專利名稱：標(biāo)記過的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及標(biāo)記過的核苷酸。具體地講，本發(fā)明披露了具有可除去的標(biāo)記的核苷酸，及其在多核苷酸測序方法中的用途。
背景分子研究方面的進(jìn)展部分是由于用于表征所述分子或它們的生物學(xué)反應(yīng)的技術(shù)的改良。具體地講，核酸DNA和RNA的研究，業(yè)已從用于序列分析的發(fā)展中的技術(shù)和雜交事件的研究中受益。
業(yè)已改善了核酸研究的所述技術(shù)的一種例子，是固定化核酸的組裝的陣列的發(fā)展。所述陣列通常包括固定在固體支持材料上的多核苷酸的高密度距陣。例如，參見Fodor等，Trends Biotech.1219-26，1994，該文獻(xiàn)披露了組裝核酸的方法，其中使用用掩膜保護(hù)的化學(xué)敏化的玻璃表面，不過，暴露了特定的部位，以便能夠結(jié)合適當(dāng)修飾過的核苷酸亞磷酰胺。組裝的陣列還可以通過將已知的多核苷酸“點”在固體支持物的預(yù)定位置上而生產(chǎn)(例如Stimpson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926379-6383，1995)。
陣列技術(shù)的另一種發(fā)展，是將所述多核苷酸連接在固體支持材料上，以便形成單分子陣列。這種類型的陣列披露于國際專利申請?zhí)朩O00/06770中。所述陣列的優(yōu)點是，可以在單分子水平上監(jiān)測反應(yīng)，并且可以從單個反應(yīng)中采集到大量單分子的信息。
為了使DNA陣列能夠使用，必須確定所述分子的序列。美國專利號5,302,509披露了對固定在固體支持物上的多核苷酸進(jìn)行測序的方法。所述方法取決于在存在DNA聚合酶的條件下，具有不同熒光標(biāo)記的3′-封閉的堿基A，G，C和T向所述固定化多核苷酸中的摻入。所述聚合酶能夠摻入與所述靶核苷酸互補的堿基，但是，能防止進(jìn)一步添加3′-封閉基團(tuán)。然后，可以確定所述摻入堿基的標(biāo)記，并且通過化學(xué)裂解除去所述封閉基團(tuán)，以便可以發(fā)生進(jìn)一步的聚合。
Welch等(Chem.Eur.J.5(3)951-960，1999)披露了用3′-O-封閉基團(tuán)修飾的核苷三磷酸的合成，所述封閉基團(tuán)是光不穩(wěn)定性的，并且能發(fā)出熒光。打算將所述修飾過的核苷酸用于DNA測序?qū)嶒?。不過，證明了所述核苷酸難于摻入在現(xiàn)有的多核苷酸上，因為它不能結(jié)合到所述聚合酶的活性位點。
Zhu等(Cytometry 28206-211，1997)還披露了通過所述堿基基團(tuán)連接在所述核苷酸上的熒光標(biāo)記的用途。希望將所述標(biāo)記過的核苷酸，用于在原位雜交(FISH)實驗中發(fā)出熒光，其中，需要一系列摻入的標(biāo)記過的核苷酸，以便產(chǎn)生熒光“條形碼”。
發(fā)明概述在本發(fā)明中，通過與堿基連接的可裂解的接頭基團(tuán)，將核苷或核苷酸分子連接在可檢測的標(biāo)記上，使得所述分子可用于使用標(biāo)記過的核苷或核苷酸的技術(shù)中，例如，測序反應(yīng)，多核苷酸合成，核酸擴增，核酸雜交分析，單核苷酸多態(tài)性研究，以及其他使用諸如聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，末端轉(zhuǎn)移酶，或其他DNA修飾酶的酶的其他技術(shù)。本發(fā)明特別適用于使用標(biāo)記過的dNTPs的技術(shù)，如切口翻譯，隨機引物標(biāo)記，末端標(biāo)記(例如，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)，逆轉(zhuǎn)錄或核酸擴增。本發(fā)明的分子與現(xiàn)有技術(shù)不同，其中，所述標(biāo)記連接在核糖或脫氧核糖上，或者，其中，所述標(biāo)記是通過不可裂解的接頭連接的。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，核苷酸或核苷分子或它們的類似物具有通過可裂解的接頭連接在可檢測的標(biāo)記上的堿基。
本發(fā)明涉及具有通過可裂解的接頭連接在可檢測標(biāo)記上的堿基的核苷酸或核苷分子。所述堿基可以是嘌呤或嘧啶。所述堿基可以是脫氮嘌呤。所述分子可以具有核糖或脫氧核糖糖部分。所述核糖或脫氧核糖可以包括通過2’或3’氧原子連接的保護(hù)基團(tuán)?？梢詫⑺霰Ｗo(hù)基團(tuán)除去，以便暴露出3’-OH基團(tuán)。所述分子可以是脫氧核糖核苷三磷酸。所述可檢測的標(biāo)記可以是熒光團(tuán)。所述接頭可以是酸不穩(wěn)定性接頭，光不穩(wěn)定性接頭，或可以包括二硫鍵。
本發(fā)明還涉及標(biāo)記核酸分子的方法，其中，所述方法包括將核苷酸或核苷分子摻入到所述核酸分子上，其中，所述核苷酸或核苷分子具有通過可裂解的接頭連接在可檢測的標(biāo)記上的堿基。所述摻入步驟可以通過末端轉(zhuǎn)移酶，聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶完成。所述堿基可以是嘌呤或嘧啶。所述堿基可以是脫氮嘌呤。所述核苷酸或核酸分子可以具有核糖或脫氧核糖糖部分。所述核糖或脫氧核糖可以包括通過2’或3’氧原子連接的保護(hù)基團(tuán)?？梢詫⑺霰Ｗo(hù)基團(tuán)除去，以便暴露出3’-OH基團(tuán)。所述分子可以是脫氧核糖核苷三磷酸。所述可檢測的標(biāo)記可以是熒光團(tuán)。所述接頭可以是酸不穩(wěn)定性接頭，光不穩(wěn)定性接頭，或可以包括二硫鍵。所述可檢測的標(biāo)記和/或可裂解的接頭可以具有足以阻止第二個核苷酸或核苷摻入到所述核酸分子上的大小。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于測定靶單鏈多核苷酸序列的方法，其中，所述方法包括監(jiān)測互補性核苷酸的依次摻入，其中，每一個所述核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基。并且，其中，每一個摻入的核苷酸的身份是通過檢測與所述堿基連接的標(biāo)記確定的，并且，隨后除去所述標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及用于測定靶單鏈多核苷酸的序列的方法，其中，該方法包括(a)提供核苷酸，其中，所述核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基，并且，其中，所述與每一種類型的核苷酸連接的可檢測的標(biāo)記，在檢測時可以與用于標(biāo)記其他類型的核苷酸的可檢測標(biāo)記區(qū)分開來；(b)將核苷酸摻入到所述靶單鏈多核苷酸的互補體上；(c)檢測(b)的核苷酸的標(biāo)記，以便確定摻入的核苷酸的類型；(d)除去(b)的核苷酸的標(biāo)記；和(e)任選重復(fù)步驟(b)-(d)一次或多次，以便測定靶單鏈多核苷酸的序列。
在本文所披露的方法中，可以讓每一個核苷酸依次與所述靶接觸，在添加下一個核苷酸之前除去未摻入的核苷酸，其中，所述標(biāo)記的檢測和除去是在添加每一個核苷酸之后，或在添加所有四種核苷酸之后進(jìn)行的。
在所述方法中，可以讓所有核苷酸同時與所述靶接觸，即讓包括所有不同核苷酸的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記。
所述方法可以包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，讓包括四種核苷酸中的兩種的第一種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的兩種核苷酸的第二種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟一次或多次。
本文所披露的方法還可以包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，讓包括四種核苷酸中的一種的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的三種核苷酸的第二種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟一次或多次。
本文所披露的方法還可以包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，將包括四種核苷酸中的三種的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的核苷酸的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟一次或多次。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括(a)各個核苷酸，其中，每一個核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基，并且，其中，與每一種核苷酸連接的所述可檢測的標(biāo)記，在檢測時可以與用于標(biāo)記其他三種核苷酸的可檢測標(biāo)記區(qū)分開來；和(b)它們的包裝材料。所述試劑盒還可以包括酶和適合所述酶作用的緩沖液。
所述核苷酸/核苷適用于很多不同的基于DNA的方法中，包括DNA合成和DNA測序方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于確定靶多核苷酸序列的方法包括監(jiān)測互補性核苷酸的依次摻入，其中，所述核苷酸包括通過可裂解的接頭與所述核苷酸的堿基部分連接的可檢測的標(biāo)記，通過監(jiān)測所述標(biāo)記而檢測摻入，并且將所述標(biāo)記除去，以便能夠進(jìn)行進(jìn)一步的核苷酸摻入。


圖1表示用于本發(fā)明的典型核苷酸結(jié)構(gòu)。對于每一種結(jié)構(gòu)來說，X可以是H，磷酸，二磷酸或三磷酸。R1和R2可以相同或不同，并且可以選自H，OH，或可以轉(zhuǎn)化成OH的任何基團(tuán)。
圖2表示用于本發(fā)明的接頭的結(jié)構(gòu)，除了可以使用的所述接頭的一般定義之外，包括(1)二硫接頭和酸不穩(wěn)定性接頭，(2)二烷氧基芐基接頭，(3)Sieber接頭，(4)吲哚接頭和(5)叔丁基Sieber接頭。
圖3表示用于本發(fā)明的某些功能性分子，包括某些可裂解的接頭。在所述結(jié)構(gòu)中，R1和R2可以相同或不同，并且可以是H，OH，或可以轉(zhuǎn)化成OH的任何基團(tuán)，包括羰基。R3表示獨立地選自烷基，烷氧基，氨基，或鹵素的一個或多個取代基。另外，可以用任何用在3′-封閉基團(tuán)上的不穩(wěn)定性官能團(tuán)，構(gòu)建可裂解的接頭。
圖4表示變性凝膠，展示用Klenow聚合酶進(jìn)行的實施例1的三磷酸的摻入。
圖5表示變性凝膠，展示用Klenow聚合酶進(jìn)行的實施例3的三磷酸的摻入。
圖6表示變性凝膠，展示用Klenow聚合酶進(jìn)行的實施例4的三磷酸的摻入。
詳細(xì)說明本發(fā)明涉及通過可裂解的接頭連接標(biāo)記的方式修飾過的核苷酸和核苷，以便使得所述分子可用于所述標(biāo)記過的分子與酶相互作用的技術(shù)中，如測序反應(yīng)，多核苷酸合成，核酸擴增，核酸雜交分析，單核苷酸多態(tài)性研究，使用諸如聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，末端轉(zhuǎn)移酶的酶的技術(shù)，使用標(biāo)記過的dNTPs的技術(shù)(例如，切口翻譯，隨機引物標(biāo)記，末端標(biāo)記(例如，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)逆轉(zhuǎn)錄，或核酸擴增)。
正如本領(lǐng)域所公知的，“核苷酸”由含氮堿基，糖，以及一個或多個磷酸基團(tuán)組成。在RNA中，所述糖是核糖，而在DNA中，所述糖是脫氧核糖，即缺少存在于核糖中的羥基的糖。所述含氮堿基是嘌呤或嘧啶的衍生物。所述嘌呤是腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，而所述嘧啶是胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)(或?qū)τ赗NA來說，是尿嘧啶(U))。將脫氧核糖的C-1原子鍵合于嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。核苷酸也是核苷的磷酸酯，酯化發(fā)生在與所述糖的C-5連接的羥基上。核苷酸通常是單磷酸，二磷酸或三磷酸酯。
“核苷”在結(jié)構(gòu)上類似于核苷酸，但是，缺少了磷酸部分。核苷類似物的一種例子是其中的標(biāo)記與所述堿基連接的核苷，并且，沒有與糖分子結(jié)合的磷酸基團(tuán)。
盡管所述堿基通常被稱作嘌呤或嘧啶，技術(shù)人員可以理解的是，可以獲得不會改變所述核苷酸或核苷進(jìn)行Watson-Crick堿基配對的能力的衍生物和類似物?！把苌铩被颉邦愃莆铩北硎酒浜诵慕Y(jié)構(gòu)與母體化合物相同或非常接近的化合物或分子，不過，它具有化學(xué)或物理修飾，如不同的或額外的側(cè)基，這使得所述衍生的核苷酸或核苷能夠與其他分子連接。例如，所述堿基可以是脫氮嘌呤。所述衍生物應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)行Watson-Crick配對。“衍生物”和“類似物”還表示具有修飾過的堿基部分和/或修飾過的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。例如，所述衍生物和類似物披露于以下文獻(xiàn)中Scheit，NucleotideAnalogs(John Wiley & Son，1980)和Uhlman等，Chemical Reviews90543-584，1990。核苷酸類似物還可以包括修飾過的磷酸二酯鍵，包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基磷酸酯，phosphoranilidate和氨基磷酸酯鍵。所述類似物應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)行Watson-Crick堿基配對。本文所使用的“衍生物”和“類似物”可以交換使用，并且包括在本文所定義的術(shù)語“核苷酸”和“核苷”的范圍內(nèi)。
本發(fā)明可以利用常規(guī)可檢測標(biāo)記。檢測可以通過任何合適的方法進(jìn)行，包括熒光光譜法或通過其他光學(xué)方法。優(yōu)選的標(biāo)記是熒光團(tuán)，它在吸收能量之后，能發(fā)射出特定波長的輻射。很多合適的熒光標(biāo)記是已知的。例如，Welch等(Chem.Eur.J.5(3)951-960，1999)披露了丹酰-官能化熒光部分，可將它用于本發(fā)明中。Zhu等(Cytometry28206-211，1997)披露了熒光標(biāo)記Cy3和Cy5的用途，還可將其用于本發(fā)明中。適合使用的標(biāo)記還披露于以下文獻(xiàn)中Prober等(Science 238336-341，1987)；Connell等(BioTechniques 5(4)342-384，1987)，Ansorge等(Nucl.Acids Res.15(11)4593-4602，1987)和Smith等(Nature 321674，1986)。其他可通過商業(yè)渠道獲得的熒光標(biāo)記包括，但不局限于熒光素，羅丹明(包括TMR，德克薩斯紅和Rox)，alexa，bodipy，吖啶，香豆素，芘，苯并蒽和花青苷。
還可以將多種標(biāo)記用于本發(fā)明中。例如，雙熒光團(tuán)FRET盒(Tet.Letts.468867-8871，2000)為本領(lǐng)域所熟知，并且可用于本發(fā)明中。還可以使用多熒光樹枝型聚合物系統(tǒng)(J.Amer.Chem.Soc.1238101-8108，2001)。
盡管熒光標(biāo)記是優(yōu)選的，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，其他形式的可檢測標(biāo)記顯然是可利用的。例如，微顆粒，包括量子斑點(Empodocles等，Nature 399126-130，1999)，金納米顆粒(Reichert等，Anal.Chem.726025-6029，2000)，微珠(Lacoste等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 97(17)9461-9466，2000)，以及可以通過質(zhì)譜法檢測的標(biāo)記都可以使用。
還可以將多成分標(biāo)記用于本發(fā)明中。多成分標(biāo)記是取決于與用于檢測的另一種化合物相互作用的標(biāo)記。生物學(xué)中所使用的最常見的多成分標(biāo)記是生物素-鏈親和素系統(tǒng)。將生物素用作與所述核苷酸堿基連接的標(biāo)記。然后單獨添加鏈親和素，以便能夠進(jìn)行檢測?？梢垣@得其他多成分系統(tǒng)。例如，二硝基苯酚具有可以通過商業(yè)渠道獲得的能用于檢測的熒光抗體。
所述標(biāo)記(或標(biāo)記和接頭構(gòu)建體)可以具有足以發(fā)揮阻斷其他核苷酸摻入到本發(fā)明的核苷酸上的大小或結(jié)構(gòu)。這使得能夠進(jìn)行受控制的聚合。所述阻斷可能是由于空間位阻造成的，或者可能是由于大小，電荷和結(jié)構(gòu)的組合造成的。
將針對核苷酸對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。不過，除非另有說明，對核苷酸的說明同樣適用于核苷。還將針對DNA對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，不過，這種說明還適用于RNA，PNA，以及其他核酸，除非另有說明。
本發(fā)明的修飾過的核苷酸利用可裂解的接頭將所述標(biāo)記連接在核苷酸上?？闪呀獾慕宇^的使用，能確保所述標(biāo)記可以在檢測之后除去(如果必要的話)，避免了任何干擾信號，并且隨后可以摻入任何標(biāo)記過的核苷酸。
可裂解的接頭為本領(lǐng)域所公知，并且可以采用常規(guī)化學(xué)方法，以便將接頭連接在核苷酸堿基和標(biāo)記上。所述接頭可以通過任何合適的方法裂解，包括接觸酸，堿，親核試劑，親電試劑，自由基，金屬，還原或氧化試劑，光照，溫度，酶等。合適的接頭可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)封閉基團(tuán)改良，正如在以下文獻(xiàn)中所披露的Greene & Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons。Guillier等披露了用于固相合成的其他合適的可裂解的接頭(Chem.Rev.1002092-2157，2000)。
術(shù)語“可裂解的接頭”的使用并非意味著需要將整個接頭從核苷酸堿基上除去。裂解位點可能位于所述接頭上的位置，以便確保在裂解之后所述接頭的部分保持與所述核苷酸堿基連接。
所述接頭可以連接在核苷酸堿基的任何位置上，其前提是，仍然能進(jìn)行Watson-Crick堿基配對。對于嘌呤堿基來說，如果所述接頭是通過所述嘌呤或優(yōu)選的脫氮嘌呤類似物的7號位置，通過8-修飾過的嘌呤，通過N-6修飾過的腺嘌呤或N-2修飾過的鳥嘌呤連接的話將是優(yōu)選的。對于嘧啶來說，連接優(yōu)選是通過胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶上的5號位置和胞苷上的N-4位置連接的。合適的核苷酸結(jié)構(gòu)如圖1所示。對于圖1中的每一種結(jié)構(gòu)來說，X可以是H，磷酸，二磷酸或三磷酸。R1和R2可以相同或不同，并且可以選自H，OH，或能夠轉(zhuǎn)化成OH的任何基團(tuán)，包括，但不局限于羰基。
合適的接頭總體上在圖2中示出，并且，包括，但不局限于二硫接頭(1)，酸不穩(wěn)定性接頭(2，3，4和5；包括二烷氧基芐基接頭(例如2)，Sieber接頭(例如)，吲哚接頭(例如4)，叔丁基Sieber接頭(例如))，親電可裂解的接頭，親核可裂解的接頭，光可裂解的接頭，在還原條件，氧化條件下裂解，通過使用保險栓(safety-catch)接頭進(jìn)行的裂解，以及通過消除機制進(jìn)行裂解。
A.親電子裂解的接頭。
親電子裂解的接頭通常是由質(zhì)子裂解的，并且包括對酸的裂解敏感性。合適的接頭包括修飾過的芐基系統(tǒng)，如三苯甲基，對烷氧基芐基酯，和對烷氧基芐基酰胺。其他合適的接頭包括叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán)，和縮醛系統(tǒng)(例如，在圖3中示出的O-C(R4)(R5)-O-R6)。
為了制備合適的接頭分子，還可以考慮將諸如鎳，銀或汞的親硫金屬用于硫代縮醛或其他含硫的保護(hù)基團(tuán)的裂解。
B.親核裂解的接頭親核裂解也是得到充分認(rèn)可制備接頭分子的的方法?？梢允褂迷谒胁环€(wěn)定的諸如酯的基團(tuán)(即，可以在堿性pH下簡單地裂解)，以及對非水親核試劑不穩(wěn)定的基團(tuán)?？梢杂梅x子裂解諸如三異丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的基團(tuán)中的硅-氧鍵。
C.光可裂解的接頭。
光可裂解的接頭業(yè)已被廣泛用于糖類化學(xué)。優(yōu)選的是，激活裂解所需要的光不會影響所述修飾過的核苷酸的其他成分。例如，如果用熒光團(tuán)作標(biāo)記的話，如果它所吸收的光的波長與裂解所述接頭分子所需要的光的波長不同，則是優(yōu)選的。合適的接頭包括基于O-硝基芐基化合物和硝基藜蘆基化合物的接頭。還可以使用基于二苯乙醇酮化學(xué)的接頭(Lee等，J.Org.Chem.643454-3460，1999)。
D.在還原條件下的裂解存在很多已知容易受還原性裂解的接頭。業(yè)已將使用基于鈀的催化劑的催化氫化作用裂解芐基和芐基氧基羰基基團(tuán)。二硫鍵還原也是本領(lǐng)域所公知的。
E.在氧化條件下的裂解基于氧化的方法為本領(lǐng)域所熟知。其中包括對烷氧基芐基的氧化以及硫和硒接頭的氧化。利用含水的碘裂解二硫接頭和其他基于硫或硒的接頭也屬于本發(fā)明的范圍。
F.保險栓接頭保險栓接頭是分兩個步驟裂解的接頭。在一種優(yōu)選系統(tǒng)中，第一個步驟是制備反應(yīng)性親核中心，然后進(jìn)行的第二個步驟包括會導(dǎo)致裂解的分子內(nèi)環(huán)化。例如，可以用肼或光化學(xué)處理乙酰丙酸酯鍵，以便釋放活性胺，然后可以將所述活性胺環(huán)化，以便裂解所述分子中其他部位的酯(Burgess等，J.Org.Chem.625165-5168，1997)。
G.通過消除機制裂解還可以使用消除反應(yīng)。例如，可以使用諸如Fmoc和氰乙基的基團(tuán)的堿催化的消除，和烯丙基系統(tǒng)的鈀催化的還原型消除。
除了所述裂解位點之外，所述接頭可以包括間隔單位。所述間隔基團(tuán)將所述核苷酸堿基與所述裂解位點或標(biāo)記分開。所述接頭的長度是不重要的，其前提是，所述標(biāo)記保持離開所述核苷酸的足夠距離，以便不干擾所述核苷酸和酶的任何相互作用。
所述修飾過的核苷酸還可以包括其他基團(tuán)或所述糖基團(tuán)的修飾。例如，可以制備在核糖環(huán)結(jié)構(gòu)上缺少兩個氧的雙脫氧核糖衍生物(位于2′和3′位置上)，并且用作生長的寡核苷酸鏈上的其他核苷酸摻入的封閉基團(tuán)。所述保護(hù)基團(tuán)要被用于阻止核苷酸摻入在新生的多核苷酸鏈上，并且可以在特定條件下除去，以便能夠進(jìn)行聚合。與現(xiàn)有技術(shù)相反，沒有結(jié)合在核糖3’位置上的可檢測的標(biāo)記。由此確保降低對所述聚合酶的空間位阻，但仍然能夠用所述保護(hù)基團(tuán)控制摻入。
技術(shù)人員將會理解如何將合適的保護(hù)基團(tuán)連接在核糖環(huán)上，以便阻斷與3′-OH的相互作用。所述保護(hù)基團(tuán)可以直接連接在3’位置上，或者可以連接在2’位置上(所述保護(hù)基團(tuán)具有足夠的大小或電荷，以便阻斷3’位置上的相互作用)。另外，所述保護(hù)基團(tuán)可以連接在3′和2′位置，并且可以裂解，以便暴露出3′OH基團(tuán)。
合適的保護(hù)基團(tuán)對本發(fā)明技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且可以用披露于以下文獻(xiàn)中的任何合適的保護(hù)基團(tuán)制備Green和Wuts，同上。所述保護(hù)基團(tuán)應(yīng)當(dāng)是可以除去的(或可以修飾的)，以便產(chǎn)生3′OH基團(tuán)。用于獲得3′OH的方法，可以是任何合適的化學(xué)或酶促反應(yīng)。
所述不穩(wěn)定性的接頭，可以包括能夠在與所述封閉相同的條件下裂解的官能團(tuán)。這將使得所述脫保護(hù)方法更為有效，因為裂解所述標(biāo)記和封閉基團(tuán)只需要一次處理。因此，所述接頭可以包括如圖3所示的官能團(tuán)，它可以與位于所述殘余核苷上的羥基官能團(tuán)或所述除去的標(biāo)記一起裂解。所述接頭還可以包括完全不同的化學(xué)官能團(tuán)，所述官能團(tuán)對于用于裂解所述封閉基團(tuán)的條件來說是不穩(wěn)定的。
術(shù)語“烷基”包括直鏈和支鏈烷基，除非本文中另有說明，術(shù)語“烷基”表示具有1-8個碳原子的基團(tuán)，并且通常具有1-6個碳原子，例如1-4個碳原子。烷基的例子，包括甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基和正己基以及它們的異構(gòu)體。
環(huán)烷基的例子是具有3-10個環(huán)原子的基團(tuán)，具體例子包括源于環(huán)丙烷，環(huán)丁烷，環(huán)戊烷，環(huán)己烷和環(huán)庚烷，雙環(huán)庚烷和萘烷的基團(tuán)。
鏈烯基的例子包括，但不局限于乙烯基(烯基)，1-丙烯基，2-丙烯基(烯丙基)，異丙烯基，丁烯基，丁-1，4-二烯基，戊烯基，和己烯基。
環(huán)鏈烯基的例子包括，但不局限于環(huán)丙烯基，環(huán)丁烯基，環(huán)戊烯基，環(huán)戊二烯基，和環(huán)己烯基。
術(shù)語“烷氧基”表示C1-6烷氧基，除非另有說明-OR，其中，R是C1-6烷基。C1-6烷氧基的例子包括，但不局限于-OMe(甲氧基)，-OEt(乙氧基)，-O(nPr)(正丙氧基)，-O(iPr)(異丙氧基)，-O(nBu)(正丁氧基)，-O(sBu)(仲-丁氧基)，-O(iBu)(異丁氧基)，和-O(tBu)(叔-丁氧基)。
術(shù)語氨基表示NR1R2類型的基團(tuán)，其中，R1和R2獨立地選自氫，C1-6烷基(又稱之為C1-6烷基氨基或二-C1-6烷基氨基)。
本文所使用的術(shù)語“鹵素”包括氟，氯，溴，和碘。
本發(fā)明的核苷酸分子適用于很多不同的方法，其中，需要檢測核苷酸。
DNA測序方法，如可以用所述核苷酸進(jìn)行披露于美國專利號5,302,509中的方法。
用于測定靶多核苷酸序列的方法可以這樣進(jìn)行讓靶多核苷酸分別與不同的核苷酸接觸，以便形成所述靶核苷酸的互補體，并且檢測所述核苷酸的摻入。所述方法利用了聚合，使得聚合酶通過摻入互補于所述靶的正確的核苷酸，以延伸所述互補鏈。所述聚合反應(yīng)還需要特殊引物來啟動聚合作用。
對每一輪反應(yīng)來說，所述標(biāo)記過的核苷酸的摻入，是通過聚合酶進(jìn)行的，并且，然后測定所述摻入事件。存在很多不同的聚合酶，并且，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，顯而易見的是哪一種酶是最適合使用的。優(yōu)選的酶包括DNA聚合酶I，Klenow片段，DNA聚合酶III，T4或T7 DNA聚合酶，Taq聚合酶或vent聚合酶。還可以使用通過工程方法改造成具有特定性質(zhì)的聚合酶。
所述測序方法優(yōu)選對排列在固體支持物上的靶多核苷酸進(jìn)行?？梢酝ㄟ^接頭分子將多個靶多核苷酸固定在所述固體支持物上，或者可以連接在諸如微球體的顆粒上，所述顆粒還可以連接在固體支持材料上。
可以通過多種方法將所述多核苷酸連接在所述固體支持物上，包括使用生物素-鏈親和素相互作用。用于將多核苷酸固定在固體支持物上的方法為本領(lǐng)域所公知，并且，包括石板印刷技術(shù)以及將每一種多核苷酸“點”在固體支持物的特定位置上。合適的固體支持物為本領(lǐng)域所公知，并且包括玻璃載玻片和珠，陶瓷和硅表面和塑料材料。所述支持物通常是平面，盡管也可以使用微珠(微球體)，并且還可以通過已知方法將后者連接在其他固體支持物上。所述微球體可以具有任何合適的大小，其直徑通常為10-100納米。在優(yōu)選實施方案中，將所述多核苷酸直接連接在平面上，優(yōu)選連接在平的玻璃表面上。連接優(yōu)選通過共價鍵的形式進(jìn)行。所使用的陣列優(yōu)選是單分子陣列，它包括位于獨特的光學(xué)可分辨區(qū)域的多核苷酸，例如，正如在國際申請?zhí)朩O00/06770中所披露的。
所述測序列方法可以針對單個多核苷酸分子和多個多核苷酸分子陣列進(jìn)行，即具有不同的各個多核苷酸分子的陣列，和具有包括一種多核苷酸分子的多個拷貝的不同區(qū)域的陣列。單分子陣列使得每一種多核苷酸可以獨立分辨。優(yōu)選使用單分子陣列。對單一分子陣列的非破壞性測序，使得能夠形成可以空間尋址的陣列。
所述方法利用聚合反應(yīng)制備所述靶的互補序列。進(jìn)行聚合的必須條件，對技術(shù)人員來說是顯而易見的。
為了進(jìn)行所述聚合酶反應(yīng)，通常首先必須使引物序列與所述靶多核苷酸退火，所述引物序列是由所述聚合酶識別的，并且起著所述互補鏈隨后延伸的起始位點的作用。所述引物序列可以相對所述靶多核苷酸作為獨立的成分添加。另外，所述引物和靶多核苷酸可以分別是一個單鏈分子的一部分，由所述引物部分與所述靶的一部分形成分子內(nèi)雙鏈體，即發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)。可以在所述分子的任何位點，將該結(jié)構(gòu)固定在所述固體支持物上。進(jìn)行所述聚合酶反應(yīng)所必需的其他條件，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些條件包括溫度，pH，緩沖液組成。
然后，讓本發(fā)明的修飾過的核苷酸與所述靶多核苷酸接觸，以便能夠進(jìn)行聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分別添加每一種類型的核苷酸(A，T，G或C)，或同時添加。如果所述核苷酸是同時添加的話，優(yōu)選用不同的標(biāo)記對每一種類型的核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。
讓所述聚合步驟進(jìn)行足以摻入一個核苷酸的時間。
然后除去未摻入的核苷酸，例如，通過對所述陣列實施洗滌步驟，并且隨后可以進(jìn)行對摻入標(biāo)記的檢測。
檢測可以通過常規(guī)方法進(jìn)行，例如，如果所述標(biāo)記是熒光部分的話，摻入的堿基的檢測，可以通過使用共焦掃描顯微鏡進(jìn)行，用激光掃描所述陣列的表面，以便使直接結(jié)合在所述摻入的堿基上的熒光團(tuán)成像。另外，可以用靈敏的2-D探測器，如電荷偶連的探測器(CCD)觀察所產(chǎn)生的每一種信號。不過，可以獲得諸如掃描近場光學(xué)顯微方法(SNOM)的其他技術(shù)，并且可用于使密集的陣列成像。例如，使用SNOM可以分辨間隔距離小于100納米，例如，10納米-10微米的各個多核苷酸。有關(guān)掃描近場光學(xué)顯微方法的說明，可以參見Moyer等，Laser Focus World 2910，1993。用于使多核苷酸陣列成像的合適的裝置是公知的，并且其技術(shù)參數(shù)為技術(shù)人員所公知。
在檢測之后，可以用裂解所述接頭的合適條件除去所述標(biāo)記。
修飾過的核苷酸的使用并不局限于DNA測序技術(shù)，還可用本發(fā)明的核苷酸實施包括多核苷酸合成，DNA雜交分析，和單核苷酸多態(tài)性研究的其他形式。涉及到核苷酸和酶之間的相互作用的任何技術(shù)，都可以利用本發(fā)明的分子。例如，可以將所述分子用作逆轉(zhuǎn)錄酶或末端轉(zhuǎn)移酶的底物。
合適的結(jié)構(gòu)披露于以下實施例中，并且在附圖中示出。
實施例實施例1.二硫接頭的合成
將叔丁基-N-(2-巰基乙基)氨甲基酸酯(3mmol，0.5mL)滴加到將1.32g(6.0mmol)aldrithiol溶解在15mL MeOH中制成的溶液中。在1.5小時之后，該反應(yīng)業(yè)已結(jié)束，并且蒸發(fā)所述溶劑。通過在二氧化硅上面用乙酸乙酯∶石油醚(1∶4)層析而純化所述粗制產(chǎn)物。產(chǎn)物1a是以淺黃色油狀物形式獲得的(0.76g，2.67mmol，89％)。1HNMR(500Mhz，D6-DMSO)d＝1.38(s，9H，tBu)，2.88(t，J＝6.6Hz，2H，SCH2)，3.20(q，J＝6.6Hz，2H，CH2NH)，7.02(bs，1H，NH)，7.24(ddd，J＝7.3Hz，J＝4.9Hz，J＝1.0Hz，1H，H-5)，7.77(dt，J＝8.1Hz，J＝1.0Hz，1H，H-3)，7.82(ddd，J＝8.1Hz，J＝7.4Hz，J＝1.8Hz，1H，H-4)，8.46(ddd，J＝4.9Hz，J＝1.8Hz，J＝1.0Hz，1H，H-6)。
為了對1a的胺脫保護(hù)，將17mg(60μmol)溶解在0.5mL DCM和0.5mL三氟乙酸的混合物中。在室溫下將該混合物攪拌2.5小時，然后在減壓條件下除去溶劑。重復(fù)三次將殘余物重新溶解在2mL DCM中，并且蒸發(fā)至干燥。在高真空條件下將所述脫保護(hù)的產(chǎn)物干燥3小時，然后溶解在1mL干燥DMF中。假設(shè)所述脫保護(hù)作用業(yè)已完成。
向?qū)?5mg 5-羧甲基四甲基羅丹明(35μmol)溶解在2mL DMF中制成的溶液中添加8.0mg N-羥基琥珀酰亞胺(70μmol)和7.8mg DCC(38μmol)。在黑暗中攪拌該混合物6小時。然后添加22μl DIPEA(126μmol)和溶解在1mL DMF中的脫保護(hù)的1a的溶液。在黑暗中攪拌該反應(yīng)混合物過夜，然后在減壓條件下除去溶劑。將殘余物溶解在DCM中，并且用飽和氯化鈉溶液洗滌。在硫酸鎂上干燥之后，用CHCl3∶MeOH(3∶1)作溶劑在二氧化硅上純化所述粗制混合物。1b是以暗紅色固體形式分離的，產(chǎn)率為90％(19.2mg，31.4μmol)。1H NMR(500MHz，D6-DMSO)δ＝3.09(t，J＝6.7Hz，2H，SCH2)，3.63(q，J＝6.2Hz，2H，CH2NH)，6.48-6.53(m，6H，H-蒽)，7.23-7.26[m，1H，(吡啶)]，7.32(d，J＝7.9Hz，1Hz，H-3)，7.81-7.82[m，2H，H-3+H-4(吡啶)]，8.21(d，J＝7.9Hz，1H，H-4)，8.43(s，1H，H-6)，8.47[dt，J＝4.7Hz，J＝1.3Hz，1H，H-6(吡啶)]，9.03(t，J＝5.2Hz，1H，NH)。
將巰基丙酸(20.6μmol，1.8ml)添加到由19.6mg 1b(32.7μmol)溶解在2mL MeOH中制成的溶液中。在黑暗中攪拌2.5小時。在減壓條件下除去所述溶劑。用CHCl3∶MeOH∶AcOH 15∶1∶0.5作溶劑混合物，通過在二氧化硅上層析，純化所述粗制產(chǎn)物?？梢苑蛛x15.5mg(26μmol，80％)暗紅色晶體1c。1H NMR(500MHz，D20)δ＝2.53(t，J＝7.0Hz，2H，CH2COOH)，2.88(t，J＝7.0Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.96-2.99(m，2H，CH2CH2NH)，3.73(t，J＝6.3Hz，2H，CH2NH)，6.53(d，J＝2.4Hz，2H，H-蒽)，6.81(dd，J＝9.5Hz，J＝4.5Hz，2H，H-蒽)，7.12(d，J＝9.5Hz，2H，H-蒽)，7.48(d，J＝7.9Hz，1H，H-3)，7.95(dd，J＝8.1Hz，J＝1.9Hz，1H，H-2)，8.13(d，J＝1.9Hz，1H，H-1)。+v電子噴射(C30H31N3O6S2)預(yù)計為593.17；實測為594.3[M+H]，616.2[M+Na]。
將9.9mg N-羥基琥珀酰亞胺(86.8μmol)和9.7mg DCC(47.1μmol)添加到通過將25.8mg 1c(43.4μmol)溶解在3mL DMF(無水)制成的溶液中。在室溫下，在黑暗中將該混合物攪拌5小時，然后放入冰箱中過夜。通過棉絨塞將該混合物過濾到新的燒瓶中，并且向該混合物中添加865μL propargylamino dUTP(14.7μmol，17μmol，溶解在1mL H2O)和3mL硼酸鈉緩沖液(0.1M溶液，pH9)的溶液中。攪拌該混合物過夜。在除去溶劑之后，將殘余物溶解在盡可能少的水中，并且通過HPLC純化。使用Zorba×C18柱，用0.1M三乙基碳酸氫銨(TEAB)和乙腈作緩沖液。31p NMR(400MHz，D2O)δ＝-4.73(d)，-9.93(d)，19.03(t)。-ve電子噴射(C42H47N6O19P3S2假定4H+抗衡離子)。預(yù)計為1096.16；實測為1092.9。在水中的UVλ(max)＝555nm，A(555)＝0.885(c＝0.036μmol)。
用Klenow DNA聚合酶成功地?fù)饺肓巳姿?1)。所述反應(yīng)是在以下條件下進(jìn)行的50mM Tris·HCl(pH7.5)，10mM NaCl，2mM DTT，0.1mM EDTA，5mM MgCl2，2μM化合物3，100nM DNA模板(事先用P32和T4多核苷酸激酶標(biāo)記過的)和10個單位的市售外-Klenow(Amersham Corp.，Arlington Heights，Illinois，USA)。所述DNA模板是自我互補的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(5′-TACCgTCgACgTCgACgCTggCg-AgCgTgCTgCggTTTTT(C6-氨基)TTACCgCAgCACgCTCgCCAgCg；SEQ ID NO1)。所述反應(yīng)是在37℃下，在100μL體積中進(jìn)行的，時間點選擇為0，1，3，5和10分鐘。使所述反應(yīng)產(chǎn)物沿變性的(8M尿素)20％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并且在typhoon磷成像儀上成像。在1分鐘內(nèi)觀察到了完全的單堿基延伸，表明具有有效的聚合酶摻入(二硫接頭凝膠，圖4)。示出了第二組泳道，其中，在摻入之后，讓所述材料接觸DTT?？梢钥吹揭粋€不同的帶移動，表明從所述DNA構(gòu)建體上除去了所述染料。因此，業(yè)已使用這種二硫化物化合物證實了一輪聚合酶摻入和裂解。
實施例2.無TMR-Sieber接頭的酸的合成。
將5-[-9-[9-(芴基-甲基氧基羰基)氨基]呫噸-3-基]戊酸(42.8mg，80μmol)在室溫下，與二琥珀酰碳酸酯(22.5mg，88μmol)和N，N-二甲基氨基吡啶(10.8mg，88μmol)一起在DMF中攪拌。5分鐘之后，添加單-5-羧基TMR乙二胺(198.9mg，40μmol)，然后添加DIPEA(13.9μl，80μmol)。在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物。2小時之后，用二氯甲烷(100mL)稀釋所述反應(yīng)混合物，并且用1M含水的磷酸二氫鉀(50mL)提取所得到的溶液。分離DCM層，并且在減壓下蒸發(fā)。通過短的柱層析純化所述殘余物。收集用在氯仿中配制的40％甲醇洗脫的所述級份，并且在減壓條件下蒸發(fā)。然后，將所述殘余物溶解在無水DMF(1mL)和N-(2-巰基乙基)氨基甲基聚苯乙烯(200mg，400μmol)和DBU(12μL，80μmol)中。在室溫下放置10分鐘之后，過濾所述殘余物，并且用無水DMF(1mL)漂洗。合并所有的濾液，然后添加到將琥珀酸酐(80mg，800μmol)，DIPEA(139μL，800μmol)和DMAP(9.8mg，80μmol)溶解在DMF(1mL)中制備的溶液中。然后，在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物。在過夜(16小時)之后，在減壓下蒸發(fā)所有的溶劑，并且通過短的柱層析純化所述殘余物。以紫色粉末形式獲得了用溶解在氯仿中的30％的甲醇洗脫的標(biāo)題化合物(22mg，總產(chǎn)率63％)。1HNMR[D6-DMSO]8.82(1H，t，J5.4，ex.)，8.75(1H，d，J8.9，ex.)，8.42(1H，d，J1.5)，8.20(1H，dd，J8.0和1.5)，7.95(1H，t，J5.9，ex.)，7.34(1H，d，J7.3)，7.30-7.27(2H，m)，7.21(1H，d，J8.5)，7.16-7.07(2H，m)，6.68(1H，dd，J8.8和2.5)，6.65(1H，d，J2.4)，6.49-6.43(6H，m)，6.18(1H，d，J5.6)，3.95(1H，t，J5.9)，3.39-3.36(2H，m)，3.30-3.27(2H，m)，2.92(12H，s)，2.37-2.33(2H，m)，2.14(2H，t，J7.2)和1.70-1.62(4H，m)。MS[(ES(+)]，m/z 868.5(MH+)。
實施例3.TMR-Sieber接頭-dUTP(3)的合成 在室溫下，將無TMR-sieber接頭的酸(4.34mg，5μmol)與二琥珀酰碳酸酯(1.74mg，7.5μmol)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.92mg，7.5μmol)在DMF(1mL)中攪拌。10分鐘之后，將所有反應(yīng)溫和物添加到5-(3-氨基丙炔基)-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸的四-(三-丁銨)鹽(10mL)中。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物4小時，并且在冰箱中保存過夜。然后用冷卻水(10mL)稀釋所述反應(yīng)混合物，并且將所有得到的溶液加樣到DEAE A-25的短柱上。首先用0.1M TEAB緩沖液洗脫所述柱，然后用0.7M TEAB緩沖液洗脫。收集0.7M TEAB洗脫劑，并且在減壓下蒸發(fā)。用MeOH(2×10mL)共同蒸發(fā)殘余物，然后通過制備HPLC純化。以三乙銨鹽的形式獲得了標(biāo)題化合物，產(chǎn)率為31％(根據(jù)在水中，在555nm波長下對TMR的定量測定(pH7))。在D2O中的1HNMR表明了兩種非對映異構(gòu)體，這是由于sieber接頭部分，并且存在大約三個三乙銨抗衡離子。1HNMR[D2O]8.18(1H，m)，8.06(1H，m)，7.76(0.55H，s)，7.74(0.45H，s)，7.36-7.09(5H，m)，6.89-6.72(3H，m)，6.59-6.37(5H，m)，6.12(0.55H，t，J6.6)，6.05(0.45H，t，J6.6)，5.99(0.45H，d，J2.5)，5.91(1.1H，m)，5.88(0.45H，s)，4.49(0.55H，m)，4.43(0.45H，m)，4.00-3.35(9H，m)，3.30-2.95(32H，m)，2.65-2.52(4H，m)，2.25-2.05(4H，m)，1.62-1.42(4H，m)和1.23(27H，t，J7.3)。31P[D2O]-9.91(γP，d，J19.2)，[-11.08(αP，d，J20.1)，和-11.30(αP，d，J20.1)，由于兩種非對稱異構(gòu)體1和-22.57(βP，m)。MS[(ES(-))m/z1369.1(M-)。
用Klenow DNA聚合酶成功地?fù)饺肓巳姿?3)。所述反應(yīng)是在以下條件下進(jìn)行的50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM NaCl，2mM DTT，0.1mM EDTA，5mM MgCl2，2μM化合物3，100nM DNA模板(事先用P32和T4多核苷酸激酶標(biāo)記過)和10個單位的市售外-Klenow(Amersham Corp.Arlington Heights，Illinois，USA)。所述DNA模板是自我互補的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(5′-TACCgTCgACgTCgACgCTggCg-AgCgTgCTgCggTTTTT(C6-氨基)TTACCgCAgCACgCTCgCCAgCg；SEQ ID NO1)。所述反應(yīng)是在37℃下，在100μL體積中進(jìn)行的，時間點選擇為0，1，3，5和10分鐘。使所述反應(yīng)產(chǎn)物沿變性的(8M尿素)20％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并且在typhoon磷成像儀上成像。在1分鐘內(nèi)出現(xiàn)了完全的單堿基延伸,表明有效的聚合酶摻入(Sieber接頭凝膠，圖5)。
實施例4.TMR-吲哚接頭-dUTP(4)的合成
用KlenowDNA聚合酶成功地?fù)饺肓巳姿?4)。所述反應(yīng)是在以下條件下進(jìn)行的50mM Tris·HCl(pH7.5)，10mM NaCl，2mM DTT，0.1mM EDTA，5mM MgCl2，2μM化合物3，100nM DNA模板(事先用P32和T4多核苷酸激酶標(biāo)記過)和10個單位的市售外-Klenow(Amersham Corp.Arlington Heights，Illinois，USA)。所述DNA模板是自我互補的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(5′-TACCgTCgACgTCgACgCTggCg-AgCgTgCTgCggTTTTT(C6-氨基)TTACCgCAgCACgCTCgCCAgCg；SEQ ID NO1)。所述反應(yīng)是在37℃下，在100μL體積中進(jìn)行的，時間點選擇為0，1，3，5和10分鐘。使所述反應(yīng)產(chǎn)物沿變性的(8M尿素)20％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并且在typhoon磷成像儀上成像。在1分鐘內(nèi)觀察到了完全的單堿基延伸，表明有效的聚合酶摻入(吲哚接頭凝膠，圖6)。
本文所引用的所有專利，專利申請，和公開的參考文獻(xiàn)被以它們的全文形式收作本文參考。盡管業(yè)已結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了具體圖示和說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以對其中的形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種改變，而又不超出由所附權(quán)利要求書所包含的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸或核苷分子，具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基。
2.如權(quán)利要求1的分子，其中，所述堿基是嘌呤或嘧啶。
3.如權(quán)利要求1或2的分子，其中，所述堿基是脫氮嘌呤。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項的分子，具有核糖或脫氧核糖糖部分。
5.如權(quán)利要求4的分子，其中，所述核糖或脫氧核糖包括通過2′或3′氧原子連接的保護(hù)基團(tuán)。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項的分子，它是脫氧核糖核苷三磷酸。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項的分子，其中，所述可檢測的標(biāo)記是熒光團(tuán)。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項的分子，其中，所述接頭是酸不穩(wěn)定性的，光不穩(wěn)定性的，或包括二硫鍵。
9.一種標(biāo)記核酸分子的方法，該方法包括將核苷酸或核苷分子摻入到所述核酸分子中，其中，所述核苷酸或核苷分子具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述摻入是通過末端轉(zhuǎn)移酶，聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行的。
11.如權(quán)利要求9或10的方法，其中，所述堿基是脫氮嘌呤。
12.如權(quán)利要求9-11中任意一項的方法，其中，所述核苷酸或核苷分子具有核糖或脫氧核糖糖部分，并且，其中，所述核糖或脫氧核糖包括通過2′或3′氧原子連接的保護(hù)基團(tuán)，并且可以對它進(jìn)行修飾或?qū)⑵涑ィ员惚┞冻?′OH基團(tuán)。
13.如權(quán)利要求9-12中任意一項的方法，其中，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸三磷酸。
14.如權(quán)利要求9-13中任意一項的方法，其中，所述標(biāo)記是熒光團(tuán)。
15.如權(quán)利要求9-14中任意一項的方法，其中，所述接頭是酸不穩(wěn)定性的，光不穩(wěn)定性的，或包括二硫鍵。
16.如權(quán)利要求9-15中任意一項的方法，其中，所述可檢測的標(biāo)記和/或可裂解的接頭具有足以阻止第二個核苷酸或核苷摻入到所述核酸分子中的大小。
17.一種用于測定靶單鏈多核苷酸的序列的方法，包括監(jiān)測互補核苷酸的依次摻入，其中，每個所述核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基，并且，其中，每一個摻入的核苷酸的身份是通過檢測與所述堿基連接的標(biāo)記確定的，并且隨后除去所述標(biāo)記。
18.一種用于確定靶單鏈多核苷酸的序列的方法，包括(a)提供核苷酸，其中，所述核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基，并且，其中，所述與每一種類型的核苷酸連接的可檢測的標(biāo)記，在檢測時可以與用于標(biāo)記其他類型的核苷酸的可檢測標(biāo)記區(qū)分開來；(b)將核苷酸摻入到所述靶單鏈多核苷酸的互補體上；(c)檢測(b)的核苷酸的標(biāo)記，以便確定摻入的核苷酸的類型；(d)除去(b)的核苷酸的標(biāo)記；和(e)任選重復(fù)步驟(b)-(d)一次或多次；以便測定靶單鏈多核苷酸的序列。
19.如權(quán)利要求17的方法，其中，讓每一個核苷酸依次與所述靶接觸，在添加下一個核苷酸之前除去未摻入的核苷酸，并且其中所述標(biāo)記的檢測和除去是在添加每一個核苷酸之后，或在添加所有四種核苷酸之后進(jìn)行的。
20.如權(quán)利要求17的方法，其中，讓所有核苷酸同時與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記。
21.如權(quán)利要求17的方法，包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，讓包括四種核苷酸中的兩種的第一種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的兩種核苷酸的第二種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟一次或多次。
22.如權(quán)利要求17的方法，包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，讓包括四種核苷酸中的一種的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的三種核苷酸的第二種組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟任選一次或多次。
23.如權(quán)利要求17的方法，包括第一個步驟和第二個步驟，其中，在第一個步驟中，將包括四種核苷酸中的三種的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，在第二個步驟中，讓包括第一種組合物中所不包括的核苷酸的組合物與所述靶接觸，并且在檢測之前除去未摻入的核苷酸，并且隨后除去所述標(biāo)記，并且，其中，任選重復(fù)所述第一個步驟和第二個步驟一次或多次。
24.一種試劑盒，所述試劑盒包括(a)各個核苷酸，其中，每一個核苷酸具有通過可裂解的接頭與可檢測的標(biāo)記連接的堿基，并且，其中，與每一種核苷酸連接的所述可檢測的標(biāo)記，在檢測時可以與用于標(biāo)記其他三種核苷酸的可檢測標(biāo)記區(qū)分開來；和(b)它們的包裝材料。
25.如權(quán)利要求21的試劑盒，所述試劑盒還包括酶和適合所述酶起作用的緩沖液。
全文摘要
披露了通過可裂解的接頭基團(tuán)與可檢測的標(biāo)記連接的核苷和核苷酸。
文檔編號C07H19/06GK1617937SQ02827832
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月4日
發(fā)明者S·巴拉蘇布拉馬尼安, C·巴恩斯, 劉小海, H·斯維爾德羅 申請人:索雷克薩有限公司