專利名稱：能與金葡菌自分泌的rnaiii激活蛋白結(jié)合的環(huán)多肽及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組環(huán)多肽，具體涉及夠與金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白結(jié)合的環(huán)多肽，該結(jié)合肽能特異抑制金葡菌的毒素產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及這些環(huán)多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰(zhàn)傷感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫(yī)院內(nèi)感染金葡菌的人數(shù)就超過數(shù)百萬。目前臨床上對金葡菌的治療多采用聯(lián)合使用抗生素的辦法，但是效果并不理想。由于金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染是臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質(zhì)是毒素，包括溶血毒素、殺白細胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調(diào)節(jié)RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，通過堿基互補調(diào)節(jié)毒力因子的翻譯。在細菌生長的對數(shù)早期其RNAIII水平低，但到對數(shù)晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白，RANIII激活蛋白(RNAIII activating protein)，也稱RAP調(diào)節(jié)的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續(xù)分泌RAP，在RAP達到一定濃度后才有激活毒力因子產(chǎn)生的作用。沒有RAP產(chǎn)生的金葡菌本身并不致病。1998年Balaban等在“Science”雜志發(fā)表研究結(jié)果表明，用他們制備的RAP免疫動物，其抗體可以有效地保護小鼠免受金葡菌的感染(Balaban N，et al.Autoinducer ofvirulence as a target for vaccine and therapy against Staphylococcus aureus.Science，1998，280(17)438-440)。目前，有關(guān)RAP的存在及序列尚有爭論，也未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組能夠與金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白結(jié)合的環(huán)多肽，該結(jié)合肽能特異抑制金葡菌的毒素產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一目的是提供這些環(huán)多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，我們用改進的文獻方法從我國臨床致病金葡菌菌株04018中分離出一種可抑制RNAIII活性的蛋白，我們將之命名為RAP(Y)。我們采用噬菌體展示技術(shù)從隨機環(huán)多肽庫中篩選出能特異與RAP(Y)分子結(jié)合并抑制其活性的小分子多肽，目的是阻斷RAP(Y)對毒素產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用，從而切斷金葡菌毒素產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為治療金葡菌感染開辟新的途徑。本發(fā)明的多肽無論從來源還是從結(jié)構(gòu)上完全是新的，未見任何文獻報道，其作用靶蛋白RAP(Y)也未見文獻報道。
本發(fā)明的能夠與金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白結(jié)合的環(huán)多肽，是具有以下通式結(jié)構(gòu)的多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1。
其中，C代表天然L-型半胱氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體；X代表下述四種天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體中的任意一種，即谷氨酰胺殘基(Q)、谷氨酸殘基(E)、天冬氨酸殘基(D)和天冬酰胺殘基(N)；H代表組氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體；A代表天然L-型芳香族氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體，如色氨酸殘基(W)、酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)等；腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
具有上述結(jié)構(gòu)的多肽能夠與金葡菌毒力刺激因子RAP(Y)特異結(jié)合，并抑制其活性。具體表現(xiàn)為，在體外具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽無論是以何種形式如展示在噬菌體上、或體外化學(xué)合成、或用基因工程方法重組表達，都能夠與RAP(Y)特異結(jié)合，并抑制金葡菌中由RAP(Y)調(diào)控的RNAIII的表達，動物實驗結(jié)果表明，具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽能夠抑制金葡菌引起的感染。
本發(fā)明的小分子多肽可通過現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)合成或用基因工程方法重組表達的方法制得。
傳統(tǒng)抗生素治療產(chǎn)生抗藥性的原因主要為用藥后細菌在生存壓力下產(chǎn)生分解抗生素中有效基團的誘導(dǎo)酶。本發(fā)明利用特異抑制RAP(Y)活性的多肽建立的治療金葡菌感染的方案，由于不殺滅細菌而使細菌的致病性喪失，所以不會象傳統(tǒng)抗生素治療那樣對細菌產(chǎn)生選擇壓力而產(chǎn)生抗藥株，這就為一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發(fā)且有致命性的疾病的治療找到新的出路。


圖1為純化RAP蛋白電泳圖譜圖2為RAP(Y)活性的檢測3為ELISA方法檢測GST-C7融合蛋白與RAP(Y)結(jié)合情況圖4為RAP(Y)結(jié)合肽-GST融合蛋白對金葡菌細胞內(nèi)RNAIII水平的影響本發(fā)明對研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽藥物具有重要意義，并具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的第二個目的。另外，金葡菌毒力刺激因子RAP(Y)結(jié)合肽作為生物制劑也有潛在的應(yīng)用價值，如可用于RAP(Y)的親和純化或作為探針用于RAP(Y)的檢測等。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1.RAP(Y)的分離純化將生長至對數(shù)晚期(4.7×109細菌/ml)的金葡菌菌液7000×g離心15分鐘取上清，煮沸10分鐘后離心15分鐘，再取上清。用截留分子量10kD的濾膜體積濃縮十倍后，取3ml用分子篩層析方法分離純化。分離介質(zhì)為S-300(100ml，2.2×26cm)，緩沖液為50mMTris-Cl，pH＝8.0，收集目標(biāo)蛋白峰。常規(guī)SDS-PAGE聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測純度和觀察分子量。結(jié)果表明所獲得的蛋白為單一條帶，分子量約為38kD(見附圖1，圖中1表示RAP蛋白，2表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)，3表示牛凝血酶(～36kD)。
實施例2.利用Northern blot檢測RAP(Y)活性常規(guī)方法提取金葡菌的總RNA，甲醛變性電泳后，通過半干轉(zhuǎn)移將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。預(yù)雜交60℃，1小時后，加入標(biāo)記RNAIII特異的DNA探針。60℃，16小時后，洗膜進行放射自顯影。在RAP(Y)活性檢測中，陽性對照為濃縮10倍的對數(shù)生長晚期上清0.5ml(含高濃度RAP(Y))加入4.5ml培養(yǎng)基接種對數(shù)生長早期(5×108細菌/ml)金葡菌培養(yǎng)60分鐘；樣品為5ml培養(yǎng)基加入0.5mg純化的蛋白接種同樣金葡菌培養(yǎng)60分鐘；陰性對照為5ml培養(yǎng)基接種同樣金葡菌培養(yǎng)60分鐘。
1.Northern blot結(jié)果表明純化的蛋白在對數(shù)生長早期激活細胞內(nèi)RNAIII轉(zhuǎn)錄，使其水平顯著升高(見附圖2，圖中1表示濃縮上清，2表示純化RAP(Y)，3表示培養(yǎng)基對照)。表明純化的38kD蛋白RAP(Y)具有激活金葡菌細胞內(nèi)RNAIII轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)作用。
實施例3.RAP(Y)結(jié)合肽的篩選首先用100μl純化的RAP(Y)蛋白包被于酶聯(lián)板，置4℃過夜。經(jīng)過2％的明膠封閉1h后，加入噬菌體肽庫，室溫孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結(jié)合的噬菌體，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脫特異結(jié)合的噬菌體，洗脫液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照試劑盒提供的方法，測定洗脫液中的噬菌體的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脫噬菌體的滴度作為對照，測定投入產(chǎn)出比。同時將洗脫的與RAP結(jié)合的噬菌體擴增，并測定其下滴度，用于下一輪的篩選。經(jīng)過3輪篩選后，測定的投入產(chǎn)出有了明顯的提高，產(chǎn)率由第一輪的0.865×10-4％提高到3.846×10-2％，即第三輪時特異與RAP(Y)結(jié)合的噬菌體克隆得到了極大的富集。隨機挑取18個克隆進行測序。分析后得到具有以下通式結(jié)構(gòu)的多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1。
其中，C代表天然L-型半胱氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體，X代表下述四種天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體任意一種，即谷氨酰胺殘基(Q)，谷氨酸殘基(E)，天冬氨酸殘基(D)或天冬酰胺殘基(N)，H代表組氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體，A代表天然L-型芳香族氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體，如色氨酸殘基(W)，酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)等，腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)，具有上述結(jié)構(gòu)通式的多肽。
實施例4.RAP(Y)結(jié)合肽-GST融合蛋白的基因工程表達及其對金葡菌細胞內(nèi)RNAIII水平的影響利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建GST-環(huán)7RAP(Y)結(jié)合肽融合蛋白基因表達載體，經(jīng)測序鑒定正確后，將GST-C7融合蛋白在大腸桿菌中表達，通過ELISA的方法檢測，發(fā)現(xiàn)分離純化的GST-C7融合蛋白能與RAP(Y)特異性結(jié)合，如附圖3。
利用實施例2測活方法發(fā)現(xiàn)，GST-C7融合蛋白(0.2mg/ml)能明顯抑制金葡菌中RNAIII水平，而GST對照蛋白無此作用(見附圖4，圖中1表示培養(yǎng)基對照，2表示GST對照，3表示GST-C7融合蛋白)。
權(quán)利要求
1.能夠與金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白結(jié)合，并具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán)多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1式中，C代表天然L-型半胱氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體；X代表下述四種天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體任意一種谷氨酰胺殘基(Q)、谷氨酸殘基(E)、天冬氨酸殘基(D)和天冬酰胺殘基(N)；H代表L-型組氨酸殘基或其D-型異構(gòu)體；A代表天然L-型芳香族氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體；腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的環(huán)多肽，其特征在于A代表色氨酸殘基(W)、酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)。
3.權(quán)利要求1或2所述的環(huán)多肽在制備抗金葡菌感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組能夠與金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白結(jié)合、具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán)多肽C
文檔編號C07K7/06GK1569889SQ0315020
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者邵寧生, 楊光, 柳川, 高亞萍, 董潔, 丁紅梅, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 海南通用同盟藥業(yè)有限公司