專利名稱：抗sars病毒的單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及抗SARS病毒的特異性單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明的抗體對于非典肺炎的治療非常有用。
背景技術(shù)：
傳染性非典型肺炎是一種傳染性極強(qiáng)的呼吸系統(tǒng)疾病，世界衛(wèi)生組織將它稱為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndromes)，簡稱SARS。
SARS主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為起病急，以發(fā)熱為首發(fā)癥狀，體溫一般高于38℃；肺炎，在家庭和醫(yī)院有顯著的聚集現(xiàn)象；可有咳嗽，多為干咳、少痰；可有胸悶，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸加速、氣急或明顯呼吸窘迫的情況。典型病例實(shí)驗(yàn)室檢查以淋巴細(xì)胞計數(shù)減少和T淋巴細(xì)胞功能低下為其主要特點(diǎn)，X線檢查幾乎所有的SARS病人均有肺部單側(cè)或雙側(cè)浸潤性改變。由于其有高度的傳染性、聚集性以及許多病例快速死亡，所以引起全球的廣泛關(guān)注。迄今為止，SARS仍無特效治療方法，SARS病人中約有10％的病人病情進(jìn)行性惡化，發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，死亡率較高，尤其是伴有其他基礎(chǔ)疾病的患者。
SARS的病原體被確認(rèn)為一種新的冠狀病毒(簡稱為“SARS病毒”)，該病毒不同于其他任何已知的人源或動物冠狀病毒。
給非典型肺炎患者輸入非典康復(fù)病人的血清，從而使患者產(chǎn)生針對SARS病毒抗體，實(shí)現(xiàn)病員病體的自我康復(fù)，這一方法被稱為“血清療法”。血清療法在治療其他人類傳染性病的時就已經(jīng)被嘗試過，有一定的療效，因此從理論上來看，這一療法對非典同樣也應(yīng)該是有效的。在當(dāng)前治療非典沒有特效藥物的情況下，血清治療是一種可以嘗試的療法，但要在臨床治療中大面積使用還有相當(dāng)?shù)碾y度和風(fēng)險。
因此，本領(lǐng)域迫切需要建立可以用于臨床治療的抗SARS單克隆抗體。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性的抗SARS病毒單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種所述特異性抗SARS病毒單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含所述抗SARS病毒單克隆抗體的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種單克隆抗體VH鏈，它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5或11所示的CDR1，SEQ ID NO6或12所示的CDR2，SEQ ID NO7或13所示的CDR3。
較佳地，所述的單克隆抗體VH鏈具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ IDNO4中第1-120位的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種單克隆抗體VL鏈，它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8或14所示的CDR1，SEQ ID NO9或15所示的CDR2，SEQ ID NO10或16所示的CDR3。
較佳地，所述的單克隆抗體VL鏈具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ IDNO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種單克隆抗體，其VH鏈具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ ID NO4中第1-120位的氨基酸序列；并且其VL鏈具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ ID NO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
較佳地，所述的單克隆抗體是單克隆抗體。
更佳地，所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)本發(fā)明上述的單克隆抗體VH鏈、單克隆抗體VL鏈、或單克隆抗體。
較佳地，所述的DNA分子具有選自下組的DNA序列SEQ ID NO1中第1-831位、SEQ ID NO1中第1-402位，SEQ ID NO1中第451-828位，以及SEQ IDNO3中第1-807位，SEQ ID NO1中第1-360位，SEQ ID NO1中第401-804位。
在本發(fā)明的第五方面，提供了含有上述編碼本發(fā)明抗體DNA的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述DNA直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒的方法，包括步驟(a)將樣品與本發(fā)明的SARS特異性抗體接觸；(b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒。
在一優(yōu)選例中，所述的樣品為血清樣品或痰液。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有本發(fā)明的SARS特異性抗體。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO5，6，7，11，12，或13所示的互補(bǔ)決定區(qū)，其VL鏈具有SEQ ID NO8、9、10、14、15、或16所示的互補(bǔ)決定區(qū)。
在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ ID NO4中第1-120位的氨基酸序列；且其VL鏈具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ ID NO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
更佳地，所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列。
圖1顯示了抗體7S1的核苷酸序列和氨基酸序列。
圖2顯示了抗體7S2的核苷酸序列和氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人深入而廣泛的研究，通過大規(guī)模篩選人源抗體庫，成功獲得了對SARS病毒高特異性的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種重組抗SARS病毒單克隆抗體，它具有獨(dú)特的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明還提供了抗SARS病毒單克隆抗體的氨基酸序列及其其可變區(qū)鏈，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。
抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描述，稱為超變區(qū)域(CDR)，將該段間隔成4個框架區(qū)域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的CDR和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了FR或CDR區(qū)域。
此外，最近還發(fā)現(xiàn)由輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的相關(guān)結(jié)構(gòu)，與相應(yīng)的重鏈可變區(qū)相比，其結(jié)合的動力學(xué)比較小，分離的重鏈可變區(qū)域自身具有抗原結(jié)合活性。
此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determiningregion，CDR)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS7、293細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的SARS特異性抗體可用于檢測樣品中是否存在SARS病毒，從而作為檢測SARS的有效指標(biāo)之一。此外，本發(fā)明的SARS特異性抗體也可用于治療SARS病癥。
本發(fā)明還提供了一種治療非典肺炎的藥物組合物，它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于治療非典肺炎。此外，還可同時使用其他SARS治療劑，如類固醇等。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的單克隆抗體對SARS有高親和力，因此這種高親和力的單克隆抗體在臨床上具有重要的價值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1從抗體庫中篩選抗SARS病毒抗體的可變區(qū)基因1)抗體庫的構(gòu)建本實(shí)施例中，運(yùn)用體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建含有人源抗SARS病毒抗體單鏈可變區(qū)表達(dá)載體的文庫。方法如下從10位SARS康復(fù)病人的血清中提取了總RNA和有Poly A+RNA。從RNA制備的第一條cDNA鏈?zhǔn)褂昧薆D-Clonetech(Palo Atlo，CA，USA)的PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成，人源抗體的重鏈和輕鏈編碼序列由該cDNA為模板按Sblattero和Bradbury描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法(1998年，Immunotechnology 3271-278)制備而成，擴(kuò)增后的VH和VL基因，按在美國專利6406863中描述的方法通過酵母細(xì)胞中同源重組的方法克隆到酵母雙雜交載體中。PCR擴(kuò)增的抗體可變區(qū)基因在500到800Bp之間。用白細(xì)胞分離的mRNA最大程度減低了非抗體的其他蛋白分子在這個抗體基因庫中的比例。轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞涂在缺失亮氨酸的選擇性酵母合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。用此法建成的SARS特異的抗體庫，庫容達(dá)4×106。
2)Bait基因的選擇與構(gòu)建Spike蛋白為SARS病毒表面的主要蛋白，在病毒入侵細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。與典型的膜蛋白一樣，Spike蛋白的純化與表達(dá)相當(dāng)困難，這就給用傳統(tǒng)的方法和其他體系篩選抗體設(shè)下了障礙。用酵母雙雜交法篩選單抗先導(dǎo)物的主要優(yōu)點(diǎn)之一是不需用蛋白而是以目的基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)開始篩選，故在起始點(diǎn)上即可領(lǐng)先一步。通過生物信息學(xué)分析并與已知動物冠狀病毒的Spike蛋白比較，本發(fā)明人將重點(diǎn)放在抗原性強(qiáng)并最有可能產(chǎn)生保護(hù)性抗體的區(qū)域，同時也將不同片段進(jìn)行組合以增加成功幾率。病毒的核心蛋白N和膜蛋白M也是產(chǎn)生抗體的靶點(diǎn)，故在篩選中也被包括在內(nèi)。
用常規(guī)方法構(gòu)建編碼SARS病毒Spike蛋白、核心蛋白N和膜蛋白M片段的DNA，將其轉(zhuǎn)入pGBKT7載體(Clontech公司)中，獲得含Bait基因的的質(zhì)粒，在這些質(zhì)粒中Bait基因與GAL4 DNA結(jié)合區(qū)域形成融合。
3)篩選篩選的一般步驟分兩步A)初篩用以下步驟進(jìn)行初篩，以便獲得有抗體和Bait相互作用的陽性克隆a.用共轉(zhuǎn)化或同源重組配對的方法將Bait和抗體基因分子導(dǎo)入同一菌中。
b.通過報告基因的作用在選擇性培養(yǎng)基上選出生長良好的陽性克隆。
c.用第二個報告基因B-半乳糖苷酶活性，進(jìn)行驗(yàn)證。
d.從酵母中抽提含抗體基因的質(zhì)粒DNA并在大腸桿菌中擴(kuò)增，測序鑒定。
B)特異性試驗(yàn)對于以上實(shí)驗(yàn)中雙陽性的候選克隆進(jìn)一步驗(yàn)證，即將抗體分子與一組基因(包括相應(yīng)Bait和無關(guān)基因)再次共轉(zhuǎn)入新一輪的報告菌株中并以選擇性培養(yǎng)基和B-半乳糖苷酶活性鑒定抗體與Bait基因的特異性相互作用。
結(jié)果經(jīng)過幾輪篩選，從大約108個克隆中得到2個抗體先導(dǎo)物分子7S1和7S2，這幾個分子在特異性實(shí)驗(yàn)中只與相應(yīng)Bait有結(jié)合，而與無關(guān)基因呈陰性，故為Spike蛋白特異性抗體(結(jié)果見表1)。
表1 選擇性生長與半乳糖苷酶活性
對7S1和7S2經(jīng)DNA測序，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)均符合標(biāo)準(zhǔn)的單鏈抗體分子的構(gòu)成(即重鏈可變區(qū)+連接區(qū)+輕鏈可變區(qū)+HSVTag+His6Tag)。
7S1的核苷酸及氨基酸序列圖1和SEQ ID NO1和2所示。
7S2的核苷酸及氨基酸序列圖2和SEQ ID NO3和4所示。
其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及各CDR的位置如表2所示
表2 7S1和7S2的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以及各CDR的位置
實(shí)施例2抗體分子的表達(dá)單鏈抗體分子已在大腸桿菌周質(zhì)腔誘導(dǎo)表達(dá)，并用于體外驗(yàn)證。方法如下將編碼單鏈抗體7S1和7S2分子的DNA片段用限制性內(nèi)切酶(XhoI/NcoI)切出，并克隆至表達(dá)載體pET25b(Novagen公司)中，表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和滲透休克步驟，分別獲得可溶性單鏈抗體7S1和7S2。
實(shí)施例3抗體分子的真核表達(dá)在本實(shí)施例中，將7S1和7S2抗體分子將在酵母中分泌型表達(dá)，和與抗體恒定區(qū)融合后轉(zhuǎn)為全長抗體基因在真核細(xì)胞中的分泌表達(dá)。方法如下
酵母中的分泌型表達(dá)通過將單鏈抗體分子與α多肽信號肽融合后在畢赤氏甲醇酵母中進(jìn)行。將輕重鏈可變區(qū)分別與相對應(yīng)的恒定區(qū)融合，從而將單鏈抗體分子復(fù)原為全長抗體分子，將含輕重鏈基因的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入真核表達(dá)細(xì)胞CHO細(xì)胞，完整的抗體分子既在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并在分泌過程中組裝形成。表達(dá)的單鏈抗體可用其C端融合的His6標(biāo)簽進(jìn)行親和層析，得到較純單抗蛋白。然后用A或G蛋白親和層析柱純化，獲得全長7S1和7S2抗體。
結(jié)果，真核細(xì)胞中表達(dá)所獲得全長抗體更穩(wěn)定、更具生物活性。
實(shí)施例4重組表達(dá)的7S1和7S2抗體分子的活性驗(yàn)證本實(shí)施例中，用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下在ELISA中取滅活SARS病毒以及合成的S蛋白短肽作為包被的原料。被檢的單鏈可以是實(shí)施例2中獲得的單鏈抗體、或周質(zhì)腔誘導(dǎo)表達(dá)的粗提物，檢測抗體為鼠源HSV單克隆抗體，并最終用HRP偶聯(lián)的羊抗鼠抗體(二抗)并以TMB為底物進(jìn)行顯色發(fā)現(xiàn)。
結(jié)果表明，重組表達(dá)的7S1和7S2抗體分子可特異性地與滅活SARS病毒以及合成的S蛋白短肽結(jié)合。
此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海單抗制藥技術(shù)有限公司泰世基因公司(GENETASTIX INC.)<120>抗SARS病毒的單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用<130>033946<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>831<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(831)<223>抗體7S1的編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(402)<223>抗體7S1重鏈編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(451)..(828)<223>抗體7S1輕鏈編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(403)..(450)<223>接頭序列<400>1caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaaac cctcgcagac cctctcactc60acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggac ctggatcagg120cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat180aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga atagacatca atccagacac atccaagaac240cagttctccc tgcacctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca300agagagccgg gatcgggtgg atacagatat gattcagaag cttttgatgt ctggggccaa360gggacaatgg tcaccgtctc ttcaggcggt ggtggatcag gcggcggtgg cagcggtggt420ggaggcagtg acatccaggt gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac480
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(276)<223>抗體7S1<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(128)<223>抗體7S1重鏈<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(144)..(276)<223>抗體7S1輕鏈<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(129)..(143)<223>接頭<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Ser Ala Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Asp Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Leu His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val85 90 95Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser100105 110Glu Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115120 125Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp130135 140Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp145150 155 160Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu165170 175Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr180185 190Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser195200 205Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu210215 220Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr225230 235 240Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala245 250 255Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His260265 270His His His His275
<210>3<211>807<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(807)<223>抗體7S2的編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(360)<223>抗體7S2重鏈的編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(401)..(804)<223>抗體7S2輕鏈的編碼序列<220>
<221>misc_feature<222>(361)..(400)<223>接頭序列<400>3caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc60acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg120cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat180aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac240cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca300agagagatca gtaccagccc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca360ggcggtggtg gatcaggcgg cggtggcagc ggtggtggag gcagtgacat ccgggtgacc420cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca480agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag540ctcctgatct atgctgcatc cagtttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt600ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact660tactactgcc aacagagtta cagtaccccg tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa720atcaaactcg agatcaaacg ggctagccag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat780gtcgagcacc accaccacca ccactga807
<210>4<211>268<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(268)<223>抗體7S2<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(120)<223>抗體7S2重鏈<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(121)..(135)<223>接頭<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(136)..(268)<223>接頭<400>4Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu35 40 45Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala50 55 60Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val85 90 95Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Ser Thr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115120 125Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Arg Val Thr Gln Ser Pro Ser130135 140Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala145150 155 160Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly165170 175Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly180185 190Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu195200 205Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln210215 220Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu225230 235 240Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu245250 255Asp Pro Glu Asp Val Glu His His His His His His260265<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(12)<223>重鏈CDR1<400>5Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Thr1 5 10
<210>6<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(18)<223>重鏈CDR2<400>6Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15Lys Ser<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>重鏈CDR3<400>7Glu Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Asp Val1 5 10 15<210>8<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>輕鏈CDR1<400>8Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10<210>9
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(7)<223>輕鏈CDR2<400>9Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>輕鏈CDR3<400>10Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr1 5<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(12)<223>重鏈CDR1<400>11Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn1 5 10<210>12<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)
<223>重鏈CDR2<400>12Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15Lys Ser<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(8)<223>重鏈CDR3<400>13Glu Ile Ser Thr Ser Pro Asp Tyr1 5<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>輕鏈CDR1<400>14Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10<210>15<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(7)<223>輕鏈CDR2
<400>15Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>輕鏈CDR3<400>16Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr1 權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體VH鏈，其特征在于，它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5或11所示的CDR1，SEQ ID NO6或12所示的CDR2，SEQ ID NO7或13所示的CDR3。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈，其特征在于，它具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ ID NO4中第1-120位的氨基酸序列。
3.一種單克隆抗體VL鏈，其特征在于，它的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO8或14所示的CDR1，SEQ ID NO9或15所示的CDR2，SEQ ID NO10或16所示的CDR3。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體VL鏈，其特征在于，它具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ ID NO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
5.一種單克隆抗體，其特征在于，其VH鏈具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ ID NO4中第1-120位的氨基酸序列；并且其VL鏈具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ ID NO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于，它具有SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列。
7.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體VH鏈；權(quán)利要求3所述的單克隆抗體VL鏈；權(quán)利要求5所述的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列SEQ ID NO1中第1-831位、SEQ ID NO1中第1-402位，SEQ ID NO1中第451-828位，以及SEQ ID NO3中第1-807位，SEQ ID NO1中第1-360位，SEQ ID NO1中第401-804位。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO5，6，7，11，12，或13所示的互補(bǔ)決定區(qū)，其VL鏈具有SEQ ID NO8、9、10、14、15、或16所示的互補(bǔ)決定區(qū)。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQ ID NO2中第1-128位或SEQ ID NO4中第1-120位的氨基酸序列；且其VL鏈具有SEQ ID NO2中第144-276位或SEQ ID NO4中第136-268位所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗SARS病毒的特異性單克隆抗體。該單克隆抗體穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，特別適用于治療非典肺炎和檢測SARS病毒。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體的制備方法以及含有所述單克隆抗體的藥物組合物。
文檔編號C07H21/04GK1566155SQ03141520
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者陳克勤, 朱力, 華紹炳, 鄭建紅, 曾益新 申請人:上海單抗制藥技術(shù)有限公司, 泰世基因公司