溶液在室溫孵育10分鐘，然后在4℃在桌面離心器中以14000rpm離心15分鐘。收集上清，使用等體積的異丙醇沉淀RNA。沉淀的RNA通過(guò)在4℃在桌面離心器中以14000rpm離心15分鐘而沉淀。在離心后，棄去上清并用75％乙醇洗滌。在洗滌后，將RNA在4℃在800rpm再離心5分鐘。棄去上清并將沉淀在空氣中干燥。將RNA溶解于DEPC水中，并在60℃加熱10分鐘。使用光密度測(cè)定可以確定RNA的數(shù)量。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，可以從1.5-2.5μg RNA中合成cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物。然后將cDNA用作擴(kuò)增VH和VL結(jié)構(gòu)域的PCR模板。用于擴(kuò)增VH和VL基因的引物示于表6。典型地，PCR反應(yīng)使用一個(gè)5’引物和一個(gè)3’引物。有時(shí)當(dāng)可利用的RNA模板數(shù)量有限，或者為達(dá)到更高效力時(shí)，可以使用5’和/或3’引物組。例如，有時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)中，使用所有5個(gè)VH-5’引物和所有JH3，引物。PCR反應(yīng)在50μl體積中進(jìn)行，所述體積中含有1×PCR緩沖液，2mM的每種dNTP，0.7單位的高保真Taq聚合酶，5’引物混合物，3’引物混合物和7.5μl的cDNA。VH和VL的5’和3’引物混合物可以通過(guò)集合分別為22pmol和28pmol的各個(gè)引物而產(chǎn)生。PCR條件是96℃5分鐘；隨后進(jìn)行25次94℃1分鐘，50℃1分鐘及72℃1分鐘循環(huán)；接著進(jìn)行一次72℃10分鐘的延伸循環(huán)。在反應(yīng)完成后，將樣品管貯存于4℃。
表6用于擴(kuò)增VH和VL結(jié)構(gòu)域的引物序列引物名稱 SEQ ID NO引物序列(5’-3’)VH引物Hu VH1-5’ 6 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGHu VH2-5’ 7 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGGHu VH3-5’ 8 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGHu VH4-5’ 9 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGHu VH5-5’ 10 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGCHu VH6-5’ 11 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGHu JH1，2-5’ 12 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCHu JH3-5’ 13 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCHu JH4，5-5’ 14 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCHu JH6-5’ 15 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCVL引物Hu Vkappa1-5’ 16 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCHu Vkappa2a-5’ 17 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCHu Vkappa2b-5’ 18 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCHu Vkappa3-5’ 19 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCHu Vkappa4-5’ 20 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCHu Vkappa5-5’ 21 GAAACGACACTCACGCAGTCTCCHu Vkappa6-5’ 22 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCHu Vlambda1-5’ 23 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCHu Vlambda2-5’ 24 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCHu Vlambda3-5’ 25 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCHu Vlambda3b-5’ 26 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCHu Vlambda4-5’ 27 CACGTTATACTGACTCAACCGCCHu Vlambda5-5’ 28 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCHu Vlambda6-5’ 29 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAHu Jkappa1-3’ 30 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCHu Jkappa2-3’ 31 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCHu Jkappa3-3’ 32 ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCHu Jkappa4-3’ 33 ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCHu Jkappa5-3’ 34 ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCHu Jkambda1-3’ 35 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCHu Jlambda2-3’ 36 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCHu Jlambda3-3’ 37 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCHu Jlambda3b-3’ 38 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCHu Jlambda4-3’ 39 CACGTTATACTGACTCAACCGCCHu Jlambda5-3’ 40 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCHu Jlambda6-3’ 41 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
然后將PCR樣品在1.3％瓊脂糖凝膠上電泳?？梢詮哪z中切下預(yù)期大小的(針對(duì)VH結(jié)構(gòu)域?yàn)榇蠹s506bp，針對(duì)VL結(jié)構(gòu)域?yàn)榇蠹s344bp)DNA條帶，并使用本領(lǐng)域熟知的方法純化。純化的PCR產(chǎn)物可以連接于PCR克隆載體(TA載體，來(lái)自Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在大腸桿菌轉(zhuǎn)染及藍(lán)/白篩后，可以分離各個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物?？寺〉腜CR產(chǎn)物然后使用本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)序。
實(shí)施例5抗TR7抗體在裸鼠中阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)將9周齡的雌性無(wú)胸腺小鼠(Balb/c nu/nu小鼠，體重20-25g，購(gòu)自Taconic，Germantown，NY)在第0天，在側(cè)腹部皮下注射對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的107個(gè)Colo 205(結(jié)腸直腸腺癌，ATCC No.CCL-222)腫瘤細(xì)胞。使腫瘤生長(zhǎng)5天，之后用抗體處理，此時(shí)腫瘤大小為大約100mm3。
將小鼠用包含來(lái)自CM005G08(抗TR7抗體，見表1)或T1014G03(抗TR4抗體，見例如美國(guó)申請(qǐng)No 60/341237所述，在此以其全文并入?yún)⒖?的VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體處理，或者用CM005G08和T1014G03這兩種抗體處理，或者只用PBS稀釋劑處理。在這個(gè)實(shí)施例及以下的實(shí)施例6和8中，包含來(lái)自CM005G08或T1014G03的VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體分別稱為CM005G08或T1014G03?？贵w處理如下荷載劑量0.4mg(20mg/kg)，注射腫瘤細(xì)胞后6天開始靜脈內(nèi)注射，兩次維持劑量0.2mg(10mg/kg)，靜脈內(nèi)注射，間隔一周給予。在第11，14，18，21和25天測(cè)定腫瘤大小。使用測(cè)徑器一式三份在2個(gè)軸測(cè)定腫瘤直徑，使用公式(寬度2×長(zhǎng)度)/2計(jì)算腫瘤體積。只用T1014G03處理的小鼠與對(duì)照PBS處理組在第14天相比，腫瘤體積明顯較小。用CM005G08或CM005G08和T1014G03處理的小鼠在第18天無(wú)明顯的腫瘤(數(shù)據(jù)未示出)。
上述分析也可以用于測(cè)試一或多種抗TRAIL受體抗體與化療劑組合的治療作用?？梢杂糜谶@個(gè)分析(及用于聯(lián)合本發(fā)明抗體的治療方案)的化療劑包括例如5-氟尿嘧啶，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，紫杉醇，順鉑，Cytabarine(Cytosar)，IFN-γ，喜樹堿，irinotecan(camptosar，CPT-11)，阿霉素，氨甲蝶呤，paraplatinin，α-干擾素，太平洋紫杉醇，docetaxel，NF-κ-B抑制劑SN50，及gemcitabine(GemzarTM)?？捎糜谶@個(gè)分析的其它細(xì)胞系包括例如人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，LS174T和HCT116；人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(見實(shí)施例8)；人宮頸癌細(xì)胞系Hela；人肺癌細(xì)胞系SK-MES-1；CFPAC，HPAF-II，MPANC-96和su.86.86和胰腺癌細(xì)胞系；人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SNU449，Hep3B2.1-7和HepG2；及人卵巢癌細(xì)胞系OV90，Caov-3，TOV21G和SKOV3。相當(dāng)于這些癌細(xì)胞衍生的組織的組織癌癥可以用本發(fā)明的治療組合物治療。
在該實(shí)驗(yàn)的另一種變化中，本發(fā)明的抗體可以與TRAIL組合施用。這種組合治療與用單獨(dú)抗體治療相比抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力可以使用上述方法分析，并將得自組合治療的結(jié)果與得自用抗TR4，抗TR7或抗TR4和抗TR7治療的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
實(shí)施例6抗TR7抗體在裸鼠中阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)將SW480(結(jié)腸直腸腺癌)腫瘤細(xì)胞系在體外保持在Leibovitz’sL-15培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加了胎牛血清，谷氨酰胺和抗生素，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的指導(dǎo)。3-10代的細(xì)胞用于體內(nèi)研究。從T-150培養(yǎng)瓶中收獲腫瘤細(xì)胞，用無(wú)菌PBS漂洗，然后以5×104個(gè)細(xì)胞/μl的密度重懸于無(wú)菌鹽水中。
將SW480腫瘤細(xì)胞皮下種植于雄性Swiss無(wú)胸腺小鼠(6-8周齡，體重20-25g，購(gòu)自Taconic，Germantown，NY)的上背部或側(cè)部，密度為107個(gè)細(xì)胞/位點(diǎn)，每只動(dòng)物2個(gè)位點(diǎn)。在預(yù)防性(de novo)腫瘤模型中，在接種腫瘤細(xì)胞后24小時(shí)開始進(jìn)行化療劑和抗體處理。
T1014G03，CM005G08或不相關(guān)特異性的IgGl對(duì)照抗體經(jīng)腹膜內(nèi)注射(i.p.)施用，劑量為在第1，3和5天10mg/kg，然后每周施用3次。所述抗體和對(duì)照處理的作用通過(guò)間隔3-4天用測(cè)徑器在2個(gè)軸測(cè)定腫瘤大小而評(píng)估。
與對(duì)照IgG1治療相比，T1014G03和CM005G08治療均明顯降低腫瘤形成(見圖2)。
上述分析也可以用于測(cè)試一或多種抗TR7和/或TR4抗體在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療作用。例如，對(duì)已經(jīng)注射腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物可以用特異結(jié)合TR4的抗體和特異結(jié)合TR7的抗體處理。如上所述，這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在有或無(wú)一或多種化療劑的情況下進(jìn)行。在該實(shí)驗(yàn)的另一種變化中，本發(fā)明的抗體可以與TRAIL組合施用。這種組合治療抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力與單獨(dú)用抗體處理的對(duì)比，可以使用上述方法加以分析，并對(duì)比組合治療與單獨(dú)用抗TR4或抗TR7抗體處理的結(jié)果。
實(shí)施例7抗TR7抗體對(duì)人肝細(xì)胞的作用以下方案是本發(fā)明抗TR7抗體怎樣對(duì)人原代肝細(xì)胞的存活起作用的示例，例如通過(guò)測(cè)定caspase激活或細(xì)胞存活進(jìn)行。
將人肝細(xì)胞用15.6，62.5，250或1000ng/ml的TRAIL(氨基酸殘基114-281，Biomol Research Laboratories公司，Plymouth Meeting，PA)，62.5，125，250或1000ng/ml的同種型對(duì)照mAb(hIgG1，CAT002)，或者62.5，125，250或1000ng/ml抗TR7抗體處理。在處理6小時(shí)后測(cè)定caspase激活，在處理24小時(shí)后測(cè)定存活。
Caspase活性利用caspase底物羅丹明綴合的DEVD使用熒光分析測(cè)定(例如得自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的同源熒光caspase分析)。細(xì)胞存活使用ALAMAR BlueTM分析(Biosource International，Camarillo，CA)測(cè)定。
實(shí)施例8抗TR7抗體對(duì)MDA-MB-231乳腺癌模型的作用
MDA-MB-231細(xì)胞系是一種表達(dá)TR7的人乳腺癌細(xì)胞系?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)，選擇無(wú)胸腺小鼠中MDA-MB-231模型以測(cè)試CM005G08(IgG1形式)在體內(nèi)對(duì)降低預(yù)先存在的腫瘤體積的作用。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)當(dāng)單一使用CM005G08時(shí)，其是否能以劑量依賴的形式改變無(wú)胸腺小鼠中預(yù)先建立的MDA-MB-231腫瘤的生長(zhǎng)模式。為評(píng)估CM005G08對(duì)MDA-MB-321腫瘤的作用，在多種濃度單獨(dú)測(cè)試CM005G08，與陰性對(duì)照抗體(CAT002)進(jìn)行對(duì)比。將Swiss裸鼠分為6組，每組10只小鼠。在第0天，將小鼠在右側(cè)乳房下方部位(腹股溝部位)皮下注射(SC)1×106MDA-MB-231細(xì)胞。在第6，11，16和21天，將二組小鼠靜脈內(nèi)(IV)施用陰性對(duì)照抗體(CAT002)，劑量為10或0.1mg/kg，四組靜脈內(nèi)施用CM005G08，劑量為10，5，1和0.1mg/kg。一周測(cè)定兩次腫瘤體積，直至在接種腫瘤后第46天。
CM005G08從1.0至10mg/kg劑量以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長(zhǎng)。在全部46天的時(shí)期分析腫瘤生長(zhǎng)示出與兩組陰性對(duì)照抗體組相比，在小鼠中施用10，5和1mg/kg的CM005G08均高度明顯延遲腫瘤進(jìn)展。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第46天分析腫瘤體積，示出用10和5mg/kg的CM005G08處理的小鼠與10mg/kg的陰性對(duì)照組相比，腫瘤體積明顯減小(分別為p＝0.0025，和p＝0.0036)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中施用0.1mg/kg CM005G08的小鼠未示出任何有益作用。這些數(shù)據(jù)提示單獨(dú)的CM005G08能以劑量依賴性形式有效延遲腫瘤生長(zhǎng)。
應(yīng)了解本發(fā)明可以用與前述描述和實(shí)施例不同的方式進(jìn)行。因此根據(jù)上述教導(dǎo)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的各種修改和變化均在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明背景，詳細(xì)描述和實(shí)施例中引用的文獻(xiàn)(包括專利，專利申請(qǐng)，雜志文章，摘要，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，書籍或其它參考文獻(xiàn))的全部?jī)?nèi)容在此均并入?yún)⒖肌?br> 另外，本文提交了的序列表均以其全文并入?yún)⒖肌?br> 以下美國(guó)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容(包括說(shuō)明書，序列表和附圖)在此以其全文并入?yún)⒖济绹?guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/341237，2001年12月20日申請(qǐng)；No.60/369877，2002年4月5日申請(qǐng)；No.60/384828，2002年6月4日申請(qǐng)；No.60/396591，2002年7月18日申請(qǐng)；No.60/403370，2002年8月15日申請(qǐng)；No.60/425737，2002年11月13日申請(qǐng)。
序列表<110>人體基因組科學(xué)有限公司<120>免疫特異性結(jié)合TRAIL受體的抗體<130>PF585PCT<140>Unassigned<141>2002-12-19<150>60/341,237<151>2001-12-20<150>60/369,877<151>2002-04-05<150>60/384,828<151>2002-06-04<150>60/396,591<151>2002-07-18<150>60/403,370<151>2002-08-15<150>60/425,737<151>2002-11-13<160>72<210>1<211>468<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val1 5 10 15Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala20 25 30Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile Glu Pro Arg35 40 45Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Pro Thr Ser Met Gly Gln His Gly Pro50 55 60Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg65 70 75 80Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val85 90 95Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys100 105 110Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu115 120 125
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Val Asp Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala450 455 460Val Ser Leu Glu465<210>2<211>299<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gln Gly Val Lys Glu Arg Phe Leu Pro Leu Gly Asn Ser Gly Asp1 5 10 15Arg Ala Pro Arg Pro Pro Asp Gly Arg Gly Arg Val Arg Pro Arg Thr20 25 30Gln Asp Gly Val Gly Asn His Thr Met Ala Arg Ile Pro Lys Thr Leu35 40 45Lys Phe Val Val Val Ile Val Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Tyr50 55 60Ser Ala Thr Thr Ala Arg Gln Glu Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala65 70 75 80Pro Gln Gln Gln Arg His Ser Phe Lys Gly Glu Glu Cys Pro Ala Gly85 90 95Ser His Arg Ser Glu His Thr Gly Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly100 105 110Val Asp Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn Glu Pro Ser Cys Phe Pro Cys115 120 125Thr Val Cys Lys Ser Asp Gln Lys His Lys Ser Ser Cys Thr Met Thr130 135 140Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Lys Glu Gly Thr Phe Arg Asn Glu Asn145 150 155 160Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser Arg Cys Pro Ser Gly Glu Val165 170 175Gln Val Ser Asn Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ile Gln Cys Val Glu Glu180 185 190Phe Gly Ala Asn Ala Thr Val Glu Thr Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met195 200 205Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Asn210 215 220Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr225 230 235 240Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser
245 250 255Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro260 265 270Gly Thr Pro Ala Ser Ser His Tyr Leu Ser Cys Thr Ile Val Gly Ile275 280 285Ile Val Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Phe Val290 295<210>3<211>411<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys1 5 10 15Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro20 25 30Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu35 40 45Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln50 55 60Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu65 70 75 80Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser85 90 95Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe100 105 110Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro115 120 125Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe130 135 140Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys145 150 155 160Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile165170 175Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala180 185 190Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp195 200 205Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly210 215 220
Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp225 230 235 240Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro245 250 255Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn260 265 270Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala275 280 285Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp290 295 300Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val305 310 315 320Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp325 330 335Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr340 345 350Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala355 360 365Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu370 375 380Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met385 390 395 400Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser405 410<210>4<211>386<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Gly Leu Trp Gly Gln Ser Val Pro Thr Ala Ser Ser Ala Arg Ala1 5 10 15Gly Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Thr Ala Ser Gly Thr Arg Pro Trp Leu20 25 30Leu Asp Pro Lys Ile Leu Lys Phe Val Val Phe Ile Val Ala Val Leu35 40 45Leu Pro Val Arg Val Asp Ser Ala Thr Ile Pro Arg Gln Asp Glu Val50 55 60Pro Gln Gln Thr Val Ala Pro Gln Gln Gln Arg Arg Ser Leu Lys Glu65 70 75 80Glu Glu Cys Pro Ala Gly Ser His Arg Ser Glu Tyr Thr Gly Ala Cys85 90 95
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<211>401<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile1 5 10 15Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp20 25 30Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr35 40 45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro50 55 60Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65 70 75 80Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu85 90 95Cys Asn Arg Thr His ASn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr100 105 110Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe115 120 125Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg130 135 140Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145 150 155 160Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys165 170 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr180 185 190Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg195 200 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val210 215 220Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu245 250 255Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln260 265 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala275 280 285Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
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aggccaggga ggagtggtta ttttgactac tggggccggg gtaccctggt caccgtctcc 360tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcggatcgtc tgagctgact 420caggaccctg ctgtgtctgt ggccttggga cagacagtca ggatcacatg ccaaggagac 480agcctcagaa gctattatgc aagctggtac cagcagaagc caggacaggc ccctgtactt 540gtcatctatg gtaaaaacaa ccggccctca gggatcccag accgattctc tggctccagc 600tcaggaaaca cagcttcctt gaccatcact ggggctcagg cggaagatga ggctgactat 660tactgtaact cccgggacag cagtggtaac catgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 720accgtcctag gc 732<210>61<211>705<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM033D06 scFv<400>61caggtacagc tgcagcagtc aggggccgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagggtc 60tcctgccagg cctctggata cagcctcagc gaatactata tccactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatggggtgg ctgaatccta acagtggtgt cacagactac 180gcacagaagt ttcagggccg cgtctccatg accagggaca cgtcaatcag tacagcctac 240atggaactga gtagtctgac ttttaacgac acggccgtct atttctgtgc gcggggtaat 300ggcgactact ggggcaaagg aaccctggtc accgtctccc caggtggagg cggttcaggc 360ggaggtggca gcggcggtgg cggatcgtct gagctgactc aggaccctgc tgtgtctgtg 420gccttgggac agacagtcag gatcacttgc caaggagaca gtctcagaag ctattacaca 480aactggttcc agcagaagcc aggacaggcc cctctacttg tcgtctatgc taaaaataag 540cggccctcag ggatcccaga ccgattctct ggctccagct caggaaacac agcttccttg 600accatcactg gggctcaggc ggaagatgag gctgactatt actgtcattc ccgggacagc 660agtggttggg tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggt 705<210>62<211>735<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM013A11 scFv<400>62caggtccagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt cctgacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120ccaggcaagg ggctggagtg gatgggagtt atttcgtttg atggaagcca aacattctac 180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcccagaa tacactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag atctgatgac acggctgtct attactgtgc gagagccccc 300gcgcgttttt ttcctcttca ctttgacatc tggggccggg ggacaatggt caccgtctcg 360agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc actttcttct 420gagctgactc aggaccctgc tgtgtctgtg gccttgggac agacagtccg gatcacctgc 480cagggggaca gcctcagaac gcattatgca agctggtacc accagaggcc agggcgggcc 540cctgtccttg tcaactatcc taaagacagt cggccctcgg ggatcccaga ccgattttct 600ggctccagct caggcaacac agcttctttg accatcattg gggctcaggc ggcagatgag 660ggtgactact attgtcagtc acgggacagc agtggtgttc ttttcggcgg agggaccaag 720gtcaccgtcc taggt 735<210>63<211>741<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM013F04 scFv<400>63gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggatttt 300tctggctacg gtgactactt ggactactgg ggcaagggca ccctggtcac cgtctcgagt 360ggaggcggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gaagtgcaca atctgccctg 420actcagcctc cctccgcgtc cggatctcct ggacagtcag tcaccatctc ctgcactggc 480accagcagtg acattggtaa ttataactat gtctcctggt accaacaaca cccaggcaaa 540gcccccaaac tcatgattta tgaagtcaat gagcggccct caggggtccc tgatcgcttc 600tctggctcca agtctggcaa cacggcctcc ctgaccgtct ctgggctccg gcctgaggat 660gaggctgatt attactgcag ctcatatgca ggcaacaacg ccgtaatttt cggcggaggg 720acCcagctCa ccgtcctagg t741<210>64<211>765<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM088F10 scFv<400>64caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60tcctgcaagg cttctggata caccttcact acccatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120cccggacaaa gccttgagtg gatgggatgg atcaacactg gcaatggtaa cacaaaatat 180tcacagagtt tccagggcag agtcagcatt accagagaca catccgcgaa cacagcctac 240atggaattga gcagccttaa atctgaagac acggctatgt attactgtgc gagggctagt 300cgtgatagta gtggttatta ctacgttccc cccggcgatt tttttgatat ctggggccaa 360ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggaggc ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 420ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag cctgcctccg tgtctgggtc tcctggacag 480tcgatcacca tctcctgcac tggaagcaga agtgacattg gtggttataa ctttgtctcc 540tggtaccaac aacacccagg caaagccccc aaactcctga tctatgatgt ctataatcgg 600ccctcaggaa tttctgatca cttctctggc tccaagtctg acaacacggc ctccctgacc 660atctctggcc tccagtctga ggacgacgct gattattact gcagttcata tgcaggctac 720cacacctgga ttttcggcgg ggggaccaag gtcaccgtcc taggt 765<210>65<211>744<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM084A02 scFv<400>65gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaactt 60tcctgcaagg catctggata cacccttgtc aactacttta tgcactgggt acgacaggcc 120cctggacaag ggcctgagtg gatgggaatg atcaacccta gtggtggtac tacaaagaac 180agacagaagt tccaggacag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag aacagtctat 240atggagttga gtggtctgac atctgaagac acggccgtct attactgtgc gaccgacttt 300aaggggaccg atattctctt ccgggactgg ggccggggca ccctggtcac cgtctcgagt 360ggaggcggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gaagtgcaca gtctgtgttg 420acgcagccgc cctccgcgtc tgggaccccc gggcagaggg tctccatctc ttgttctggc 480agcagctcca atatcggaag taatactgtc atctggtacc agcaactccc aggaacggcc 540cccaaactcc tcatgtatag taatgatcgc cggccctcag gggtccctga ccgattctct 600ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg gccatcagtg ggctccagtc tgaggatgag 660
gctgattatt actgtgcaac atgggatgac agcctgaatg gccattatgt cttcggaact 720gggaccaagc tgaccgtcct aggt 744<210>66<211>729<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM087C06 scFv<400>66cagatgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc aagaggagga 300tccacttttg atatctgggg ccgggggaca atggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt 360tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga agtgcacagc ctgtgctgac tcagccaccc 420tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gttctggaag caactccaac 480atcggaagca ggcctgtaaa ttggtaccag cagctcccag gaacggcccc caaactcctc 540attcaaggta acaatcagcg gccctcaggg gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct 600ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccagtctg aggatgaggc tgattattac 660tgtgcagctt gggatgacag cctgactggt tatgtcttcg gacctgggac caagctgacc 720gtcctaggt 729<210>67<211>720<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM055A01 scFv<400>67cagatgcagc tggtgcagtc tgggggagcc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cttctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtat taaatactat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaacgg 300ttacggggcc tcgacccctg gggccagggg acaatggtca ccgtctcgag tggtggaggc 360ggttcaggcg gaggtggcag cggcggtggc ggatcgtctg agctgactca ggaccctgct 420gtgtctgtgg ccttgggaca gacagtcagg atcacatgcc aaggagacag cctcagaagc 480tattatgcaa gctggtacca gcagaagcca ggacaggccc ctgtactcgt catctatggt 540aaaaacaacc ggccctcagg gatcccagac cgattctctg gctccagctc aggaaacaca 600gcttccttga ccatcactgg ggctcaggcg gaagatgagg ctgactatta ctgtaactcc 660cgggacagca gtggtaacca tgtggtattc ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt 720<210>68<211>729<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM085C11 scFv<400>68gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccctattaca tgagctgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag tatatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccctat attactgtgc gagaggggca 300tctggccctg actactgggg cagagggaca atggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt 360tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga agtgcacagt ctgtgttgac gcagccgccc 420tcagtgtctg cggccccagg acagaaggtc accatctcct gctctggaag cacctccaac 480attgggaata attatgtatc ctggtaccag caggtcccag gaacagcccc caaactcctc 540atttatgaca ataataagcg accctcaggg attcctgacc gattctctgg ctccaagtct 600ggcacgtcag ccaccctggg catcaccggg ctccagactg gggacgaggc cgattattac 660tgcggaacat gggatagtag cctgagtgct ctggtattcg gcggagggac caaggtcacc 720gtcctaggt 729<210>69<211>759<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM089A03 scFv<400>69caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaccc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60tcctgcaagg cttctggagg caccttcagg aacaacgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120cctggacaag gccttgagtg gatgggaggg ttcatcccta agtttggaac aacaaaccac 180gcacagaagt tccagggcag agtcacgatg accgcggacg actccacgaa cacagtctac 240atggaactga gcagtctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagggggggc 300gcatattgtg gtggtggtag atgctatctt tacggtatgg acgtctgggg ccagggaacc 360ctggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 420agtgcacagg ctgtggtgat ccaggagccc tcactgactg tgtccccagg agggacagtc 480actctcacct gtggctccag cactggagct gtcaccagtg gtcattatcc ctactggttc 540cagcagaagc ctggccaagc ccccaggaca ctgatttatg acacaagtaa taaacgctcc 600tggacccctg cccggttctc aggctccctc cttgggggca aagctgccct gaccctttcg 660ggtgcgcagc ctgaggatga ggctgaatat tactgcttgg tctcctatag tggttctctt 720gtggtattcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggt 759<210>70<211>729<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM075A01 scFv<400>70gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgt caaaggagct 300tggcttgact actggggccg ggggacaatg gtcaccgtct cgagtggagg cggcggttca 360ggcggaggtg gctctggcgg tggcggaagt gcacttaatt ttatgctgac tcagccccac 420tctgtgtcgg agtctccggg gaagacggta accatctcct gcaccggcag cagtggcagt 480gttgccagaa actatgtgca gtggtaccaa cagcgcccgg gcagtgcccc caccattgtt 540atttatgagg ataaccgaag accctctggg gtccctggtc ggttctctgg ctccatcgac 600aggtcctcca attctgcctc cctcaccatc tcaggactgc agactgagga cgaggctgac 660tactactgtc agtcttataa ttacaacact tgggtgttcg gcggagggac caagctgacc 720gtcctaggt 729<210>71<211>741<212>DNA
<213>Artificial sequence<220>
<223>DNA encoding CM059H03 scFv<400>71gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60tcctgcaggg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcacctgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggaaa gacaaactat 180gtacaggagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagtctac 240atggagctga cgagcctgag atctgacgac acggccgtat attactgtgc gagacgggga 300aacaactata ggttcggtta ttttgacttc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acttgaaacg 420acactcacgc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480tgcagggcca gtcagagtat tagtagcagt aacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540cgggctccca ggctcctcat ctatggtgcg tccagcaggg ccattggcat cccagacagg 600ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggaggctgaa 660gattttgcag tgtattactg tcagcagtat ggtagctctc cgatcacctt cggccaaggg 720acacgactgg agattaaacg t741<210>72<211>281<212>PRT<213>Homo sapiens<400>72Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys1 5 10 15Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala20 25 30Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys35 40 45Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr50 55 60Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser85 90 95Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro100 105 110Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly115 120 125Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile165 170 175His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln195 200 205Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys210 215 220Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile245 250 255Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala260 265 270Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly275 280
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或其片段，其包含與選自以下一組的第二種氨基酸序列至少95％相同的第一種氨基酸序列，所述的組由以下(a)和(b)組成(a)SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VHCDR1，VHCDR2或VHCDR3的氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3的氨基酸序列；其中所述抗體或其片段免疫特異性結(jié)合TR7。
2.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述第二種氨基酸序列由SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VHCDR3的氨基酸序列組成。
3.權(quán)利要求1的抗體或其片段，相對(duì)于其結(jié)合TR1、TR5、TR4和TR10的能力，其優(yōu)先結(jié)合TR7。
4.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其結(jié)合在細(xì)胞表面表達(dá)的TR7。
5.一種分離的抗體或其片段，其包含(a)與SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VH結(jié)構(gòu)域至少90％相同的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VL結(jié)構(gòu)域至少90％相同的氨基酸序列；或(c)(a)和(b)；其中所述抗體或其片段免疫特異性結(jié)合TR7。
6.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO42的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO42的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO50的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO50的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO56的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO56的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求5的抗體或其片段，相對(duì)于其結(jié)合TR1、TR5、TR4和TR10的能力，其優(yōu)先結(jié)合TR7。
10.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其結(jié)合在細(xì)胞表面表達(dá)的TR7。
11.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其包含(a)SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO42-56任一個(gè)的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；或(c)(a)和(b)；其中所述抗體或其片段免疫特異性結(jié)合TR7。
12.權(quán)利要求11的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO42的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO42的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO50的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO50的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求11的抗體或其片段，其中所述VH結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO56的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，所述VL結(jié)構(gòu)域具有SEQ IDNO56的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求11的抗體或其片段，相對(duì)于其結(jié)合TR1、TR4、TR5和TR10的能力，其優(yōu)先結(jié)合TR7。
16.權(quán)利要求11的抗體或其片段，其結(jié)合在細(xì)胞表面表達(dá)的TR7。
17.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段選自以下一組(a)完整免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)單克隆抗體；(d)人抗體；(e)嵌合抗體；(f)人源化抗體；(g)Fab片段；(h)Fab’片段；(i)F(ab’)2；(j)FV；和(k)二硫鍵連接的Fv。
18.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其包含選自以下一組的一個(gè)重鏈免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域(a)人IgM恒定結(jié)構(gòu)域；(b)人IgG1恒定結(jié)構(gòu)域；(c)人IgG2恒定結(jié)構(gòu)域；(d)人IgG3恒定結(jié)構(gòu)域；(e)人IgG4恒定結(jié)構(gòu)域；和(f)人IgA恒定結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其包含選自以下一組的一個(gè)輕鏈免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域(a)人Igκ恒定結(jié)構(gòu)域；和(b)人Igλ恒定結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的解離常數(shù)(KD)選自以下一組(a)在10-7M(包含)和10-8M之間的解離常數(shù)(KD)；和(b)在10-8M(包含)和10-9M之間的解離常數(shù)(KD)。
21.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的解離常數(shù)(KD)小于或等于10-9M。
22.權(quán)利要求21的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的KD在10-9M(包含)和10-10M之間。
23.權(quán)利要求21的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的KD在10-10M(包含)和10-11M之間。
24.權(quán)利要求21的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段的KD在10-11M(包含)和10-12M之間。
25.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與一種可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
26.權(quán)利要求25的抗體或其片段，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是一種放射標(biāo)記。
27.權(quán)利要求26的抗體或其片段，其中所述放射標(biāo)記是125I，131I，111In，90Y，99Tc，177Lu，166Ho，或153Sm。
28.權(quán)利要求25的抗體或其片段，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是一種酶，熒光標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記。
29.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是生物素化的。
30.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段綴合于一種治療劑或胞毒劑。
31.權(quán)利要求30的抗體或其片段，其中所述治療劑或胞毒劑選自以下一組(a)抗代謝物；(b)烷化劑；(c)抗生素；(d)生長(zhǎng)因子；(e)細(xì)胞因子；(f)抗血管發(fā)生劑；(g)抗有絲分裂劑；(h)蒽環(huán)類；(i)毒素；(j)凋亡劑。
32.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段附著于一種固體支持物。
33.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段在Western印跡中免疫特異性結(jié)合TR7。
34.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段在ELISA中免疫特異性結(jié)合TR7。
35.一種分離的細(xì)胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求11的抗體或其片段。
36.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其不抑制TRAIL與TR7結(jié)合的能力。
37.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是TR7的一種激動(dòng)劑。
38.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡。
39.權(quán)利要求38的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段刺激TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡比等濃度的TRAIL多肽刺激的TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡更好。
40.權(quán)利要求38的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段刺激TR7表達(dá)細(xì)胞凋亡在有或無(wú)抗體交聯(lián)劑的情況下一樣好。
41.權(quán)利要求38的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段不是肝毒性的。
42.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段上調(diào)TRAIL受體表達(dá)。
43.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段抑制TRAIL與TR7結(jié)合。
44.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是TR7的拮抗劑。
45.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段抑制TR7表達(dá)細(xì)胞的凋亡。
46.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段下調(diào)TRAIL受體表達(dá)。
47.一種抗體或其片段，其與權(quán)利要求11的抗體或其片段結(jié)合TR7多肽上的相同表位。
48.一種抗體或其片段，其與權(quán)利要求12的抗體或其片段結(jié)合TR7多肽上的相同表位。
49.一種抗體或其片段，其與權(quán)利要求13的抗體或其片段結(jié)合TR7多肽上的相同表位。
50.一種抗體或其片段，其與權(quán)利要求14的抗體或其片段結(jié)合TR7多肽上的相同表位。
51.權(quán)利要求5的抗體或其片段，其在一種藥物學(xué)可接受的載體中。
52.一種治療、預(yù)防或改善癌癥的方法，包括為動(dòng)物施用權(quán)利要求5的抗體或其片段或者含有所述抗體或其片段的組合物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述動(dòng)物是人。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
56.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是子宮癌。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
58.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是肺癌。
59.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是胃腸道癌。
60.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是Kaposi肉瘤。
61.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。
63.權(quán)利要求61的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
64.權(quán)利要求61的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
65.權(quán)利要求52的方法，其中所述抗體或其片段與一種化療劑組合施用。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述化療劑選自以下一組(a)irinotecan；(b)paclitaxel(TAXOL)_；和(c)gemcitabine。
67.一種治療、預(yù)防或改善選自以下一組疾病或紊亂的方法(a)移植物抗宿主疾病(GVHD)；(b)AIDS；和(c)神經(jīng)退行性疾?。凰龇椒ò閯?dòng)物施用權(quán)利要求5的抗體或其片段或者含有所述抗體或其一部分的組合物。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述動(dòng)物是人。
69.一種抑制TR7表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死TR7表達(dá)細(xì)胞的方法，包括為需要這種抑制TR7受體表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死TR7受體表達(dá)細(xì)胞的動(dòng)物施用權(quán)利要求5的抗體或其片段或者含有所述抗體或其片段的組合物，施用量為有效抑制TR7表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死TR7受體表達(dá)細(xì)胞的量。
70.一種檢測(cè)TR7多肽表達(dá)的方法，包括(a)使用權(quán)利要求5的抗體或其片段分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中TR7多肽的表達(dá)；(b)將TR7多肽的水平與TRAIL受體多肽的標(biāo)準(zhǔn)水平相對(duì)比。
71.一種檢測(cè)、診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)癌癥或其它過(guò)度增殖性紊亂的方法，包括(a)使用權(quán)利要求5的抗體或其片段分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中TR7多肽的表達(dá)；(b)將TR7多肽的水平與TR7多肽的標(biāo)準(zhǔn)水平相對(duì)比。
72.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求5的抗體或其片段。
73.權(quán)利要求72的試劑盒，其包含一種對(duì)照抗體。
74.權(quán)利要求72的試劑盒，其中所述抗體或其片段偶聯(lián)或綴合于一種可檢測(cè)標(biāo)記。
75.由ATCC保藏物PTA-4178的細(xì)胞系表達(dá)的抗體。
76.由ATCC保藏物PTA-4539的細(xì)胞系表達(dá)的抗體。
77.由ATCC保藏物PTA-4376的細(xì)胞系表達(dá)的抗體。
78.由ATCC保藏物PTA-4547的細(xì)胞系表達(dá)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫特異性結(jié)合TRAIL受體TR7的抗體和相關(guān)分子。這些抗體在例如預(yù)防和治療癌癥和其它增生性疾病中有用。本發(fā)明還涉及編碼抗TR7抗體的核酸分子，含有這些核酸的載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生這些材料的方法。本發(fā)明涉及用于預(yù)防、檢測(cè)、診斷、治療或改善疾病或紊亂、特別是癌癥和其它過(guò)度增生性疾病的方法和組合物，包括為動(dòng)物、優(yōu)選人類施用有效量的一或多種免疫特異性結(jié)合TRAIL受體TR7的抗體或其片段或變體或者相關(guān)分子。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1610696SQ02825741
公開日2005年4月27日申請(qǐng)日期2002年12月19日優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者西奧多拉·薩爾塞多, 維維安·R·艾伯特, 克雷格·A·羅森, 羅賓·漢弗萊斯, 特里斯坦·約翰·沃恩申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司

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該技術(shù)已申請(qǐng)專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：西奧多拉.薩爾塞多;維維安.R.艾伯特;克雷格.A.羅森;羅賓.漢弗萊斯;特里斯坦.約翰.沃恩
技術(shù)所有人：人體基因組科學(xué)有限公司
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