專利名稱：一種具有抗腫瘤作用的蛋白質(zhì)及其體外高效表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的新用途，特別是涉及心肌肌鈣蛋白I的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前治療惡性腫瘤的常用方法有外科手術(shù)治療、化學藥物療法、放射治療、生物療法和中醫(yī)中藥療法。其中以外科手術(shù)治療、化學藥物療法、放射治療最為常用。外科手術(shù)治療作為大多數(shù)腫瘤治療的首選和主要方案，使無數(shù)腫瘤患者得以康復、延長壽命或者提高了生活質(zhì)量。但是，在腫瘤治療方面，外科手術(shù)治療只適用于一定條件和范圍的病人，而且由于腫瘤可復發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因，手術(shù)切除并不都能達到根治的目的?；瘜W藥物療法和放射治療的運用在腫瘤的治療方面也發(fā)揮著非常重要和必不可少的作用，并且也在不斷的發(fā)展。但是，目前應用的化療藥物療法和放射治療對身體中所有活躍的增殖細胞都有侵害，如造血系統(tǒng)、胃腸道等，所以放化療的病人常有血象降低、胃腸道出血、惡心、嘔吐等癥狀。而且，由于受到病人機體和精神方面承受力及腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥性等多方面原因的限制，放化療并不能殺死所有的腫瘤細胞，為腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移及疾病的惡化留下了隱患。生物療法和中醫(yī)中藥療法也是抗腫瘤的合理的方法，但仍需繼續(xù)研究以提高療效。因此，開發(fā)有明顯治療效果、安全的抗腫瘤藥物是醫(yī)藥界面臨的一項迫在眉睫的任務。
研究表明，惡性實體腫瘤的無限制侵襲性生長及其轉(zhuǎn)移依賴于新血管的不斷生成，所以抑制血管生成能顯著地抑制腫瘤的生長。抑制血管生成，阻斷瘤體血液供應是不同于常規(guī)抗腫瘤治療的新策略，也稱為“腫瘤饑餓療法”，已經(jīng)成為抗腫瘤治療研究的熱點。正常生理狀態(tài)下，除了女性生殖系統(tǒng)在排卵，黃體生成，懷孕等過程，有短暫的新生血管生成過程外，成年人的脈管系統(tǒng)增生處于相對靜止狀態(tài)。但是在腫瘤組織中，為適應瘤組織的快速生長，血管生成非?；钴S，以及時為瘤組織生長供應血液。腫瘤組織中的微血管來源有兩種一種是腫瘤細胞等產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子，誘導瘤體生成微血管；另一種是殘存于瘤體的宿主血管逐漸變?yōu)槟[瘤血管，既宿主血管的腫瘤化。與正常血管不同，腫瘤血管的血管內(nèi)皮細胞不完整，基底膜稀疏且易于泄露。腫瘤血管生成后不再進一步分化改建成動脈及靜脈，無平滑肌及神經(jīng)末梢，屬于被動血管，其血流完全依賴于體循環(huán)。新生的微血管是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的第一站，腫瘤細胞通過腫瘤微血管壁進入血液循環(huán)向遠處轉(zhuǎn)移。
實體腫瘤生長需要大量的血液供應。許多實驗研究證實抑制動物體內(nèi)新血管生成，可有效地切斷為腫瘤生長提供養(yǎng)分的血液供應，使瘤體萎縮以至消失?？剐律芩幬颰NP-470以及抗bFGF、VEGF單克隆抗體的應用，突變型VEGF受體FlK-1競爭性阻斷VEGF信號傳導，αVβ3過度表達誘導內(nèi)皮細胞凋亡、以及Angiostatin特異抑制腫瘤新生血管形成等，均可抑制腫瘤生長，是一種新型的、有前途的抗腫瘤藥物，可以彌補當前臨床腫瘤治療手段的局限并取代部分治療手段。由于這類藥物是通過抑制新生血管的形成來達到抑制腫瘤生長的，而人的正常組織細胞的生長不依賴于新生血管的生成，所以對正常組織幾乎沒有毒副作用。這類藥物不直接作用于腫瘤細胞，故抑制腫瘤具有廣譜性而不產(chǎn)生抗藥性，是當前國際上公認的有效、安全、有前途的抗腫瘤藥物，主要用于原位和轉(zhuǎn)移實體瘤的治療和輔助腫瘤的手術(shù)治療，也可以用來防止腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，開發(fā)一種具有血管增生抑制作用的抗腫瘤藥物，在惡性腫瘤的防治方面，具有重要的臨床意義。
心肌肌鈣蛋白I是心肌肌鈣蛋白的三個亞基之一，目前常被用作心肌梗塞診斷的標志物，具有序列表中的SEQ ID №1氨基酸殘基序列，由210個氨基酸殘基組成。
大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)是用于表達外源蛋白的最成功的表達系統(tǒng)之一，近年來發(fā)展非常迅速，目前已有幾百種蛋白在該表達系統(tǒng)中得以表達。畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母菌，其生長迅速，培養(yǎng)條件簡單，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，遺傳操作與釀酒酵母相似，技術(shù)已相當成熟，是工業(yè)生產(chǎn)中常用的高表達菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供心肌肌鈣蛋白I的一種新用途。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，心肌肌鈣蛋白I具有抑制腫瘤增生的作用。因此本發(fā)明的技術(shù)方案是心肌肌鈣蛋白I在制備抑制腫瘤的藥物中的應用。
需要的時候，在以心肌肌鈣蛋白I為活性成分的藥物中，還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
本發(fā)明的藥物中，心肌肌鈣蛋白I的有效劑量為1微克-1毫克/公斤體重/天，可以制成注射液、凍干粉針劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的另一個目的是提供在畢赤酵母和大腸桿菌表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I的編碼基因。
本發(fā)明提供的心肌肌鈣蛋白I編碼基因有兩種，第一種是在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列2的DNA序列由633個核苷酸組成，編碼序列表中序列1的蛋白質(zhì)。
含有上述基因的表達載體和細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍，如pPIC9K-AAF載體，(物理圖譜如圖1所示)和GS115畢赤酵母細胞系。
本發(fā)明提供的第二種心肌肌鈣蛋白I編碼基因是在大腸桿菌表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №3；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列3的DNA序列由633個核苷酸組成，編碼序列表中序列1的蛋白質(zhì)。
含有上述基因的表達載體和細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍，如pET-AAF載體，(物理圖譜如圖3所示)和BL21-DE3大腸桿菌細胞系。
本發(fā)明創(chuàng)造性地揭示了心肌肌鈣蛋白I的抗腫瘤活性。以心肌肌鈣蛋白I為活性成分的藥物不直接作用于腫瘤細胞，抑制腫瘤具有廣譜性而不產(chǎn)生抗藥性，具有深遠的實踐意義。


圖1為表達質(zhì)粒pPIC9KAAF的物理圖譜圖2為質(zhì)粒pPIC9K-AAF的酶切電泳圖譜圖3為甲醇誘導后的GS115畢赤酵母菌培養(yǎng)液電泳圖譜圖4為表達質(zhì)粒pET-AAF的物理圖譜圖5為表達質(zhì)粒pET-AAF的酶切電泳圖譜圖6為IPTG誘導后的BL21-DE3大腸桿菌培養(yǎng)液電泳圖譜具體實施方式
實施例1、心肌肌鈣蛋白I的畢赤酵母菌體外表達(1)心肌肌鈣蛋白I基因的合成人工合成序列表中序列2的全長序列，并在其5’端加上NdeI酶切位點、3’端加上NotI酶切位點，得到序列AAF1。
(2)心肌肌鈣蛋白I體外表達a、將人工合成的全序列裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-AAF1。
b、表達質(zhì)粒的構(gòu)建采用購自美國Invitrogen公司的高效表達質(zhì)粒pPIC9K，用NdeI和NotI分別酶切pGEM-AAF1質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標片段，用T4連接酶16℃過夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴增獲得表達質(zhì)粒pPIC9K-AAF，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，證明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。
c、將質(zhì)粒pPIC9K-AAF用SacI線性化，采用浙江新芝公司電基因?qū)雰x，將線性化的pPIC9K-AAF導入GS115畢赤酵母菌(購自Invitrogen公司)內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過程，獲得抗G418mg/ml的單克隆菌。
d、挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，30℃過夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝10-20，收集菌體，用無碳源培養(yǎng)基稀釋至OD600＝50，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，加入甲醇至終濃度為1％誘導表達，每隔24小時加甲醇一次，至96小時。離心取上清液，進行凝膠電泳分析和功能測定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。如圖3所示，結(jié)果表明在32kD的位置，有誘導的蛋白表達，并根據(jù)BSA對照，計算得到表達量為120mg/L。
(3)本發(fā)明心肌肌鈣蛋白I的功能測定取24只昆明小鼠，分為甲醇誘導前上清和甲醇誘導后上清兩組，分別頸部皮下接種S180腹水細胞瘤株，三天后分別皮下注射甲醇誘導前上清和甲醇誘導后上清0.5ml/只，每隔12小時注射一次，連續(xù)注射7天。觀察并切取瘤組織，稱重，結(jié)果甲醇誘導前上清和甲醇誘導后上清組瘤體重分別為0.82+0.22克和0.11+0.05克，抑瘤率為86.6％。
實施例2、心肌肌鈣蛋白I的大腸桿菌體外表達(1)人工基因的合成人工合成基因序列3全長1-210堿基，分別在5’端加上SnabI酶切位點和3’端加上NotI酶切位點，得到序列AFF2。
(2)心肌肌鈣蛋白I體外表達a、將人工合成的全序列裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建pGEM-AAF2克隆載體。
b、表達質(zhì)粒的構(gòu)建采用購自美國Novagen公司的高效表達質(zhì)粒pET21b，用SnabI和NotI分別酶切pGEM-AAF2質(zhì)粒和pET21b質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標片段，用T4連接酶16℃過夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴增獲得表達質(zhì)粒pET-AAF，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖4所示。酶切鑒定結(jié)果，如圖5所示，證明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。
c、將質(zhì)粒pET-AAF用轉(zhuǎn)化法導入BL21-DE3大腸桿菌內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過程，獲得單克隆菌。
d、挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，37℃過夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.8，加入IPTG至終濃度為1％37℃誘導表達4小時。離心取沉淀，用裂解液混懸，超聲破碎，10000g離心30分鐘，棄上清，沉淀洗滌兩次，最后用8M尿素溶解，經(jīng)50mM磷酸緩沖鹽液過夜透析。取10ul，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。如圖6所示，結(jié)果表明在29KD的位置，有誘導的蛋白表達，并根據(jù)BSA對照，計算得出表達量為85mg/L。
(3)本發(fā)明心肌肌鈣蛋白I的功能測定取24只昆明小鼠，分為磷酸鹽緩沖液和表達提純液組，分別頸部皮下接種S180腹水細胞瘤株，三天后分別皮下注射磷酸鹽緩沖液和表達提純液1.0mg蛋白/kg，每隔12小時注射一次，連續(xù)注射7天。觀察并切取瘤組織，稱重，結(jié)果磷酸鹽緩沖液和表達提純液組瘤體重分別為1.02+0.28克和0.15+0.06克，抑瘤率為85.3％。
實施例3、心肌肌鈣蛋白I的大腸桿菌體外表達提純液的體內(nèi)穩(wěn)定性實驗取24只昆明小鼠，分為磷酸鹽緩沖液和表達提純液組，分別皮下注射磷酸鹽緩沖液和表達提純液2.0mg蛋白/kg，注射8小時，眼底靜脈取血，分離血清，采用常規(guī)酶聯(lián)免疫法測定血清心肌肌鈣蛋白I濃度。結(jié)果磷酸鹽緩沖液和表達提純液組血清心肌肌鈣蛋白I濃度分別為0.52+0.08ng/ml、3.55+0.12ng/ml，表明心肌肌鈣蛋白I在體內(nèi)的穩(wěn)定性較高。
序列表<160>3<210>1<211>210<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala15 10 15Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala20 25 30Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg35 40 45Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu50 55 60Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala65 70 75Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe80 85 90Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp95 100 105Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys110 115 120Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu125 130 135Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser140 145 150Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu
155 160 165Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp170 175 180Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile185 190 195Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser200 205 210<210>2<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggctgacg gttcctccga cgctgctaga gagccaagac cagctccagc tccaatcaga 60agaagatcct ccaactacag agcttacgct accgagccac acgctaagaa gaagtccaag 120atctccgctt ccagaaagtt gcaattgaag accttgttgt tgcaaatcgc taagcaagag 180ttggagagag aggctgagga gagaagaggt gagaagggta gagctttgtc caccagatgt 240caaccattgg agttggctgg tttgggtttc gctgagttgc aagacttgtg tagacaattg 300cacgctagag tcgacaaggt cgacgaggag agatacgaca tcgaggctaa ggtcaccaag 360aacatcaccg agatcgctga cttgacccaa aagatcttcg acttgagagg taagttcaag 420agaccaacct tgagaagagt cagaatctcc gctgacgcta tgatgcaagc tttgttgggt 480gctagagcta aggagtcctt ggacttgaga gctcacttga agcaagtcaa gaaggaggac 540accgagaagg agaacagaga ggtcggtgac tggagaaaga acatcgacgc tttgtccggt 600atggagggta gaaagaagaa gttcgagtcc taa 633<210>3<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.心肌肌鈣蛋白I在制備抑制腫瘤的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于在所述抑制腫瘤的藥物中，心肌肌鈣蛋白I的有效劑量為1微克-1毫克/公斤體重/天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于在制備抑制腫瘤的藥物中還加入一種或多種藥學上可接受的載體。
4.在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，具有畢赤酵母偏愛密碼子編碼SEQ ID №1的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的表達載體和細胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體和細胞系，其特征在于所述表達載體為pPIC9K-AAF；所述細胞系為GS115畢赤酵母。
7.在大腸桿菌表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №3；2)與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，具有大腸桿菌偏愛密碼子編碼SEQ ID №1的DNA序列。
8.含有權(quán)利要求7所述基因的表達載體和細胞系。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達載體和細胞系，其特征在于所述表達載體為pET-AAF；所述細胞系為BL21-DE3大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了心肌肌鈣蛋白I在制備抑制腫瘤藥物中的用途。研究表明，心肌肌鈣蛋白I具有抑制腫瘤的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是心肌肌鈣蛋白I在制備抑制腫瘤的藥物中的應用。在抑制腫瘤的藥物中，心肌肌鈣蛋白I的有效劑量為1微克－1毫克/公斤體重/天。在制備抑制腫瘤的藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。本發(fā)明還公開了在大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達的心肌肌鈣蛋白I編碼基因。本發(fā)明的藥物不直接作用于腫瘤細胞，抑制腫瘤具有廣譜性而不產(chǎn)生抗藥性，具有深遠的實踐意義。
文檔編號C07K14/435GK1537633SQ0310986
公開日2004年10月20日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者劉鳳鳴 申請人:劉鳳鳴