專利名稱：牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(Lf lactoferrin)是一種鐵結(jié)合性的糖蛋白，存在于大多數(shù)哺乳動物的乳汁、唾液、胰液、眼淚和汗液等幾乎所有外分泌物中，但含量甚微。而牛初乳(即奶牛產(chǎn)犢后1-7天內(nèi)分泌的乳)中含有大量的乳鐵蛋白，它在增強機體免疫能力，調(diào)節(jié)機體生理狀態(tài)平衡，改善胃腸功能，抗菌抗病毒等方面起著重要作用。基于它的多種功能，人們不斷探索各種提取方法。自Sorensen等人最早在動物乳中發(fā)現(xiàn)了乳鐵蛋白以來，人們相繼開發(fā)出多種乳鐵蛋白的分離方法。
其中，主要方法是通過離心脫脂，等電點沉降酪蛋白，鹽析去除雜蛋白后，層析純化乳鐵蛋白。根據(jù)不同原理，層析主要可分為疏水間相互作用、離子交換層析、親和層析三種，而要獲得符合醫(yī)藥和實驗室要求的高純度乳鐵蛋白則需用親和層析純化。研究不同原料、不同分離純化技術(shù)及不斷提高得率對乳鐵蛋白分離純化技術(shù)改進提高具有重要理論和技術(shù)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為了獲得符合醫(yī)藥和實驗室要求的高純度乳鐵蛋白，提供一種改進的牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。
實現(xiàn)上述目的的具體技術(shù)解決方案如下牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，包括獲取脫脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、親和層析、收集高離子強度峰蛋白、透析和凍干；其特征在于取透析6小時后的上清液，上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，用含0～1摩爾的氯化鈉(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩爾磷酸鉀緩沖液以40毫升～180毫升/小時(40～180ml/h)速度線性洗脫。
本發(fā)明的整體工藝路線與傳統(tǒng)的實驗室分離方法相同，但是在關(guān)鍵工藝親和層析獲取高純度乳鐵蛋白過程中進行了條件篩選、優(yōu)化，確定使用肝素-瓊脂糖(Heparin-sepharoseCL-6B)樹脂親和層析柱從牛初乳中分離提純?nèi)殍F蛋白時，利用內(nèi)含0～1摩爾氯化鈉(0～1M NaCl)pH6.5～8.5 0.05～0.005M磷酸鉀緩沖液洗脫得率比報道中內(nèi)含0.05～1摩爾氯化鈉(0.05～1M NaCl)pH7.4 5mM巴比妥鈉—鹽酸緩沖液(巴比妥鈉-HCl緩沖液)高15％以上。
本發(fā)明首次采用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharose CL-6B)樹脂親和層析柱從牛的初乳中分離提純高純度的乳鐵蛋白，經(jīng)檢測純度在90％以上；通過不同緩沖液的對照，找到一種比報道所用緩沖液具有更高得率的緩沖液系統(tǒng)；建立了使用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)親和層析從牛初乳中分離提取乳鐵蛋白的最佳技術(shù)條件。
與傳統(tǒng)意義上的親和層析比較，肝素-瓊脂糖(Heparin-seharose CL-6B)無須進行特異性配體固定，使用方便、廣泛；另外現(xiàn)有技術(shù)主要是從奶酪乳清中提純?nèi)殍F蛋白，而牛初乳中乳鐵蛋白的含量比奶酪乳清中高，且由于初乳和奶酪乳清的理化特性不同，本發(fā)明建立了用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)樹脂親和層析柱從初乳中分離提純的技術(shù)參數(shù)。
本發(fā)明在國外分離提純?nèi)殍F蛋白的同類方法中，對緩沖液這一重要的技術(shù)參數(shù)進行摸索，得到了效果更好的磷酸鉀緩沖液體系，在獲得高純度乳鐵蛋白(純度在90％以上)的基礎(chǔ)上進一步提高得率(得率提高15％以上)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步地說明。
牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝路線如下獲取脫脂乳→去除酪蛋白→去除球蛋白→透析→親和層析→收集高離子強度峰蛋白→透析→凍干實施例1取產(chǎn)后24小時內(nèi)的荷斯坦奶牛初乳，在4℃下4000g離心30分鐘脫脂后；用2摩爾鹽酸(2M HCl)調(diào)pH至4.6，4℃下4000g離心30分鐘去除酪蛋白；用2摩爾氫氧化鈉(2M NaOH)調(diào)pH至6.8，按42％飽和度加入硫酸氨((NH4)2SO4)，室溫下作用3小時，2000g離心20分鐘去球蛋白；取上清液透析6小時后上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，在蠕動泵推動下，用含0～1摩爾氯化鈉(0～1M NaCl)的pH6.5、0.05摩爾磷酸鉀緩沖液以150毫升/小時速度線性洗脫；由設(shè)置好的自動部分收集器收集，紫外檢測儀檢測，記錄儀記錄不同收集管內(nèi)的蛋白峰曲線；收集高離子強度峰蛋白，透析后凍干。
肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱是利用肝素(一種多聚陰離子的蛋白聚糖)作為配基，通過糖苷鍵與一些結(jié)構(gòu)糖蛋白結(jié)合，利用不同離子強度的緩沖液洗脫來分離結(jié)合強度不同的蛋白質(zhì)。
親和層析操作如下將肝素—瓊脂糖干粉用去離子水溶脹8小時，抽濾去除氣體；用不含氯化鈉的磷酸鉀緩沖液浸泡后，裝入玻璃純化柱內(nèi)，平衡8小時；將透析后的樣品上柱。
實施例2其洗脫工藝條件為pH7.0 0.01摩爾磷酸鉀緩沖液(內(nèi)含0～0.5摩爾氯化鈉)以50毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例3其洗脫工藝條件為pH7.4 0.01摩爾磷酸鉀緩沖液(內(nèi)含0.1～0.6摩爾氯化鈉)以180毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例4其洗脫工藝條件為pH7.7 0.005摩爾磷酸鉀緩沖液(內(nèi)含0.05～0.7摩爾氯化鈉)以120毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例5其洗脫工藝條件為pH8.0 0.005摩爾磷酸鉀緩沖液(內(nèi)含0.2～0.6摩爾氯化鈉)以90毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
權(quán)利要求
1.牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，包括獲取脫脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、親和層析、收集高離子強度峰蛋白、透析和凍干；其特征在于取透析6小時后的上清液，上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，用含0～1摩爾的氯化鈉(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩爾磷酸鉀緩沖液以40毫升～180毫升/小時(40～180ml/h)速度線性洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，其特征在于所述的親和層析操作方法是，將肝素—瓊脂糖干粉用去離子水溶脹8～12小時，抽濾去除氣體；用不含氯化鈉的磷酸鉀緩沖液浸泡后，裝入玻璃純化柱內(nèi)，平衡8～12小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。其特點是關(guān)鍵工藝確定使用肝素－瓊脂糖(Heparin－sepharose CL－6B)樹脂親和層析柱從牛初乳中分離提純?nèi)殍F蛋白，同時采用磷酸鉀緩沖液洗脫。本發(fā)明的分離提純方法可實現(xiàn)獲得純度在90％以上的提取物，采用磷酸鉀緩沖液，在獲得高純度乳鐵蛋白(純度在90％以上)的基礎(chǔ)上進一步提高得率，得率比報道的巴比妥鈉—鹽酸緩沖液高15％以上。
文檔編號C07K14/435GK1486989SQ03152940
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者王志耕, 葉震敏 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)