專利名稱：苦蕎種子內(nèi)肌醇衍生物轉(zhuǎn)化為其單體的方法及其提取物產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種苦蕎麥種子內(nèi)肌醇D-CHIRO-INOSITO與MYO-INOSITOL衍生物用生物工程方法轉(zhuǎn)化為其單體的方法及得到的苦蕎麥提取物產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
胰島素是由胰島器官產(chǎn)生的激素，進(jìn)入血液循環(huán)后作用于人體重要器官和周邊組織調(diào)控糖、脂及其它代謝過程。胰島素結(jié)合于人體細(xì)胞表面受體蛋白，激活一系列信號(hào)傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞表面渠道打開，將血中葡萄糖引入細(xì)胞內(nèi)從而達(dá)到降糖作用。這個(gè)信號(hào)傳遞途徑中的任何步驟受阻或效率降低均會(huì)導(dǎo)致胰島素失去作用，稱為胰島素抵抗性。為補(bǔ)償胰島素作用效率降低，人體產(chǎn)生更多的胰島素，稱為高胰島素血癥。血中持續(xù)高胰島素濃度造成代謝紊亂、血糖升高、血甘油三脂水平升高、高密度脂蛋白膽固醇降低、血漿纖維蛋白原升高及高尿酸血癥等。由胰島素抵抗性導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱為X綜合癥，包括糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖癥、冠心病、多囊性卵巢綜合癥等。
美國科學(xué)家近20年的研究證明，肌醇(INOSITOL)類分子(以D-手性-肌醇(D-Chiro-Inositol)及肌-肌醇(Myo-Inositol)為代表)在胰島素作用的信號(hào)傳遞過程中起了重要角色。研究發(fā)現(xiàn)正常人血中及尿液中含有一定濃度的D-Chiro-Inositol，而在II類糖尿病人中則幾乎檢測(cè)不到。因此，提示這些病人可能無法產(chǎn)生足夠量的D-Chiro-Inositol，造成胰島素作用的信號(hào)傳遞受阻。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果均確認(rèn)，通過給試驗(yàn)動(dòng)物補(bǔ)償D-Chiro-Inositol或Myo-Inositol能有效地促進(jìn)胰島素功能，降低血糖、血中胰島素、血甘油三脂水平等。正在進(jìn)行的人體臨床檢驗(yàn)亦表明，純化的D-Chiro-Inositol對(duì)II類糖尿病、多囊性卵巢綜合癥有顯著療效。
人類長(zhǎng)期以來將蕎麥種子制成各種食品，并有報(bào)道這種食品對(duì)糖尿病有益。但長(zhǎng)期一來，對(duì)其中的功效分子一直不甚了解。蕎麥屬蓼科麥屬一年生植物，栽培的蕎麥有兩種類型一種是普通蕎麥，又稱為甜蕎(Fagopyrumesculentum)，子粒呈三棱形；二是韃靼蕎麥(Fagopyrum taricum)，俗稱苦蕎，比普通蕎麥粒小，棱角鈍、粒色灰暗、無光澤、料面粗糙、皮層不易脫落。《本草綱目》記載苦蕎麥性味苦、平、寒、有益氣力，續(xù)精神，利耳目，有降氣寬腸健胃的作用?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)觀察表明，蕎麥具有降血糖、降血脂，增強(qiáng)人體免疫力的作用，對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、中風(fēng)等病人都有輔助治療作用。
本發(fā)明人在研究普通蕎麥(Fagopyrum esculentum)(又稱甜蕎)的過程中發(fā)現(xiàn)甜蕎中含有豐富的D-Chiro-Inositol衍生物Myo-Inositol衍生物，但是由于人的胃腸內(nèi)沒有alpha-半乳糖苷酶的存在(Gitzelmann&Auricchio，1965)，使得蕎麥種子中天然存在的D-Chiro-Inositol衍生物及Myo-Inositol衍生物在人體內(nèi)無法分解為有效成分(亦即單獨(dú)存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol分子)，亦無法充分吸收，無法完全發(fā)揮其功效。我們的研究發(fā)明了一種將蕎麥種子內(nèi)天然存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物轉(zhuǎn)化為有效單體分子的方法，并可直接應(yīng)用于開發(fā)生產(chǎn)治療2型糖尿病、多囊性卵巢綜合癥、高血壓、肥胖癥及其它心血管疾病的藥品和相關(guān)的保健食品(參見專利申請(qǐng)?zhí)?1110472.4)。我們?cè)陔S后的研究中又發(fā)現(xiàn)，在苦蕎(Fagopyrum tataricum)中同樣含有大量的D--Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物，且用我們專利01110472.4所述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，也能將苦蕎種子內(nèi)天然存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物轉(zhuǎn)化為有效的單體分子。并發(fā)現(xiàn)使苦蕎種子中的D--Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物轉(zhuǎn)化為有效單體分子后的苦蕎提取物具有顯著的降糖、降脂功效，比同等量的純化的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol以及普通蕎麥提取物具有更好的功效。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，進(jìn)一步研究開發(fā)苦蕎種子，尋找具有顯著降糖、降脂功效的提取物及制備方法。
本發(fā)明提供了一種使苦蕎成熟種子內(nèi)D-CHIRO-INOSITO衍生物及MYO-INOSITOL衍生物轉(zhuǎn)化為D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的方法，該方法是苦蕎成熟種子在22℃至30℃，0至30mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)18至48小時(shí)，或更好地在22℃至25℃，10至20mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)24至40小時(shí)，或最好地在25℃，20mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)36小時(shí)，種子中的D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物大幅度減少，D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL單體大幅度增加。Alpha-半乳糖苷酶活性在萌發(fā)過程中快速、急劇增加，提示D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物是通過水解而產(chǎn)生D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL單體。
本發(fā)明提供了上述方法的生產(chǎn)工藝，該工藝方法包括種子萌發(fā)、勻漿、攪拌、加熱、離心過濾、純化、濃縮、噴霧干燥、灌裝成膠囊或者片劑等步驟。該方法包括的具體步驟為(1).將苦蕎麥成熟種子在22℃～30℃，0～30mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)12～48小時(shí)；
(2).收集處理后的萌發(fā)的苦蕎麥種子，按種子濕重量加入10～20倍體積(1g濕種子10～20ml酒精或者甲醇)的30～70％酒精或者甲醇，碾磨成勻漿，過濾；(3).收集濾液，冷凍干燥，獲得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL單體的以可溶性碳水化合物為主的提取物。
按照此工藝，成熟的苦蕎種子在25℃、20mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)36小時(shí)的種子中獲得了高達(dá)135ug/粒種子的D-CHIRO-INOSITOL及43ug/粒種子的MYO-INOSITOL。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種采用上述方法從苦蕎種子內(nèi)肌醇衍生物轉(zhuǎn)化得到的苦蕎提取物產(chǎn)品，該產(chǎn)品可用于制備抗糖尿病、降血脂藥物。
本發(fā)明人對(duì)上述苦蕎種子產(chǎn)品進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)糖尿病大鼠具有明顯的降糖效應(yīng)，對(duì)高血脂鵪鶉有明顯的降血脂效應(yīng)，并且該降糖、降脂效應(yīng)與提取物中D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL單體含量成正比。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)本發(fā)明方法提取的苦蕎麥種子的提取物比同等量的純化的D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL單體具有更好的降糖、降脂功能，提示該提取物可能含有其它有效降糖、降脂的物質(zhì)與D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL協(xié)同作用。黃酮類化合物是其中可能的活性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的提取物對(duì)糖尿病大鼠、高血脂鵪鶉的降糖、降脂效應(yīng)優(yōu)于甜蕎抽提物，這也表明苦蕎麥種子抽提物中黃酮類化合物在降糖、降脂上的可能的協(xié)同作用。見下列實(shí)驗(yàn)(1)提取物的降糖功效實(shí)驗(yàn)1.鼠化學(xué)誘導(dǎo)糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x取平均重量為250-280克的雄性Sprague-Dawley鼠，按45mg/kg的劑量IP注射STZ(Streptozocin，SigmaChemicals Co.，溶于檸檬酸緩沖液中)溶液。24小時(shí)后從鼠尾靜脈抽血，用葡萄糖氧化法(Beckman葡萄糖分析儀，F(xiàn)ullerton，CA)測(cè)定其中的血糖含量。選取血糖在350至400mg/dl的大鼠作為糖尿病試驗(yàn)動(dòng)物(正常大鼠的血糖水平為116mg/dl)。
2.上述選取的經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠隨機(jī)分組，每組以一定劑量的經(jīng)過本發(fā)明實(shí)施所得提取物，按下表3中的劑量給予糖尿病大鼠，其結(jié)果為表3 抽提物在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中的降糖效應(yīng)

* P＜0.05**P＜0.01說明提取物為從25℃、20mM NaCl條件下萌發(fā)36個(gè)小時(shí)的種子中制備。上述數(shù)值均為10只實(shí)驗(yàn)鼠的平均值，0天時(shí)間血糖含量設(shè)為100，并將其它時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)作相應(yīng)調(diào)整。上述四組處理的0天時(shí)間血糖濃度分別為0mg/kg(對(duì)照)，382.3+/-15.1mg/dl；25mg/kg，376.4+/-18.7mg/dl；50mg/kg，377.9+/-20.2mg/dl；100mg/kg，372.+/-16.3mg/dl。
從上表可以看出，當(dāng)種子提取物使用劑量為50mg/kg時(shí)，在4天后實(shí)驗(yàn)鼠血糖含量比對(duì)照下降了40％。而在25mg/kg劑量下，4天內(nèi)與對(duì)照沒有明顯區(qū)別，8天后才初見效果。當(dāng)使用劑量進(jìn)一步增加至100mg/kg時(shí)，1天后血糖含量比對(duì)照下降了30％，4天后下降達(dá)44％。且比單效的肌醇和黃酮類化合物用藥更具有療效。說明提取物中肌醇和黃酮類化合物具有協(xié)同作用，也可能在提取物中尚存在其它的功效成分。此外，苦蕎提取物比同劑量的甜蕎提取物降糖功效好。
實(shí)施例七、本發(fā)明提取物的鵪鶉降脂實(shí)驗(yàn)1.制造模型與分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鵪鶉為同窩孵出，體重在100g左右。10只動(dòng)物喂普通飼料，其余喂高脂飼料，飼料均按25g/只，分早晚兩次給予，自由飲水。喂養(yǎng)20天后，取普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，分別檢測(cè)血脂以確定高血脂模型的形成。將模型動(dòng)物分六組1.苦蕎提取物1組(25mg/kg)2.苦蕎提取物2組(50mg/kg)3.苦蕎提取物3組(100mg/kg)4.肌醇組(15mg/kg)5.黃酮組(15mg/kg)6.甜蕎提取物組(50mg/kg)7.空白模型組正常動(dòng)物，不給藥，喂普通飼料。給藥2周。
2.指標(biāo)及測(cè)定使用酶法試劑盒檢測(cè)指標(biāo)①總膽固醇(TC)；②甘油三脂(TG)；③低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；④高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；⑤HDL-C/LDL-C。
3.統(tǒng)計(jì)方法t-檢驗(yàn)按照上述方法，用不同劑量的本發(fā)明提取物對(duì)高血脂模型動(dòng)物鵪鶉進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)果如下
表4 本發(fā)明提取物的降脂效應(yīng) *P＜0.05(與模型組比較)**P＜0.01(與模型組比較)從表2中可以看出，當(dāng)使用25mg/kg苦蕎提取物時(shí)，在2周后實(shí)驗(yàn)鵪鶉的膽固醇(CHO)含量、甘油三酯(TG)含量、低密度脂蛋白(LDL)含量分別比模型組下降了10％、2％和12％；當(dāng)使用50mg/kg苦蕎提取物時(shí)，上述含量則分別下降了19％、13％和26％；當(dāng)使用100mg/kg苦蕎提取物時(shí)，上述含量則分別下降了26％、23％和3l％；當(dāng)使用15mg/kg黃酮時(shí)，上述含量分別下降了21％、7％和24％，而當(dāng)使用15mg/kg肌醇時(shí)，上述含量分別下降了9％、6％和18％。
由此可見，本發(fā)明的提取物表現(xiàn)為1.從苦蕎中分離、提取、純化所得到的提取物具有顯著的降低血液中的膽固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白含量的作用。
2.苦蕎提取物的降血脂效應(yīng)優(yōu)于肌醇和黃酮類化合物，說明降血脂效應(yīng)與其中所含的肌醇類分子和黃酮類分子的含量成正比，這二類分子具有明顯的協(xié)同作用，也可能存在另外的功效成分。
已有許多報(bào)道黃酮類化合物具有有益的生理效應(yīng)和病理作用，越來越引起人們的重視?，F(xiàn)普遍認(rèn)為黃酮類化合物具有改善微循環(huán)、降糖降脂、維持血管正常滲透壓、防止血管脆化等功效。我們?cè)诒景l(fā)明的提取物中也測(cè)定到較高的總黃酮類含量，并表明了其在降糖降脂上的可能作用。
表五 苦蕎種子提取物中各類功效分子的含量

本發(fā)明的產(chǎn)品可與各種藥學(xué)可接受的載體混合制成片劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、口服液等藥物組合物，一般成人用量為600-6000mg提取物/每天。并且本發(fā)明的產(chǎn)品還可以直接加入食品中制備預(yù)防和治療糖尿病的保健食品，一般加入的量以成人每天攝取300-3000mg本發(fā)明提取物為適宜的劑量范圍。
實(shí)施例一一種將苦蕎成熟種子內(nèi)D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物顯著轉(zhuǎn)化為D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的生物學(xué)方法植物種子在萌發(fā)過程中激發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)，以提供種子萌發(fā)、生長(zhǎng)所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)和能量。我們的研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎種子在萌發(fā)過程中會(huì)激活alpha-半乳糖苷酶的表達(dá)。因此，一種激活半乳糖苷酶表達(dá)的生物學(xué)方法或者化學(xué)方法處理，將能有效地轉(zhuǎn)化D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的半乳糖苷鍵衍生物，釋放出游離的D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL分子。
在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)苦蕎種子在適當(dāng)?shù)臏囟?、鹽濃度和萌發(fā)時(shí)間下，激活alpha-半乳糖苷酶基因高效表達(dá)，從而顯著地將D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物轉(zhuǎn)化為D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL分子。
·萌發(fā)時(shí)間，鹽濃度及萌發(fā)溫度對(duì)苦蕎種子中alpha-半乳糖苷酶活性的影響為了確定不同萌發(fā)溫度、不同鹽濃度、不同萌發(fā)時(shí)間對(duì)苦蕎種子中alpha-半乳糖苷酶活性的影響，我們進(jìn)行了多因子交叉實(shí)驗(yàn)。將成熟的苦蕎種子在清水中浸泡數(shù)分鐘，置于用不同濃度NaCl溶液(0mM，10mM，20mM，30mM)浸濕的4-5層吸水紙上，置于盤內(nèi)，放置在不同溫度下(22℃，25℃，30℃)萌發(fā)。分別在萌發(fā)0小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、40小時(shí)、48小時(shí)后檢測(cè)alpha-半乳糖苷酶活性。25℃結(jié)果示于表1所示。表1.25℃下萌發(fā)時(shí)間及鹽濃度對(duì)苦蕎種子中alpha--半乳糖苷酶活性的影響

單位每毫克提取物中所含alpha-半乳糖苷酶單位數(shù)(以每分鐘水解1umol pnp-alpha-galactoside所需的酶量為1單位)從表1中可以看出，萌發(fā)開始后種子內(nèi)alpha-半乳糖苷酶的活性急劇增加，在30到36小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰。低濃度的NaCl加速alpha--半乳糖苷酶的激活并增大峰值。20mM NaCl條件下萌發(fā)36小時(shí)測(cè)得的酶相對(duì)活性最高，是處理前的40倍?！っ劝l(fā)溫度、鹽濃度、萌發(fā)時(shí)間對(duì)苦蕎種子中INOSITOL衍生物轉(zhuǎn)化為單體分子的影響上述多因子交叉實(shí)驗(yàn)下D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物及單體的含量示于下表。表2 25℃下萌發(fā)時(shí)間及鹽濃度對(duì)苦蕎種子中D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物及單體含量的影單位ug/粒種子


從表2的結(jié)果中可以得出幾個(gè)結(jié)論1)伴隨著萌發(fā)過程中D-chiro-inositol及myo-inositol衍生物的減少，D-chiro-inositol及myo-inositol單體含量增加，并在30至40個(gè)小時(shí)達(dá)到峰值。
2)萌發(fā)溫度上升加速D-chiro-inositol及myo-inositol衍生物的消失及單體的積累。但我們發(fā)現(xiàn)超過25℃時(shí)單體含量反而減少。單體含量可由多重因素影響，包括衍生物降解、單體被利用于它種生物合成途徑、單體被降解、單體新合成等。
3)低濃度NaCl大大增加D-chiro-inositol及myo-inositol單體含量，且這種效應(yīng)不是通過影響衍生物降解而實(shí)現(xiàn)。NaCl可能通過減少單體的利用或降解或者增加單體的合成而達(dá)到單體含量大大增加的效果。
4)單體累積的最佳條件為25℃，20mM NaCl，萌發(fā)36個(gè)小時(shí)，每粒種子中含135ug D-Chiro-Inositol及43ug Myo-Inositol。實(shí)施例二、alpha-半乳糖苷酶活性的測(cè)定收集苦蕎麥種子或萌發(fā)種子，在含有40m NaCl，3mMDTT的30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中碾磨，13200g離心5分鐘。在上清液中加入硫酸銨至60％飽和度，過夜，18000g離心15分鐘。沉淀溶于0.01M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，透析，18000g再離心15分鐘以去除不溶物。上樣于DEAE-Sephadex A-50柱(預(yù)先用0.01M pH7.0磷酸鈉緩沖液飽和)，分別用0.01M磷酸鈉緩沖液，0.05M緩沖液，0.1M緩沖液洗脫。alpha-半乳糖苷主要存在于0.05M磷酸鈉洗脫液內(nèi)。粗酶溶液再在0.05M醋酸鈉溶液中透析(pH4.0)，用CM-SephadexC-50柱(預(yù)先用0.05M醋酸鈉pH4.0飽和)進(jìn)一步純化，分別用0.05M醋酸鈉緩沖液(pH4.0)和線性梯度NaCl溶液洗脫，收集富含alpha-半乳糖苷酶的部分。最后用Sephadex G-100柱進(jìn)一步純化，并濃縮，得到純化的alpha-半乳糖苷酶。在10％SDS-聚丙稀酰胺膠上電泳檢查其純度，其分子量在45-47KD之間。
酶活性的測(cè)定采用下述方法以p-Nitrophenyl(PNP)alpha-galactoside(Sigma Chemical Co.)為底物，反應(yīng)液中含有0.05M磷酸鈉(pH6.0)0.2mM PNP-galactoside和酶，反應(yīng)體積為0.1ml。37℃保溫12小時(shí)后，反應(yīng)用0.7ml0.2M硼酸鈉(sodiumborate)(pH9.8)終止。在400nm下測(cè)定p-nitrophenol的分解量。酶活性單位為在上述條件下每分鐘水解1umol底物所需的酶量。實(shí)施例三.一種同時(shí)提取苦蕎種子中D-CHIRO-INOSITOL、MYO-INOSITOL和總黃酮的方法收集不同處理后的萌發(fā)的苦蕎種子，按干燥種子重量加入10倍體積(1g干燥種子10ml)的50-60％酒精或者甲醇，碾磨成勻漿，在40-60℃保溫下攪拌1-3個(gè)小時(shí)后，離心過濾，收集濾液，冷凍干燥，獲得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL單體及其衍生物的以可溶性碳水化合物為主的抽提物。從未萌發(fā)的成熟蕎麥種子制備的抽提物含約28％的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物和極少量(＜1％)的單體，而在25℃、20mM NaCl，、萌發(fā)36個(gè)小時(shí)的種子中制備的抽提物含約8％的D-Chiro-Inositol單體，3％Myo-Inositol單體，以及少量(＜3％)的衍生物和15％的總黃酮類化合物。經(jīng)進(jìn)一步純化后，抽提物中D-Chiro-Inositol單體和Myo-Inositol單體的含量可高達(dá)43％和9％。實(shí)施例四.本實(shí)施例是肌醇分子的純化及測(cè)定為了進(jìn)一步純化肌醇類分子，將實(shí)施例一所得到的抽提物按干重加入0.5倍體積(0.5ml/g)的75％丙腈(acetonitrile)，碾磨成勻漿。制備分離柱，該分離柱用具有3-氨醛(aminopropyl)鍵修飾的硅膠(9％)填充(AldrichChemical Company Inc.產(chǎn)品)，勻漿物在此柱上得到分離。用60-75％丙腈洗脫，0.4ml/Min。以5ml為單位收集不同組分洗脫液，其中的1ml蒸發(fā)干燥用于氣相色譜分解。各組分在Hewlett-Packard 5890 Series II氣相色譜儀上分析，分離柱為DB-1701(30-m length，0.25-mm i.d.，0.25um film thickness，J&w Scientific產(chǎn)品)。柱溫為275℃和325℃。攜帶氣(Carrier gas)是氦氣(1.0ml/min)，split 1∶100；檢測(cè)氣是氫氣(30ml/min)、空氣(300ml/min)和氮?dú)?30ml/min)。肌醇類分子含量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并與標(biāo)樣的保留時(shí)間和峰面積對(duì)比而計(jì)算的。肌醇、D-手性-肌醇及其它衍生物的標(biāo)準(zhǔn)均購自Sigma公司。實(shí)施例五、本實(shí)施例是總黃酮含量的測(cè)定精確稱取樣品3g，100ml 80％乙醇回流提取二次，每次一小時(shí)，合并濾液，濃縮至粘稠狀，精密加入25ml甲醇后，用蒸餾水定容至250ml容量瓶中；取出5ml至50ml容量瓶中，按順序分別在容量瓶中加入5％NaNO2和10％Al(NO3)3各2ml，搖勻，放置6分鐘后，加入4％NaOH 20ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻放置5分鐘，以0ml作空白，在510nm處測(cè)定。所用標(biāo)樣購自SIGMA公司，儀器為紫外可見分光光度計(jì)。
權(quán)利要求
1.一種使苦蕎麥種子內(nèi)肌醇D-CHIRO-INOSITO與MYO-INOSITOL衍生物轉(zhuǎn)化為其單體的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1).將苦蕎麥成熟種子在22℃～30℃，0～30mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)12～48小時(shí)；(2).收集處理后的萌發(fā)的苦蕎麥種子，按種子濕重量加入10～20倍體積的30～70％酒精或甲醇，碾磨成勻漿，過濾；(3).收集濾液，冷凍干燥，獲得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL單體的以可溶性碳水化合物為主的提取物產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使苦蕎麥種子內(nèi)肌醇D-CHIRO-INOSITO與MYO-INOSITOL衍生物轉(zhuǎn)化為其單體的方法，其特征在于其中所述萌發(fā)步驟中的選擇條件較佳為22℃至25℃，10至20mM NaCl鹽濃度條件下萌發(fā)24至40小時(shí)，或在25℃，20mMNaCl鹽濃度條件下萌發(fā)36小時(shí)；在碾磨勻漿的步驟中種子與酒精或者甲醇的用量為1g濕種子10～20ml酒精或者甲醇。
3.一種如權(quán)利要求1所述的方法獲得的苦蕎麥提取物產(chǎn)品，其特征在于該提取物產(chǎn)品含有8％～43％D-CHIRO-INOSITOL及1％～9％MYO-INOSITOL單體。
4.一種通過如權(quán)利要求1所述的方法獲得的苦蕎麥提取物產(chǎn)品在制備防治糖尿病和高血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種使苦蕎麥種子內(nèi)肌醇衍生物D－CHIRO－INOSITO與MYO－INOSITOL通過生物工程方法轉(zhuǎn)化為其單體的方法。用本發(fā)明方法得到的苦蕎麥提取物產(chǎn)品具有顯著的降糖降脂功能，可用于制備抗糖尿病、降血脂的藥物或用于防治糖尿病、高血脂的保健食品。
文檔編號(hào)C07D311/30GK1442399SQ0311628
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2003年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月10日
發(fā)明者夏濤, 王沁, 劉華奇 申請(qǐng)人:上海諾金科生物科技有限公司