專利名稱：水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達(dá)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達(dá)菌株，特別涉及一種大腸桿菌分泌型水蛭素突變體編碼基因與高效表達(dá)菌株。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，水蛭是一種傳統(tǒng)的中藥，一千八百年前《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。中醫(yī)認(rèn)為它有破血、逐瘀、通經(jīng)的療效，主要用于治療瘕癥、痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷。西方也常用水蛭吸血以治療某些疾病。從水蛭及其唾液腺中已提取出多種活性成分，水蛭素(Hirudin)是其中活性最顯著并且研究最多的一種。水蛭素是由65-66個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多肽)，對(duì)凝血酶有極強(qiáng)的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凝血酶天然特異抑制劑。動(dòng)物試驗(yàn)與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等進(jìn)一步血瘀現(xiàn)象。此外，它還能抑制凝血酶誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和凝血酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會(huì)引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子，有較好的療效。
水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓、彌漫性血管內(nèi)凝血和腦血栓的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動(dòng)脈血栓的形成，預(yù)防溶栓后或血管再造后血栓的形成，以及用于腦外傷的治療；改善體外血液循環(huán)和血液透析過程。在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病細(xì)胞等。水蛭素配合化學(xué)治療和放射治療，促進(jìn)腫瘤中的血流，增強(qiáng)療效。
動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究證明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用。無論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，血壓、心率、血相、出血時(shí)間和血液化學(xué)成分均不受影響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無過敏反應(yīng)，一般無特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量LD50＞50mg/kg，遠(yuǎn)大于治療所用的劑量(0.25mg/kg)。尤其是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來很大方便。水蛭素比較穩(wěn)定，加熱、酸堿溶液、以及一定條件下胰蛋白酶和糜蛋白酶反應(yīng)并不破壞其活性；而且水蛭素的某些水解片斷仍有抑制凝血酶的作用。
水蛭素具有重要開發(fā)價(jià)值，但水蛭的來源有限，所以國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。1986年后，重組水蛭素已在大腸桿菌和酵母菌中分別表達(dá)成功。與天然水蛭素相比，重組水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酯化，活性略低，其余性質(zhì)基本相同。在治療的劑量下靜脈注射無毒副反應(yīng)。1999年底重組水蛭素首先在德國(guó)和英國(guó)上市，為粉針劑，商品名是脈管通(Revasc)，其有效成分為酵母細(xì)胞制造的重組水蛭素(去硫水蛭素，Desirudin)。目前臨床主要用于手術(shù)后防止血栓形成，以及對(duì)深靜脈血栓、冠狀動(dòng)脈再狹窄、心肌梗塞、不穩(wěn)定心絞痛等的治療。
我國(guó)有許多抗栓中成藥以水蛭為主要成分，如腦血康口服液、抗血栓片、活血通脈膠囊等。含水蛭素的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程生產(chǎn)重組水蛭素可以取代藥源有限的水蛭，而且還能開發(fā)出更有效的藥物。重組水蛭素類多肽藥物的研制和生產(chǎn)有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
當(dāng)前，水蛭素突變體有數(shù)十種之多，研究表明，將水蛭素第47位天冬酰胺(Asn)改變成賴氨酸(Lys)的水蛭素突變體HV2-Lys47(序列表中的序列2，由65個(gè)氨基酸殘基組成。)可以顯著提高水蛭素抗凝血酶的活性，達(dá)到天然63位含硫酸酯水蛭素同樣高的活性水平。目前，該種水蛭素突變體在酵母表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)，產(chǎn)率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適于在大腸桿菌中表達(dá)，編碼水蛭素突變體HV2-Lys47的基因。
編碼水蛭素突變體HV2-Lys47的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)，能在大腸桿菌中表達(dá)的DNA序列。
所述SEQ ID №1由198個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1位至第195位核苷酸。
水蛭素突變體HV2-Lys47基因是采用大腸桿菌偏愛密碼子，用遞歸PCR方法合成的。
含有水蛭素突變體HV2-Lys47編碼基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系，均屬本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍，特別是包含有在水蛭素突變體HV2-Lys47基因上連接有外膜蛋白信號(hào)肽編碼序列的表達(dá)載體具有重要意義，這樣的表達(dá)載體可以使水蛭素突變體HV2-Lys47分泌至胞外。利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體，如pBH-2重組質(zhì)粒，其物理圖譜如圖1所示。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)水蛭素突變體HV2-Lys47的菌株。
將本發(fā)明的突變體HV2-Lys47基因?qū)氲酱竽c桿菌中，可以得到高效表達(dá)水蛭素突變體HV2-Lys47的菌株，熱誘導(dǎo)分泌型高效表達(dá)水蛭素的菌株是大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2，已于2003年03月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC №0908。
大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908是通過將重組質(zhì)粒pBH-2導(dǎo)入到大腸桿菌中得到的。大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908在LB平板培養(yǎng)基上呈光滑、濕潤(rùn)、全緣的菌落形態(tài)，其最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH值是7.0。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)水蛭素突變體HV2-Lys47的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)水蛭素突變體HV2-Lys47的方法，是在將培養(yǎng)溫度自25℃-32℃升高到40℃-43℃的熱誘導(dǎo)條件下，培養(yǎng)大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2CGMCC №0908，產(chǎn)生水蛭素突變體HV2-Lys47。優(yōu)選的熱誘導(dǎo)條件為培養(yǎng)溫度從30℃升高到42℃；并對(duì)所得到的水蛭素進(jìn)行分離純化。
大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2熱誘導(dǎo)分泌型表達(dá)水蛭素突變體產(chǎn)率可高達(dá)350mg/L，生產(chǎn)周期短、成本低；水蛭素突變體在細(xì)胞內(nèi)被正確加工，并且全部分泌到培養(yǎng)基中，大大簡(jiǎn)化了分離純化的工藝。大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2穩(wěn)定，易于操作，要求的設(shè)備條件相對(duì)較低。


圖1為表達(dá)載體pBH-2的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、水蛭素的生產(chǎn)培養(yǎng)大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908至菌體濃度為OD600達(dá)到15以上時(shí)，將培養(yǎng)溫度由30℃升高到42℃，水蛭素突變體HV2-Lys47即誘導(dǎo)產(chǎn)生，培養(yǎng)15小時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高值，水蛭素突變體HV2-Lys47被分泌到胞外；收集培養(yǎng)液，除去菌體，水蛭素突變體HV2-Lys47存在于上清液中；然后通過離子交換柱，純化水蛭素突變體HV2-Lys47；最后經(jīng)超濾，去鹽和濃縮，并凍干成粉末。產(chǎn)率為350mg/L。
實(shí)施例2、原藥動(dòng)物試驗(yàn)1、鼠急毒試驗(yàn)取小鼠30只，每只靜脈注射實(shí)施例1得到的水蛭素突變體HV2-Lys47 1300mg/kg，觀察小鼠的反應(yīng)，結(jié)果小鼠均未見異常，說明本發(fā)明的水蛭素突變體HV2-Lys47無毒副作用。
2、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)取大鼠30只，每只每天靜脈注射實(shí)施例1得到的水蛭素突變體HV2-Lys47 2mg/kg，連續(xù)給藥二個(gè)月，觀察大鼠的反應(yīng)，結(jié)果大鼠均未見異常，說明本發(fā)明的水蛭素突變體HV2-Lys47無毒副作用。
序列表<160>2<210>1<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1attacttaca ctgattgtac agaatcgggt caaaatttgt gcctctgcga gggaagcaat60gtttgcggta aaggcaataa gtgcatattg ggttctaatg gaaagggcaa ccaatgtgtc120actggcgaag gtacaccgaa gcctgaaagc cataacaacg gcgatttcga agaaattcca180gaagaatatt tacaataa198<210>2<211>65<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu15 10 15Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu20 25 30Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr35 40 45Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro50 55 60Glu Glu Thr Leu Gln6權(quán)利要求
1.水蛭素突變體HV2-Lys47的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)，能在大腸桿菌中表達(dá)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述水蛭素突變體HV2-Lys47的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №1的編碼框?yàn)樽?‘端第1至第195個(gè)堿基。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體中的水蛭素突變體HV2-Lys47基因連接有外膜蛋白信號(hào)肽編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pBH-2重組質(zhì)粒。
7.大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2 CGMCC №0908。
8.一種生產(chǎn)水蛭素突變體HV2-Lys47的方法，是在將培養(yǎng)溫度自25℃-32℃升高到40℃-43℃的熱誘導(dǎo)條件下，培養(yǎng)大腸埃希氏菌的熱誘導(dǎo)條件下，培養(yǎng)大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2 CGMCC №0908，產(chǎn)生水蛭素突變體HV2-Lys47。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述熱誘導(dǎo)條件為培養(yǎng)溫度從30℃升高到42℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達(dá)菌株，目的是提供一種適于在大腸桿菌中表達(dá)，編碼水蛭素突變體HV2－Lys47的基因。本發(fā)明提供的水蛭素突變體基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)，能在大腸桿菌中表達(dá)的DNA序列。本發(fā)明還提供了水蛭素突變體和產(chǎn)生水蛭素突變體的工程菌—大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2CGMCC №0908。本發(fā)明可用于高效地生產(chǎn)水蛭素突變體HV2－Lys47。
文檔編號(hào)C07K14/815GK1536082SQ0310924
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月7日
發(fā)明者朱圣庚 申請(qǐng)人:北京大學(xué)