專利名稱：一種變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變性蛋白質(zhì)(包涵體)的重折疊復(fù)性，具體地說是一種變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)的最后一年，人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)的工業(yè)化以迅猛的速度跨越式地進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代，即后基因組時(shí)代；基因組工程的各種新興學(xué)科，交叉學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生，生物技術(shù)的發(fā)展猶如長(zhǎng)江之水，一日千里，正在形成一個(gè)宏觀的稱之為“生命科學(xué)工業(yè)”，而不僅僅局限于生物技術(shù)或生物工程技術(shù)領(lǐng)域了；然而，生命的本質(zhì)在于蛋白質(zhì)，在了解到人類只有不到40,000個(gè)基因的同時(shí)，許多科學(xué)家正在為探索這一本質(zhì)做出不懈的努力和創(chuàng)造。盡管，全球已有近4000種重組蛋白質(zhì)已經(jīng)被制備，但是能用于直接表達(dá)和制備的蛋白質(zhì)不到25％，大部分基因工程菌(大腸桿菌或真菌)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)是作為變性的包涵體(Inclusion Body)形式分泌出細(xì)胞，以不溶解的凝聚物存在。這就使獲得大量重組人體功能蛋白質(zhì)成為生命科學(xué)工業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，開發(fā)毫克級(jí)乃至克級(jí)的高通量蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)成為當(dāng)前生命科學(xué)工業(yè)界的一大熱點(diǎn)。
大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)已成為生物實(shí)驗(yàn)室或生物技術(shù)公司日常的工作，其原因是大腸桿菌便宜易得，蛋白質(zhì)合成高效，工藝成本比脯乳動(dòng)物、昆蟲和真菌系統(tǒng)相對(duì)便宜而高效；對(duì)一些有細(xì)胞毒的蛋白質(zhì)，可以通過該系統(tǒng)快速得到大量重組蛋白質(zhì)，過量表達(dá)對(duì)于大腸桿菌并不造成傷害；重組后不溶蛋白質(zhì)穩(wěn)定，易于保存；可以避免其他系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的降解，不穩(wěn)定等問題。利用經(jīng)典的細(xì)胞破壁(溶菌酶或機(jī)械法，lysozymeor French Press)、離心(10,000xg低速離心)，再經(jīng)凍融和用不同的緩沖洗液洗滌法可高效地得到變性的包涵體(Krueger，J.K.等Biopharm，1989，340-45)。這樣可以較容易地獲得高于90％純度的不溶蛋白質(zhì)包涵體；由于眾多的基因分子文庫(kù)已經(jīng)商業(yè)化，這樣可以用這一常規(guī)法快速建立重組人體蛋白質(zhì)包涵體分子文庫(kù)備用。其關(guān)鍵是變性蛋白質(zhì)(包涵體)的重折疊復(fù)性技術(shù)，尤其是做到高通量的重折疊是工業(yè)界急需解決的難題之一。
蛋白質(zhì)折疊是個(gè)復(fù)雜的過程，體內(nèi)維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境有很大關(guān)系，可以是分子伴侶、或其他輔助物質(zhì)的調(diào)節(jié)；然而，體外重折疊方法，除了使用常規(guī)熱力學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制之外(如控制濃度、壓力，pH值等)，常見的重折疊復(fù)性方法包括稀釋法和滲透法。但是，在許多情況下，由于折疊復(fù)性的中間產(chǎn)物較易形成凝聚體(Aggregates)，常常很難拿到活性蛋白質(zhì)；新近通過轉(zhuǎn)向于體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的模擬，產(chǎn)生了一些新的方法，例如使用分子伴侶蛋白質(zhì)GroEL在體內(nèi)具有結(jié)合蛋白質(zhì)的作用，相當(dāng)于變性蛋白質(zhì)的親和配基；固定化GroEL柱(固定床)相當(dāng)于變性蛋白質(zhì)的親和吸附層析柱，從而可提高樣品的處理量，并使蛋白質(zhì)在復(fù)性的同時(shí)得到濃縮和純化，其特點(diǎn)在于1)不僅可以解決分子伴侶的重復(fù)利用問題，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侶的利用效率；2)由于采用連續(xù)操作，原料處理量大，產(chǎn)品可以得到濃縮、純化；3)易于建立相關(guān)的模型，對(duì)于放大生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)作用；Teshima等利用固定化分子伴侶，在體外輔助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折疊復(fù)性(Teshima T等.Appl Microbiol Biotech，1997，4841-46)，其他備受關(guān)注的適用于蛋白質(zhì)重折疊的分子伴侶還包括蛋白質(zhì)二硫健異構(gòu)酶(多肽脯氨酸順式-反式異構(gòu)酶，Peptidyl Proly Cis-Trans Isomerase，簡(jiǎn)稱PPI)，GroEL，GroES，DnaJ，DnaK；還有報(bào)道利用“小分子伴侶”對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性(Zahn R等.Proc Nail Acad Sci USA，1996，9315024-15029)，“小分子伴侶”是指GroEL的一個(gè)片段，而這個(gè)片段并不是GroEL的水解產(chǎn)物，而是由基因重組后包括GroEL191-345氨基酸殘基片段(16.7kD)或191-376氨基酸殘基片段(21kD)密碼的基因片段在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物，它們能有效地促進(jìn)親環(huán)蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢桿菌RNA酶的復(fù)性；由于“小分子伴侶”分子較小，更適合于固定化，且不需另加復(fù)性輔助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的應(yīng)用前景；但是，由于這些分子伴侶均需特別制備技術(shù)，對(duì)于大規(guī)模多種蛋白質(zhì)制備，仍屬昂貴試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、可調(diào)控的適于規(guī)?；瘧?yīng)用的變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為以價(jià)廉的人工分子伴侶體系“三合一”法、以不溶性變性蛋白質(zhì)(包涵體)(或商業(yè)用酶)為原料，采用人工分子伴侶-去污劑-阻凝劑三聯(lián)復(fù)性系統(tǒng)分離提純重組蛋白質(zhì)，具體操作過程如下1)在4～36℃溫度下，將多次洗滌純化后包涵體(純度＞90％)(較好的方法參見Babbit，P.C.等Biotechnology 1990，8945-949；Wong，H.H.等Bioseparation 1996，6185-192)用6-8M尿素或3-7M胍緩沖液使包涵體變成一級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展態(tài)，其中含有蛋白質(zhì)重量0.1～0.5％(w/v)去污劑和0.4～0.6M阻凝劑，0.5～5小時(shí)后，形成伸展態(tài)蛋白質(zhì)-去污劑復(fù)合物在變性蛋白質(zhì)溶液中加入去污劑和阻凝劑，通過與蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，抑制肽鏈間的相互聚集；加入去污劑(紫外分析檢測(cè)A280)至無游離伸展態(tài)蛋白質(zhì)；2)加入1～2M尿素或胍緩沖液稀釋10～50倍，使蛋白質(zhì)濃度為0.1～10毫克/毫升，時(shí)間0.5～2小時(shí)(用復(fù)性液稀釋至理想復(fù)性濃度)；根據(jù)具體蛋白質(zhì)而定，80％的包涵體為還原態(tài)，對(duì)于已知含有非還原態(tài)巰基的包涵體，可加入過量的谷胱甘肽在緩沖溶液中作為弱還原劑，以維持所有去折疊的包涵體處于還原肽；除在純化包涵體時(shí)，充分除去膜蛋白和細(xì)胞壁一樣重要，維持還原態(tài)是獲得高產(chǎn)率的復(fù)性重組蛋白質(zhì)的關(guān)鍵；3)加入含有濃度為20～100mM(毫摩爾濃度)分子伴侶和氧化還原系統(tǒng)的1～2M尿素或胍緩沖液，逐步釋放出伸展態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，時(shí)間3～5小時(shí)內(nèi)復(fù)性，個(gè)別需～1周；脈沖法控制(可于90～120分鐘內(nèi)間歇式或梯度式)加入含有分子伴侶的緩沖液速度，逐步釋放出伸展態(tài)的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，保持同時(shí)抑制錯(cuò)誤折疊和包涵體再生，使游離出的蛋白質(zhì)伸展態(tài)濃度達(dá)到理想的，利于分子內(nèi)反應(yīng)的濃度；控制一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)從去污劑-復(fù)合物上剝離下來的速度，變?yōu)椴糠终郫B即不含去污劑分子的非活性狀態(tài)PFP，進(jìn)一步完成正確折疊蛋白質(zhì)的復(fù)性，從而折疊為天然活性蛋白質(zhì)NP。
4)使用各種平行分離柱純化重折疊復(fù)性的重組蛋白質(zhì)，濃縮或冷凍干燥(以蛋白質(zhì)溶液或固體方式，分別在4℃，-20℃，或-80℃儲(chǔ)存)；所述分子伴侶為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或甲基-β-環(huán)糊精。
包涵體去折疊脲緩沖液組成為6-8M脲、1-5mM EDTA(乙二氨四乙酸二鈉)、0.1M 2-Me、20mM NaOAc；胍緩沖液組成為3-7M胍、150mM的磷酸鈉、25mM DTT(二硫蘇糖醇)、10mM MgCl2和10mM KCl、pH5-7.6。緩沖液中可同時(shí)加入0.1-0.5％的去污劑和阻凝劑0.4-0.6M精氨酸，0.05％聚乙二醇(3550-5000分子量)所述去污劑為十二烷基磺酸鈉，十六烷基三甲氨溴化氫季氨鹽(CTAB)，甜菜堿或直鏈環(huán)糊精；所述阻凝劑為L(zhǎng)-精氨酸、聚乙二醇(3500～6000)、甘油、葡萄糖、甘氨酸、乳酸鈣、氯化鋅、脯氨酸或硫代甜菜堿(NDSBs)；所述氧化還原系統(tǒng)是指脲緩沖液中含有10～100mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、還原劑縮硫乙二醇、巰基乙醇、1～30mM半胱氨酸、1～30mM谷光甘肽或二硫蘇糖醇、10∶1～1∶1谷胱甘肽/半谷胱甘肽、10∶1～1∶1胱氨/半光氨或10∶1～1∶1胱氨酸/半胱氨酸；(具體條件根據(jù)各個(gè)蛋白質(zhì)性質(zhì)折疊/凝聚比而定)其用量為蛋白質(zhì)當(dāng)量濃度的5～100倍過量；所述平行分離純化柱為固定相為Saphodex 30到Sophadex 300凝膠過濾柱或反相層析柱；流速＝5～8.4毫升/小時(shí)；所述平行分離純化柱所得產(chǎn)物可以通過快速蛋白質(zhì)液相層析方法進(jìn)一步純化；所述在加完分子伴侶后，采用在4℃恒溫復(fù)性法或采用跳躍式升溫法以提高重折疊復(fù)性收率，即先在4℃復(fù)性至最大活性，然后升溫至20～36度，可縮短復(fù)性時(shí)間數(shù)倍，降低長(zhǎng)期復(fù)性過程中蛋白質(zhì)活性失去或凝聚付產(chǎn)物的形成，提高復(fù)性蛋白質(zhì)的純度；所得提純液可以再次使用超濾濃縮到相應(yīng)濃度，或加入穩(wěn)定劑制成濃縮液在-20℃儲(chǔ)存(活性可保持?jǐn)?shù)月)，或冷凍干燥成含有低于1～2％水份的干粉，在-80℃長(zhǎng)期保存(一年以上)。
所述包涵體原料可通過下述方法取得1)在大腸桿菌中引入人體外源基因表達(dá)/合成重組蛋白質(zhì)的包涵體，快速分別沉淀出對(duì)應(yīng)基因的包涵體，建立相應(yīng)的顆粒包涵體粗品文庫(kù)(方法Krueger，J.K.等.Biopharm 1989，340-45)；2)提純包涵體到較高的純度(Marston，F(xiàn).A.O等Methods of Enzymology，1990，182，264-276)，然后，使用6～8M尿素緩沖液使包涵體變成一級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展態(tài)。
其中“三合一”法或稱“雞尾酒”法(去污劑+環(huán)糊精+阻凝劑或促折疊劑)為主要模型，(以前報(bào)道的“二合一”方法參見輔助碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復(fù)性，Rozema D et al.Biochemistry，1996，3515760-15771)，以及我們?cè)缙诎l(fā)表的“溫度跳躍技術(shù)”(4℃然后30-36℃，Xie，Y.等，D.B.Protein Science 1996，5(3)517-523)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明運(yùn)用組合學(xué)原理進(jìn)行蛋白質(zhì)平行復(fù)性，復(fù)性蛋白質(zhì)濃度高，所用反應(yīng)容器體積小，對(duì)于各種表達(dá)系統(tǒng)所形成的包涵體進(jìn)行平行重折疊復(fù)性均有效；通過調(diào)節(jié)人工分子伴侶環(huán)糊精、去污劑、和阻凝劑的比例、加料方式(順序)、和加料速度，達(dá)到熱動(dòng)力學(xué)協(xié)同調(diào)控的平行蛋白質(zhì)純化的技術(shù)，可快速獲得多種重組蛋白質(zhì)；比快速稀釋法和透析法效率提高數(shù)十倍。以廉價(jià)的α或甲基-β-環(huán)糊精為模型分子伴侶，建立一個(gè)可適于高效蛋白質(zhì)復(fù)性的“雞尾酒”法可調(diào)控的重折疊平臺(tái)技術(shù)(CART)；是對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中所需功能蛋白質(zhì)提供大量制備的工業(yè)化平臺(tái)方法。
2.本發(fā)明通過以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為模型，建立一通用的其他任何表達(dá)系統(tǒng)的高通量變性蛋白質(zhì)(包涵體)重折疊復(fù)性的技術(shù)。與GroE等蛋白質(zhì)分子伴侶相比，去污劑-環(huán)糊精-阻凝劑的聯(lián)合使用，即所謂“雞尾酒法”協(xié)同調(diào)節(jié)重折疊技術(shù)(CART)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)(1)人工分子伴侶不屬于蛋白質(zhì)，不易受環(huán)境影響而失活，操作條件較為溫和；(2)去污劑和環(huán)糊精均可直接購(gòu)買，省去大分子分子伴侶分離純化的步驟；(3)去污劑與環(huán)糊精的分子量較小，容易與蛋白質(zhì)分離，有利于提高工業(yè)化生產(chǎn)效率，重折疊和超濾濃縮可以“一鍋煮”；可使分離提純包涵體效率提高數(shù)倍乃至數(shù)十倍；該方法對(duì)蛋白酶(Protease)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloprotease)、和激酶(Kinase)等制備均有較好的效果，方法簡(jiǎn)便，適用于蛋白質(zhì)組工程研究。
3.本發(fā)明重折疊反應(yīng)可在同個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，避免了中間物料轉(zhuǎn)移的麻煩，同時(shí)蛋白質(zhì)的重折疊過程的優(yōu)化可通過如下步驟判斷而不要測(cè)定活性1)過程沒有大量的沉淀形成；2)蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)復(fù)性裝置中分子量截留膜，超濾濃縮到20～70毫克/毫升(A280納米分光光度法測(cè)定)，小分子化合物和復(fù)性劑可通過此法除去；3)柱層析產(chǎn)生一個(gè)折疊單峰；4)非還原性SDS-凝膠電泳判斷正確的分子量；
5)蛋白質(zhì)可以通過結(jié)晶或使用蛋白質(zhì)庫(kù)中蛋白質(zhì)圖譜比較確定。
高通量制備毫克級(jí)以上的有活性重組蛋白質(zhì)，方法簡(jiǎn)便，條件優(yōu)化容易，產(chǎn)業(yè)化前景好；具體優(yōu)化條件取決于1)復(fù)性系統(tǒng)的方法脈沖加液或多步法；一步加液或梯度加液法，穩(wěn)態(tài)加液法，和跳躍升溫法；2)所純化的蛋白質(zhì)的內(nèi)在理化性質(zhì)；3)重折疊復(fù)性的緩沖液中的組份搭配和進(jìn)一步凝膠柱分離純化，重折疊后的蛋白質(zhì)通過凝膠過濾柱層析法或高效液相法提純。


圖1為本發(fā)明所述變性蛋白質(zhì)“雞尾酒”調(diào)控重折疊復(fù)性技術(shù)(CocktailAligned Refolding Technology-CART)的原理圖。其中非折疊蛋白質(zhì)UP(Unfolded Protein)；中間過渡態(tài)UP-D(Unfolded Protein-DetergentComplex)；部分折疊物PFP(Partial Folded Protein)；凝聚物Ag(Aggregates)天然蛋白質(zhì)NP(Native Protein)。
圖2為本發(fā)明的操作流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1HIV-1蛋白酶D30W的重折疊復(fù)性即HIV-胰蛋白酶包涵體(50毫克，美國(guó)BiotaiX，Inc.)溶解到8M脲中(100mM Tris，pH3.5)，然后脲的濃度稀釋到2M(pH3.5，1mM DTT和3％的PEG，0.2％ C-12 SDS，0.5M精氨酸鹽酸鹽)，蛋白質(zhì)最終濃度為0.5毫克/毫升，攪拌1小時(shí)，然后加入α-環(huán)糊精緩沖液(Aldrich，6當(dāng)量，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG)，攪拌5小時(shí)，在自行設(shè)計(jì)的分子濃縮器中超濾(分子量截留超濾膜＝10,000)。濃縮到5毫升后，調(diào)節(jié)PH至4.4(加入大約0.5毫升含有1M氯化鈉的100mM的醋酸鈉緩沖液)；20分鐘后，蛋白質(zhì)溶液在室溫下離心20分鐘(10,000g)，剔除少量不溶物，上清液(PH3.5，4小時(shí))經(jīng)凝膠柱層析后，再經(jīng)自制的生物反應(yīng)器再次濃縮，得相應(yīng)蛋白質(zhì)溶液(收率35％)，純度＞90％(SDS-PAGE和HPLC分析)，在4℃儲(chǔ)存待用。
為獲得最大效果和復(fù)性收率，可利用自制的平行反應(yīng)器(國(guó)家專利申請(qǐng)?zhí)?3210921.0)。
實(shí)施例2HIV-1蛋白酶V82N重折疊復(fù)性即HIV-蛋白酶(50毫克，美國(guó)BiotaiX.)溶到8M脲中，然后脲的濃度稀釋到2M(pH3.5，1mM DTT和3％的聚乙二醇)，蛋白質(zhì)最終濃度0.5毫克/毫升，攪拌1小時(shí)，加入去污劑和阻凝劑緩沖液(0.2％SDS，0.5M精氨酸鹽酸鹽，100mM醋酸鈉，pH4.5，1mM DTT和1％的PEG)，攪拌1小時(shí)，然后加入α-環(huán)糊精(Aldrich，5當(dāng)量，1-2mM還原型谷胱甘肽(GSH)，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，攪拌5小時(shí)，吸出反應(yīng)液，離心20分鐘(10,000g)，上清液(約100毫升)在自行設(shè)計(jì)的分子濃縮器中超濾(分子量截留超濾膜＝10,000)濃縮到5毫升后，調(diào)節(jié)PH至4.4(加入大約0.5毫升含有1M氯化鈉的100mM的醋酸鈉緩沖液)；20分鐘后，蛋白質(zhì)溶液在室溫下再次離心20分鐘(10,000g)，剔除少量不溶物，上清液經(jīng)凝膠柱層析，再次在自制的分子濃縮器中濃縮，得相應(yīng)蛋白質(zhì)溶液，濃縮后測(cè)定約含38毫克活性蛋白質(zhì)(純度＞90％)，在4℃儲(chǔ)存待用。
實(shí)施例3HIV-1變異蛋白質(zhì)D30F的制備(包涵體的制備方法Ido，E.等J.Biol.Chem.1991，266，24359-24366.)溶到8M脲中(100mM醋酸鈉，PH4.5)，攪拌2小時(shí)，然后用2M脲緩沖液(PH3.5，1mM DTT和3％的PEG，0.2％SDS，0.5M精氨酸鹽酸鹽)，稀釋到最終蛋白質(zhì)濃度0.5毫克/毫升，攪拌1小時(shí)，其后加入α-環(huán)糊精緩沖液(Aldrich，5當(dāng)量，含有1-2mM還原型谷胱甘肽(GSH)，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG))攪拌5小時(shí)，吸出反應(yīng)液，離心20分鐘(10,000g)，上清液中加入400毫升10mM的醋酸鈉和1mM DDT，PH5.0，時(shí)間維持5小時(shí)。在10,000g離心，除去不溶物質(zhì)。該胰蛋白質(zhì)溶液用分子量截留膜濃縮到5毫升。蛋白質(zhì)的濃縮液在A280納米(E0.1％＝1.0)測(cè)定濃度。使用阿普強(qiáng)制藥公司的HIV-1抑制劑滴定測(cè)定所的蛋白質(zhì)活性超過90％。
實(shí)施例4重組Caditropsinogen的包涵體復(fù)性Caditropsinogen包涵體根據(jù)已知方法(Lin，X.等.J.Biol.Chem.1992，267，17257-17263)制備。50毫克包涵體溶于2毫升含有8M脲緩沖液(50mM Tris，1mM 0.8和1mM EDTA，100mM 2-Me，pH8.0，5.7mM CATB，0.5M精氨酸)，攪拌30分鐘，離心(175,000Xg)30分鐘，除去不溶物，然后用去污劑緩沖液(含有最終濃度2M脲)稀釋到蛋白質(zhì)濃度1.0mg/ml，攪拌1小時(shí)，向最終溶液中加入甲基-β-環(huán)糊精緩沖液(含有6當(dāng)量的甲基-β-環(huán)糊精，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM Tris-HCl)，脈沖法間歇式三次加料(約1小時(shí))，然后在4℃攪拌48小時(shí)，用10,000Da分子量截留膜，超濾濃縮至10毫升，離心(175,000xg)15分鐘除去少量不容物，上清液用Sephacryl S-300柱層析(3×90cm柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0的緩沖液平衡并洗脫，流速25毫升/小時(shí))，活性部分用FPLC(陰離子交換柱momoQ，用pH為7.0的20mM Tris-HCl緩沖液平衡)，再用0～1MNaCl線性梯度洗脫，活性組份溶液經(jīng)脫鹽后，冷凍干燥得7.5克蛋白質(zhì)，15％的收率，SDS-PAGE分析，顯示單峰。純度大于90％。
實(shí)施例5
重組胃蛋白酶原(Pepsinogen)的重折疊復(fù)性純化的包涵體顆粒(制備方法參見Lin，X.等J.Biol Chem 1989，4482-4489)(50毫克)經(jīng)離心(16,000xg，30min)溶于6M脲中(含有100mM 2-巰基乙醇，體積60毫升)，4℃攪拌6小時(shí)。殘留不溶物質(zhì)經(jīng)離心(286,000xg，2小時(shí))除去，用脲緩沖液稀釋到200毫升(100mM Tris-HCl，0.3％硫代甜菜堿(NSBAs)，2mM EDTA，0.4M精氨酸鹽酸鹽，5mM GSH，0.5mM GSSG，0.1mM PMSF，pH8.0)，攪拌2小時(shí)，加入α-環(huán)糊精(100mMα-CD，6當(dāng)量，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM Tris，pH8.0)攪拌5小時(shí)，本溶液經(jīng)分子量截留膜30,000超濾濃縮到10毫升，離心(286,000xg)1小時(shí)，上清液用Sephacryl S-300凝膠柱層析，3×90-cm柱用20mM Tris-HCl，pH7.5，流速30/小時(shí)。如果使用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)純化(Pharmacia)陰離子交換MonoQ HR 5/5柱。緩沖液是20mMTris-HCl，pH8.0溶液梯度0-1M NaCl。30分鐘，1毫升/分鐘。脫鹽后、干燥、得相應(yīng)復(fù)性蛋白質(zhì)(15mg，復(fù)性收率30％，純度＞95％)。
實(shí)施例6重組蛋白質(zhì)鏈激酶(StreptoKinase，SK)的純化和表達(dá)，該重組蛋白質(zhì)從pET11基因載體在大腸桿菌菌落中BL21(DE3)表達(dá)(方法參見Studier，F(xiàn).W.等Methods Enzymol.1990，185，60-89.)。SK(SK殘基1-147)。所表達(dá)的包涵體經(jīng)提純后，按實(shí)例1所述條件重折疊。50毫克包涵體，復(fù)性后，進(jìn)一步在Sephacryl S-300柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)上純化，洗脫緩沖液為20mM Hepes和0.4M脲，pH7.5，其后經(jīng)陰離子交換樹脂柱(20mM Hepes和0.4M脲，pH7.5，0～0.1M NaCl為洗脫劑。收率15％，純度＞90％。
實(shí)施例7重組人體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(Human Neurotrophin-3，NT-3)的復(fù)性。重組人體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3按報(bào)道方表達(dá)(Suenaga，M.等Biotechnology Appl.Biochem1998，28，119-124)，10克冷凍細(xì)胞(濕基)分散在40毫升緩沖液中(10mMEDTA，pH7.0)超聲細(xì)胞破壁，懸浮離心(17,000g)一小時(shí)，上清液棄去，包涵體顆粒重新分散在上述緩沖液中，離心。重復(fù)改過程兩次，確保除去所有細(xì)胞垃圾，和膜蛋白酶。然后包涵體顆粒用30毫升4M脲緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0，5mM DTT)均漿，并再次離心(17,000g)60分鐘。最終純化的包涵體顆粒在8M脲緩沖液(60毫升，pH3.0，20mM檸檬酸鈉，0.1％SDS)中去折疊后，攪拌2小時(shí)，加入復(fù)性液稀釋10倍(三次脈沖加料，50mM β-環(huán)糊精，0.1M磷酸鈉，0.2精氨酸，1.0mM GSH和0.2mMGSSG，pH8.5)，在4℃攪拌一周后，采用跳躍快速升溫至12-20度法，攪拌3小時(shí)，活性達(dá)到最大(＞90％，原法需一個(gè)月)，復(fù)性液濃縮到10毫升，用SP-Sepharose(Pharmacia Biotech，Sweden，10×150cm，含有0.1％CHAPS，pH6.0的0.1M磷酸鈉緩沖液，使柱平衡)柱層析，洗脫液為含有0.4M NaCl的(pH6.0)的同樣緩沖液，所得流份經(jīng)RP/HPLC(ODS-120T，TosohCorporation，Japan)柱，用含有0.1％的TFA的20-36％乙腈洗脫，所得流份經(jīng)冷凍干燥得10毫克NT-3。純度＞95％。
實(shí)施例8碳酸酐酶II(碳酸酐酶CAB II，Sigma，Inc.，20毫克)溶于5毫升6M鹽算胍緩沖液(含50mM Tris，1mM DTT，pH8.5)，4℃用2M脲緩沖液(pH7.5，1mM DTT和1％的PEG，1.1mM CTAB，0.5M精氨酸鹽酸鹽，1.43mMEDTA，5.7mM CTAB，5.7mM GSH，0.57mM GSSG，pH7.5，50mM Tris)稀釋10倍，攪拌2小時(shí)，然后加入甲基-β-環(huán)糊精(6當(dāng)量甲基-β-CD，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，50mMTris，兩次間歇式加入)，攪拌3小時(shí)，超濾濃縮(分子量截留膜20K Da)，光散射法檢測(cè)，復(fù)性收率97％，比我們前期使用鹽酸胍緩沖液重復(fù)性方法收率穩(wěn)定(Xie，Y.等.Protein Science 1996，5(3)517-523)。
實(shí)施例9截?cái)嗟幕|(zhì)金屬蛋白酶催化部位(protMMP3，多肽1-255，MW＝28,779)的制備根據(jù)已知方法表達(dá)脫輔基MMP3包涵體(Marcy，A.I.等Biochemistry 1991，30，6476-6483.)，50毫克protMMP3包涵體溶于8M脲中(50mM HEPES，0.1M NaCl)，攪拌1小時(shí)，用2M脲緩沖液(50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl，10mM CaCl2，0.2 SDS，0.5M精氨酸，30mM EDTA，4mM 1，10-鄰二氮雜菲)稀釋到0.4毫克/毫升蛋白質(zhì)濃度，加入等體積的50mM HEPES，pH7.5，and 0.1M NaCl.)，在4℃攪拌1小時(shí)，加入甲基-β-環(huán)糊精(5當(dāng)量，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM HEPES，pH7.5，分三批加入)，用緩沖液(50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl，2mM 1，10-鄰二氮雜菲，and 3mM EDTA)稀釋5倍后攪拌過夜，然后超濾，用緩沖液(5毫升，50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl)稀釋后吸出離心(12,000g)，取出上清液，棄去不溶物，冷凍干燥的10毫克去輔基截?cái)嗷|(zhì)金屬蛋白酶催化部位(10毫克)。所得酶無活性，加入鋅離子后活性恢復(fù)。該法可避免自身蛋白水解現(xiàn)象(相關(guān)活性分析與Wetmore，D.R.Biochemistry 1996，35，6549-6558等所用方法同)。
實(shí)施例10重組精氨酸激酶的純化方法精氨酸激酶(AK)包涵體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得(Strong & Ellington，Comp Biochem Physiol 1996，113B，809-816)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)溶菌酶破壁，凍融后，在Beckman JA12離心機(jī)上(10,000g)離心，包涵體用80mL緩沖液IV(50mM Tris pH8.0；2％曲頓X-100(TritonX-100)；10mM EDTA；1M脲)洗滌以除去脂質(zhì)體，核酸，和其他一些污染的蛋白質(zhì)。同法、洗滌三次后離心AK分散到緩沖液(50毫升，10mM Tris·HClpH8.0；1mM EDTA；1mM DTT；10mM NaCl，and 0.02％w/v NaN3)，室溫下，在8M脲中變性去折疊1小時(shí)，然后離心(8,000xg)1小時(shí)BeckmanJA20離心機(jī)，通過0.22μm膜過濾，再經(jīng)凝膠柱層析(2.5×120厘米Sephacryl S-300柱)，洗脫液6M脲(50毫升，10mM Tris·HCl pH8.0；1mMEDTA；1mM DTT；10mM NaCl，and 0.02％w/v NaN3)，超濾濃縮后，取相當(dāng)于50毫克AK包涵體濃縮液，用變性液8M脲(50mM Tris·HCl，10mMEDTA，2mM DTT)稀釋到0.5毫克/毫升，4℃條件下，經(jīng)蠕動(dòng)泵緩慢加入2M脲復(fù)性液(100毫升，含50mM Tris·HCl，pH8.0；1mM EDTA，100mM2-巰基乙醇，0.1％SDS，0.5M精氨酸鹽酸鹽，1mM DTT和1％的PEG)中，攪拌2小時(shí)形成AK-去污劑復(fù)合物，然后加入α-環(huán)糊精(1～2mM還原型谷胱甘肽(GSH)，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，50mM Tris-HCl，pH8.0，三次間歇式加入6當(dāng)量，3當(dāng)量/次)脫除去污劑，攪拌復(fù)性5小時(shí)，離心20分鐘(10,000g)，經(jīng)陰離子交換柱層析(2.5×120cm Sephacryl S-100柱，自然裝柱，UV檢測(cè)，10 to 60mM KCl梯度洗脫(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT，and 0.02％NaN3)的純化的產(chǎn)物，最后在分子濃縮器(10kDa)中真空超濾，濃縮到～1mL，既得純化的精氨酸激酶(10毫克)。SDS-PAGE顯示純度＞90％。
實(shí)施例11牛胰RNase的復(fù)性牛胰RNase A為商業(yè)酶(Sigma)50毫克RNase在6M鹽酸胍的緩沖液中(2毫升，0.1M Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，0.14DTT，0.4M精氨酸，0.2％CTAB)室溫下攪拌18個(gè)小時(shí)去折疊失活(Lyles，M.M.等Biochemistry 1991，30，613-619)。該溶液通過Sephadex G-25短柱(用0.1M Tris-HCl，pH8.7，含有1M鹽酸胍，和1mM EDTA，以除去DTT并降低鹽酸胍的濃度至1M(蛋白濃度在278nm測(cè)定，失活系數(shù)為9300M-1。調(diào)節(jié)還原的酶，用1M鹽酸胍(含有0.1M Tis-HCl，pH8.7，0.5M精氨酸，0.2％CTAB，1mM EDTA)調(diào)節(jié)變性酶濃度至1mg/mL，攪拌2小時(shí)。加入甲基-β-環(huán)糊精(6當(dāng)量，1～2mM還原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，0.1M Tris-HCl，三次脈沖式加入)，在30℃攪拌5小時(shí)(酶活性由如下方法測(cè)定cCMP溶于0.05mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)含有5mM EDTA，cCMP濃度(0.12毫克/毫升)。取cCMP溶液(2.4毫升)溶于復(fù)性的上清液(100μL)中，在30℃波長(zhǎng)287納米測(cè)試cCMP溶液的吸收，與100％RNase A活性比較)，復(fù)性收率＞90％。
實(shí)施例12人體淋巴趨藥性細(xì)胞素(Human Lymphotactin，hltn)是趨藥細(xì)胞素C類中唯一一組專屬性吸引T-淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞蛋白質(zhì)該蛋白質(zhì)由93個(gè)殘基組成，無2或4-位保留的半胱氨酸。hltn的包涵體可由已知方法制得(Kuloglu，E.S等Biochemistry 2001，40，12486-12496)，即1升發(fā)酵液所獲得的細(xì)胞糊分散于50mMTris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，50mM PMSF，2mMEDTA)，經(jīng)過多次凍融后，加入CaCl2活化融合蛋白質(zhì)中的Snase(Aldrich-Sigma)至最終濃度為10mM。攪拌20分鐘，離心(20000xg)15分鐘，剔除上清液，下層顆粒用50mL的破壁緩沖液(0.5％Triton-100)洗滌兩次。離心后得相應(yīng)包涵體，取50毫克溶于7M鹽酸胍緩沖液(40mMTris-HCl，pH7.4，20mM EDTA，50mM DTT，0.2％CTAB，0.5M精氨酸)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，離心(20000g)20分鐘，上清液取出，用復(fù)性液1M鹽酸胍(含100mM Tris-Ac，pH8.0，0.2％CTAB，0.5M精氨酸，25μM 2-MTT)稀釋到0.5毫克/毫升，4℃攪拌3小時(shí)，加入α-環(huán)糊精(5當(dāng)量，三次脈沖式加入，1～2mM還原型谷胱甘肽(GSH)，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，100mM Tris-HCl，pH8.0)，攪拌16小時(shí)，然后超濾濃縮(3000Da分子量截留膜)到10毫升，然后用取離子水(50毫升)洗滌三次，然后濃縮到約1毫升，用分解融合蛋白質(zhì)緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl，10mM CaCl2)稀釋10倍(每毫升約含5毫克融和蛋白質(zhì))。該融合蛋白質(zhì)溶液用Xa因子(2單位/10毫克融和蛋白質(zhì)，Xa因子購(gòu)自Promega)處理1～2天，該hltn產(chǎn)物，經(jīng)反相HPLC(C18柱，Vydac，Hesperia，CA，USA)分離制得。冷凍干燥，得5毫克蛋白質(zhì)，純度大于95％(SDS-PAGE顯示其分子量為10.3kDa，與報(bào)道的方法同)。
該方法不限于本專利所列的蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和激酶，也不限于大腸桿菌工程菌。對(duì)其他表達(dá)系統(tǒng)所獲得的包涵體同樣適用。
權(quán)利要求
1.一種變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于以不溶性變性蛋白質(zhì)的包涵體為原料，采用人工分子伴侶-去污劑-阻凝劑三聯(lián)復(fù)性系統(tǒng)分離提純重組蛋白質(zhì)，具體操作過程如下1)在4～36℃溫度下，將洗滌純化的包涵體，使用6～8M尿素或3～7M胍緩沖液，使包涵體變成一級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展態(tài)，其中緩沖液含有0.1～0.5％的去污劑和0.4～0.6M阻凝劑，0.5～5小時(shí)后，形成伸展態(tài)蛋白質(zhì)-去污劑復(fù)合物；2)加入1～2M尿素或胍緩沖液稀釋10～50倍，使蛋白質(zhì)濃度為0.1～10毫克/毫升，時(shí)間0.5～2小時(shí)；3)加入含有濃度為20～100mM人工分子伴侶4～6當(dāng)量和氧化還原系統(tǒng)的1～2M脲或胍緩沖液，逐步釋放出伸展態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，時(shí)間為3小時(shí)～1周；所述分子伴侶為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或甲基-β-環(huán)糊精4)使用平行分離柱純化重折疊復(fù)性的重組蛋白質(zhì)，濃縮或冷凍干燥；
2.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于包涵體去折疊緩沖液組成為6～8M脲中含1～5mM EDTA；pH4～8，0.1M 2-Me；3～7M鹽酸胍中含150mM的磷酸鈉，PH 7.6；25mM DTT，10mM MgCl2和10mM KCl。
3.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述去污劑為十二烷基磺酸鈉、甜菜堿、聚乙醚或直鏈環(huán)糊精。
4.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述阻凝劑為L(zhǎng)-精氨酸、聚乙二醇、甘油、葡萄糖、甘氨酸、乳酸鈣、氯化鋅、脯氨酸或硫代甜菜堿。
5.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述氧化還原系統(tǒng)是指脲緩沖液中含有10～100mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、還原劑縮硫乙二醇、巰基乙醇、1～30mM半胱氨酸、1～30mM谷光甘肽、二硫蘇糖醇、10∶1～1∶1谷胱甘肽/半谷胱甘肽、10∶1～1∶1胱氨/半胱氨或10∶1～1∶1胱氨酸/半胱氨酸；其用量為蛋白質(zhì)當(dāng)量濃度的5～100倍過量。
6.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述平行分離純化柱為固定相為Saphodex 30到Sophadex 300凝膠過濾柱或反相層析柱；流速＝5～8.4毫升/小時(shí)。
7.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述平行分離純化柱所得產(chǎn)物可以采用快速蛋白質(zhì)液相層析方法進(jìn)一步純化。
8.按照權(quán)利要求1所述變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法，其特征在于所述在加完分子伴侶后，采用在4℃復(fù)性恒溫復(fù)性法或采用跳躍式升溫法提高重折疊復(fù)性收率，既先在4℃復(fù)性至最大活性，然后升溫至20～36度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種變性重組蛋白質(zhì)高通量重折疊復(fù)性方法；以不溶性變性蛋白質(zhì)的包涵體為原料，采用人工分子伴侶－去污劑－阻凝劑三聯(lián)復(fù)性系統(tǒng)，過程如下將包涵體使用含去污劑和阻凝劑尿素或胍緩沖液使包涵體變成一級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展態(tài)，形成蛋白質(zhì)－去污劑復(fù)合物；加入脲或胍緩沖液稀釋10～50倍，再加入含分子伴侶和氧化還原系統(tǒng)的脲或胍緩沖液，逐步釋放出伸展態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；使用平行分離柱純化重折疊復(fù)性的重組蛋白質(zhì)，濃縮或冷凍干燥；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是有待復(fù)性蛋白質(zhì)濃度高，所用反應(yīng)容器體積小，對(duì)于各種表達(dá)系統(tǒng)所形成的包涵體或變性蛋白質(zhì)均有效，效率提高數(shù)倍乃至幾十倍；方法簡(jiǎn)便，適用于蛋白質(zhì)組工程研究，條件易優(yōu)化，產(chǎn)業(yè)化前景好。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1521183SQ03110960
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者梅曉丹, 謝巖生, 郭曉迪, 劉進(jìn)前, 張利平 申請(qǐng)人:大連百奧科技發(fā)展有限公司