專利名稱：蛋白質(zhì)復(fù)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及取代的咪唑鎓鹽用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的應(yīng)用，以及用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的方法，以及由根據(jù)本發(fā)明的方法制備的復(fù)性蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
在目前的情況下，蛋白質(zhì)的復(fù)性可認(rèn)為是生物學(xué)活性和/或高程度正確折疊的蛋白質(zhì)的恢復(fù)或復(fù)原。蛋白質(zhì)復(fù)性問題在生物技術(shù)中具有高度的重要性。由于在分子生物學(xué)的發(fā)展，可能以重組方式從蛋白質(zhì)編碼序列開始對其進行克隆并在宿主生物中產(chǎn)生所述的蛋白質(zhì)。然而，在這些情形中，重組蛋白質(zhì)常以生物學(xué)無活性的聚集體或包含體形式沉淀。在這些包含體中含有的蛋白質(zhì)隨后必須由體外復(fù)性轉(zhuǎn)化為生物學(xué)活性形式。
所述的復(fù)性是非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)生物學(xué)過程，且常常僅導(dǎo)致非常低產(chǎn)量的天然蛋白質(zhì)。因此，復(fù)性的蛋白質(zhì)產(chǎn)量中即使少許百分比的增加也將提供基本的改善和經(jīng)濟利益。
在包含體蛋白質(zhì)的體外折疊中，已常觀察到正確折疊和無效果的副反應(yīng)如錯折疊和聚集體之間的動力學(xué)競爭。聚集過程主要基于多肽鏈的疏水相互作用，所述的多肽鏈在很大程度上是未折疊或非天然的，部分地是折疊中間體。與其分子基礎(chǔ)無關(guān)，這些聚集事件具有大于2的反應(yīng)等級。隨后，這些無效果的聚集反應(yīng)的速率隨未折疊的多肽鏈濃度的增加而增大。由于正確折疊事件主要由一級反應(yīng)控制，所以這意味著如果變性的蛋白質(zhì)濃度增加，那么聚集反應(yīng)比正確折疊占優(yōu)勢。為此原因，體外折疊反應(yīng)常常以非常低的蛋白質(zhì)濃度進行。此外，物理參數(shù)如pH、離子強度、氧化還原系統(tǒng)和溫度對于蛋白質(zhì)復(fù)性必須是最適的。然而，在許多情形中，即使這些措施也未帶來預(yù)期的成功率。
此外，長期以來已知以非變性濃度加入緩沖液如尿素或胍鹽可對折疊效率具有積極影響。作為胍鹽或尿素的替代，其他離液序列高的物質(zhì)也已用于體外折疊過程中，如烷基脲或共溶劑如羧酸酰胺或烷基化的胺。
在來自大腸桿菌(E.coli)包含體的人類纖溶酶原激活物的復(fù)性情形中，已觀察到體外折疊的產(chǎn)量可通過添加L-精氨酸而增強。進一步的研究已揭示L-精氨酸在其他蛋白質(zhì)如抗體片段或免疫毒素的體外折疊中也可用于改善折疊效率。盡管精氨酸含有胍基，但它對結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定作用不如胍鹽。因此，認(rèn)為精氨酸可增加未折疊的多肽鏈或折疊中間體的溶解性，而不顯著使天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定。增加體外這些效率的其他添加物為高度濃縮的Tris緩沖液、聚乙二醇或去污劑。也已用混合的微團(如Triton X 100和磷脂)實現(xiàn)了改善的折疊產(chǎn)量。所述的混合的微團含有可能通過與其相互作用而抑制折疊中間體聚集的極性和非極性基團。
2000年5月的Amersham Pharmacia Biotech(Data FileAffinityChromatography；HiTrap Chelating 1ml和5ml；18-1134-78 AB)出版物中第1-6頁描述了His6-標(biāo)記的蛋白質(zhì)在Ni2+-NTA柱上的復(fù)性。復(fù)性緩沖液含有20mM咪唑。所述的咪唑濃度可防止蛋白質(zhì)和柱基質(zhì)之間非特異性的相互作用，但不導(dǎo)致任何復(fù)性。相反，咪唑已知是一種變性劑。
2000年Yeh等人的“細(xì)胞色素c的等級折疊(Hierachical folding ofcytochrome c)”(Nature Struct.Biol.7，第443-445頁)描述了咪唑可加速細(xì)胞色素c的折疊動力學(xué)。蛋白質(zhì)的His33與其共價結(jié)合的配體的分子內(nèi)相互作用可由咪唑抑制。高濃度的咪唑基本具有對蛋白質(zhì)的變性作用。
盡管在文獻中提到了許多用于蛋白質(zhì)復(fù)性的規(guī)程，但該技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用不是非常充分發(fā)展的。該事實的原因基于技術(shù)和生物化學(xué)兩者的困難。由于即使在最適的條件下，蛋白質(zhì)的復(fù)性也僅在非常低的蛋白質(zhì)濃度存在時才可實現(xiàn)，所以工業(yè)生產(chǎn)需要非常高的復(fù)性體積的操作。此外，即使在最適的條件下，許多蛋白質(zhì)的復(fù)性效率也是低的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是鑒定可在體外增強蛋白質(zhì)折疊效率的物質(zhì)，并提供一種以迄今為止獲得的較高產(chǎn)量進行有效蛋白質(zhì)復(fù)性的方法。
該目的是根據(jù)本發(fā)明通過應(yīng)用用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的取代咪唑鎓鹽實現(xiàn)的，以及是通過用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的方法實現(xiàn)的，其中使要進行處理的蛋白質(zhì)與含有取代咪唑鎓鹽的液體基質(zhì)接觸。本發(fā)明也涉及應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法制備的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用是用于蛋白質(zhì)的復(fù)性。
根據(jù)本發(fā)明，聚集的降低意指降低或甚至基本防止蛋白質(zhì)的聚集，所述的蛋白質(zhì)聚集通常在液體基質(zhì)中延長的貯存期中發(fā)生并伴隨著生物學(xué)功能性的喪失或減少。
根據(jù)本發(fā)明，熱穩(wěn)定性的增加指即使在大大高于室溫的溫度時，生物學(xué)活性或正確的蛋白質(zhì)折疊各自在延長的時間段中得以維持。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的咪唑鎓鹽在室溫時優(yōu)選地是離子型液體。如果這些化合物在室溫時不是液體，那么根據(jù)本發(fā)明的咪唑鎓鹽在處理條件下至少應(yīng)以液體形式存在和/或可溶于液體基質(zhì)中。在本發(fā)明的背景中應(yīng)用的咪唑鎓鹽具有與環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的有機成分的正電荷，所述的正電荷通?；騼?yōu)選地在咪唑鎓環(huán)中是離域的。
本方法是基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即取代咪唑鎓鹽抑制蛋白質(zhì)的聚集并增強復(fù)性效率。迄今為止，這些有機鹽僅已用作有機合成和兩相催化作用中的溶劑，然而它們對生物化學(xué)中結(jié)構(gòu)形成過程的作用迄今尚未知曉。也已描述了其他使得能夠進行更有效的蛋白質(zhì)復(fù)性的有機鹽，如3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯或鹽酸胡蘆巴堿(WO 99/18196)。這些物質(zhì)例如在雜環(huán)系統(tǒng)中不具有離域的正電荷。在對它們對蛋白質(zhì)的復(fù)性作用進行的直接比較中，本發(fā)明的咪唑鎓鹽衍生物顯示明顯高的效率(也參見工作實施例以及圖2和3連同圖8和9)。
優(yōu)選地是本發(fā)明咪唑鎓鹽的咪唑鎓環(huán)由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代，而這些基團自身可由功能基團如含有氮、硫和/或磷的基團取代，其中不同的氧化狀態(tài)是可能的。根據(jù)本發(fā)明的這些功能基團的優(yōu)選例子為胺、羧基、羰基、醛、羥基、硫酸鹽、磺酸鹽和/或磷酸鹽基團。
根據(jù)本發(fā)明，咪唑鎓環(huán)的一個或兩個N原子可由相同或不同的取代基取代。優(yōu)選地，咪唑鎓環(huán)的兩個氮原子均由相同或不同的取代基取代。
根據(jù)本發(fā)明同樣可能或優(yōu)選的是咪唑鎓鹽在咪唑鎓環(huán)的一個或多個碳原子進行加成性或排斥性取代。
優(yōu)選用作取代基的是C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基和/或異丁基，特別優(yōu)選的是乙基和/或甲基。同樣優(yōu)選的取代基為C2-C4烯基，如乙烯、正丙烯、異丙烯、正丁烯和/或異丁烯。具有這些C1-C4烷基和C2-C4烯基時，根據(jù)本發(fā)明的咪唑鎓鹽化合物具有根據(jù)本發(fā)明特別有用的且隨較長的烷基和烯基而降低的水溶性。然而，水溶性也可通過烷基或烯基鏈自身上的溶解促進取代基得到改善，如通過硫酸鹽、磺酸鹽、氨基或磷酸鹽基團。根據(jù)本發(fā)明，也包含具有超過4個C原子的烷基和烯基取代基，如C5-C10烷基或烯基取代基也是優(yōu)選的。這些C5-C10烷基或烯基如果在其烷基和/或烯基上具有一個或多個其他取代基，則進一步是優(yōu)選的，所述的取代基如硫酸鹽、磺酸鹽、氨基或磷酸鹽基團。
至于芳基取代基，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是單-和/或二環(huán)芳基、苯基、聯(lián)苯和/或萘，以及這些化合物帶有羥基、磺酸鹽、硫酸鹽、氨基、醛、羰基和/或羧基的衍生物。優(yōu)選的芳基取代基的例子是酚、聯(lián)苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、二苯酚基、聯(lián)苯羧酸、酚、苯基磺酸鹽和/或苯酚磺酸。
優(yōu)選的芳烷基為芐基或取代的芐基。
特別優(yōu)選的是咪唑鎓環(huán)在其至少一個N原子上具有甲基。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的咪唑鎓鹽優(yōu)選地為液體，即它們優(yōu)選地為室溫(約25℃)時離子型的液體。然而，也可應(yīng)用在室溫非液體，但在復(fù)性條件下分別應(yīng)以液體形式存在或應(yīng)溶于液體基質(zhì)的咪唑鎓鹽。
咪唑鎓鹽在性質(zhì)上明顯區(qū)別于咪唑。具體而言，咪唑鎓鹽是親水的，而咪唑是疏水的，且對蛋白質(zhì)具有變性作用。
至于根據(jù)本發(fā)明取代的咪唑鎓環(huán)的陰離子抗衡離子，鹵素和含有離子的鹵素是尤其有用的。在這一方面特別優(yōu)選的是氯化物和四氟硼酸根。進一步優(yōu)選的是磷酸鹽、硫酸鹽和異氰酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選應(yīng)用的咪唑鎓鹽是1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓，1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓，1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓。
根據(jù)本發(fā)明，下面的蛋白質(zhì)種類和/或蛋白質(zhì)優(yōu)選地可進行復(fù)性，其熱穩(wěn)定性可得到增強和/或其聚集可降低，或者下面的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)種類優(yōu)選地可分別應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法中蛋白酶，優(yōu)選的為絲氨酸蛋白酶，具體而言為凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金屬蛋白酶如嗜熱菌蛋白酶；蛋白酶抑制劑，優(yōu)選的為胃酶抑制劑、抗蛋白酶、化學(xué)抑制素、彈性蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選的為轉(zhuǎn)錄因子，具體而言為NFκB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成員、病毒T抗原；病毒蛋白質(zhì)，如病毒包膜蛋白、衣殼蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原；磷酸酶；蛋白激酶，優(yōu)選的為酪氨酸激酶和/或絲氨酸激酶；免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，如抗體及其片段；生長因子，如表皮生長因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGFI和IGFII)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和/或血小板生長因子(PDGF)，以及源自這些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和片段。
根據(jù)本發(fā)明，可分別使無二硫鍵的和二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)復(fù)性，和/或改善其熱穩(wěn)定性，和/或預(yù)防或降低其聚集。特別優(yōu)選地，可對多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和復(fù)雜二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)進行處理，如溶菌酶、rPA(重組的纖溶酶原激活物，商品名為replase)、α葡糖苷酶、抗體及其片段和/或生長因子。這些蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)種類僅用作例子，然而，本發(fā)明不局限于所述的列舉。
至于根據(jù)本發(fā)明在用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或增加其熱穩(wěn)定性的方法中的液體基質(zhì)，優(yōu)選地應(yīng)用適合于要處理的蛋白質(zhì)的緩沖液系統(tǒng)。Tris、Hepes、Mes、Mops、乙酸鹽、甘氨酸和/或磷酸鹽優(yōu)選地用作緩沖液物質(zhì)，液體基質(zhì)中的緩沖液濃度優(yōu)選地為10-1000mM，更優(yōu)選地為5-200mM，同樣優(yōu)選地為10-200mM，且進一步優(yōu)選地為10-50mM。緩沖液系統(tǒng)的pH優(yōu)選地為4-11，進一步優(yōu)選地為7.5-10.5。在溶菌酶的情形中，復(fù)性過程中的pH值優(yōu)選地為約8，且對于rPA的復(fù)性，pH值優(yōu)選地為約10.5。對于要復(fù)性的其他蛋白質(zhì)，可單獨使緩沖液組成參數(shù)適合和最適化以獲得最大產(chǎn)量的變性蛋白質(zhì)。
在根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)性的方法，要復(fù)性或要處理的蛋白質(zhì)的接觸優(yōu)選地分別通過用液體基質(zhì)對要處理的蛋白質(zhì)的稀釋、透析和/或滲濾進行。最重要的，為進行復(fù)性應(yīng)確保變性的蛋白質(zhì)向復(fù)性緩沖液中的緩沖液交換。
在接觸過程中，具體而言為在復(fù)性過程中，要處理的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選地為5-500μg/ml，優(yōu)選地為10-100μg/ml，更加優(yōu)選地為約50-100μg/ml。這些值可由本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮各個蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)，分別關(guān)于要進行復(fù)性或要進行處理的蛋白質(zhì)進行調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的方法可用于無二硫鍵或二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)的復(fù)性。關(guān)于無二硫鍵的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地使其在還原劑存在時與含有取代的咪唑鎓鹽的復(fù)性基質(zhì)接觸，所述的還原劑如DTT、DTE和/或半胱氨酸，優(yōu)選地在1-10mM的濃度。
關(guān)于二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地使其在氧化還原系統(tǒng)存在時接觸，所述的氧化還原系統(tǒng)包含還原和氧化的硫羥物質(zhì)，如DTT、DTE、谷胱甘肽、半胱氨酸、巰基乙醇，優(yōu)選地在1-10mM的濃度。在這些情形中，還原的物質(zhì)與氧化的物質(zhì)的濃度比例(“還原的∶氧化的”)優(yōu)選地為1∶10～20∶1，優(yōu)選地為1∶5～10∶1，進一步優(yōu)選地為1∶1～5∶1。
在接觸過程中，具體而言為在復(fù)性過程中，取代的咪唑鎓鹽濃度基于復(fù)性基質(zhì)優(yōu)選地為5-95體積％，進一步優(yōu)選地為5-50體積％，進一步優(yōu)選地為10-40體積％。同樣在這些情形中，每一種蛋白質(zhì)的最適濃度可由簡單的實驗進行確定。通常，以10-40體積％添加取代的咪唑鎓鹽提供了最好的復(fù)性結(jié)果。然而如上文已提及的，所述的濃度依賴于各自所用的咪唑鎓鹽化合物而可高達95體積％。
根據(jù)體積摩爾濃度，上述體積百分比10-40體積％相應(yīng)于約0.5-3M在1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的情形中，這精確地指0.68-2.73M。因此，根據(jù)體積摩爾濃度，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是取代的咪唑鎓鹽的體積摩爾濃度基于復(fù)性基質(zhì)為約0.25-5M，進一步優(yōu)選地為0.25-3.5M，且最優(yōu)選地為約0.5-3M。
通常，復(fù)性過程優(yōu)選地為0.1-100小時，進一步優(yōu)選地為1-50小時，更加優(yōu)選地為約2-20小時。
復(fù)性優(yōu)選地在0-37℃的低溫發(fā)生，優(yōu)選地為5-15℃，這是因為在高溫時，聚集反應(yīng)增加。
作為使復(fù)性最適化的參數(shù)，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和聚集行為優(yōu)選地可在所述的過程中進行測量。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，蛋白質(zhì)可在幾個連續(xù)的時間以脈沖方式或以連續(xù)方式添加到復(fù)性緩沖液中。
總之，根據(jù)本發(fā)明的方法適合于以特別有利的方式用于蛋白質(zhì)復(fù)性。在這一方面，進一步優(yōu)選的是除取代的咪唑鎓鹽之外，用于蛋白質(zhì)復(fù)性的液體基質(zhì)含有其他已知的復(fù)性物質(zhì)或促進復(fù)性的物質(zhì)，如尿素、胍鹽、L-精氨酸、烷基脲、羧酸酰胺、烷基化的胺、Tris緩沖液、聚乙二醇和/或去污劑。


下面，本發(fā)明將對工作實施例進行描述。在這一方面可參考下面的附圖圖1顯示以％表示的溶菌酶復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系；圖2顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系；圖3顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系；圖4顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓之間的關(guān)系；圖5顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系；圖6是復(fù)性過程中rPA聚集的圖示說明，如由光散射法所確定的，其中含有0％～5％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓；圖7顯示在5％的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓不存在和存在時溶解的nGLP1R的濃度；圖8是rPA關(guān)于溫度和對不同濃度的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的聚集行為的圖示說明，如由光散射法所確定的；圖9顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的濃度之間的關(guān)系；
圖10顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與鹽酸胡蘆巴堿的濃度之間的關(guān)系。
具體實施例方式
實施例1蛋白質(zhì)的變性使蛋白質(zhì)濃度為0.5～20mg/ml的溶菌酶、rPA或包含體在0.1M pH8的Tris、6M鹽酸胍、1mM EDTA、200mM DTT中變性，并在室溫還原至少2小時。隨后，通過添加HCl將pH值降低到約pH2。任選地，變性的蛋白質(zhì)可對1000倍體積的6M pH2的鹽酸胍進行透析。變性蛋白質(zhì)的濃度通過Bradford測定(Bradford，1976)或分光光度法進行確定。為此目的，將e(1mg/ml，280nm，1cm)＝1的消光系數(shù)用于rPA，而將e(1mg/ml，280nm，1cm)＝2.37的消光系數(shù)用于溶菌酶。
實施例2溶菌酶的復(fù)性溶菌酶的復(fù)性通過將變性的且還原的蛋白質(zhì)以1∶100稀釋入復(fù)性緩沖液中進行，所述的復(fù)性緩沖液已預(yù)先平衡到10℃，其中蛋白質(zhì)終濃度為200μg/ml。至于復(fù)性緩沖液，應(yīng)用0.05M pH8的Tris、1mM EDTA、4mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)和不同濃度的離子型液體1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓。將通過稀釋變性樣品而傳送的2mM DTT用作還原劑。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.05M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。溶菌酶的酶活性用光度測定法測量，并關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖1顯示溶菌酶復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系。在10-15體積％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時，有定量的(即100％的)溶菌酶氧化復(fù)性，。
實施例3應(yīng)用1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的rPA復(fù)性存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、2mM GSH(還原的谷胱甘肽)中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖2顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系。在20-30體積％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時，復(fù)性產(chǎn)量為23％。
實施例4應(yīng)用1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的rPA復(fù)性存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖3顯示以rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系。在20-25體積％的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在時，復(fù)性產(chǎn)量為26％。
實施例5應(yīng)用4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓的rPA復(fù)性(比較例)存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓存在時在0.01M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mMGSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖4顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓的濃度之間的關(guān)系。復(fù)性產(chǎn)量隨4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓增加的濃度而增加。在濃度為94％(v/v)的4-甲基-N-丁基四氟硼酸吡啶鎓時，rPA復(fù)性產(chǎn)量為13.5％。
實施例6應(yīng)用1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的rPA復(fù)性存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mMGSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖5顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的濃度之間的關(guān)系。在20％(v/v)的1-丁基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時，復(fù)性產(chǎn)量為8％。
實施例7復(fù)性過程中rPA的聚集存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在或不存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性于10℃在攪動的熒光杯中進行。在該動力學(xué)過程中，蛋白質(zhì)的聚集通過應(yīng)用360nm的激發(fā)光和360nm的吸收光測量光散射而監(jiān)控。
圖6顯示在不存在鹽時(空心條)和在存在5體積％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓時(實心條)復(fù)性rPA聚集測量的緩沖液校正的平穩(wěn)值。在至少5體積％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時，要復(fù)性的rPA的聚集幾乎完全受到抑制。
實施例8GLP1受體(nGLP1R)N-末端結(jié)構(gòu)域的溶解性在5％的1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓存在時將天然的結(jié)構(gòu)化的受體結(jié)構(gòu)域以不同蛋白質(zhì)濃度在0.4M pH6.3的磷酸鉀、0.4M硫酸銨中于20℃溫育過夜。隨后于70,000rpm使蛋白質(zhì)聚集體沉淀，并將可溶性蛋白質(zhì)組分用吸收分光光度法在280nm進行定量。圖7顯示在每一種條件下可獲得的可溶性蛋白質(zhì)最大濃度的比較。
因此，本實施例顯示由取代的咪唑鎓鹽分別增加溶解性或降低聚集。
實施例9rPA的熱穩(wěn)定性在不同濃度的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓存在時，將以20μg/ml濃度存在于0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的天然rPA以約0.3℃/分鐘的加熱速率從20℃加熱到90℃。在所述的過程中，蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)由光散射進行分析。為此目的，對樣品的激發(fā)在360nm于熒光計中進行，且信號也在360nm進行探測。
圖8顯示在熱變性過程中rPA的聚集行為(對于1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓的體積％，實心圓為0體積％，實心三角形為5體積％，空心圓為12體積％，空心三角形為20體積％)。不存在1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓時rPA的聚集開始于55℃。存在5體積％的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓時，僅在高于80℃的溫度可觀察到增加的聚集，而在更高的1-乙基-3-甲基四氟硼酸咪唑鎓濃度時，高達90℃時仍無可測量的聚集發(fā)生。
實施例10應(yīng)用3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的rPA復(fù)性(比較例)存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖9顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯的濃度之間的關(guān)系。在30％(v/v)的3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯存在時，復(fù)性的最大產(chǎn)量為18％。
實施例11應(yīng)用鹽酸胡蘆巴堿的rPA復(fù)性(比較例)存在于6M pH2的胍鹽中的rPA復(fù)性通過在不同濃度鹽酸胡蘆巴堿存在時在0.1M pH10.5的Tris、1mM EDTA、5mM GSSG、2mM GSH中的1∶100稀釋進行。復(fù)性在10℃進行至少16小時。復(fù)性后，將樣品對1000倍體積的0.1M pH8的Tris、1mM EDTA透析過夜。rPA的酶活性用Chromozyme tPA測定(Roche Diagnostics)進行測量，并關(guān)于天然rPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量以提供對復(fù)性的測量。
圖10顯示rPA復(fù)性產(chǎn)量與鹽酸胡蘆巴堿的濃度之間的關(guān)系。在鹽存在時未觀察到改善的rPA復(fù)性。
權(quán)利要求
1.取代的咪唑鎓鹽用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于增加其熱穩(wěn)定性和/或用于降低其聚集的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓鹽由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代，而這些基團自身可由官能團取代，優(yōu)選由含有氮、硫和/或磷的基團取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在咪唑鎓環(huán)的兩個氮原子上進行取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在咪唑鎓環(huán)的一個或多個碳原子上進行取代。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)具有C1-C4烷基，優(yōu)選為甲基和/或乙基，C1-C4烯基和/或單或二環(huán)芳基作為取代基。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)在至少一個N原子上具有甲基。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)具有一個或多個下述取代基酚、聯(lián)苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、聯(lián)苯酚、聯(lián)苯羧酸、酚、苯基磺酸酯、苯酚磺酸和/或取代的或未取代的芐基。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的取代基進一步由一個或多個下述基團取代胺、羧基、羰基、醛、羥基、硫酸根、磺酸根和/或磷酸根基團。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在室溫時是離子型液體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項或多項的應(yīng)用，其用于如下蛋白質(zhì)的復(fù)性、增加其熱穩(wěn)定性和/或降低其聚集蛋白酶，優(yōu)選的為絲氨酸蛋白酶，具體為凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金屬蛋白酶如嗜熱菌蛋白酶；蛋白酶抑制劑，優(yōu)選的為胃酶抑制劑、抗蛋白酶、化學(xué)抑制素、彈性蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選的為轉(zhuǎn)錄因子，具體為NFкB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成員，和/或病毒T抗原；病毒蛋白質(zhì)，如病毒包膜蛋白、衣殼蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原；磷酸酶；蛋白激酶，優(yōu)選為酪氨酸激酶和/或絲氨酸激酶；免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，如抗體及其片段；生長因子，優(yōu)選地為表皮生長因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGFI和IGFII)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和/或血小板生長因子(PDGF)；溶菌酶、rPA、α-葡糖苷酶，以及源自這些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和片段。
11.一種用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于增加其熱穩(wěn)定性和/或降低其聚集的方法，其特征在于使要處理的蛋白質(zhì)與含有取代的咪唑鎓鹽的液體基質(zhì)接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11用于蛋白質(zhì)復(fù)性的方法，其中將液體復(fù)性基質(zhì)用作液體基質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其特征在于將適合于要處理的蛋白質(zhì)的緩沖液系統(tǒng)用作液體基質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中一項或多項的方法，其特征在于將Tris、HEPES、Mes、Mops、乙酸鹽、甘氨酸和/或磷酸鹽用作緩沖液物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中一項或多項的方法，其特征在于液體基質(zhì)中的緩沖液濃度為10-1000mM，優(yōu)選地為5-200mM，更加優(yōu)選地為10-50mM。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中一項或多項的方法，其特征在于緩沖液系統(tǒng)的pH值為4-11，優(yōu)選地為7.5-10.5。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓鹽由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代，而這些基團自身可由官能團取代，優(yōu)選地由含有氮、硫和/或磷的基團取代。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在咪唑鎓環(huán)的兩個氮原子上進行取代。
19.根據(jù)權(quán)利要求11-18中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在咪唑鎓環(huán)的一個或多個碳原子上進行取代。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-19中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)具有C1-C4烷基，優(yōu)選地為甲基和/或乙基，C1-C4烯基和/或單或二環(huán)芳基作為取代基。
21.根據(jù)權(quán)利要求11-20中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)在至少一個N原子上具有甲基。
22.根據(jù)權(quán)利要求11-21中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓環(huán)具有一個或多個下述取代基酚、聯(lián)苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、聯(lián)苯酚、聯(lián)苯羧酸、酚、苯基磺酸鹽、苯酚磺酸和/或取代的或未取代的芐基。
23.根據(jù)權(quán)利要求11-22中一項或多項的方法，其特征在于所述的取代基進一步由一個或多個下述基團取代胺、羧基、羰基、醛、羥基、硫酸根、磺酸根和/或磷酸根基團。
24.根據(jù)權(quán)利要求11-23中一項或多項的方法，其特征在于所述的咪唑鎓鹽在室溫時是離子型液體。
25.根據(jù)權(quán)利要求11-24中一項或多項的方法，其特征在于所述接觸通過用液體基質(zhì)對要處理的蛋白質(zhì)的稀釋、透析和/或滲濾進行。
26.根據(jù)權(quán)利要求11-25中一項或多項的方法，其特征在于在接觸過程中，要處理的蛋白質(zhì)濃度為5-500μg/ml，優(yōu)選地為10-200μg/ml，更加優(yōu)選地為約50-100μg/ml。
27.根據(jù)權(quán)利要求11-26中一項或多項的方法，其特征在于取代的咪唑鎓鹽濃度基于液體基質(zhì)為5-95體積％，優(yōu)選地為5-50體積％，最優(yōu)選地為10-40體積％。
28.根據(jù)權(quán)利要求11-27中一項或多項的方法，其特征在于取代的咪唑鎓鹽的體積摩爾濃度基于液體基質(zhì)為0.25-5M，優(yōu)選地為0.25-3.5M，且最優(yōu)選地為0.5-3M。
29.根據(jù)權(quán)利要求11-28中一項或多項的方法，其特征在于所述的方法通過將要復(fù)性的蛋白質(zhì)在幾個連續(xù)的時間或以連續(xù)方式添加到復(fù)性基質(zhì)中而進行。
30.根據(jù)權(quán)利要求11-29中一項或多項的方法，其特征在于要復(fù)性的蛋白質(zhì)與復(fù)性基質(zhì)的接觸進行0.1-100小時，優(yōu)選地為1-50小時，更加優(yōu)選地為約2-20小時。
31.根據(jù)權(quán)利要求11-30中一項或多項的方法，其用于如下蛋白質(zhì)的復(fù)性、增加其熱穩(wěn)定性和/或降低其聚集蛋白酶，優(yōu)選的為絲氨酸蛋白酶，具體而言為凝血酶、凝血因子Xa、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶如胃蛋白酶或凝乳酶、金屬蛋白酶如嗜熱菌蛋白酶；蛋白酶抑制劑，優(yōu)選的為胃酶抑制劑、抗蛋白酶、化學(xué)抑制素、彈性蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、抗凝血酶III；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選的為轉(zhuǎn)錄因子，具體而言為NFкB和jun、fos、krox、myc、E2F家族的成員，病毒T抗原；病毒蛋白質(zhì)，如病毒包膜蛋白、衣殼蛋白、病毒蛋白酶、聚合酶和/或T抗原；磷酸酶；蛋白激酶，優(yōu)選的為酪氨酸激酶和/或絲氨酸激酶；免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，如抗體及其片段；生長因子，優(yōu)選地為表皮生長因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGFI和IGFII)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和/或血小板生長因子(PDGF)；溶菌酶、rPA、α-葡糖苷酶，以及源自這些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和片段。
32.根據(jù)權(quán)利要求11-31中一項或多項的方法，其特征在于對無二硫鍵的蛋白質(zhì)復(fù)性，其中所述的無二硫鍵的蛋白質(zhì)與復(fù)性基質(zhì)的接觸在還原劑存在時進行，所述的還原劑優(yōu)選地為DTT、DTE和/或半胱氨酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求11-32中一項或多項的方法，其特征在于對二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)復(fù)性，其中所述的二硫鍵橋聯(lián)的蛋白質(zhì)與復(fù)性基質(zhì)的接觸在氧化還原系統(tǒng)存在時進行，所述的氧化還原系統(tǒng)包含還原和氧化的硫醇物質(zhì)，如DTT、DTE、谷胱甘肽、半胱氨酸和/或巰基乙醇。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其特征在于還原的物質(zhì)與氧化的物質(zhì)的濃度比例為1∶10～20∶1，優(yōu)選地為1∶5～10∶1，進一步優(yōu)選地為1∶1～5∶1。
35.根據(jù)權(quán)利要求11-34中一項或多項的方法，其特征在于用于蛋白質(zhì)復(fù)性的液體基質(zhì)含有其他復(fù)性物質(zhì)，優(yōu)選地為尿素、胍鹽、L-精氨酸、烷基脲、羧酸酰胺、烷基化的胺、Tris緩沖液、聚乙二醇和/或去污劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求11-35的方法制備的復(fù)性蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及取代的咪唑鎓鹽用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的應(yīng)用，以及用于蛋白質(zhì)復(fù)性、用于降低其聚集和/或用于增加其熱穩(wěn)定性的方法，以及由根據(jù)本發(fā)明的方法制備的復(fù)性蛋白質(zhì)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使要處理的蛋白質(zhì)與含有取代的咪唑鎓鹽的液體復(fù)性基質(zhì)接觸。
文檔編號C07K1/00GK1608077SQ02826228
公開日2005年4月20日 申請日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月14日
發(fā)明者瑞奈爾·魯?shù)婪? 胡可·李烈, 吳塔·雷武 申請人:塞爾蛋白質(zhì)股份有限公司