專利名稱：金絲桃苷和異鼠李素－3－o－半乳糖苷對照品的同時制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法。
背景技術：
近年來在回歸自然潮流的影響下，中藥(天然藥物)迅速發(fā)展。隨著對中藥(天然藥物)藥效物質基礎研究的不斷深入，對中藥(天然藥物)對照品的需求量也日益增加，如在用高效液相色譜法對一些天然產物作定性定量分析時，常常因一時難以找到適量的對照品而無法深入開展研究。目前對照品的制備方法通常采用制備型高效液相色譜純化，設備昂貴且成本高昂，僅適于制備少量樣品。
吳茱萸(Evodia rutaecarpa[Juss.]Benth)為蕓香科植物吳茱萸干燥將近成熟的果實。有“溫中散寒、疏肝止痛之功效”，常用于治療脘腹冷痛、嘔吐腹瀉、頭痛、胃痛、疝痛、腹痛和痛經等。《本草綱目》稱吳茱萸“開郁化滯，治吞酸、厥陰、痰涎頭痛、陰毒腹痛、疝氣血痢和喉舌口瘡”。近代醫(yī)學亦證明吳茱萸有鎮(zhèn)痛、安神、抗菌、降壓和抗缺氧等藥理作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法。
它的步驟如下1)將吳茱萸藥材置于容器中，加入溶劑回流提??；2)吳茱萸提取液過濾，減壓濃縮，得浸膏；浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取；3)乙酸乙酯萃取部分經兩次柱層析純化；4)柱層析洗脫液合并濃縮，再經重結晶，分別得到金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷兩種對照品。
本發(fā)明的優(yōu)點如下1)由于吳茱萸藥材提取物中雜質很多，既有高極性組分，又有低極性組分，對提取物直接進行柱層析難于得到純品，因此本發(fā)明先采用兩相萃取對吳茱萸提取物進行初步的純化，用石油醚萃取可除去吳茱萸提取物中的低極性組分，用氯仿萃取可除去吳茱萸提取物中的生物堿類組分，用乙酸乙酯萃取可使吳茱萸提取物中的黃酮類物質富集在乙酸乙酯相；2)分離純化的另一個難點是將性質相近的金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷分開。本發(fā)明采用兩次柱層析，第一次柱層析可將絕大部分金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷分離開，第二次柱層析可徹底將金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷分開；3)采用甲醇重結晶可使產品得到進一步的純化，得到純度98.0％以上的晶體；4)本發(fā)明所得的高純度金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷在避光，低溫(0℃)下可穩(wěn)定保存至少半年而含量基本沒有變化；5)本發(fā)明工藝流程短，操作簡單，不需昂貴的特殊設備就可同時制得純度98％以上的金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷純品，不僅成本低廉而且適于較大規(guī)模的制備。


圖1是金絲桃苷液相色譜圖；圖2是異鼠李素-3-O-半乳糖苷液相色譜圖。
具體實施例方式
金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法步驟如下(1)將吳茱萸藥材置于容器中，加入溶劑(甲醇或乙醇水溶液)回流提取。
(2)吳茱萸提取液過濾，減壓濃縮，得浸膏。浸膏加適量的水溶解，依此用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。
(3)乙酸乙酯部分經兩次聚酰胺柱層析，第一次柱層析采用水、10～95％乙醇梯度洗脫；第二次采用20～40％乙醇等度洗脫。
(4)柱層析洗脫液合并濃縮，甲醇重結晶，分別得到金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷兩種對照品。
用上述制備方法對金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷進行提取、分離、純化，得到的產品純度在98.0％以上，符合新藥審批辦法規(guī)定中藥對照品的純度要求，因而可作為金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的對照品使用。
本發(fā)明方法中金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的鑒別采用薄層色譜法；含量測定采用HPLC法，儀器先進，結果可靠。
下面結合實施例對本發(fā)明作詳細說明。
實施例1
吳茱萸果實800g，甲醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，20％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷30mg，含量為99.5％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷171mg，含量為98.4％(HPLC)。
實施例2吳茱萸果實800g，甲醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷31mg，含量為99.4％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷175mg，含量為98.3％(HPLC)。
實施例3吳茱萸果實800g，甲醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，40％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷35mg，含量為98.5％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷179mg含量為98.1％(HPLC)。
實施例4吳茱萸果實800g，50％乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，20％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷33mg，含量為99.3％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷178mg，含量為98.3％(HPLC)。
實施例5吳茱萸果實800g，50％乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷36mg，含量為99.1％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷185mg，含量為98.2％(HPLC)。
實施例6吳茱萸果實800g，50％乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，40％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷38mg，含量為98.3％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷187mg，含量為98.1％(HPLC)。
實施例7吳茱萸果實800g，水回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷18mg，含量為98.2％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷132mg，含量為98.1％(HPLC)。
實施例8吳茱萸果實800g，25％乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷32mg，含量為99.0％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷178mg，含量為98.2％(HPLC)。
實施例9吳茱萸果實800g，75％乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷35mg，含量為99.2％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷182mg，含量為98.1％(HPLC)。
實施例10吳茱萸果實800g，無水乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏加水溶解，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經聚酰胺柱層析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脫，以聚酰胺薄層色譜法鑒別。合并相同組分，再經聚酰胺柱層析，30％乙醇洗脫，甲醇重結晶得到金絲桃苷28mg，含量為99.3％，異鼠李素-3-O-半乳糖苷164mg，含量為98.3％(HPLC)。
金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的分子結構 金絲桃苷異鼠李素-3-O-半乳糖苷金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的理化常數及結構鑒定金絲桃苷mp228～230℃(熔點儀測定法)。ESI-MS(m/z)463(M--H)。
1HNMR(CD3OD)δ7.84(1H，d，J＝1.8Hz，C2′-H)，7.57(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.5Hz，C6 ′-H)，6.85(1H，d，J＝8.5Hz，C5′-H)，6.38(1H，d，J＝1.4Hz，C8-H)，6.18(1H，d，J＝1.4Hz，C6-H)，5.15(1H，d，J＝7.8Hz，C1″-H)，3.46～3.84(6H，m，糖上質子)。13CNMR(CD3OD)δ158.42(C2)，135.77(C3)，179.51(C4)，162.97(C5)，99.92(C6)，166.07(C7)，94.74(C8)，158.81(C9)，105.42(C10)，122.95(C1 ′)，116.09(C2′)，145.79(C3′)，149.94(C4′)，117.79(C5′)，120.04(C6′)，105.61(C1″)，73.17(C2″)，75.08(C3″)，70.01(C4″)，77.16(C5″)，61.94(C6″)。
異鼠李素-3-O-半乳糖苷 mp224～226℃(熔點儀測定法)。ESI-MS(m/z)477(M--H)。1HNMR(CD3OD)δ8.02(1H，d，J＝1.5Hz，C2′-H)，7.55(1H，dd，J＝1.5Hz，J＝8.4Hz，C6′-H)，6.88(1H，d，J＝8.4Hz，C5′-H)，6.32(1H，d，J＝1.4Hz，C8-H)，6.14(1H，d，J＝1.4Hz，C6-H)，5.28(1H，d，J＝7.8Hz，C1″-H)，3.94(3H，S，C3′-OCH3)，3.46～3.83(6H，m，糖上質子)。13CNMR(CD3OD)δ158.24(C2)，135.42(C3)，179.04(C4)，162.68(C5)，99.85(C6)，166.01(C7)，94.67(C8)，158.72(C9)，105.21(C10)，123.60(C1′)，114.53(C2′)，150.99(C3′)，148.48(C4′)，115.99(C5′)，122.98(C6′)，104.69(C1″)，73.19(C2″)，75.06(C3″)，70.00(C4″)，77.21(C5″)，62.16(C6″)，56.95(C3 ′-OCH3)。
金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的定性鑒別和定量測定定性鑒別采用聚酰胺薄層層析，展開劑為乙醇∶水(3∶2)，金絲桃苷的Rf值為O.47，異鼠李素-3-O-半乳糖苷的Rf值為0.60。
定量測定采用HPLC法。儀器Agilentl100型高效液相色譜儀(配四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器)。色譜條件色譜柱為Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-0.5％磷酸溶液(50∶50)；流速1.0mL·min-1；檢測波長360nm；柱溫30℃。在本色譜條件下，金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的HPLC色譜圖見附圖1和附圖2。用高效液相色譜面積歸一法測定圖1和圖2所示的金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷的純度分別為99.4％和98.3％。
權利要求
1.一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法，其特征在于它的步驟如下1)將吳茱萸藥材置于容器中，加入溶劑回流提??；2)吳茱萸提取液過濾，減壓濃縮，得浸膏；浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃?。?)乙酸乙酯萃取部分經兩次柱層析純化；4)柱層析洗脫液合并濃縮，再經重結晶，分別得到金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷兩種對照品。
2.根據權利要求1所述的一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法，其特征在于所說的提取溶劑為甲醇或0～100％乙醇水溶液。
3.根據權利要求1所述的一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法，其特征在于所說的柱層析填料為聚酰胺樹脂。
4.根據權利要求1所述的一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法，其特征在于所說的兩次柱層析純化第一次柱層析采用水、10～95％乙醇梯度洗脫；第二次采用20～40％乙醇等度洗脫。
5.根據權利要求1所述的一種金絲桃苷和異鼠李素-3-O-半乳糖苷對照品的同時制備方法，其特征在于所說的重結晶采用的溶劑為甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金絲桃苷和異鼠李素－3－O－半乳糖苷對照品的同時制備方法。它的步驟如下1)將吳茱萸藥材置于容器中，加入溶劑回流提?。?)吳茱萸提取液過濾，減壓濃縮，得浸膏。浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃??；3)乙酸乙酯萃取部分經兩次柱層析純化；4)柱層析洗脫液合并濃縮，再經重結晶，分別得到金絲桃苷和異鼠李素－3－O－半乳糖苷兩種對照品。本發(fā)明的優(yōu)點是工藝流程短，操作簡單，不需昂貴的特殊設備就可同時制得純度98％以上的金絲桃苷和異鼠李素－3－O－半乳糖苷純品，不僅成本低廉而且適于較大規(guī)模的制備。
文檔編號C07H1/08GK1523032SQ0315084
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月3日 優(yōu)先權日2003年9月3日
發(fā)明者呂秀陽, 潘浪勝, 吳平東 申請人:浙江大學