專利名稱：人嚴重急性呼吸道綜合癥(sars)免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學、血液學技術(shù)領(lǐng)域，涉及治療疾病的免疫球蛋白制劑，特別涉及治療人嚴重急性呼吸道綜合癥/急性呼吸窘迫征(SevereAcute Respiratory Syndrome SARS)。
背景技術(shù)：
SARS是一種急性呼吸道傳染病，主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高。SARS病人都是既往身體健康、年齡25～70歲的成年病人，也有一部分疑診SARS兒童(≤15歲)病例報告，潛伏期通常為2～7天，但可以長達10天。該病開始時一般先出現(xiàn)發(fā)熱(＞38℃)前驅(qū)癥狀，發(fā)熱通常為高熱，有時伴有畏寒和寒顫，有時還伴有其他癥狀包括頭痛、疲乏和肌痛，發(fā)病期間，一些病人有輕度的呼吸系統(tǒng)癥狀。典型病例通常沒有皮疹和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)或胃腸道表現(xiàn)，但有一些病人報告，在出現(xiàn)發(fā)熱前驅(qū)癥狀期間發(fā)生了腹瀉，3～7天后，病人開始進入下呼吸道受累期，開始出現(xiàn)干咳或呼吸困難，可能伴有或發(fā)展為低氧血癥。10％～20％病人的呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)非常嚴重，需要插管和機械通氣，在出現(xiàn)發(fā)熱前驅(qū)癥狀期間和整個病程中，胸部X線檢查可能正常。但是，大量病人在呼吸系統(tǒng)受累期間出現(xiàn)下列特征性表現(xiàn)早期局灶性滲出，發(fā)展為更彌漫的斑片狀間質(zhì)性滲出。
中國香港的研究人員Peiris等報告了(Lancet 2003 3619365)50例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學研究結(jié)果。強有力的證據(jù)表明，新冠狀病毒可能是SARS的致病原因。研究者分析了50例SARS病人的病史記錄和微生物學研究結(jié)果，這50例病人是來自5個以上的獨立的流行病學聯(lián)系的傳播聚集群。他們通過胸部X線檢查、鼻咽部抽吸物和血清標本的實驗室檢查來調(diào)查病原體，對這些病人的實驗室結(jié)果與其他呼吸道疾病患者的微生物學檢查結(jié)果進行了比較，結(jié)果顯示，發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肌痛和咳嗽是最常見的癥狀。與胸部X線變化相比，呼吸道癥狀和聽診結(jié)果不成比例地顯著輕微，年齡較大、淋巴細胞減少、肝功能異常與嚴重疾病相關(guān)。2例病人分離出一種屬于冠狀病毒屬的病毒。采用這種病毒的特異性血清學和PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))試驗的測試結(jié)果顯示，50例SARS病人中的45例，而對照組中無一例，有該病毒感染的證據(jù)。研究人員采用經(jīng)典的病毒培養(yǎng)法、血清學技術(shù)和現(xiàn)代分子基因技術(shù)，描述和確定了香港50例SARS病人的發(fā)病原因。他們報告的一個優(yōu)點是分析了來自對照病人的標本，這一點也是確定因果關(guān)系的一個重要手段。在40例患有其他呼吸系統(tǒng)疾病的病人中，無一例病人的呼吸道標本含有冠狀病毒的RNA，在來自獻血者的200份血清標本中也沒有發(fā)現(xiàn)抗這種新冠狀病毒的抗體。研究者稱沒有恒定地識別出經(jīng)典的呼吸道的或細菌性呼吸道病原體。然而，從符合SARS定義的病人標本中分離出了一種新的冠狀病毒。在接種了咽拭子標本的Vero E6細胞中以顯微鏡檢查看到了細胞病理學特征。培養(yǎng)細胞的電子顯微鏡檢查揭示了具有冠狀病毒特征的超微結(jié)構(gòu)特征，免疫組織化學和免疫熒光染色展示了與I組冠狀病毒多克隆抗體的反應(yīng)性。為了用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR(擴增)冠狀病毒聚合酶基因的片段，他們設(shè)計并使用了冠狀病毒共有(序列)的引物，以取得一段序列，該序列清楚地識別了上述分離物是一種獨特的冠狀病毒，它與以往測過序的冠狀病毒只有較遠的關(guān)系。研究者用特異的診斷用RT-PCR引物，在12例不同地點的病人中識別出了數(shù)個相同的核苷酸序列，這一結(jié)果與從一個點發(fā)源的暴發(fā)一致。以此新的冠狀病毒制備的間接熒光抗體試驗和酶聯(lián)免疫吸附檢測法已被用于證實病毒特異性血清學反應(yīng)。
2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦宣布，經(jīng)過全球科研人員的通力合作，終于正式確認冠狀病毒的一個變種是引起非典型肺炎的病原體。來自中國、美國、中國香港和新加坡等10個國家和地區(qū)的13個實驗室的科學家在當日舉行的會議上，一致認定了變種冠狀病毒的作用。
SARS病毒是一種嶄新的冠狀病毒，而非某種已知冠狀病毒的近期變種。SARS病毒基因組研究表明在不同國家發(fā)生的SARS病毒沒有顯著的變異。SARS病毒存活時間比以往估計的長，SARS病毒在病人的糞便和尿中可存活數(shù)天。
冠狀病毒是RNA病毒。冠狀病毒屬Coronavirus是冠狀病毒科Coronaviridae中的一個屬，其成員包括三個組。第一組有犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、人冠狀病毒229E、可傳播胃腸炎病毒等；第二組有牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒等；第三組包括傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒和大鼠冠狀病毒。以上病毒中，人冠狀病毒引起人類普通感冒。
冠狀病毒病毒顆粒多為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為60-220nm，表面有多個稀疏的棒狀突起，長約20nm。電鏡負染照片示病毒顆粒形似王冠，因而得名。病毒顆粒內(nèi)有由病毒RNA和蛋白質(zhì)組成的核心，外面有脂質(zhì)雙層膜。此病毒對理化因素的抵抗力不強，56℃10分鐘可消除其感染性；pH3、用乙醚、氯仿或紫外線處理，均可使其滅活。
對冠狀病毒感染，尚無特異性抗病毒療法，而且關(guān)于冠狀病毒感染抗病毒治療的文獻報告也很少。SARS推薦的治療方案為密切觀察病情變化(多數(shù)病人在發(fā)病后14天內(nèi)都可能屬于進展期)，預防和治療繼發(fā)細菌感染，抗病毒治療，有嚴重中毒癥狀或達到重癥病例標準者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，中藥輔助治療。
已有報道稱對重癥病人可使用已康復非典型肺炎病人的血清進行治療。研究者對21例非典患者不同時期的血清研究，已將非典保護性抗體鎖定在IgG抗體上。對21例非典型患者采集了不同時期的序列血清，發(fā)現(xiàn)在非典病人發(fā)病一周內(nèi)未產(chǎn)生IgG型抗體，IgG型抗體亦可在10-14天時檢測到，但滴度較低，60天時達到高峰，90天時仍維持在高水平。在調(diào)查的21例非典患者中，恢復期病人100％發(fā)現(xiàn)有IgG型抗體。感染SARS病毒病人如果在首兩星期內(nèi)使用血清，病人的住院時間和發(fā)燒期會較短，死亡率會較低。香港醫(yī)師已經(jīng)用SARS痊愈患者的血清成功治療了一些患者。但在目前的治療中，仍以利巴韋林和類固醇等藥物作為抗病毒的首選。因為血清需由康復者捐出，且會使初痊愈病人感覺難受，并還得選擇合適的血型配合才行。
病毒是一種抗原，能引起特異性免疫應(yīng)答。病毒抗原刺激機體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生多種特異性抗體(IgG、IgM、IgA)?？贵w與病毒結(jié)合后能使病毒失去感染性，抗體對病毒有中和作用，這種抗體稱為中和抗體。病毒感染后細胞表面抗原變化也能被宿主免疫系統(tǒng)識別，引起特異性免接應(yīng)答。在病毒血癥期間抗體如能充分發(fā)揮作用，則可防止嚴重臨床癥狀產(chǎn)生。特異性抗體主要作用于游離病毒，亦可作用于受染靶細胞。IgG抗體對游離病毒的作用為病毒中和作用，其機制是抗體與病毒包膜或衣殼結(jié)合后，覆蓋住病毒吸附位點，病毒不能吸附和穿入易感細胞，喪失感染力，從而阻止病毒對易感靶細胞的吸附。血清中最主要的中和抗體是1gG。
免疫預防是目前人類對付病毒感染最根本的措施。對付急性病毒感染，人免疫球蛋白制劑是最常用的免疫血清。目前市場上常見的有人狂犬病免疫球蛋白、人破傷風免疫球蛋白、人乙肝免疫球蛋白等。人免疫球蛋白制劑是由人血漿制備而得，對人體無任何副作用與過敏反應(yīng)。而馬及其它動物血清制備的免疫球蛋白，對人體有嚴重副作用與過敏反應(yīng)，因而不能大劑量使用于臨床搶救危重病人。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于預防和治療SARS的免疫制劑，該免疫制劑能及時有效地清除和殺滅體內(nèi)的冠狀病毒等特異性抗原，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，并可用于高危人群的預防等特點。
本發(fā)明提供的用于預防和治療SARS的免疫制劑，是由SARS病人恢復期的血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人的血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取后經(jīng)病毒滅活處理制備的人SARS免疫球蛋白。
上述“低溫乙醇蛋白分離法提取”和“病毒滅活處理”的具體技術(shù)方案分別是低溫乙醇蛋白分離法提取包括(1)將抗SARS人血漿于反應(yīng)罐混合攪拌后，調(diào)節(jié)pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.1-0.14，反應(yīng)溫度為-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后用低溫連續(xù)離心法分離，得到組分I+II+III沉淀；(2)用組分I+II+III沉淀重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉淀組分I+II+III沉淀，調(diào)節(jié)pH 5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.01至0.015，反應(yīng)溫度-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，用低溫連續(xù)分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉淀廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經(jīng)20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘后經(jīng)澄清濾板(如NA12)深度過濾，濾液返回反應(yīng)罐，調(diào)節(jié)pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.03至0.06，反應(yīng)溫度-5至-7℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后離心得到組分II沉淀；(4)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀。
病毒滅活處理采用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
低pH孵化滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，并用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.10±0.3，然后用除菌濾板(如NA17)過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘余乙醇檢測含量低于0.03％，蛋白含量為5±1％；然后用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經(jīng)除菌過濾后的制品密閉后立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾。
巴氏滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾后再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩(wěn)定劑(如甘氨酸)，然后進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒后的蛋白溶液立即冷卻，用規(guī)格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾。
本發(fā)明提供的用于預防和治療SARS的人SARS免疫球蛋白的制備方法包括以下步驟(1)將抗SARS人血漿于反應(yīng)罐混合攪拌后，調(diào)節(jié)pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.1-0.14，反應(yīng)溫度為-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后用低溫連續(xù)離心法分離，得到組分I+II+III沉淀；(2)用組分I+II+III沉淀重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉淀組分I+II+III沉淀，調(diào)節(jié)pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.01至0.015，反應(yīng)溫度-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，用低溫連續(xù)分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉淀廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經(jīng)20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘后經(jīng)澄清濾板(如NA12)深度過濾，濾液返回反應(yīng)罐，調(diào)節(jié)pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.03至0.06，反應(yīng)溫度-5至-7℃，繼續(xù)攪沉淀，拌2小時后靜置3至12小時，然后離心得到組分II沉淀。
(4)進行病毒滅活處理，可采用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
低pH孵化滅活病毒處理的內(nèi)容及步驟是(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，并用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.10±0.3，然后用除菌濾板(如NA17)過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘余乙醇檢測含量低于0.03％，蛋白含量為5±1％；然后用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經(jīng)除菌過濾后的制品密閉后立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾，從而制得本發(fā)明人SARS免疫球蛋白。
巴氏滅活病毒處理的內(nèi)容及步驟是(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.4±0.3，用除菌濾板(如NA17)過濾后再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩(wěn)定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5-10％，然后進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒后的蛋白溶液立即冷卻，用規(guī)格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾，從而制得本發(fā)明人SARS免疫球蛋白。
制備過程中使用的抗SARS人血漿為SARS病人恢復期的血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人的血漿。
本發(fā)明提供的人SARS免疫球蛋白含有高效價的SARS抗體，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，結(jié)合后SARS抗體的Fc段變構(gòu)，產(chǎn)生中和作用、調(diào)理作用、激活補體系統(tǒng)等生物學活性。此外SARS抗體的Fc段還能與吞噬細胞、NK細胞、B細胞毒性作用(ADCC)、胞飲抗原等，從而使機體立即獲得較強的免疫力，顯著增強機體的體液應(yīng)答，及時有效地清除和殺滅體內(nèi)的冠狀病毒等特異性抗原，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，還可用于高危人群的預防。


圖1為制備本發(fā)明人SARS免疫球蛋白的工藝流程，圖中字母F表示組分。
(2)也可在健康人群中進行SARS抗體篩選，當抗SARS≥8IU/ml即可采集免疫血漿。
(3)在有SARS疫苗的情況下，還可應(yīng)用SARS疫苗免疫健康人后進行SARS抗體篩選和血漿采集。SARS疫苗免疫應(yīng)按國家食品藥品監(jiān)督管理局(SDA)批準的免疫程序進行。SARS疫苗應(yīng)符合相關(guān)質(zhì)控部門頒布的標準。免疫接種方法可采用皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射以及多點小劑量免疫接種等。免疫接種部位包括左側(cè)或右側(cè)上臂、左右雙側(cè)上臂、左右雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)等靠近淋巴結(jié)部位?？筍ARS人血漿效價標準為應(yīng)用SARS抗體酶標試劑盒或其他適宜方法測定SARS抗體效價，當抗SARS效價≥8IU/ml時即可采集免疫血漿。
2、人SARS免疫球蛋白的制備(1)抗SARS原料血漿合并與澄清用75％乙醇洗滌裝有抗SARS人血漿的血漿袋表面，再用注射用水沖洗血漿袋表面的殘余乙醇，逐袋剪開血漿袋，30-37℃融化，融化后用網(wǎng)眼布過濾，再移入反應(yīng)罐。
(2)組分組分I+II+III獲得混合血漿攪拌后大罐計量，調(diào)節(jié)pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.1-0.14，反應(yīng)溫度為-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置8小時，然后用低溫連續(xù)離心法分離，得到組分I+II+III沉淀；(3)組分II上清獲得用組分I+II+III沉淀重量25倍0℃注射用水溶解沉淀組分I+II+III沉淀，調(diào)節(jié)pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.01至0.015，反應(yīng)溫度-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置8小時，用低溫連續(xù)分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉淀廢棄；(4)收獲組分II沉淀每100ml組分I+III上清加入1g經(jīng)20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘后經(jīng)澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應(yīng)罐，調(diào)節(jié)pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.03至0.06，反應(yīng)溫度-5至-7℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置8小時，然后離心得到組分II沉淀。
(5)病毒滅活處理采用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
①低pH孵化滅活病毒處A組分II溶解按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0℃注射用水溶解組分II沉淀，并用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.10±0.3，然后用除菌濾板NA17過濾。
B超濾濃縮濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/4，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘余乙醇檢測含量低于0.03％，蛋白含量為5±1％。
C除菌過濾然后用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾。除菌濾膜規(guī)格0.2μm，組裝順序為預過濾膜NA17板→0.45μm→0.2μm，除菌前后均應(yīng)按所用濾器及濾膜的要求進行完整性測試。
D病毒滅活將經(jīng)除菌過濾后的制品密閉后立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天。
②巴氏滅活病毒處理按所得組分II沉淀重量的3-5倍量的0℃注射用水溶解組分II沉淀，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾后再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩(wěn)定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5-10％，然后進行60℃10小時巴氏滅活，滅活病毒后的蛋白溶液立即冷卻，用規(guī)格為0.2μm濾膜進行除菌過濾，組裝順序為預過濾膜NA17板→0.45μm→0.2μm，除菌前后均應(yīng)按所用濾器及濾膜的要求進行完整性測試。
(6)DV50除病毒過濾將制品經(jīng)已滅菌過的除菌濾器進行預過濾，預過濾膜規(guī)格為0.1μm，預過濾后的制品進行終端過濾(DV50過濾)。過濾前后要對DV50濾器進行膜完整性測試。
(7)第二次超濾將經(jīng)病毒滅活及DV50除病毒過濾后的濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％。
(8)第二次除菌過濾用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾，從而得到用于預防和治療SARS的人SARS免疫球蛋白。
3.制品的分裝和包裝按2000年版《中國生物制品規(guī)程》中的《生物制品分裝規(guī)程》和《生物制品包裝規(guī)程》進行人SARS免疫球蛋白的分裝、包裝成液體制劑，或分裝、凍干、包裝成凍干制劑。
4.本發(fā)明人SARS免疫球蛋白理化指標的檢定
(1)物理檢查外觀本品主要組成成分為人SARS免疫球蛋白，液體制劑為無色或淡黃色的澄明液體。凍干制劑為白色或乳白色疏松體，無融化現(xiàn)象，重融后呈無色或微黃色的澄明液體，可帶乳光。
(2)化學檢定按2000年版《中國生物制品規(guī)程》中的《生物制品化學檢定規(guī)程》進行。
pH值用生理鹽水稀釋至1％蛋白質(zhì)濃度，在20±2℃測定，pH應(yīng)為6.4-7.4。
純度免疫球蛋白的含量應(yīng)不低于蛋白含量的90％。
IgG單體及二聚體含量IgG單體及二聚體含量之和應(yīng)≥90％。
(3)熱穩(wěn)定性試驗人SARS免疫球蛋白的制劑于57±0.5℃水浴保溫4小時，應(yīng)無凝膠或絮狀物。
(4)蛋白質(zhì)含量用鎢酸沉淀法測定，蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于180克/升。
(5)鑒別試驗用免疫雙擴散法。應(yīng)只與抗人的血清產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、抗牛血清不產(chǎn)生沉淀線。
(6)抗SARS效價測定應(yīng)用軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供的SARS抗體酶標試劑盒檢測，效價應(yīng)不低于100IU/ml。
(7)無菌試驗按2000年版《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。
(8)安全試驗按2000年版《人免疫球蛋白的制造及檢定規(guī)程》進行。
(9)熱原質(zhì)試驗按2000年版《生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程》進行。
5.本發(fā)明人SARS免疫球蛋白使用說明(1)成品規(guī)格本品肌肉注射規(guī)格為100IU/瓶，200IU/瓶，包裝規(guī)格為每箱500瓶。
本品靜脈注射規(guī)格為10000IU/瓶，20000IU/瓶，包裝規(guī)格為每箱500瓶。
(2)質(zhì)量標準本品依據(jù)《中國生物制品規(guī)程》2000年版人免疫球蛋白制劑生產(chǎn)和檢定，質(zhì)量符合要求。
(3)適應(yīng)證受SARS病毒感染病人的治療，還可用于高危人群的預防。
(4)用法與劑量通常采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。預防劑量1次皮下或肌內(nèi)注射100～200IU，兒童與成人用量相同，必要時可間隔3-4周再注射一次；治療劑量疑似意外感染者，立即(最多不超過7天)按體重注射8-10IU/kg，以后視病情決定注射劑量與間隔時間。
(5)禁忌過敏體質(zhì)者慎用。
(6)副反應(yīng)及處理過敏反應(yīng)的處理主要癥狀為蕁麻疹、發(fā)熱等，一般系在注射后7-14天發(fā)病，亦有在注射后2-4天發(fā)病。癥狀輕者停藥即可，重者可使用鈣劑或抗組織胺藥物，一般數(shù)日即可痊愈。
(7)注意事項本品有液體及凍干兩種類型。制品混濁，有搖不散的沉淀、異物或瓶身有裂紋，標簽不清，過期失效者均不可使用。制品打開后應(yīng)一次用完。凍干制品應(yīng)加標簽規(guī)定量滅菌注射用水，輕搖使完全溶解。
(8)保存、運輸及使用期限于2～8℃避光干燥處保存和運輸。在盒簽(瓶簽)標明的失效期前使用。
權(quán)利要求
1.一種用于預防和治療SARS的免疫制劑，它是由SARS病人恢復期血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取后經(jīng)病毒滅活處理制備的人SARS免疫球蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預防和治療SARS的免疫制劑，其特征在于所說的經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取包括(1)將抗SARS人血漿于反應(yīng)罐混合攪拌后，調(diào)節(jié)pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.1-0.14，反應(yīng)溫度為-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后用低溫連續(xù)離心法分離，得到組分I+II+III沉淀；(2)用組分I+II+III沉淀重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉淀組分I+II+III沉淀，調(diào)節(jié)pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.01至0.015，反應(yīng)溫度-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，用低溫連續(xù)分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉淀廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經(jīng)20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘后經(jīng)澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應(yīng)罐，調(diào)節(jié)pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.03至0.06，反應(yīng)溫度-5至-7℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后離心得到組分II沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預防和治療SARS的免疫制劑，其特征在于所說的病毒滅活處理是低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于預防和治療SARS的免疫制劑，其特征在于所說的低pH孵化滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，并用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.10±0.3，然后用除菌濾板NA17過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘余乙醇檢測含量低于0.03％，蛋白含量為5±1％；然后用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經(jīng)除菌過濾后的制品密閉后立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)滅活病毒后用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾，再進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于預防和治療SARS的免疫制劑，其特征在于所說的巴氏滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾后再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩(wěn)定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5％-10％，然后進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒后的蛋白溶液立即冷卻，用規(guī)格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
6.制備人SARS免疫球蛋白的方法，包括(1)將抗SARS人血漿于反應(yīng)罐混合攪拌后，調(diào)節(jié)pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.1-0.14，反應(yīng)溫度為-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后用低溫連續(xù)離心法分離，得到組分I+II+III沉淀；(2)用組分I+II+III沉淀重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉淀組分I+II+III沉淀，調(diào)節(jié)pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.01至0.015，反應(yīng)溫度-3至-6℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，用低溫連續(xù)分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉淀廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經(jīng)20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘后經(jīng)澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應(yīng)罐，調(diào)節(jié)pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度至0.03至0.06，反應(yīng)溫度-5至-7℃，繼續(xù)攪拌2小時后靜置3至12小時，然后離心得到組分II沉淀；(4)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，經(jīng)病毒滅活處理制得人SARS免疫球蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備人SARS免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的病毒滅活處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，并用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.10±0.3，然后用除菌濾板NA17過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘余乙醇檢測含量低于0.03％，蛋白含量為5±1％；然后用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經(jīng)除菌過濾后的制品密閉后立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備人SARS免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的病毒滅活處理包括(1)按所得組分II沉淀重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉淀，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾后再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩(wěn)定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5％-10％，然后進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒后的蛋白溶液立即冷卻，用規(guī)格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規(guī)格為0.1μm的濾膜進行預過濾后進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍后濃縮至蛋白質(zhì)含量不超過18％，再用規(guī)格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
全文摘要
一種用于預防和治療SARS的免疫制劑，它是由SARS病人恢復期血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取并經(jīng)病毒滅活處理制備的人SARS免疫球蛋白，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，還可用于高危人群的預防。
文檔編號C07K16/08GK1449833SQ0312811
公開日2003年10月22日 申請日期2003年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月7日
發(fā)明者楊曉明, 鄒漢武, 方志正, 葉巨兵, 李策生 申請人:武漢生物制品研究所