專利名稱：喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備及用于抑制癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)和生物分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
喜樹(Camptocheca acuminata Decaisne)為山茱萸目(Cornales)珙桐科(Nyssaceae)喬木植物，是我國南方特有樹種。在長江以南各省區(qū)廣為分布，具有生長速度快、病蟲害少等特點，是我國南方主要綠化樹種?，F(xiàn)有的大多是栽培樹種，野生資源極其有限。喜樹在一些少數(shù)民族地區(qū)自古以來即為重要藥材，且全株入藥，用于治療惡性疔毒、腫瘤，效果很好。在我國的一些中草藥著作里也有關(guān)于喜樹用于治療惡性腫瘤、腸癰等的記載。
1957年開始，美國國立癌癥治療服務(wù)中心(CCNSC)對農(nóng)業(yè)部(USDA)東北地區(qū)研究實驗室(ERRL)提供的兩千余種植物的乙醇提取物進(jìn)行了抗腫瘤活性分析，其中只有喜樹提取物對CA-755標(biāo)準(zhǔn)分析系統(tǒng)表現(xiàn)出極高的生理活性。隨后進(jìn)行的小鼠L1210白血病生命延長率測定，喜樹提取物仍表現(xiàn)出極高的生理活性。這引起了Monroe E.Wall博士等人的高度興趣。1966年，他們從喜樹提取物中分離得到了這種具有高抗癌活性的生物堿，并將這種生物堿命名為喜樹堿(Camptothecin，CPT)。此后，美國生物化學(xué)家Horwitz博士經(jīng)過幾年實驗研究，提示喜樹堿極其衍生物的抗癌活性機制是對癌細(xì)胞DNA復(fù)制過程中酶的抑制。1985年，美國霍普金斯大學(xué)(Johns Hopkins)的Hsiang發(fā)現(xiàn)喜樹堿是通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I，Topo I)發(fā)揮其抗癌作用，對白血病，胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、直腸癌等有較高療效。
盡管喜樹堿具有很高的抗癌活性，但由于毒性較大在臨床治療中受到了極大的限制。因此，采用化學(xué)修飾的方法篩選活性高、毒性低的喜樹堿衍生物作為抗癌藥物成為目前研究的熱點。此外，由于利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)在很多種藥用植物上都取得了成功，因此利用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法篩選和生產(chǎn)具有低毒高效特點的喜樹衍生物也具有一定的可能性。
我們在進(jìn)行喜樹細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物的乙醇提取液中含有具有較強的抗癌活性物質(zhì)。因此，我們在提高這種抗癌活性物質(zhì)的得率，抗癌活性組分的提取、分離、純化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對其進(jìn)行了體外實驗，為新的抗癌藥物開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備及用于抑制癌細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)，是喜樹正堿和喜樹異堿，分子式均為C16H10N2O3，分子量均為278，喜樹正堿結(jié)構(gòu)式為 喜樹異堿結(jié)構(gòu)式為 喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，是以喜樹的嫩葉為外植體，將在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)的喜樹愈傷組織，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基上，進(jìn)行喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；然后用色譜法分離純化喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)。
愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)是在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，光照10-20小時/天，培養(yǎng)溫度為23-30℃，喜樹愈傷組織每隔25-35天繼代一次。
作為誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的固體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了0.05-05mg/l 2，4-D、0.4-0.8mg/L 6-BA，碳源為蔗糖，20-40g/L，凝固劑為瓊脂7g/L，pH為5.5～6.5。
喜樹細(xì)胞是在120r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，溫度為23～30℃，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)每隔7～14天繼代一次。
進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了0.5～0.05mg/L 2，4-D、0.4～0.8mg/L 6-BA，碳源還是蔗糖，20～50g/L，pH值在5.5～6.5。
喜樹細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)喜樹正堿和喜樹異堿，其培養(yǎng)周期為15～25天。
分離純化喜樹培養(yǎng)細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的步驟是A.抗癌活性物質(zhì)的提取以乙醇為提取液，采用索氏提取，在95℃水浴中，提取喜樹細(xì)胞物內(nèi)的活性物質(zhì)，得到含有抗癌活性物質(zhì)的提取液，B.大孔樹脂柱對提取液的粗分離在已活化大孔樹脂301柱上，使用72％、90％和100％濃度的乙醇依次洗脫喜樹細(xì)胞的提取液，收集其中乙醇濃度為90％的洗脫液，得到含有抗癌新物質(zhì)的粗分離洗脫液，C.C18柱對洗脫液的再分離通過C18填料柱、以乙腈為洗脫液，采用0％、40％、45％、和100％四個濃度的己腈洗脫粗分離液，收集濃度40％的己腈洗脫液，得到含有抗癌活性物質(zhì)含量更高，雜質(zhì)較少的洗脫液，D.高壓液相色譜的精分離高壓液相色譜固定相采用C18反相色譜柱，在高壓液相制備色譜上，以體積比為3∶7的己腈-水為流動相，流速4.5mL/min，檢測波長254nm，定量參數(shù)為保留時間，對C步驟得到的洗脫液進(jìn)行精分離，得到純度在99％以上抗癌活性物質(zhì)的純品。
檢測所得到的純品的抗癌活性的方法，步驟是A.喜樹培養(yǎng)細(xì)胞乙醇活性原液的制備；B.培養(yǎng)Hela細(xì)胞；C.喜樹提取液處理Hela細(xì)胞；D.MTT及酶標(biāo)儀測量，根據(jù)抑制率繪圖，計算LD50；
被處理過的Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法(1)倒置顯微鏡觀察(2)熒光顯微鏡觀察(3)電子顯微鏡觀察實驗結(jié)果表明喜樹細(xì)胞提取液對腫瘤細(xì)胞有抑制作用(1)喜樹細(xì)胞提取液對Hela細(xì)胞有抑制作用，在一定范圍內(nèi)，隨喜樹細(xì)胞提取液的濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用增加。作用24小時，LD50為406.18μg/mL；作用48小時，LD50為319.48μg/mL；作用72小時，LD50為112.84μg/mL。
形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(1)倒置顯微鏡觀察Hela細(xì)胞加入喜樹正堿和喜樹異堿乙醇液后，與對照組相比，細(xì)胞增加減緩，倒置顯微鏡下單位面積的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。(2)熒光顯微鏡觀察Hela細(xì)胞加入喜樹正堿和喜樹異堿乙醇液培養(yǎng)24小時后，與對照組相比，加藥組細(xì)胞明顯變小，細(xì)胞核固縮，碎裂。PI-Hochest33258染色，著色輕且均勻的綠色細(xì)胞為正常細(xì)胞；著色不均勻，顏色較深的綠色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞；紅色細(xì)胞是壞死細(xì)胞或繼發(fā)性壞死細(xì)胞。從實驗結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著喜樹正堿和喜樹異堿乙醇液濃度和作用時間的增加，Hela細(xì)胞凋亡，細(xì)胞數(shù)量增加，壞死細(xì)胞量液增加，但當(dāng)喜樹正堿和喜樹異堿乙醇液濃度降低，作用時間短時，壞死細(xì)胞數(shù)量少，數(shù)量增加速度緩慢。(3)電子顯微鏡觀察加藥組Hela細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、染色質(zhì)固縮，聚集于核膜呈境界分明的塊狀，隨著加藥時間的延長，細(xì)胞變形，染色質(zhì)邊聚更明顯。
本發(fā)明的有益效果是用喜樹的嫩葉為外植體，不影響原植株的繼續(xù)生長。所用的培養(yǎng)基廉價易得，操作過程簡便明了；分離步驟少，分離方法簡單，節(jié)省大量時間和溶劑，能夠得到含量在99％以上喜樹正堿和喜樹異堿純品；抑制癌細(xì)胞效果明顯。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。1、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物抽提物抑制人宮頸內(nèi)膜瘤細(xì)胞株活性實驗1)喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物抽提物制備將喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物磨成細(xì)粉，用95％乙醇為提取液，采用索氏提取，在95℃水浴下，提取喜樹干細(xì)胞粉末內(nèi)的活性物質(zhì)，得到含有兩種抗癌活性物質(zhì)的提取液。在已活化大孔樹脂301柱上，使用72％、90％和100％濃度的乙醇依次洗脫喜樹細(xì)胞的提取液，收集其中乙醇濃度為90％的洗脫液，得到含有兩種抗癌新物質(zhì)的粗分離洗脫液。C18柱對洗脫液的再分離通過C18填料柱、以乙腈為洗脫液，采用0％、40％、45％、和100％四個濃度的己腈洗脫粗分離液，收集濃度40％的己腈洗脫液，得到含有兩種抗癌活性物質(zhì)含量80％以上的洗脫液，將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干，重新溶于95％乙醇中，制成0.58mg/mL原液。2)MTT法(1)細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞采用添加10％小牛血清的含酚紅指示劑的RPMI1640培養(yǎng)基，置于5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。每48小時或培養(yǎng)液變黃表明培養(yǎng)液變酸時換液。當(dāng)貼壁細(xì)胞Hela長滿時，棄液體培養(yǎng)基，用0.25％的胰蛋白酶消化，吹打，收集傳代。(2)喜樹抽提液處理Hela細(xì)胞取對數(shù)生長期的細(xì)胞記數(shù)，以1×105個/mL加到96孔板中，每孔100μL，37℃，5％ CO2孵箱中培養(yǎng)18小時，換液，加入不同濃度提取液，處理不同時間，以僅添加培養(yǎng)液孔作空白對照，每組4復(fù)孔，重復(fù)3次。加入藥物終濃度如下2.25、4.5、9.01、18.125、36.25、72.5、145、290、580μg/mL共9個濃度梯度。(3)加入MTT及酶標(biāo)儀測量Hela細(xì)胞分別用藥物處理24小時、48小時、72小時后，丟棄上清，用1×PBS洗滌2次。酶標(biāo)儀測定吸光值，測定波長為570nm。 根據(jù)抑制率繪圖，計算LD50。3)形態(tài)學(xué)觀察(3)倒置顯微鏡觀察將含有細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板直接置于倒置顯微鏡下觀察，比較誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)，觀察有無凋亡小體的出現(xiàn)，拍照片。
Hela細(xì)胞接種量1×105個/mL，藥物濃度600μg/mL，作用時間分別為0、4、12和24h。
(4)熒光顯微鏡觀察收集細(xì)胞，離心，1×PBS洗2次，0.25％胰酶消化，涂于玻璃片上，4％甲醛固定，加入PI染液(終濃度50μg/mL)，于熒光顯微鏡下觀察。
收集細(xì)胞，離心，1×PBS洗2次，加入Hochest33258(終濃度5μg/mL)及PI(終濃度5μg/mL)，避光染色15min，于熒光顯微鏡下觀察并記數(shù)。
(3)電子顯微鏡觀察接種量1×105個/mL，藥物濃度400μg/mL，作用時間為8h和24h。收集細(xì)胞，置離心管中離心，800～1000r/min，10min。用0.01mol/LPBS5mL重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液吸入裝有瓊脂空槽的離心管中。離心，800～1000r/min，10min。取出離心管內(nèi)的瓊脂，仔細(xì)切下尖槽內(nèi)含細(xì)胞團(tuán)的瓊脂塊。將含有細(xì)胞團(tuán)瓊脂塊放入戊二醛固定液的小瓶中，4℃可長期保存。用0.1mol/LPBS緩沖液洗1次。1％鋨酸固定30～60分鐘。常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋，超薄切片，鈾鉛染色。透射電鏡觀察并拍照。2、喜樹細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)喜樹正堿和喜樹異堿1)喜樹愈傷組織誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的配制用蒸餾水配制MS培養(yǎng)基一升。附加30g/L蔗糖(分析純)，0.15mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.6mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)，7g/L瓊脂，pH值調(diào)到5.8。分裝25個100mL三角培養(yǎng)瓶，加塞后，置于高壓鍋中，121°、15個大氣壓下，滅菌20分鐘。
選取喜樹嫩葉為外植體，先用清水清洗干凈，浸入70％乙醇漂洗30min，取出后用清水沖洗三次，再在滴加了二滴吐溫-80的0.1％次氯酸鈉溶液中浸泡3～5min，無菌水沖洗三至四次(直至無泡沫時為止)。將葉片在無菌條件下剪成約0.8cm×0.8cm大小的小塊，接入配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照16小時/天，培養(yǎng)溫度為25℃。培養(yǎng)8天，就會看到有愈傷組織產(chǎn)生。每隔30天繼代一次(所用繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)。經(jīng)過五次繼代培養(yǎng)，就可以得到疏松易碎，生長狀態(tài)良好，適于懸浮培養(yǎng)的喜樹愈傷組織。2)喜樹細(xì)胞懸浮系建立液體培養(yǎng)基的配制液體培養(yǎng)基的組成與固體培養(yǎng)基組成基本一致，只去除掉瓊脂，將2，4-D濃度改為0.5mg/L。分裝于500mL三角培養(yǎng)瓶中，每瓶200mL培養(yǎng)液，高壓滅菌。
將五次繼代培養(yǎng)以上的疏松易碎、生長旺盛的喜樹愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，每瓶的接種量(鮮重)20克，為培養(yǎng)液重量的10％。于120r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，溫度為25℃。經(jīng)7天培養(yǎng)，用新鮮的液體培養(yǎng)基更換瓶中1/3體積的培養(yǎng)液。以后每隔7天，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)瓶中2/3體積的培養(yǎng)液。更換兩次培養(yǎng)液后，愈傷組織已離散到培養(yǎng)液中分散成單細(xì)胞或小顆粒，并快速生長。經(jīng)過1個月左右即可建成淡黃色、生長旺盛、單細(xì)胞與小細(xì)胞團(tuán)均勻混合的喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系。稱取20g繼代培養(yǎng)10d的喜樹細(xì)胞為“種子”，共20份，分別接入20瓶內(nèi)含200mL液體培養(yǎng)基三角瓶中，上述條件下喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)30d，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，60°烘干至恒重，磨成細(xì)粉，待用。3)喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中抗癌新物質(zhì)含量檢測用高效液相色譜法檢測喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中新組分喜樹正堿和喜樹異堿的含量。色譜條件液相色譜分析采用WATERS高效液相色譜儀，色譜柱YWM-C18(10)200×4.6mm(大連化物所出品)，流動相己睛-水(體積比為3∶7)，流速1mL/min，波長254nm，定量參數(shù)為峰面積。稱3克細(xì)粉，于索氏提取器中用95％乙醇40mL回流提取8小時，乙醇提取液經(jīng)過過濾后直接進(jìn)樣分析。
兩個新物質(zhì)喜樹正堿和喜樹異堿含量用細(xì)胞培養(yǎng)物干重的百分含量來表示。經(jīng)過分析，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中新物質(zhì)含量喜樹正堿為2％，喜樹異堿為0.8％。分子式為C16H10N2O3。喜樹正堿結(jié)構(gòu)式為 喜樹異堿結(jié)構(gòu)式為 3、喜樹正堿和喜樹異堿的分離純化1)喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中新組分的提取稱取80g喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)粉，裝入濾紙筒中，封好，將其放入500mL索氏提取器中，用200mL 95％乙醇、在95℃水浴下回流提取8小時，收集提取液，待用。2)大孔樹脂301柱對提取液的粗分離將用乙醇活化好的產(chǎn)于天津南開大學(xué)化工廠的大孔樹脂301，裝入φ40×800的玻璃柱中，用蒸餾水清洗樹脂柱，將樹脂柱內(nèi)的乙醇置換干凈。將所得到的喜樹細(xì)胞提取液加入蒸餾水，使提取液中乙醇的含量為65％～70％，取60mL倒入處理好的樹脂柱中，以100mL 72％、100mL 90％以及100mL 100％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集90％的乙醇洗脫液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將90％的乙醇洗脫液進(jìn)行濃縮，然后將濃縮后的乙醇液50mL用孔徑為0.25μm濾膜過濾，超純水稀釋至五倍，待用。3)C18柱對洗脫液的進(jìn)一步分離50mL酸式漏斗通過橡皮塞密封于瓶上，瓶上的另一接口通過膠管接在真空泵上。在50mL酸式漏斗中加入20mL C18填料，填料表面加蓋濾紙。在酸式漏斗中先后加入40mL水、40mL 40％乙腈、40mL 100％乙腈將柱中的C18活化，然后將過濾好的樣品液5mL倒入柱中，用真空泵在真空度為0.1下進(jìn)行抽濾，待抽干后，倒入超純水40mL，收集洗脫液于A瓶中、倒入40％乙腈40mL，收集洗脫液于B瓶中、倒入45％己睛40mL、收集洗脫液于C瓶中、最后倒入100％乙腈60mL，收集洗脫液于D瓶中。然后再上樣，重復(fù)操作，直至完成所有樣品的分離。將收集到的A、B、C、D瓶中的液體濃縮蒸干后，再重新溶于乙醇溶液中。得到細(xì)分后的A液、B液、C液、D液進(jìn)行抗癌活性實驗，得知活性組分存在于C中。將C樣重新溶于100％乙醇溶液中，待分。4)高效液相色譜的精分離高效液相色譜制備與分析采用Waters高效液相色譜儀，大連化物所出品的制備色譜柱YWM-C18(10)200×10mm，流動相體積比為3∶7的乙腈-水，流速4.5mL/min，紫外檢測波長為254nm，上樣量為90μL。分別收集保留時間為36.56min和42.33min兩個色譜峰組分，濃縮干燥后，得到兩個淡黃色的純品。經(jīng)色譜和質(zhì)譜檢測，兩種組分含量在99％以上。通過光譜分析鑒定，確定兩種新物質(zhì)的分子式為C16H10N2O2；結(jié)構(gòu)式分別為 和 分子量同為278。我們將其命名為喜樹正堿和喜樹異堿。
權(quán)利要求
1.喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，以喜樹的嫩葉為外植體，將在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生、并繼代培養(yǎng)5次以上的喜樹愈傷組織，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；為了獲得喜樹培養(yǎng)細(xì)胞中的抗癌活性物質(zhì)，首先選用大孔樹脂301對喜樹細(xì)胞的提取液進(jìn)行柱層析，得到活性物質(zhì)含量較高洗脫液，然后通過C18柱對所獲得的洗脫液分離純化，最后用高壓液相色譜獲得喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)是在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，光照10～20小時/天，培養(yǎng)溫度為23～30℃，喜樹愈傷組織每隔25～35天繼代一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，作為誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)喜樹愈傷組織的固體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了0.05～05mg/l 2，4-D、0.4～0.8mg/l 6-BA，碳源為蔗糖，20～40g/l，凝固劑為瓊脂7g/l，pH為5.5～6.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，喜樹細(xì)胞是在120r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，溫度為23～30℃，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)每隔7～14天繼代一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中附加了0.5～0.05mg/l 2，4-D、0.4～0.8mg/l 6-BA，碳源還是蔗糖，20～50g/l，pH值為5.5～6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，喜樹細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)喜樹正堿和喜樹異堿，其培養(yǎng)周期為25～35天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于，分離純化喜樹培養(yǎng)細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的步驟是A.喜樹培養(yǎng)細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的提取以乙醇為提取液，采用索氏提取，在95℃水浴下，提取喜樹細(xì)胞粉末內(nèi)的活性物質(zhì)，得到含有抗癌活性物質(zhì)的提取液，B.大孔樹脂柱對提取液的粗分離在已活化大孔樹脂301柱上，使用72％、90％和100％濃度的乙醇依次洗脫喜樹細(xì)胞的提取液，收集其中乙醇濃度為90％的洗脫液，得到含有抗癌新物質(zhì)的粗分離洗脫液，C.C18柱對洗脫液的再分離通過C18填料柱、以乙腈為洗脫液，采用0％、40％、45％、和100％四個濃度的己腈洗脫粗分離液，收集濃度45％的己腈洗脫液，得到含有抗癌活性物質(zhì)含量80％以上的洗脫液，D.高壓液相色譜的精分離高壓液相色譜固定相采用C18反相色譜柱，在高壓液相制備色譜上，以體積比為3∶7的己腈-水為流動相，流速4.5ml/min，檢測波長254nm，定量參數(shù)為保留時間，對C步驟得到的洗脫液進(jìn)行精分離，得到含量在99％以上抗癌活性物質(zhì)的純品。
8.用權(quán)利要求1、7所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備方法制備的抗癌活性物質(zhì)抑制癌細(xì)胞的方法，其特征在于，A.喜樹細(xì)胞乙醇活性原液的制備將抗癌活性物質(zhì)的純品重新溶于95％乙醇中，制成0.58mg/mL原液，B.細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞采用添加10％小牛血清的含酚紅指示劑的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)；每48小時或培養(yǎng)液變黃表明pH值變酸時換液；當(dāng)貼壁細(xì)胞Hela長滿時，棄液體培養(yǎng)基，用0.25％的胰蛋白酶消化，吹打，收集傳代，C.接種與喜樹提取液處理細(xì)胞取對數(shù)生長期的細(xì)胞記數(shù)，以1×105個/mL加到96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)18小時，換液，加入不同濃度提取液，處理Hela細(xì)胞不同時間，以僅添加培養(yǎng)液孔作空白對照，每組4復(fù)孔，重復(fù)3次；加入藥物終濃度如下2.25、4.5、9.01、18.125、36.25、72.5、145、290、580μg/mL，共9個濃度梯度，D.MTT及酶標(biāo)儀測定Hela細(xì)胞分別用藥物處理24～72小時后，棄上清，用1×PBS洗滌2次；HLF細(xì)胞用藥物處理24小時后，加90μL無酚紅培養(yǎng)基及10μLMTT溶液(1×PBS配制，0.22μm微孔濾膜過濾，終濃度5mg/mL)，37℃孵育4小時，丟棄上清，加入含0.04MHCL的異丙醇100μL輕輕振蕩，酶標(biāo)儀測定吸光值，測定波長為570nm， 根據(jù)抑制率繪圖，計算LD50，結(jié)果表明喜樹細(xì)胞提取液對Hela細(xì)胞有抑制作用Hela細(xì)胞24h、48h、72h的LD50分別為406.18μg/mL、319.48μg/mL、112.84μg/mL。
9.權(quán)利要求1、8所述的喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)，其特征在于，是喜樹正堿和喜樹異堿，喜樹正堿結(jié)構(gòu)式為 喜樹異堿結(jié)構(gòu)式為 分子式均為C16H10N2O3，分子量均為278。
全文摘要
喜樹細(xì)胞中抗癌活性物質(zhì)的制備及用于抑制癌細(xì)胞的方法屬于植物生物技術(shù)和生物分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用喜樹嫩葉在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，獲得喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物；用喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物提出液處理人宮頸內(nèi)膜瘤細(xì)胞株細(xì)胞24小時后，MTT法測定細(xì)胞存活率變化，結(jié)果表明，喜樹細(xì)胞提出物對腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。通過粗分離和精致，從喜樹細(xì)胞培養(yǎng)物中純化得到兩個抗癌活性新物質(zhì)喜樹正堿和喜樹異堿純品。本發(fā)明的優(yōu)點是抗癌新物質(zhì)喜樹正堿和喜樹異堿，其含量分別達(dá)到了2％和0.8％的水平。本發(fā)明的優(yōu)點是所得到的新化合物喜樹正堿和喜樹異堿有抗癌活性，且含量高，有很好的發(fā)展前景。
文檔編號C07D471/00GK1462749SQ03133489
公開日2003年12月24日 申請日期2003年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月21日
發(fā)明者安利佳, 張冬艷, 白鳳武, 包永明, 于放, 關(guān)水 申請人:大連理工大學(xué)