專利名稱：酵母耐熱相關(guān)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和工業(yè)微生物學。本發(fā)明涉及酵母耐熱基因及其用途，以及利用這些耐熱基因改良的工業(yè)菌株和作物品種。
背景技術(shù)：
隨著1996年釀酒酵母基因組測序完成，有關(guān)方面科學工作者的研究的注意力很快從基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向基因功能，“基因爭奪戰(zhàn)”迅速展開。高溫酵母是一種耐熱真核生物，從基因組學的層面(而不是單個基因的行為)研究其耐熱相關(guān)基因的整體表達，不僅能獲得此類基因自主權(quán)、深入了解高溫酵母耐熱機制，更重要的是通過對酵母抗逆性基因調(diào)控本質(zhì)的認識可為研究高等生物、甚至是人類基因組提供借鑒。另一方面將耐熱因用于酵母工程菌的構(gòu)建，將會解決發(fā)酵工業(yè)所面臨的實際問題。世界上很多熱帶、亞熱帶國家或地區(qū)包括我國南方省區(qū)由于地域環(huán)境溫度較高，夏季高溫季節(jié)菌株生產(chǎn)能力低下，很多廠家被迫停產(chǎn)。即使在春秋季節(jié)，也要使用制冷設(shè)備降低發(fā)酵液的溫度，極大增加生產(chǎn)運行費用。因此，高溫酵母耐熱相關(guān)基因的克隆不僅具有理論戰(zhàn)略意義，而且潛在的商業(yè)價值也是重大的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得酵母在高溫與常溫條件下基因表達的差異，再從中找出耐熱相關(guān)的基因。
本發(fā)明包括下列步驟總體思路為分別抽提30度下培養(yǎng)的酵母Y-179和45度下培養(yǎng)的酵母Y-179的總RNA，進行DD-RTPCR，回收差異片段，T-載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布平皿，挑取藍白斑，擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定；northern blot排除假陽性，測序。
具體的包括以下的方案一.實驗方法1、酵母接種和培養(yǎng)培養(yǎng)基成分葡萄糖2％、蛋白胨2％，酵母抽提物1％，菌種yeastY-179，培養(yǎng)條件30度和45度不同條件下恒溫培養(yǎng)48個小時。
2、總RNA的抽提采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟悉的技術(shù)。
3.總RNA的處理用不含RNA酶的DNA酶處理總RNA去除少量基因組DNA，采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟悉的方法4、RNA的鑒定及定量采用比色法和電泳法鑒定總RNA的質(zhì)量。
5、cDNA的合成MgCl24μl10×PCR緩沖液 2μldNTP混合液2μlRNase抑制物 0.5μl逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl“錨鏈引物”4μl總RNA 1μg無RNA酶的去離子水加至20μl上述成分混勻后，放入PCR儀，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下42℃5分鐘50℃50分鐘70℃15分鐘4℃ 保存6、DD-PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer1.0μlMgCl2(25mM) 1.5μldNTPs(2.5mM) 2.0μl5′隨機引物 1.75μl3′TMR標記-錨鏈引物 0.7μlRT反應(yīng)產(chǎn)物1.0μlEx Taq酶 0.1μl去離子水加至 10μl7、DD-PCR電泳
8、割膠和膠回收試驗9、差異片斷的亞克隆10.Northern blot抽提總RNA，制成cDNA探針，與DD-PCR發(fā)現(xiàn)的差異條帶進行Northern blot。
11.測序采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟悉的技術(shù)對得到的差異表達序列進行測序。


圖1.30℃和45℃生長的酵母PCR mRNA差異展示30℃時生長的酵母，右邊的泳道為45℃時生長的酵母。數(shù)字表示30℃和45℃酵母差異表達的條帶。
圖2.逆向Northern blot分析30℃和45℃生長酵母差異展示的mRNA。DDRT-PCR克隆的14cDNA樣品點在膜上，與30℃和45℃生長酵母mRNA的Bio-cDNA逆向轉(zhuǎn)錄物雜交。(A).(a)對照基因。表中的數(shù)字代表14 cDNA樣品及相應(yīng)位置。
具體實施例方式
一.實驗方法1.酵母接種和培養(yǎng)培養(yǎng)基成分葡萄糖2％、蛋白胨2％，酵母抽提物1％，菌種yeastY-179，培養(yǎng)條件30度和45度不同條件下恒溫培養(yǎng)48個小時。
2、總RNA的抽提根據(jù)TRIZOL總RNA抽提試劑的說明書，具體操作如下1)取0.1克新鮮的組織，用剪刀剪碎，放入含1ml TRIZOL液的玻璃勻漿器中徹底勻漿。
2)將組織勻漿液吸入50ml離心管，于室溫下靜置5分鐘。
3)加入0.2ml氯仿，劇烈振搖15秒混勻后，室溫靜置3分鐘。
4)4℃10,000g離心15分鐘，RNA分布于水相中。
5)將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10分鐘。
6)4℃10,000離心10分鐘7)棄上清，用1m175％乙醇洗滌RNA沉淀，4℃7,500g離心5分鐘，室溫干燥15分鐘。
8)經(jīng)干燥的沉淀中加入30μl DEPC水溶解沉淀，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.總RNA的處理用不含RNA酶的DNA酶處理總RNA去除少量基因組DNA，具體方法如下在一滅菌的Eppendorf管中加入
10×PCRbuffer5.0μl50mmol/L MgCl2 1.5μlRNasin 50uDNA酶I(RNase-Free) 45u總RNA20μg加DEPC處理過所雙蒸水至50μl，混勻，37C℃，30分鐘，加DEPC處理過的雙蒸水至50μl，加酚/氯仿(3∶1)100μl，4℃，10000g，20分鐘，轉(zhuǎn)移上清，加等體積氯仿，4℃，10000g，20分鐘，轉(zhuǎn)移上清，加15μl 2mmol/L乙酸鈉，250μl無水乙醇，-20℃，1小時，4℃，10000g，20分鐘，75％乙醇洗沉淀一次，沉淀溶于20μl DEPC處理過的雙蒸水中。
4、RNA的鑒定及定量采用比色法和電泳法鑒定總RNA的質(zhì)量1.比色法上述RNA溶液經(jīng)適當稀釋(50～100倍)后于260nm和280nm波長處測吸光度(A)，求出A260/A280的值。
2.電泳法RNA電泳的具體操作過程如下a凝膠的制備稱取瓊脂糖1.2克，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液12ml，DEPC處理過的雙蒸水37.3ml，加熱溶解。待溶液冷卻至60℃時加入12.3mol/L的甲醛貯存液10.7ml，10mg/ml的溴乙啶3.0μl，混勻，于室溫中靜置半小時左右，使凝膠凝固。
b樣品的制備及上樣在一滅菌的Eppendorf管中加入RNA樣品4.5μl5×甲醛凝膠電泳緩沖液 2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺 10.0μl上述各成分混勻后于65℃保溫15分鐘，離心5秒鐘使管內(nèi)液體集中于管底，然后立即置于冰裕中，加2μl滅菌的并經(jīng)EDPC處理的10×甲醛凝膠上樣緩沖液，混勻。將凝膠預(yù)電泳5分鐘(5V/cm)，然后上樣。
c電泳在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中以4V/cm的場強電泳。40分鐘后于紫外燈下觀察電泳結(jié)果。
RNA的定量測出RNA溶液的A260值后，根據(jù)下列公式求出其濃度
RNA溶液的濃度(μg/ml)＝A260×40×稀釋倍數(shù)5、cDNA的合成MgCl24μl10×PCR緩沖液2μldNTP 混合液 2μlRNase抑制物 0.5μl逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl“錨鏈引物” 4μl總RNA1μg無RNA酶的去離子水 加至20μl上述成分混勻后，放入PCR儀，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下42℃5分鐘50℃50分鐘70℃15分鐘4℃ 保存6、DD-PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 1.0μlMgCl2(25mM) 1.5μldNTPs(2.5mM) 2.0μl5′隨機引物 1.75μl3′TMR標記-錨鏈引物 0.7μlRT反應(yīng)產(chǎn)物 1.0μlEx Taq酶 0.1μl去離子水加至 10μlDD-PCR反應(yīng)條件如下1)95℃ 2分鐘2)4個循環(huán)92℃ 15秒50℃ 30秒72℃ 2分鐘
3)30個循環(huán)92℃15秒60℃30秒72℃2分鐘4)72℃7分鐘5)4℃ 保存7、DD-PCR電泳流程準備工作(1)用蒸餾水反復(fù)沖洗玻璃板、墊片和梳子。
(2)將無切跡玻璃板的內(nèi)面用4N NaOH處理，目的是為了提供一個親水表面讓膠能粘在玻璃板上，后用蒸餾水充分漂洗，自然晾干；將有切跡玻璃板的內(nèi)面用GlassShield硅化，隨后用乙醇處理，自然晾干。
(3)將無切跡玻璃板的處理面朝上置于灌膠工作臺上，將墊片用蒸餾水浸濕，緊貼于玻板的兩側(cè)，將另一塊玻板的處理面朝下覆蓋在上述玻璃板上。在70ml 5.6％變性HR-1000膠中加入560ml新鮮制備的10％APS和56μl TEMED，水平灌膠，并將梳子的水平一側(cè)插入凝膠內(nèi)，玻板的兩邊用夾子固定，使膠充分凝固。
(4)在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR產(chǎn)物和1.5μl上樣緩沖液，95℃變性2分鐘，迅速置于冰內(nèi)。
(5)上樣前，將膠放在掃描儀上預(yù)掃描，以減少背景干擾。步驟如下1)打開掃描儀和電腦2)取下夾子，將玻板周圍碎膠去除，用蒸餾水沖洗干凈，用玻璃清潔劑擦凈；將膠放入掃描儀，有切跡的玻璃板朝外，關(guān)上掃描儀門。
3)雙擊Acquire SC圖標，打開Scanner菜單，單擊“Initialize”打開掃描燈，當“Ready”出現(xiàn)在屏幕左下角并且燈泡圖標變亮時，單擊“Setup”，調(diào)整掃描設(shè)置，單擊″Browse”，設(shè)置正確盤符路徑，然后單擊“OK”。在Scanner菜單中點擊“Initialize Flat Field”，開始掃描。
DD-PCR電泳及圖像處理(1)梳子齒面向下插入凝膠1～2毫米，將膠板垂直置于Genomyx LR電泳系統(tǒng)中，加入上、下槽緩沖液并清洗樣品孔去除碎膠，上樣，電泳，條件如下電壓3000V
功率 100W時間 5小時(2)電泳結(jié)束后，把玻璃板用水充分沖洗，然后然后用玻璃清潔劑擦洗，晾干；把膠放入掃描儀中，關(guān)上掃描儀的門。
(3)打開Acquire SC程序并啟動掃描儀，開始正式掃描，設(shè)置好文件名，單擊“0K”，整塊膠的掃描大約花費1小時，掃描結(jié)束后，電腦對掃描的圖像進行處理。在Photoshop 5.0中找到并打開目標文件。打開“Adjust”菜單，使用“Invert”工具對圖像進行轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)圖像的亮度和對比度。
差異條帶的定位1)打開膠圖像和“Virtual Grid”這兩個圖像文件，將這兩個圖像并排擺在屏幕上，調(diào)節(jié)這兩個圖像使它們具有相同的大小。
2)選擇Virtual Grid圖像，打開“Select”菜單，單擊“All”然后再打開“Edit”菜單，單擊“Copy”。
3)選擇膠圖像，然后打開“Edit”菜單，單擊“Paste”，這樣Virtual Grid圖像就覆蓋在膠圖像上，打開“Windows”菜單，單擊“Show Layer”，調(diào)節(jié)“Opacity”由100％至25％，這樣膠圖像上就會出現(xiàn)方格，使方格圖像上的1A和19H與凝膠圖像上的兩個圓圈型標志對齊，將差異條帶準確地定位于相應(yīng)的塑料方格板上。
割膠將膠從掃描儀取下，移走有切跡的玻璃板，干膠15分鐘，用蒸餾水沖洗，再干膠5分鐘。將方格板與膠板重疊置于割膠工作臺上，注意方向及位置。用清潔刀片將對應(yīng)于方格板上的差異片斷割下，浸泡于50μl去離子水中，37℃溫育1小時。切割完畢后將玻璃板放入掃描儀重新掃描，檢測割膠的準確性。
割膠條帶的再擴增10×buffer 2.5μldNTP2μlMgCl2 2.5μl引物1 2μl引物2 2μlTaq酶 0.125μlH2O11.875μl
模板2μl總體積 25μl反應(yīng)條件1)95℃2分鐘2)4cycles92℃15秒50℃30秒72℃2分鐘3)25cycles92℃ 15秒60℃ 30秒72℃ 2分鐘4)72℃ 7分鐘反應(yīng)結(jié)束后，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴增出特異條帶。
8、割膠和膠回收試驗(1)紫外燈下，用干凈的刀片將條帶切割下來，放入1.5ml的Eppendorf管中。
(2)每100mg瓊脂糖加入300μl S1液的比例加入S1液，置55℃水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。每2分鐘顛倒混勻一次。(若瓊脂糖重量小于100mg，用雙蒸水補充至100mg，以確保體系總體積不至太小。)(3)入1/3 S1液體積的異丙醇，混勻。55℃溫浴1分鐘(4)溶化后的Agarose液移入吸附柱，再將吸附柱放入同一個收集管中(5)在吸附柱中加入450μl W1液，靜置1分鐘后，高速離心30秒。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中。
(6)在吸附柱加入450μl W1液，高速離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管。
(7)高速離心1分鐘。
(8)將吸附柱放入一個干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜中央加入30μlT1液，37℃靜置5分鐘后，高速離心1分鐘。將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20℃。
9、差異片斷的亞克隆(1)連接反應(yīng)；
Insert DNA4μlPMD 18-T Vector 1μlSolution I5μl加去離子水至 10μl2)16℃反應(yīng)1小時。
(2)轉(zhuǎn)化1)感受態(tài)細菌的制備A用無菌鉑絲蘸取-70℃凍存的E.coli(DH52)，在LB平板上劃線接種。然后將平板置于37℃保溫16小時。
B用無菌牙簽挑取單菌落(約3mm)置于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃振搖(200rpm)16小時。
C取1ml上述培養(yǎng)液接種到一含有50ml LB培養(yǎng)基的燒瓶中，37℃振搖培養(yǎng)3小時，測A600，待其值達到0.3~0.4時將燒瓶取出，立即置冰浴10分鐘。
D在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一消毒過的預(yù)冷的50ml離心管。
E4℃4000rpm離心10分鐘，棄去上培養(yǎng)液，將離心管倒立于濾紙上1分鐘使培養(yǎng)液流盡。
F向離心管中加入10ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重懸沉淀的菌體，置冰浴30分鐘。
G4℃4000rpm離心10分鐘，棄去上清液，將離心管倒立于濾紙上1分鐘。
H加入2ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，輕輕重懸菌體。
I將上述菌體置于4℃冰箱中12～24小時，然后分裝保存于15％的甘油中(-70℃)備用。
2)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程的操作如下連接產(chǎn)物5μl+感受態(tài)細菌200μl，冰浴30分鐘，42℃水浴90秒，加入800μl不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，混勻37℃振搖90分鐘(120rpm)，將菌液接種于含有10μg/ml氨芐青霉素，及IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)板于37℃正放30分鐘，37℃倒放20小時，挑取白色菌斑，接種于5ml含有，10μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖(120rpm)。
(3)質(zhì)粒的抽提采用柱離心式質(zhì)粒抽提試劑盒從上述細菌培養(yǎng)液中抽取質(zhì)粒，操作如下采用柱離心式質(zhì)粒抽提試劑盒從上述細菌培養(yǎng)液中抽取質(zhì)粒，操作如下細菌培養(yǎng)液于13000rpm離心2分鐘，棄上清沉淀懸浮于150μl B1緩沖液中，劇烈振搖加入150μl B2緩沖液，溫和顛倒5次，加入210μl B3緩沖液，立即溫和顛倒5次，13000rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，靜置1分鐘，13000rpm離心30秒棄液體，加入450μl P1緩沖液，13000rpm離心30秒，棄液體，加入450μl W1洗滌液，13000rpm離心30秒，棄液體再離心1分鐘，棄液體以30μl雙蒸水洗脫，洗脫液保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 9.Northern blot按方法中2的方法再次抽提總RNA，用AtlasTMSpotLightTMLabeling Kit(clontech)制成cDNA探針，與DD-PCR發(fā)現(xiàn)的14條差異條帶進行Northern blot(Nonrad-GEArayTMDetection KIT，Supperarray)10.測序氨基酸序列表采用本方法發(fā)現(xiàn)了14條克魯維酵母在高溫和低溫下差異表達的基因。其中兩條為特異性的表達序列。
<110>上海大學<120>CD374838序列<160>3<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>769<212>DNA<213>馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<220>
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<223>n＝a或g或c或tcagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga cgattagcgg ataacaattt cacacaggag 60accattgcat aggggaatat atctatccaa gaggtcctac ggccaatcat taattaaaga120tattaccacc ggaggtagta gagtcaaggt tcaaccacac gaaccactgc gtgagtatag180
ttacgaggac gtcgatttag atgccttgaa gaaggctaat gcagttcgcc aaagcatgga240attcgtggta aatctccgag atttacaaaa tttgatgagc attatggttt tcattactga300taaggtcgaa aaatttgtat atggtacggc agggctcaag aacgaacaga tttcaaccat360ggtgttcctt tcagggtttt tctttttaat atcattatgg gttatagcac cgttcataaa420ttgggcatta atgaccagca tgctggcatg gggagtcatg tttgtgctac atccaagagt480gagaccagta ttattaggac tcttaaaaaa gcagcagttg gaaaagggca aagaggttct540tgaaaagacg gagcggtatg atatactatt ggacgaacca gtagaaacta ggtggacaga600agtgtttgaa attcaaatac aaggaatcac tgaaacagaa tggtcacatt atatgtatgc660gacacatgta ttcgacaaaa gtgatctata tcgnaaatct caaaagccac caccaggcgt720tcaaacnttt gaagaattaa acccccccaa cttgggtttt ttgatcgna769<110>上海大學<120>CD374839序列<160>3<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>375<212>DNA<213>馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)<220>
<221>
<222>
<223>n＝a或g或c或tgggccccccc tcgaggtcga caccagcagg acggggcggc cgtccagtgc ggctgcgatg 60ttgcgggcac caccgtggtg ggtggcgtat gcctcttcgg gatgcgactc gcaccaagtg120atgtcggagg ggccgtgcac ggccacgacg gcatcgggct cgacggcatc catcaaggca180gccacctgcg ggcccgaggt gacatcgacc tgcttccagc gcacacctcg gctctcgggg240aggactgggg cacgccggga gctgagcact gtctcggcgc cgagccgggt gaggcgggcg300gcgatgtgcc cggcaaggta gccggaaccg aggatcagga tgcggccagn nnnnnnnnnn360nncncnnnnn nnnnc37權(quán)利要求
1.酵母耐熱相關(guān)基因，尤其是Kluyveromyces marxianus耐熱相關(guān)的兩個全新基因序列CD374838和CD374839。
2.包含權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.包含權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞。
4.權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因細胞，其中包括真核細胞、原核細胞。
5.權(quán)利要求4所述的原核細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等工業(yè)微生物。
6.權(quán)利要求4所述的真核細胞包括酵母和其他高等真核細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了與酵母耐熱相關(guān)的基因，尤其是Kluyveromyces marxianus耐熱相關(guān)的兩個全新EST。本發(fā)明也提供了發(fā)現(xiàn)這些基因的技術(shù)。
文檔編號C07H21/00GK1537862SQ03151139
公開日2004年10月20日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者文鐵橋, 鮑奎一, 曹子謙, 陳付學, 宋紅生, 李育陽 申請人:上海大學