專利名稱：一組抗hbv感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性乙型病毒性肝炎(“乙肝”)是乙型肝炎病毒引致的肝臟炎性病變。我國(guó)是“乙肝”的高發(fā)區(qū)，約1.2億人的乙肝表面抗原呈現(xiàn)陽(yáng)性。乙肝的流行，嚴(yán)重危害人類健康。
近年的研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞內(nèi)存在著“RNA干擾”機(jī)制?！癛NA干擾”是一種由雙鏈RNA(干擾RNA)誘導(dǎo)的基因沉默，在此過(guò)程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA被降解，從而抑制了該基因的表達(dá)。通過(guò)該途徑也可降解病毒基因、抑制病毒基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。因此，尋找針對(duì)乙型肝炎病毒的特異“干擾RNA”序列為診斷和治療乙型肝炎提供了新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其片段，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述核苷酸序列的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下設(shè)計(jì)方案一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，該組DNA序列如下1)catcctgctgctatgcctcat2)aaggtatgttgcccgtttgtcc3)cctattgattggaaagtatgtcaaa4)tcgccaacttacaaggcctttct5)tgtgctgccaactggatcct6)ccgtgtgcacttcgcttcacct7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt8)ggagtgtggattcgcactcct9)agaccaccaaatgcccctatc10)gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc11)tattcttgggaacaagagctacag12)ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt。
所述的DNA序列及其片段和與其反向互補(bǔ)序列形成的雙鏈DNA序列。該雙連序列主要應(yīng)用于克隆至表達(dá)載體，以表達(dá)干擾RNA。
所述的DNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修飾形成的DNA序列。其用途如在DNA兩端加上酶切位點(diǎn)。
一組所述的DNA序列對(duì)應(yīng)的RNA序列及其片段。該RNA序列在細(xì)胞內(nèi)可能與細(xì)胞內(nèi)RNA形成雙鏈RNA。
所述的RNA序列及其片段和與之互補(bǔ)的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。該RNA雙鏈具有RNA干擾活性，可以使特異的mRNA降解。
所述的RNA序列及其片段和與之反向互補(bǔ)的序列加上中間非互補(bǔ)連接序列形成的發(fā)夾樣雙鏈RNA序列。在細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)載體表達(dá)發(fā)夾樣雙鏈，具有干擾RNA活性，促使特異mRNA降解。
所述的RNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修飾形成的RNA序列。這種修飾通常是在合成RNA的3’端或5’端加UU修飾。
包含所述的DNA序列及其片段的表達(dá)載體。即利用質(zhì)粒等載體，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)RNA，形成干擾RNA。
包含所述的RNA序列及其片段的表達(dá)載體。
包含所述DNA序列及其片段、RNA序列及其片段和表達(dá)載體的脂質(zhì)體。使用脂質(zhì)體，可以將RNA或可表達(dá)RNA的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，從而達(dá)成治療目的。
將所述的DNA序列及其片段或RNA序列及其片段利用病毒載體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。常用的病毒載體包括DNA病毒載體，如rAAV和ad-5；RNA病毒載體，如Lentivirus和Coronovirus。使用重組腺病毒伴隨病毒載體，攜帶合適真核啟動(dòng)子及編碼發(fā)夾狀雙鏈RNA的以上所述的DNA或RNA片段，該重組病毒感染細(xì)胞或注射給予動(dòng)物及人體后表達(dá)形成干擾RNA，抑制HBV基因的表達(dá)，從而治療HBV感染。
將所述的表達(dá)載體和脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。
所述的DNA序列及其片段、RNA序列及其片段、表達(dá)載體、脂質(zhì)體和方法用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)同源序列比較，獲得了一系列在各種乙型肝炎病毒(HBV)間保守的DNA序列。使用該序列衍生的干擾RNA可以有效抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)。與已有的基因治療方法比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.通過(guò)同源比較，獲得了一系列與所有已經(jīng)發(fā)表的乙型肝炎病毒序列高度同源的DNA序列片段，使用該系列片段衍生的干擾RNA可以有效抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)，而且作用位點(diǎn)多、作用范圍廣泛；2.這些干擾RNA作用的位點(diǎn)是乙型肝炎病毒的保守序列，因而不會(huì)因病毒基因的突變而失去作用效果；3.使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的這些干擾RNA，可在細(xì)胞內(nèi)抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，因此不僅有望用于乙肝患者的治療，而且有可能用于乙肝感染的預(yù)防；4.用腺病毒伴隨病毒作為載體，可將目的干擾RNA對(duì)應(yīng)的DNA片段整合到宿主細(xì)胞的染色體上，因而有可能使人體產(chǎn)生永久的抗HBV能力。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。


圖1為合成干擾RNA抑制HBsAg表達(dá)的效率2為合成干擾RNA抑制HBcAg表達(dá)的效率3為表達(dá)內(nèi)部雙鏈RNA的質(zhì)粒pH1-HBVS1的的構(gòu)建4為質(zhì)粒pAAV-HBVS1的構(gòu)建圖5為質(zhì)粒pcDNA-HBVS的構(gòu)建具體實(shí)施方式
實(shí)施例中采用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，詳見(jiàn)《分子克隆》第三版(科學(xué)出版社，1998年)。
實(shí)施例1極度保守HBV DNA序列的獲得選擇已經(jīng)發(fā)表的HBV1典型序列，按功能基因分成每個(gè)約70個(gè)核苷酸(nt)的片段；每一個(gè)片段用NIH(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)提供的BLAST軟件(BLASTN2.2.6)在英特網(wǎng)上分析其在GenBank(NCBI，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)，EMBL(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù))，DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù))及GDB(基因組數(shù)據(jù)庫(kù))等數(shù)據(jù)庫(kù)核酸序列中的同源序列；選擇出符合以下條件的核苷酸序列(1)該片段大于或等于19個(gè)核苷酸；(2)該片段在所比較的HBV序列中極度保守或完全同源；所獲得的序列見(jiàn)表1。
表1.通過(guò)同源比較發(fā)現(xiàn)的HBV序列中極度保守的DNA序列編號(hào) HBV基因 DNA序列1 Polymerase；Scatcctgctgctatgcctcat2 Polymerase；Saaggtatgttgcccgtttgtcc3 Polymerase cctattgattggaaagtatgtcaaa4 Polymerase tcgccaacttacaaggcctttct5 Polymerase；Xtgtgctgccaactggatcct6 Polymerase；Xccgtgtgcacttcgcttcacct
編號(hào)HBV基因 DNA序列7 X ggaggctgtaggcataaattggtctgt8 Core ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt9 Core ggagtgtggattcgcactcct10 Core agaccaccaaatgcccctatc11 Polymerase；core gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc12 Polymerasetattcttgggaacaagagctacag實(shí)施例2.使用合成RNA雙鏈，降低HBV S基因的表達(dá)。
根據(jù)上述env基因的保守序列(表1中1號(hào)序列)，合成DNA序列對(duì)應(yīng)的19核苷酸的RNA片段，并根據(jù)互補(bǔ)原則合成該鏈的互補(bǔ)RNA鏈，在RNA鏈3’端加UU修飾5’uccugcugcuaugccucauuu3’uuaggacgacgatacggagta上述合成的RNA鏈各1μg，加1μl退火緩沖液(10mmol/LTrisHCl(PH7.4)，100mmol/L NaCl)，加不含RNase的去離子水至總體積10μl。90℃加熱5分后25℃保溫1h，取2μg退火后的RNA雙鏈、經(jīng)4IU單鏈RNA特異的RNase及DNase I 37℃消化30分鐘后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別雙鏈RNA的形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20bp處有一單一的RNA條帶出現(xiàn)。說(shuō)明合成的兩條互補(bǔ)RNA單鏈已雜交成RNA雙鏈。
接種CHO-HBV細(xì)胞(該細(xì)胞整合有乙肝病毒全基因組并表達(dá)有關(guān)蛋白，本公司自行構(gòu)建)于100mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞達(dá)到90％的匯合度(confluence)。分別取1.5ml無(wú)抗生素的DMEM稀釋2μg合成的雙鏈干擾RNA、以2μg合成的單鏈RNA為對(duì)照，然后加入1.5ml無(wú)抗生素DMEM稀釋的適量0ligofectamine轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)，輕微混勻后室溫中放置20分鐘。將轉(zhuǎn)染液加入到所培養(yǎng)的CHO-HBV細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞6小時(shí)。棄去轉(zhuǎn)染液，加入含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。裂解細(xì)胞，離心提取上清。使用HBV表面蛋白抗原ELISA檢測(cè)試劑(華美生物工程公司)測(cè)定乙肝表面抗原的表達(dá)量，并觀察干擾RNA對(duì)乙肝表面抗原表達(dá)的影響。
結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染2μg雙鏈RNA的細(xì)胞，其HBsAg表達(dá)量(1#)較轉(zhuǎn)染2μg單鏈(作為陰性對(duì)照)的細(xì)胞顯著降低，僅為對(duì)照的1/10。由于該蛋白為病毒的外膜蛋白且含有病毒進(jìn)入細(xì)胞的配體序列，因此抑制該基因的表達(dá)可阻斷病毒顆粒的形成、防止病毒感染細(xì)胞。
實(shí)施例3、合成RNA雙鏈抑制core(HBcAg)基因表達(dá)根據(jù)上述core保守序列(表1中8號(hào)序列)合成19核苷酸的RNA片段，并根據(jù)互補(bǔ)原則合成該鏈的互補(bǔ)RNA鏈，在互補(bǔ)RNA鏈3’端加UU，如實(shí)施例2退火，形成RNA雙鏈5’gaguguggauucgcacuccuu3’uucucacaccuaagcgugagg按照實(shí)施例2的方法，將2μg雙鏈RNA及2μg單鏈RNA(正鏈)分別轉(zhuǎn)染CHO(HBV)細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞，破碎后測(cè)定HBcAg的表達(dá)量(使用華美生物工程有限公司HBcAg ELISA試劑盒)。
結(jié)果表明，與對(duì)照相比，合成雙鏈RNA使細(xì)胞HBcAg的表達(dá)量降低了85％(圖2，8#)。
實(shí)施例4.合成其它雙鏈RNA抑制S基因和c基因的表達(dá)同實(shí)施例2，合成了實(shí)施例1中2號(hào)、9號(hào)、10號(hào)序列對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA，同樣測(cè)定轉(zhuǎn)染CHO(HBV)細(xì)胞后HBsAg或HBcAg的表達(dá)水平，結(jié)果表明這3個(gè)序列均使相應(yīng)蛋白的表達(dá)量大幅降低(分別見(jiàn)圖1中2#，圖2中9#和10#)。
實(shí)施例5.合成含有S基因保守序列對(duì)應(yīng)的DNA片段及其雜交序列，克隆至真核表達(dá)載體，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)干擾RNA，抑制HBV膜蛋白的表達(dá)合成含有S基因保守序列(表1中1號(hào)序列)的DNA片段及其雜交序列(黑斜體)的DNA片段，退火后形成DNA片段，5’端為BamHI位點(diǎn)的末端，3’端為HindIII位點(diǎn)的末端，在同源序列及其互補(bǔ)序列中間含有間隔序列。B為A的互補(bǔ)序列1A gatcccctcctgctgctatgcctcatttcaagagaatgaggcatagcagcaggatttttggaaa1B agcttttccaaaaatcctgctgctatgcctcattctcttgaaatgaggcatagcagcaggaggg如圖3所示，通過(guò)PCR(以人基因組DNA 1μg為模板，引物15’-TAATTAATACGGCTGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3’100ng，其5‘端分別含有AseI，MluI和NotI位點(diǎn)；引物25’-GCACTAGTAAGCTTGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3’100ng，其5’端含有SpeI、HindIII和BglII位點(diǎn)，使用Roche High Fidelity PCR試劑盒按說(shuō)明書(shū)，使用PE公司9700型PCR儀，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件94℃ 50秒；46℃ 50秒，72℃ 90秒，擴(kuò)增2個(gè)循環(huán)；94℃ 50秒；56℃ 50秒，72℃ 90秒，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；獲得人H1 RNA基因的啟動(dòng)子區(qū)，質(zhì)粒pEGFPC1(Clontech)用AseI和XbaI酶切后回收大片段作為載體，上述擴(kuò)增片段用AseI和SpeI酶切后回收，與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得質(zhì)粒pH1。將上述合成的DNA片段(A，B)退火后克隆至pH1質(zhì)粒的BamHI和HindIII位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pH1-HBVS1(圖3)。該質(zhì)粒在細(xì)胞中，在RNA聚合酶III的作用下，表達(dá)發(fā)夾狀RNA，形成RNA雙鏈。
用4μg pH1-HBVS1質(zhì)粒(使用同量pH1質(zhì)粒作為對(duì)照)，使用Lipofectamine法轉(zhuǎn)染CHO(HBV)細(xì)胞，通過(guò)如實(shí)施例2所述方法比較HBsAg表達(dá)產(chǎn)量的差異。結(jié)果表明pH1-HBVS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后HBsAg表達(dá)量降低90％左右(圖1)。
實(shí)施例6.使用腺病毒伴隨病毒載體，攜帶如實(shí)施例5中所述的H1啟動(dòng)子及編碼發(fā)夾狀雙鏈RNA的DNA片段，重組病毒感染細(xì)胞后抑制HBV S基因的表達(dá)。
如圖5所示，質(zhì)粒pAAV-MCS(購(gòu)于Stratagene)用MluI和HindIII酶切；含H1啟動(dòng)子和編碼HBV S1發(fā)夾狀RNA的DNA片段從質(zhì)粒pH1-HBVS1中用MluI和HindIII酶切獲得，并克隆至pAAV-MCS的相應(yīng)位點(diǎn).構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-HBV S1(圖4)，將該質(zhì)粒(4μg)(對(duì)照病毒載體用pAAV-MCS)與輔助質(zhì)粒pHelper(1μg，Stratagene)和質(zhì)粒pAAV-RC(2μg Stratagene)一起用LIPOFECTamine法共轉(zhuǎn)染HEK 293FT細(xì)胞(見(jiàn)說(shuō)明書(shū))，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，反復(fù)凍融4次，12000rpm離心10分鐘，取上清儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆?，此上清即為AAV-干擾RNA病毒上清。
以乙型肝炎病毒(adr亞型)基因組DNA 1ng為模板，加入引物HBV S5(cggatccatgcagtggaactccacaaca)和HBV S3(cgaattctcaaatgtatacccaaagac)，和HBV S3各100ng，使用Roche公司HighFidelity PCR試劑盒(方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū))，使用PE公司9700型PCR儀，94℃ 50秒；46℃ 50秒，72℃ 90秒，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，獲得HBV的S基因(含PreS1和PreS2)。該片段用BamHI+EcoRI酶切后克隆至pcDNA3.1的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pcDNA-HBVS(圖5)。
使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK 293細(xì)胞至50％左右，加入上述病毒上清，繼續(xù)培養(yǎng)12h。質(zhì)粒pcDNA-HBS 5μg，使用Lipofectamine法轉(zhuǎn)染上述感染病毒的293細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后受細(xì)胞，使用ELISA法分析HBsAg的表達(dá)水平。
結(jié)果和對(duì)照(攜帶半乳糖苷酶基因的AAV)病毒相比，表達(dá)干擾RNA的重組腺相關(guān)病毒可以顯著抑制HBsAg的表達(dá)(圖2)。
序列表<110>北京三諾佳邑生物技術(shù)有限公司<120>一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其應(yīng)用<130>
<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>1catcctgctg ctatgcctca t 21<210>2<211>22<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>2aaggtatgtt gcccgtttgt cc22<210>3<211>25<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)
<400>3cctattgatt ggaaagtatg tcaaa25<210>4<211>23<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>4tcgccaactt acaaggcctt tct 23<210>5<211>20<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>5tgtgctgcca actggatcct 20<210>6<211>22<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>6ccgtgtgcac ttcgcttcac ct 22<210>7
<211>27<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>7ggaggctgta ggcataaatt ggtctgt27<210>8<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>8ggagtgtgga ttcgcactcc t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>9agaccaccaa atgcccctat c 21<210>10<211>33<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>10
gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgc33<210>11<211>24<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>11tattcttggg aacaagagct acag24<210>12<211>33<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒屬(orthohepadnaviridae)<400>12ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc ttt3權(quán)利要求
1.一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，該組DNA序列如下1)catcctgctgctatgcctcat2)aaggtatgttgcccgtttgtcc3)cctattgattggaaagtatgtcaaa4)tcgccaacttacaaggcctttct5)tgtgctgccaactggatcct6)ccgtgtgcacttcgcttcacct7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt8)ggagtgtggattcgcactcct9)agaccaccaaatgcccctatc10)gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc11)tattcttgggaacaagagctacag12)ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt。
2.權(quán)利要求1所述的DNA序列及其片段和與其反向互補(bǔ)序列形成的雙鏈DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的DNA序列及其片段和與之反向互補(bǔ)的序列加上中間非互補(bǔ)連接序列形成的發(fā)夾樣雙鏈DNA序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的DNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修飾形成的DNA序列。
5.一組權(quán)利要求1所述的DNA序列對(duì)應(yīng)的RNA序列及其片段。
6.權(quán)利要求5所述的RNA序列及其片段和與之互補(bǔ)的序列雜交形成的雙鏈RNA序列。
7.權(quán)利要求5所述的RNA序列及其片段和與之反向互補(bǔ)的序列加上中間非互補(bǔ)連接序列形成的發(fā)夾樣雙鏈RNA序列。
8.權(quán)利要求5或6所述的RNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修飾形成的DNA序列。
9.包含權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的DNA序列及其片段的表達(dá)載體。
10.包含權(quán)利要求5至8中任何一項(xiàng)所述的RNA序列及其片段的表達(dá)載體。
11.包含權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的DNA序列及其片段的脂質(zhì)體。
12.包含權(quán)力要求5至8中任何一項(xiàng)所述的RNA序列及其片段的脂質(zhì)體。
13.包含權(quán)利要求9或10所述的表達(dá)載體的脂質(zhì)體。
14.將權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的DNA序列及其片段利用病毒載體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。
15.將權(quán)利要求5至8中任何一項(xiàng)所述的RNA序列及其片段利用病毒載體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。
16.將權(quán)利要求9或10所述的表達(dá)載體導(dǎo)在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。
17.將權(quán)利要求11至13中任何一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物及人體的方法。
18.權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的DNA序列及其片段用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求5至8中任何一項(xiàng)所述的RNA序列及其片段用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求9或10所述的表達(dá)載體用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
21.權(quán)利要求11至13中任何一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求14至17中任何一項(xiàng)所述的方法用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，如序列表所示；與該組序列相應(yīng)的RNA序列及其片段、修飾的核苷酸序列、雙鏈核苷酸序列；包含上述核苷酸序列的表達(dá)載體、脂質(zhì)體以及將所述核苷酸序列、表達(dá)載體和脂質(zhì)體在體內(nèi)或體外導(dǎo)入真核細(xì)胞系、動(dòng)物或人體的方法；上述內(nèi)容在用于制備抗HBV感染及乙型肝炎診斷、治療和預(yù)防的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)同源比較，獲得一系列與所有已經(jīng)發(fā)表的HBV序列高度同源的DNA序列片段，使用該系列片段衍生的雙鏈RNA序列可以有效地抑制HBV基因的表達(dá)；使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的該系列RNA也可在細(xì)胞內(nèi)抑制HBV基因的表達(dá)；攜帶該片段DNA的腺病毒伴隨病毒感染細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)錄出對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA并抑制HBV基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1580070SQ0314969
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月6日
發(fā)明者周志文, 李月娟, 趙春文, 馮宇霞 申請(qǐng)人:北京三諾佳邑生物技術(shù)有限責(zé)任公司