專利名稱：治療阿爾茨海默氏癥的協(xié)同前體藥物化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阿爾茨海默氏癥協(xié)同前體藥物化合物及其制備方法，也涉及含有所述化合物的藥物組合物以及所述化合物在制備治療阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)，所述化合物是由煙酸和美曲膦酯經(jīng)酯鍵偶聯(lián)形成的，即(1-二甲基磷?；?2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯(NMF)。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease，簡(jiǎn)稱AD)為老年癡呆癥的主要類型，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，伴隨有性格改變及行為障礙。65歲左右老年人中發(fā)病率為10％，85歲以上老年人中發(fā)病率為50％。我國(guó)目前60歲以上的老年人已達(dá)1.3億，AD患者在1300萬(wàn)左右，且數(shù)量隨老齡化趨勢(shì)不斷上升，而可供臨床使用的治療藥物的類別、數(shù)量較少，療效亦不甚理想。隨著計(jì)劃生育政策的逐步貫徹落實(shí)，一對(duì)中年夫婦家庭將有四個(gè)老人需要照顧及贍養(yǎng)；而AD患者較其他老年性疾病更需要?jiǎng)e人的看護(hù)和照顧，這對(duì)家庭和社會(huì)的巨大的壓力是顯而易見(jiàn)的。
由于阿爾茨海默氏癥(AD)的病因及病理機(jī)制尚不完全清楚且相當(dāng)復(fù)雜，因而可著手研究的角度及治療方案較多，其中Metrifonate(美曲膦酯)是由Bayer公司開(kāi)發(fā)的一個(gè)原本較有前途的AChE抑制劑。該藥作為抗血吸蟲及鉤蟲藥已有三十多年的歷史，副作用輕微、耐受性好，一直被列為WHO的基本藥物(essential drug)，其作為阿爾茨海默氏癥治療藥申請(qǐng)上市屬老藥增加新的適應(yīng)癥。該藥本已完成III期臨床試驗(yàn)，顯示其對(duì)患者的認(rèn)知功能和行為障礙均有改善，并已向美國(guó)FDA及歐盟EMEAD提交上市申請(qǐng)，但由于在1998年的后續(xù)III期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)服用本品的3000例患者中有20多例發(fā)生肌肉虛弱，雖然Bayer公司隨后找到了原因及解決辦法，但美國(guó)仍未給予批準(zhǔn)。
研究表明煙酸缺乏是老年性癡呆臨床常見(jiàn)的因素之一。煙酸是維生素B族中最穩(wěn)定的維生素，在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為煙酰胺，然后成為輔酶I與輔酶II的組成部分，參與體內(nèi)葡萄糖的酵解、脂類代謝、丙酮酸代謝、戊糖合成以及高能磷酸鍵的形成等，具有廣泛的生理活性，如擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血脂等作用。長(zhǎng)期應(yīng)用煙酸能減少冠心病、心肌梗死及其他心腦血管疾病的發(fā)生率或死亡率，但由于煙酸所需要的治療劑量較大(3-6g/天)，且易產(chǎn)生面部潮紅、瘙癢、誘發(fā)潰瘍病、加重糖尿病及痛風(fēng)等副作用，限制了其臨床應(yīng)用。
為了增強(qiáng)藥物的活性，減少毒副作用，在采用前體藥物設(shè)計(jì)原理和結(jié)構(gòu)拼合原理的基礎(chǔ)上，我們合成了(1-二甲基磷?；?2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯(NMF)，它包含了兩個(gè)母體藥物美曲膦脂和煙酸的全部化學(xué)結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)可被酶水解為兩個(gè)獨(dú)立的母體藥物，協(xié)同發(fā)揮藥理效應(yīng)，從而成為一種協(xié)同前藥(Mutual Prodrug)，發(fā)揮雙重、協(xié)同的藥理作用并達(dá)到長(zhǎng)效、緩釋且降低毒性的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種下式I所示的治療阿爾茨海默氏癥的藥物化合物或其鹽 本發(fā)明化合物的分子式C10H10Cl3NO5P＝362.5本發(fā)明化合物的理化性質(zhì)MP 88.4-88.8℃；不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、稀酸。
顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明化合物中存在有手征性碳原子，因此，具有光學(xué)異構(gòu)體。消旋體和光學(xué)異構(gòu)體均包含在本發(fā)明的范圍之中。本發(fā)明的化合物可以是無(wú)定型粉末或者是晶體形式。
本發(fā)明所述鹽是式I化合物的無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽，例如包括但不限于鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、檸檬酸鹽等。優(yōu)選為鹽酸鹽、硫酸鹽或檸檬酸鹽。
本發(fā)明的另一目的是提供所述化合物或其鹽的合成方法。本發(fā)明的合成方法是多種多樣的。一般來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域中能夠?qū)Ⅳ然土u基酯化的方法均可用于本發(fā)明化合物的合成。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是通過(guò)將煙酸中的羧基與美曲膦酯中的羥基進(jìn)行酯化而進(jìn)行的。酯化方法包括但不限于酰氯法、活性酯的方法或者混合酸酐法。合成方案例舉如下合成方案1酰氯法 合成方案2、3活性酯的方法 合成方案4混合酸酐法 本發(fā)明化合物的鹽通常是由本發(fā)明化合物中的堿性氮與酸發(fā)生成鹽反應(yīng)得到的。所述酸通?？梢允蔷哂兴嵝缘娜魏挝镔|(zhì)。例如包括但不限于無(wú)機(jī)酸如鹽酸、硝酸、硫酸、氫溴酸、磷酸等，有機(jī)酸如甲酸、乙酸、苯甲酸、蘋果酸、馬來(lái)酸、檸檬酸等。
本發(fā)明的化合物或其鹽還可以與二氫吡啶或其他藥物分子或酶底物等通過(guò)化學(xué)鍵偶聯(lián)組成靶向藥物，如腦靶向藥物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是一種治療阿爾茨海默氏癥的藥物組合物，其中含有治療有效量的本發(fā)明式I化合物或其鹽和可藥用載體。所述的可藥用載體是對(duì)本發(fā)明化合物或其鹽不產(chǎn)生不利影響的在藥物領(lǐng)域可以使用的任何賦型劑、稀釋劑或添加劑?？梢愿鶕?jù)所期望的給藥途徑而制備的具體劑型來(lái)選擇使用的載體。本發(fā)明的化合物或其鹽可以通過(guò)口服或非胃腸道給藥。非胃腸道給藥可包括注射、吸入、透皮或直腸給藥。所述藥物組合物的劑型包括但不限于片劑、膠囊、懸浮劑、溶液劑、脂質(zhì)體、微球或者栓劑等。所述載體可例舉的是黏合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、等滲劑、表面活性劑、防腐劑、甜味劑、香味劑、著色劑等，例如淀粉、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、磷脂、膽固醇、玉米油等。本發(fā)明化合物或其鹽在組合物中的含量可以在很大的范圍內(nèi)變化，只要能夠達(dá)到治療的目的并便于藥物制劑的制備和患者的使用。例如，按組合物的重量計(jì)算，含有0.1-99.9％的本發(fā)明化合物或其鹽。優(yōu)選1-99％。另外，本發(fā)明的組合物還可以含有其他可以與本發(fā)明化合物或其鹽聯(lián)合給藥的其他活性成分，例如有利于阿爾茨海默氏癥治療的活性成分如AChE抑制劑。特別需要指出的是，煙酸和美曲膦酯的物理組合產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的也是完全可以的，也應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩個(gè)組分之間的配比的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是顯而易見(jiàn)的，例如，按重量計(jì)算，煙酸和美曲膦酯配比為1∶20-20∶1。所述的物理組合產(chǎn)品可以是組合配制在一起的藥物制劑或者是分別配制但包裝在一起的藥盒。
本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)常規(guī)方法來(lái)制備，例如將組合物的各組分進(jìn)行混合，或者按照本領(lǐng)域常規(guī)方法按一定順序混合來(lái)制備。如在制備片劑時(shí)，可以將活性組分與黏合劑混合制粒，加入崩解劑和潤(rùn)滑劑并壓制成片。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供式I化合物或其鹽或者煙酸和美曲膦酯的物理組合產(chǎn)品在制備治療阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。正如本說(shuō)明書中所證實(shí)的那樣，本發(fā)明的化合物或其鹽具有良好的治療阿爾茨海默氏癥的作用。給藥途徑是多種多樣的，如口服、注射、吸入等。給藥劑量可以在很大的范圍內(nèi)變化，這取決于給藥的途徑、患者的身體狀況、年齡、性別等。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明化合物或其鹽的給藥劑量為0.1-100mg/天，kg體重，優(yōu)選1-50mg/天，kg體重，更優(yōu)選10-30mg/天，kg體重。
體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NMF可顯著促進(jìn)原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經(jīng)元活性，增加神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量，且對(duì)抗興奮性氨基酸海人藻酸所致神經(jīng)損傷。體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，NMF能夠顯著改善東莨菪堿所致記憶認(rèn)知障礙大、小鼠的認(rèn)知能力，藥效強(qiáng)于美曲膦酯；NMF可明顯改善D-半乳糖所致衰老小鼠的若干衰老指標(biāo)，使之恢復(fù)至接近正常水平或不再向衰老方向發(fā)展。綜上所述，NMF可應(yīng)用于治療阿爾茨海默氏癥，藥效強(qiáng)于美曲膦脂，且毒副作用小。
具體實(shí)施方案簡(jiǎn)寫注釋NMF(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯DCC二環(huán)己基碳二亞胺
DMFN，N’-二甲基甲酰胺TEA三乙胺CDI1，1’-羰基二咪唑DMAP4-二甲氨基吡啶AD阿爾茨海默氏癥實(shí)施例1酰氯法制備(1-二甲基磷?；?2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯(NMF)在干燥無(wú)水條件下，裝好干燥裝置及氣體吸收裝置，將8mL氯化亞砜加入反應(yīng)瓶中，用冰水浴冷卻到0℃左右，攪拌，向其中加入0.8g(6.5mmol)煙酸，并滴入5-7滴無(wú)水DMF，油浴緩慢升溫至77℃左右回流，3h后減壓蒸除過(guò)量氯化亞砜，得煙酰氯鹽酸鹽(淺黃色固體)。冰鹽浴下向干燥的反應(yīng)瓶中加入適量無(wú)水二氯甲烷，強(qiáng)烈攪拌，先后滴加10mL無(wú)水TEA和1.7g(6.6mmol)美曲膦酯的20mL二氯甲烷溶液，反應(yīng)3h，濾過(guò)，濾液減壓濃縮后加入適量乙酸乙酯，依次用水、0.1N HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗3次，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，快速柱層析(硅膠H，洗滌液石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯1.2g(淺黃色固體)，石油醚-丙酮混合溶劑重結(jié)晶得無(wú)色塊狀晶體。產(chǎn)率51.0％。
實(shí)施例2DCC/DMAP法(活性酯的方法)制備NMF2.46g(0.02mol)煙酸和5.15g(0.02mol)美曲膦酯室溫下溶于干燥的120mL DMF中，加入0.30g(0.002mol)DMAP，攪拌均勻。于0-5℃滴加6.19g(0.03mol)DCC的50mL DMF溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，過(guò)濾，減壓濃縮，加入適量乙酸乙酯，過(guò)濾，依次用水、0.1N HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗3次，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，快速柱層析(硅膠H，洗滌液石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯4.70g(淺黃色固體)，石油醚-丙酮混合溶劑重結(jié)晶得無(wú)色塊狀晶體。產(chǎn)率65.0％。
實(shí)施例3CDI/DMAP法(活性酯的方法)制備NMF0.62g(5mmol)煙酸溶于干燥的25mL DMF溶液中，快速加入0.81g(0.002mol)CDI和0.08g(0.5mmol)DMAP，于0-5℃攪拌反應(yīng)1h。滴加1.29g(5mmol)美曲膦酯的25mL DMF溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，減壓濃縮，加入適量乙酸乙酯，過(guò)濾，依次用水、0.1N HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗3次，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，快速柱層析(硅膠H，洗滌液石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷?；?2，2，2-三氯)-乙基-1-醇煙酸酯1.26g(淺黃色固體)，石油醚-丙酮混合溶劑重結(jié)晶得無(wú)色塊狀晶體。產(chǎn)率70.0％。
實(shí)施例4混合酸酐法制備NMF冰鹽浴下將1.0g(8.12mmol)煙酸、適量二氯甲烷和TEA依次加入反應(yīng)瓶，緩慢滴加1.1mL(8.59mmol)無(wú)水苯磺酰氯，保持0℃攪拌反應(yīng)1h。緩慢滴加2.50g(9.71mmol)美曲膦酯溶于適量二氯甲烷和TEA的混合溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，減壓濃縮，加入適量乙酸乙酯，過(guò)濾，依次用水、0.1N HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗3次，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，快速柱層析(硅膠H，洗滌液石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷?；?2，2，2-三氯)乙基-1-醇煙酸酯2.2g(淺黃色固體)，石油醚-丙酮混合溶劑重結(jié)晶得無(wú)色塊狀晶體。產(chǎn)率74.4％。IR(KBr，v)3081，1745，1267，1049；1HNMR(CDCl3，δ)9.31(s，1H，PyC2-H)，8.84(d，1H，PyC6-H)，8.38(d，1H，PyC4-H)，7.46(t，1H，PyC5-H)，6.12(d，1H，CH)，3.85(q，6H，OCH3)；EI-MS(m/z)362(M+).純度99.0％(HPLC測(cè)定)。
實(shí)施例5NMF對(duì)體外培養(yǎng)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性的影響取懷孕15天的正常昆明小鼠，引頸脫臼處死，以碘酒和75％酒精消毒，在無(wú)菌條件下分層解剖，取出胚胎小鼠，置于冰浴的解離液D1-SGH(D1為無(wú)鈣離子的PUCK液，SGH為蔗糖-葡萄糖溶液和HEPES緩沖液)。體視顯微鏡下解剖分離出胎鼠大腦皮層，剔除血管和被膜，粗略剪成1mm3碎塊，用80mg/L Dnasel作用10min，然后用火焰刨光的細(xì)口徑滴管輕柔吹打組織團(tuán)塊，使其充分分散，靜置后吸取上層細(xì)胞懸液。離心后用含血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DF12)將細(xì)胞密度調(diào)至為1.0×106個(gè)/mL，接種于預(yù)先包被PLL的96孔板中，每孔100μL，于37℃，5％的CO2孵育箱中培養(yǎng)。神經(jīng)細(xì)胞接種后的第3天，每孔加入50μL不同濃度的NMF的DF12液(終濃度依次為10μmol L-1，1μmol L-1，0.1μmol L-1，10nmol L-1，1nmol L-1，0.1nmol L-1)，對(duì)照組加入等體積的DF12。繼續(xù)培養(yǎng)3天，每孔加入MTT(Sigma)15μL(1.5g L-1)，37℃孵育4h，鏡下觀察紫色針狀結(jié)晶，小心棄去上清，每孔加入DMSO 100μL，室溫下放置10min，待鏡下紫色結(jié)晶全部溶解后，以Dynatech MR400EL ISA讀數(shù)儀測(cè)定MTT光吸收值，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。同法NMF分別與母體藥物煙酸、美曲膦酯對(duì)比。結(jié)果均經(jīng)SPSS 10.0軟件One-wayANOVA(單因素方差分析)檢驗(yàn)。與對(duì)照組相比，各劑量組的NMF均能顯著促進(jìn)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性，其中1μmol L-1，0.1μmol L-1，10nmol L-1的NMF促進(jìn)活性增殖率分別高達(dá)34.7％、37.4％、36.7％(見(jiàn)表1)。相反，美曲膦酯抑制正常小鼠皮層神經(jīng)元活性(見(jiàn)表2)，而煙酸則對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性無(wú)影響(見(jiàn)表3)。以上結(jié)果提示NMF能顯著促進(jìn)正常是皮層神經(jīng)元活性。
表1 NMF對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05 vs對(duì)照，**P＜0.01 vs對(duì)照，***P＜0.001vs對(duì)照表2 美曲膦酯對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性的影響(n＝6，x±s)


***P＜0.001vs對(duì)照表3 煙酸對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元活性的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs對(duì)照實(shí)施例6NMF對(duì)體外培養(yǎng)正常胎鼠皮層神經(jīng)元存活率的影響正常胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法同實(shí)施例5，含血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DF12)將細(xì)胞密度調(diào)至為4.0×104/cm2，接種于預(yù)先包被PLL的24板中，每孔0.5mL，于37℃，5％的CO2孵育箱中培養(yǎng)。神經(jīng)細(xì)胞接種后的第2天，每孔加入阿糖胞苷的DF12液(終濃度為10μmol L-1)作用24h，以抑制非神經(jīng)元的過(guò)度增殖。第3天每孔加入50μL不同濃度的NMF的DF12液(終濃度依次為0.1μmol L-1、10nmol L-1、1n mol L-1)，對(duì)照組加入等體積的DF12。每天換液1次，藥物作用濃度同上。培養(yǎng)至第7天，吸出各孔的培養(yǎng)液，加入臺(tái)盼蘭，相差顯微鏡下進(jìn)行存活神經(jīng)元計(jì)數(shù)，每孔計(jì)5個(gè)視野，共計(jì)6孔。結(jié)果均經(jīng)SPSS 10.0軟件One-way ANOVA(單因素方差分析)檢驗(yàn)。NMF能顯著促進(jìn)正常胎鼠皮層神經(jīng)元存活，與對(duì)照組相比，10n mol L-1、1n mol L-1的NMF對(duì)皮層神經(jīng)元的存活率分別提高39.3％、73.5％(見(jiàn)表4)。以上結(jié)果提示NMF能著促進(jìn)正常胎鼠皮層神經(jīng)元存活，明顯降低細(xì)胞死亡率。
表4 NMF對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元存活率的影響(n＝6，x±s)

***P＜0.001vs對(duì)照實(shí)施例7NMF對(duì)海人藻酸所致神經(jīng)毒性的皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用正常胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法和NMF加藥方法同實(shí)施例6，皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，吸出各孔的培養(yǎng)液，用D1-SGH液洗2次，加入海人藻酸的D1-SGH液(終濃度為50μmol L-1)。處理30min后用無(wú)海人藻酸的D1-SGH液洗3次，再用DF12培養(yǎng)液洗1次，于每孔加入DF12培養(yǎng)液0.5mL。正常對(duì)照組除不加海人藻酸外，處理?xiàng)l件完全同實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)18-24h，加入臺(tái)盼蘭染色，相差顯微鏡下進(jìn)行存活神經(jīng)元計(jì)數(shù)，每孔計(jì)5個(gè)視野，共計(jì)6孔。結(jié)果均經(jīng)SPSS 10.0軟件One-way ANOVA(單因素方差分析)檢驗(yàn)。相差顯微鏡下觀察，與正常對(duì)照組相比，海人藻酸組的細(xì)胞折光度下降，顆粒增加，陸續(xù)出現(xiàn)漂浮的呈折光性的死細(xì)胞，交織成網(wǎng)狀的神經(jīng)細(xì)胞其突起漸漸成斷線狀，死亡率也明顯升高，表明50μmol L-1海人藻酸對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。NMF能顯著對(duì)抗海人藻酸所致的神經(jīng)損傷，與海人藻酸組相比，0.1μmol L-1、10n mol L-1、1n mol L-1的NMF對(duì)損傷皮層神經(jīng)元的保護(hù)率分別為77.30％、80.10％、84.15％(見(jiàn)表5)。
表5 NMF對(duì)正常胎鼠皮層神經(jīng)元存活率的影響(n＝6，x±s)

***P＜0.001vs海人藻酸；###P＜0.001vs正常對(duì)照組。
實(shí)施例8NMF對(duì)東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用昆明種小鼠雌雄各半，每天訓(xùn)練前20min，除正常組腹腔注射生理鹽水和模型組腹腔注射3mg kg-1氫溴酸東莨菪堿以外，其余各組小鼠腹腔注射3mg kg-1氫溴酸東莨菪堿的同時(shí)，腹腔分別注射NMF(2.8mg kg-1、14.1mg·kg-1、70.3mg kg-1)及美曲膦酯50mg kg-1。每只小鼠每天使用MORRIS水迷宮自動(dòng)記錄儀(由北京杰日歐科技有限公司提供)進(jìn)行定位航行訓(xùn)練兩次，連續(xù)6天，第7天進(jìn)行空間探索測(cè)試。第8天斷頭取腦，稱重后按照乙酰膽堿酶試劑盒的說(shuō)明書測(cè)定乙酰膽堿酶活性，蛋白定量以考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行。結(jié)果均經(jīng)SPSS10.0軟件General linear model的Repeated measure進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，其中小鼠6天訓(xùn)練總平均成績(jī)用One-way ANOVA(單因素方差分析)檢驗(yàn)。
如表6所示，與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組具有延長(zhǎng)小鼠定位航行潛伏期的趨勢(shì)，且游泳軌跡以盲目的隨機(jī)螺旋狀為主，說(shuō)明東莨菪堿導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組比較，70.3mg kg-1NMF能顯著縮短?hào)|莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的平均潛伏期，且尋找策略目的性明顯增強(qiáng)，趨向式和直線式比例增加；而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，說(shuō)明NMF能顯著改善東莨菪堿所致小鼠定位航行障礙，且效能高于美曲膦酯。
表6 NMF對(duì)東莨菪堿所致小鼠定位航行潛伏期的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組，**P＜0.001vs模型組如表7所示，與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組的記憶頻度具有下降趨勢(shì)，說(shuō)明東莨菪堿導(dǎo)致小鼠空間探索能力障礙。與模型組相比，70.3mg kg-1NMF能顯著提高東莨菪堿所致記憶障礙小鼠的記憶頻度，而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，此外，NMF對(duì)小鼠記憶得分率無(wú)明顯影響。以上結(jié)果提示說(shuō)明NMF能顯著改善東莨菪堿所致小鼠定位探索障礙，且效能高于美曲膦酯。
表7 NMF對(duì)東莨菪堿所致小鼠空間探索記憶頻度和記憶得分率的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組如表8所示，與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組能夠顯著引起大腦萎縮。與模型組比較，70.3mg kg-1NMF組能夠顯著增加腦系數(shù)；而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，說(shuō)明NMF能顯著對(duì)抗東莨菪堿所致小鼠大腦萎縮，且效能高于美曲膦酯。與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組能夠顯著增加乙酰膽堿酯酶的活性，引起記憶障礙。與模型組比較，70.3mg kg-1NMF組能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，較等摩爾濃度的美曲膦酯抑制乙酰膽堿酯酶的程度大，對(duì)改善記憶是有益的表8 NMF對(duì)東莨菪堿所致小鼠腦系數(shù)的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組實(shí)施例9NMF(腹腔注射)對(duì)東莨菪堿所致SD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用SD大鼠雌雄各半，實(shí)驗(yàn)方法和給藥劑量、方法同實(shí)施例8。由表9所示，與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組顯著延長(zhǎng)大鼠定位航行潛伏期，且游泳軌跡以盲目的隨機(jī)邊緣式為主，說(shuō)明東莨菪堿損傷了大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。與模型組比較，2.8mg kg-1NMF能顯著縮短?hào)|莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的平均潛伏期，且尋找策略目的性明顯增強(qiáng)，趨向式和直線式比例增加；而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，說(shuō)明NMF能顯著改善東莨菪堿所致大鼠定位航行障礙，且效能大大高于美曲膦酯。
表9 NMF對(duì)東莨菪堿所致大鼠定位航行潛伏期的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組，***P＜0.001vs模型組如表10所示，與正常組比較，3mg kg-1東莨菪堿模型組的記憶分率具有下降趨勢(shì)，說(shuō)明東莨菪堿對(duì)小鼠空間探索能力形成了損傷。與模型組相比，14.1mg kg-1NMF能夠顯著提高大鼠的記憶得分率，說(shuō)明煙美曲能顯著改善東莨菪堿所致大鼠定位探索障礙，且效能大大高于美曲膦酯。
表10 NMF對(duì)東莨菪堿所致大鼠空間探索記憶得分率的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.01vs模型組，***P＜0.001vs模型組實(shí)施例10NMF(灌胃)對(duì)東莨菪堿所致SD雌性大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用實(shí)驗(yàn)方法和給藥劑量同實(shí)施例8。給藥方法為灌胃。由表11所示，與模型組比較，14.1、70.3mg kg-1NMF均能顯著縮短?hào)|莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙SD雌性大鼠的平均潛伏期，尋找策略目的性明顯增強(qiáng)，趨向式和直線式比例增加；而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，說(shuō)明NMF能顯著改善東莨菪堿所致SD雌雄大鼠定位航行障礙，且效能大大高于美曲膦酯。
表11 NMF對(duì)東莨菪堿所致SD雌性大鼠定位航行潛伏期的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組，**P＜0.01vs模型組，***P＜0.001vs模型組如表12所示，與模型組相比，NMF有提高SD雌性大鼠記憶得分率的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效能高于美曲膦酯。
表12 NMF對(duì)東莨菪堿所致SD雌性大鼠空間探索記憶得分率的影響(n＝8，x±s)


*P＜0.01vs模型組實(shí)施例11NMF(灌胃)對(duì)東莨菪堿所致SD雄性大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用除模型組和給藥組腹腔注射7mg kg-1氫溴酸東莨菪堿以外，其余實(shí)驗(yàn)方法和給藥劑量同實(shí)施例8。給藥方法為灌胃。由表13所示，與模型組比較，70.3mg kg-1NMF能顯著縮短?hào)|莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙SD雄性大鼠的平均潛伏期，尋找策略目的性明顯增強(qiáng)，趨向式和直線式比例增加；而等摩爾濃度的美曲膦酯則效果不明顯，說(shuō)明NMF能顯著改善東莨菪堿所致SD雄性大鼠定位航行障礙，且效能大大高于美曲膦酯。
表13 NMF對(duì)東莨菪堿所致SD雄性大鼠定位航行潛伏期的影響(n＝10，x±s)

*P＜0.05vs模型組，***P＜0.001vs模型組如表14所示，與模型組相比，70.3mg·kg-1NMF有提高SD雄性大鼠記憶得分率的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效能高于美曲膦酯。
表14 NMF對(duì)東莨菪堿所致SD雄性大鼠空間探索記憶得分率的影響(n＝8，x±s)

*P＜0.01vs模型組實(shí)施例12NMF對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠衰老指標(biāo)的影響昆明種小鼠，雌雄各半，每天分別灌胃NMF(2.8mg kg-1、14.1mg kg-1、70.3mg kg-1)，舒血寧100mg kg-1，同時(shí)各鼠每天腹腔注射D-半乳糖80mg kg-1。連續(xù)給藥造模42天后，分別檢測(cè)相關(guān)衰老指標(biāo)。結(jié)果采用SPSS 10.0軟件General linear model的Repeated measure進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析和One-way ANOVA(單因素方差分析)統(tǒng)計(jì)處理。
如表15所示，NMF有顯著縮短D-半乳糖所致衰老小鼠達(dá)岸潛伏期的趨勢(shì)(表15)，與舒血寧相似。
表15 NMF對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠定位航行潛伏期的影響(n＝10，x±s)


如表16所示，與正常生理鹽水組比較，模型組衰老小鼠的體重明顯較輕，且毛稀疏，色澤暗淡。表明D-半乳糖抑制衰老模型小鼠的體重增長(zhǎng)。NMF促進(jìn)衰老小鼠的體重增長(zhǎng)，毛色光澤發(fā)亮，其中給藥28天作用最為明顯。
表16 NMF對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠體重的影響(n＝10，x±s)

##P＜0.01，#P＜0.05vs正常組***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05vs模型組如表17所示，與正常生理鹽水組比較，模型組衰老小鼠的胸腺系數(shù)及脾系數(shù)均有明顯減少，表明D-半乳糖衰老模型小鼠的免疫臟器出現(xiàn)萎縮。NMF可顯著提高衰老小鼠的胸腺小鼠和脾小鼠，表現(xiàn)出良好的免疫增強(qiáng)作用。NMF對(duì)腦、肝、腎小鼠無(wú)明顯影響。
表17 NMF對(duì)D-半乳糖所致亞急性小鼠臟器系數(shù)的影響(n＝10，x±s)

##P＜0.01，#P＜0.05vs正常組***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05vs模型組如表18所示，與正常生理鹽水組比較，模型衰老小鼠的MDA的含量、MAO活性和脂褐質(zhì)水平明顯升高，SOD水平、肝GSH的含量明顯降低。NMF可顯著降低血清丙二醛(MDA)含量、腦組織MAO活性和脂褐質(zhì)水平，并提高血清超氧化物歧化酶(SOD)水平，對(duì)GSH水平有提高趨勢(shì)，表現(xiàn)出良好的抗氧化作用。
表18 NMF對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠生化指標(biāo)的影響(n＝10，x±s)

#P＜0.05vs正常組，*P＜0.05vs模型組小鼠長(zhǎng)期注射D-半乳糖，引起全身代謝混紊亂，產(chǎn)生各器官功能衰退，表現(xiàn)為記憶力減退，各免疫器官退化，由于自由基堆積，細(xì)胞膜受損，MDA、MAO及脂褐質(zhì)水平增高，SOD、GSH水平降低，這些變化與老齡小鼠相似，我們實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了D-半乳糖所致亞急性衰老模型小鼠的上述病理改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NMF能顯著改善D-半乳糖所致衰老小鼠的若干衰老指標(biāo)，使之恢復(fù)至接近正常水平或不再衰老方向發(fā)展，提示NMF在改善機(jī)體物質(zhì)代謝紊亂及延緩機(jī)體衰老等方面具有一定的作用。
實(shí)施例13片劑(萬(wàn)片量)

制備方法將NMF粉碎并過(guò)100目篩，稱重后，與已過(guò)100目篩的淀粉混合均勻，加入10％淀粉漿制成軟材，以16目尼龍篩制粒，濕粒于60℃干燥，干顆粒與硬脂酸鎂混合均勻，再經(jīng)16目篩整粒，經(jīng)含量測(cè)定后，計(jì)算出片重，選擇6mm淺凹或平?jīng)_模壓片即得。
實(shí)施例14膠囊(萬(wàn)粒量)

制備方法將NMF粉碎并過(guò)100目篩，稱重后，與已過(guò)100目篩的淀粉混合均勻，加入10％淀粉漿制成軟材，以16目尼龍篩制粒，濕粒于60℃干燥，干顆粒再經(jīng)16目篩整粒，分裝于3號(hào)硬膠囊殼，蓋上節(jié)，壓平，打光即可。
實(shí)施例15注射劑

制備方法分別稱取NMF的鹽酸鹽、氯化鈉，溶于適量注射用水中，添加注射用水至全量，攪勻，過(guò)濾，濾液灌裝于安瓿中，熔封，于100℃流通蒸汽滅菌30min即得。
權(quán)利要求
1.式I所示的化合物或其鹽
2.權(quán)利要求1的化合物或其鹽，是其消旋體
3.權(quán)利要求1的化合物或其鹽，是其光學(xué)異構(gòu)體.
4.權(quán)利要求1、2或3的化合物或其鹽，是無(wú)定型粉末
5.權(quán)利要求1、2或3的化合物或其鹽，是晶體形式。
6.權(quán)利要求1、2或3的化合物或其鹽，所述鹽是式I化合物的無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽。
7.權(quán)利要求6的化合物或其鹽，所述鹽是式I化合物的鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽或檸檬酸鹽。
8.權(quán)利要求7的化合物或其鹽，所述鹽是式I化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽或檸檬酸鹽。
9.權(quán)利要求1的化合物或其鹽的合成方法，該方法包括將煙酸中的羧基與美曲膦酯中的羥基進(jìn)行酯化，需要時(shí)與可藥用酸成鹽。
10.權(quán)利要求9的方法，所述酯化是通過(guò)酰氯法、活性酯的方法或者混合酸酐法進(jìn)行的。
11.一種治療阿爾茨海默氏癥的藥物組合產(chǎn)品，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1-6所述的任一化合物或其鹽和可藥用載體或者含有有效量的煙酸和美曲膦酯的物理組合物和可藥用載體。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，為片劑、膠囊、懸浮劑、溶液劑、脂質(zhì)體、微球、栓劑或者藥盒。
13.權(quán)利要求11或12的藥物組合物，其中所述化合物或其鹽的含量按組合物的重量計(jì)算為0.1-99.9％。
14.權(quán)利要求1-6所述的任一化合物或其鹽或者權(quán)利要求11-13的藥物組合產(chǎn)品在制備治療阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，所述藥物是口服、注射、吸入藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及阿爾茨海默氏癥協(xié)同前體藥物化合物或其鹽及其制備方法，也涉及含有所述化合物或其鹽的藥物組合物以及所述化合物或其鹽在制備治療阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)，所述化合物是由煙酸和美曲膦酯經(jīng)酯鍵偶聯(lián)形成的，即(1－二甲基磷?；?，2，2－三氯)－乙基－1－醇煙酸酯(NMF)。本發(fā)明化合物或其鹽在治療阿爾茨海默氏癥具有良好的效果。
文檔編號(hào)C07F9/58GK1548444SQ0313693
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者熊曉云, 鄒永, 朱杰, 吳玉梅, 梅其炳, 陳海生, 劉及響, 胡建平 申請(qǐng)人:桂林集琦藥業(yè)股份有限公司