專利名稱：制備酪-絲-亮三肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的制備方法。更具體地講，本發(fā)明涉及酪-絲-亮三肽(CMS024)的制備方法。
背景技術(shù)：
在多肽合成方法中，常用的液相合成方法是采用最大保護(hù)策略，即對(duì)作為單體的氨基酸的相關(guān)官能基團(tuán)，尤其是氨基、羧基和羥基均作出保護(hù)，再進(jìn)行氨基酸間的縮合反應(yīng)從而合成多肽。關(guān)于多肽合成的詳細(xì)描述可參見文獻(xiàn)《多肽合成》，1985年，黃惟德、陳常慶著；《多肽藥物化學(xué)》，1990年，彭師奇。
例如，在合成酪-絲-亮三肽時(shí)，采用最大保護(hù)策略方法，可以Boc-Leu-OH為原料制備銫鹽，接著將羧端芐酯化，隨后用HCl脫去Boc，暴露出氨端，然后按照DCC法(HOBT為輔助縮合劑)和側(cè)鏈用芐基(Bzl)保護(hù)的絲氨酸和2，6-二氯芐基(Dcb)保護(hù)的酪氨酸進(jìn)行逐步接肽，接著采用HCl脫去Boc，最后用HF脫去各種保護(hù)基，得到酪-絲-亮三肽。所述采用最大保護(hù)策略方法，合成酪-絲-亮三肽方案的簡(jiǎn)明路線見圖1最大保護(hù)策略采用側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸價(jià)格昂貴，在合成的最后需要經(jīng)過劇烈的HF脫保護(hù)。由于HF的劇毒性，反應(yīng)的危險(xiǎn)性較大，必須具備專門的HF脫保護(hù)裝置。而且由于這類脫保護(hù)裝置的反應(yīng)容器體積有限，每一次脫保護(hù)所得產(chǎn)品數(shù)量有限，因此限制了在產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。
因此，需要一種避免采用強(qiáng)毒性和刺激性的HF進(jìn)行脫保護(hù)、成本便宜且能夠在工業(yè)上實(shí)施的合成CMS024的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種采用最小保護(hù)策略合成所述酪-絲-亮三肽(CMS024)的方法，所述方法包括以下步驟(1)使L-Leu-OH與SOCl2在醇溶液中反應(yīng)，得到L-Leu-OH的酯；(2)使(1)中制得的L-Leu-OH的酯與氨端保護(hù)的L-Ser-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的絲氨酸和亮氨酸的二肽縮合物的酯；(3)對(duì)(2)中制得的產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)；(4)使(3)中制得的產(chǎn)物與氨端保護(hù)的L-Tyr-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的酪氨酸、絲氨酸和亮氨酸的三肽縮合物的酯；(5)使(4)中制得的產(chǎn)物在醇溶劑中、在堿存在下進(jìn)行水解，得到保護(hù)的H-Tyr-Ser-Leu-OH；(6)對(duì)(5)中制得的產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，將(6)中制得的產(chǎn)物在Sephadex G15中，以5％HOAC水溶液進(jìn)行純化，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
相對(duì)于HF的脫保護(hù)條件，本發(fā)明方法的安全性增大，同時(shí)對(duì)工業(yè)化沒有障礙。另外，由于側(cè)鏈不保護(hù)氨基酸的價(jià)格較為便宜，因此采用本發(fā)明的保護(hù)路線的合成成本也較小，而且不需要最大保護(hù)路線的昂貴的HF脫保護(hù)的裝置。
本發(fā)明方法在制備過程中通過選擇合適的反應(yīng)條件，有效地防止副反應(yīng)的發(fā)生，制得的產(chǎn)物經(jīng)薄層層析測(cè)定為單點(diǎn)。
發(fā)明詳述盡管不希望受任何理論的限制，但是認(rèn)為本發(fā)明是以下面的事實(shí)為基礎(chǔ)由于1)CMS024為僅含有三個(gè)氨基酸殘基的小肽；2)酪氨酸和絲氨酸的側(cè)鏈的羥基的親核反應(yīng)活性相對(duì)氨基較小；因此在合成過程中可以不對(duì)兩個(gè)側(cè)鏈的羥基進(jìn)行保護(hù)。
首先，申請(qǐng)人制備了亮氨酸的酯，與側(cè)鏈不保護(hù)的絲氨酸和酪氨酸進(jìn)行逐步接肽，皂化脫去酯基，最后脫去Boc保護(hù)得到CMS024的鹽。圖2所示是本發(fā)明采用最小保護(hù)策略方法合成酪-絲-亮三肽時(shí)的簡(jiǎn)明路線圖。
1.L-Leu-OH的酯化采用SOCl2的醇溶液將Leu-OH酯化，以保護(hù)Leu的羧端。其中Leu-OH先與SOCl2形成Leu-C1，接著與醇反應(yīng)成酯。所用的醇溶劑可為甲醇、乙醇或芐醇等。本發(fā)明優(yōu)選使用甲醇。反應(yīng)先在0℃進(jìn)行4小時(shí)，隨后逐步升溫至室溫，由薄層層析監(jiān)測(cè)，直至原料點(diǎn)消失。一般為約8小時(shí)。制得的產(chǎn)物為L(zhǎng)-Leu-OH酯的鹽酸鹽形式。
2.Boc保護(hù)的亮氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯的制備將上述產(chǎn)物HCl·Leu-OH的酯用溶劑溶解，用有機(jī)堿調(diào)節(jié)pH值至一定值。另一方面，將僅對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù)(醇羥基呈游離狀態(tài))的Boc-L-Ser-OH用溶劑溶解，加入縮合劑，隨后在一定溫度下與HCl·Leu-OH的酯溶液混合反應(yīng)，在反應(yīng)過程中采用有機(jī)堿維持pH值在一定范圍內(nèi)。得到Boc保護(hù)的亮氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯。
在該步反應(yīng)中采用Boc-作為氨基保護(hù)劑，此外所述氨基保護(hù)劑還可選自常用于多肽合成中的任意保護(hù)劑，如芐氧羰基(Z)。
所用的溶劑可選自四氫呋喃、重蒸的DMF、NMP等，優(yōu)選使用四氫呋喃。
所用的有機(jī)堿可選自N-甲基嗎啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二異丙基乙基胺)等，優(yōu)選使用NMM。
在該步反應(yīng)中選用DCC/HOBt作為縮合劑，此外所述縮合劑還可選自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意縮合劑。
在反應(yīng)過程中，當(dāng)pH低于7時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的純度將降低，而pH高于11，將使產(chǎn)率降低。因此，優(yōu)選將pH控制在7-11，更優(yōu)選在8-10的范圍內(nèi)。
反應(yīng)溫度可為0℃至室溫。當(dāng)在室溫下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間較短，但經(jīng)薄層層析檢測(cè)為多點(diǎn)，產(chǎn)物純度下降，產(chǎn)率下降。而先在0℃下反應(yīng)2小時(shí)后，再于室溫下反應(yīng)，則得到經(jīng)薄層層析檢測(cè)為純的產(chǎn)物。
3.脫保護(hù)Boc保護(hù)的二肽縮合物的脫保護(hù)可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脫保護(hù)試劑來實(shí)施。
采用TFA/二氯甲烷作為脫保護(hù)試劑時(shí)，雖然其對(duì)反應(yīng)原料的溶解性較好，但得到的產(chǎn)物為粘稠狀物質(zhì)，而且TFA需減壓蒸餾才能除去，因此后處理較為困難。
而HCl/乙酸乙酯中由于HCl為揮發(fā)性酸，得到的產(chǎn)物容易結(jié)晶，通過過濾后處理即可，因此更優(yōu)選使用HCl/乙酸乙酯作為脫保護(hù)試劑。
4.Boc保護(hù)的亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸的三肽縮合物的酯的制備Boc保護(hù)的亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸的三肽縮合物的酯的制備條件的選擇與Boc保護(hù)的亮氨酸和絲氨酸的二肽縮合物的酯的制備條件的選擇類似。
在該步反應(yīng)中采用Boc作為氨基保護(hù)劑，此外所述氨基保護(hù)劑還可選自常用于多肽合成中的任意保護(hù)劑，如芐氧羰基(Z)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用僅對(duì)氨基進(jìn)行保護(hù)(酚羥基呈游離狀態(tài))的Boc-L-Tyr-OH作為原料進(jìn)行反應(yīng)。
所用的溶劑可選自四氫呋喃、重蒸的DMF、NMP等，優(yōu)選使用四氫呋喃。所用的有機(jī)堿可選自N-甲基嗎啉、三乙胺和DIEA等，優(yōu)選使用NMM?？s合劑可選自DCC/HOBt、DIC、HBTU、BOP等，優(yōu)選使用DCC/HOBt。反應(yīng)過程的pH控制在7-11，更優(yōu)選在8-10的范圍內(nèi)。反應(yīng)溫度控制為先在0℃下反應(yīng)2小時(shí)，再于室溫下反應(yīng)。
5.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制備將上一步反應(yīng)產(chǎn)物用醇溶劑溶解，在一定溫度下緩慢滴加入堿進(jìn)行皂化反應(yīng)，脫去羧酸端的酯基。
反應(yīng)中使用的溶劑可選自甲醇、乙醇等常用反應(yīng)溶劑。
反應(yīng)可在0℃至室溫下進(jìn)行。在室溫下進(jìn)行可縮短反應(yīng)時(shí)間(由0℃下的約5小時(shí)縮至2小時(shí))，但發(fā)生嚴(yán)重的消旋化，產(chǎn)生較多的包括消旋物在內(nèi)的副產(chǎn)物。而當(dāng)在0℃下進(jìn)行時(shí)則得到經(jīng)薄層層析檢測(cè)為純的化合物。因此優(yōu)選在0℃下實(shí)施皂化反應(yīng)。
6.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的脫保護(hù)與3中的脫保護(hù)條件類似，可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脫保護(hù)試劑來實(shí)施。但較優(yōu)選使用HCl/乙酸乙酯作為脫保護(hù)試劑。
7.精制將制得的HCl·Tyr-Ser-Leu-OH用去離子水溶解，采用Sephadex G15凝膠柱進(jìn)行脫鹽，終產(chǎn)品為酪絲亮肽H-Tyr-Ser-Leu-OH。


圖1是采用最大保護(hù)策略方法合成酪-絲-亮三肽時(shí)的簡(jiǎn)明路線圖。
圖2是本發(fā)明采用最小保護(hù)策略方法合成酪-絲-亮三肽時(shí)的簡(jiǎn)明路線圖。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式下面結(jié)合圖2，通過非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
在本文中，所用試劑的縮寫為DCC二環(huán)己基碳二亞胺HOBt1-羥基苯并三氮唑NMMN-甲基嗎啉THF四氫呋喃實(shí)施例11.HCl·Leu-OMe的制備將20g(0.152mol)的L-LeuOH(Sigma)與事先制備的SOCl2(化學(xué)純，北京化工廠)/CH3OH(化學(xué)純，北京化工廠)溶液(冷至-10℃，由260ml的CH3OH與70ml新蒸SOCl2構(gòu)成)逐步混合，外溫維持-10℃，使L-Leu-OH逐步溶解。得到的反應(yīng)液于0℃反應(yīng)4小時(shí)，然后逐步升溫至室溫，再反應(yīng)8小時(shí)，經(jīng)TLC(氯仿/甲醇，20/1)檢測(cè)顯示原料點(diǎn)消失。將反應(yīng)液減壓濃縮至干，除凈游離氯化氫。殘留物用少量甲醇溶解，加無水乙醚至渾濁，放置，析晶，過濾得到22.02g(74.8％)目標(biāo)化合物。在氯仿/甲醇(5/1)展開劑中為單點(diǎn)。熔點(diǎn)151～153℃[α]D20＝20°(C＝2 MeOH)
2.Boc-Ser-Leu-OMe的制備(1)
將22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉調(diào)pH至7，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(購(gòu)自揚(yáng)州寶盛公司)、17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，于0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，再于0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉(Fluka)維持PH＝7，于室溫?cái)嚢?4小時(shí)，經(jīng)TLC(氯仿/甲醇/乙酸，(20/1/0.4))檢測(cè)顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，用石油醚反復(fù)研磨殘留物，用400ml乙酸乙酯溶解得到的粘稠狀物質(zhì)，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×5)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到40.0g(100.8％)粘稠狀目標(biāo)化合物。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種系統(tǒng)展開，得到3個(gè)點(diǎn)。
3.Boc-Ser-Leu-OMe的制備(2)
將22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉調(diào)pH至8，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(購(gòu)自揚(yáng)州寶盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉(Fluka)維持pH＝8，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，氯仿/甲醇/乙酸，(20/1/0.4)顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，殘留物用石油醚反復(fù)研磨，得到的粘稠狀物質(zhì)，用400ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×5)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到41.2g(103.8％)粘稠狀目標(biāo)化合物。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種展開系統(tǒng)，均為單點(diǎn)，該產(chǎn)物可直接用于下一步反應(yīng)。
4.Boc-Ser-Leu-OMe的制備(3)
將22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉調(diào)pH至10，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(購(gòu)自揚(yáng)州寶盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，于0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，再于0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉(Fluka)維持PH10，于室溫?cái)嚢?0小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展開，顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，用石油醚反復(fù)研磨殘留物，得到的粘稠狀物質(zhì)用400ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×5)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到41.2g(103.8％)粘稠狀目標(biāo)化合物。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種展開系統(tǒng)，均為單點(diǎn)，該產(chǎn)物可直接用于下一步反應(yīng)。
5.Boc-Ser-Leu-OMe的制備(4)
將22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉調(diào)pH至11，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(購(gòu)自揚(yáng)州寶盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，再于0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉(Fluka)維持PH11，于室溫?cái)嚢?0小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展開，顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，用石油醚反復(fù)研磨殘留物，得到的粘稠狀物質(zhì)用400ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×5)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到32.9g(83％)粘稠狀目標(biāo)化合物。。
6.HCl·Ser-Leu-OMe的制備將41.2g(0.124mol)的Boc-Ser-Leu-OMe與200ml 4N HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室溫下攪拌1小時(shí)30分鐘，溶液出現(xiàn)大量白色沉淀，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用TLC(氯仿/甲醇，20/1)展開，顯示原料點(diǎn)消失。過濾，用乙酸乙酯反復(fù)洗滌濾餅，以除凈游離HCl。用無水乙醚反復(fù)研磨殘留物，得到目標(biāo)化合物26.23g(78.7％)。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇(10/1)展開系統(tǒng)，為單點(diǎn)。熔點(diǎn)128～129℃，[α]D20＝-18°(C＝2MeOH)
7.Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe的制備(1)
將26.23g(0.097mol)的HCl·Ser-Leu-OMe用125ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉(Fluka)調(diào)pH至8，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將27.45g(0.097mol)的Boc-Tyr-OH(購(gòu)自四川三高生化有限公司)，13.85g(0.102mol)的HOBt(Fluka)用125ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入21.13g(0.102mol)的DCC(Fluka)，于0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，再于0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉維持PH＝8，于室溫?cái)嚢?8小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展開，顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，用石油醚反復(fù)研磨殘留物，得到的固體用400ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×3)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×3)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過濾，濾液減壓旋干得到49.12g(101.6％)目標(biāo)化合物。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種展開系統(tǒng)，均為單點(diǎn)。熔點(diǎn)147.4～147.8℃[α]D20＝-22°(C＝2 MeOH)8.Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe的制備(2)
將26.23g(0.097mol)的HCl·Ser-Leu-OMe用125ml無水四氫呋喃(分析純，北京化工廠)溶解，得到的溶液用N-甲基嗎啉(Fluka)調(diào)pH至10，冷卻至0℃?zhèn)溆谩?br> 將27.45g(0.097mol)的Boc-Tyr-OH(購(gòu)自四川三高生化有限公司)，13.85g(0.102mol)的HOBt(Fluka)用125ml無水四氫呋喃溶解，冷至0℃，緩慢加入21.13g(0.102mol)的DCC(Fluka)，于0℃攪拌5分鐘。然后與上面的溶液混合，再于0℃攪拌2小時(shí)，用N-甲基嗎啉維持PH＝8，于室溫?cái)嚢?8小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展開，顯示原料點(diǎn)消失。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮濾液，用石油醚反復(fù)研磨殘留物，得到的固體用400ml乙酸乙酯溶解，分別用飽和NaHCO3水溶液(75ml×3)、飽和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×3)和飽和NaCl水溶液(15ml×3)洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干得到48.30g(100.0％)目標(biāo)化合物。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)與氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)兩種展開系統(tǒng)，均為單點(diǎn)。熔點(diǎn)147.4～147.8℃[α]D20＝-22°(C＝2 MeOH)9.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制備(1)
將49.12g(0.099mol)的Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe，用400ml CH3OH(化學(xué)純，北京化工廠)溶解，0℃下緩慢滴入120ml 2N的NaOH(化學(xué)純，北京化工廠)/H2O，于0℃攪拌5小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇(10/1)展開，顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液用KHSO4/H2O調(diào)至中性，減壓蒸干甲醇，KHSO4/H2O繼續(xù)酸化至PH值1～2，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，合并有機(jī)層，并用H2O(20ml×3)反復(fù)洗滌至中性，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干，得目標(biāo)化合物48.32g(100.8％)。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(5/1/0.4)展開系統(tǒng)，為單點(diǎn)，Rf＝0.31，可直接用于下一步反應(yīng)。
熔點(diǎn)103.2～105.1℃。[α]D20＝-7°(C＝2 MeOH)10.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制備(2)
將49.12g(0.099mol)的Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe，用400ml CH3OH(化學(xué)純，北京化工廠)溶解，于室溫下緩慢滴入120ml 2N的NaOH(化學(xué)純，北京化工廠)/H2O，在室溫下攪拌2小時(shí)，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇(10/1)展開，顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液用KHSO4/H2O調(diào)至中性，減壓蒸干甲醇，KHSO4/H2O繼續(xù)酸化至PH值1～2，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，合并有機(jī)層，并用H2O(20ml×3)反復(fù)洗滌至中性，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓旋干，得目標(biāo)化合物47.50g(99.1％)。經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇/乙酸(5/1/0.4)展開系統(tǒng)，為多點(diǎn)，表明發(fā)生了嚴(yán)重的消旋化。
11.HCl·Tyr-Ser-Leu-OH的制備于0℃下，向48.32g的Boc-Tyr-Ser-Leu-OH中緩慢加入250ml4NHCl/乙酸乙酯，于0℃攪拌1小時(shí)30分鐘，反應(yīng)液出現(xiàn)大量沉淀，經(jīng)TLC檢測(cè)，采用氯仿/甲醇(10/1)展開，顯示原料點(diǎn)消失，過濾，沉淀用乙酸乙酯反復(fù)洗滌至無HCl，用100ml乙醇溶解，放置析晶，過濾，收集沉淀。再向母液中加入石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，收集結(jié)晶。合并得目標(biāo)化合物35.5g(85.1％)。[α]D20＝-6°(C＝2 H2O)12.酸根離子的轉(zhuǎn)換及脫鹽將35.5g HCl·Tyr-Ser-Leu-OH用少量去離子水溶解，采用SephadexG 15進(jìn)行換鹽，洗脫劑為5％HOAc水溶液，紫外檢測(cè)儀215nm在線檢測(cè)以及茚三酮顯色方法檢測(cè)，收集主成分，凍干，得31.0gHOAC·Tyr-Ser-Leu-OH[α]D20＝+19°(C＝2 冰醋酸)
已經(jīng)通過非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出了舉例說明。但本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，在沒有偏離本發(fā)明的宗旨和范圍下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種修改、替換和變更。
權(quán)利要求
1.一種制備具有以下結(jié)構(gòu)的三肽化合物的方法 (H-Tyr-Ser-Leu-OH)所述方法包括以下步驟(1)使L-Leu-OH與SOCl2在醇溶液中反應(yīng)，得到L-Leu-OH的酯；(2)使(1)中制得的L-Leu-OH的酯與氨端保護(hù)的L-Ser-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的絲氨酸和亮氨酸的二肽縮合物的酯；(3)對(duì)(2)中制得的產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)；(4)使(3)中制得的產(chǎn)物與氨端保護(hù)的L-Tyr-OH在縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得氨端保護(hù)的酪氨酸、絲氨酸和亮氨酸的三肽縮合物的酯；(5)使(4)中制得的產(chǎn)物在醇溶劑中、在堿存在下進(jìn)行水解，得到保護(hù)的H-Tyr-Ser-Leu-OH；(6)對(duì)(5)中制得的產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，脫除保護(hù)基團(tuán)，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括在步驟(6)后將制得的產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G15、以5％HOAC水溶液洗脫進(jìn)行純化。
3.權(quán)利要求1的方法，其中保護(hù)的L-Ser-OH為Boc-Ser-OH，且保護(hù)的L-Tyr-OH為Boc-Tyr-OH。
4.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(1)中所用的醇為甲醇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)和步驟(4)中所用的縮合劑均為DCC/HOBt。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)和步驟(4)的反應(yīng)中pH值均為7-11。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟(2)和步驟(4)的反應(yīng)中pH值均為8-10。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)和步驟(4)的反應(yīng)均先在0℃下進(jìn)行，再于室溫下進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(3)中的脫保護(hù)采用HCl/乙酸乙酯進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(5)的水解反應(yīng)在0℃下實(shí)施。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備酪－絲－亮三肽的方法，該方法以亮氨酸和兩個(gè)側(cè)鏈的羥基未進(jìn)行保護(hù)的絲氨酸和酪氨酸為原料合成所述酪－絲－亮三肽(CMS024)。本發(fā)明的方法安全、成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K5/08GK1513871SQ0311784
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 王超, 丁文峰, 林剛 申請(qǐng)人:深圳市康哲藥業(yè)股份有限公司