專利名稱：新型熒光標(biāo)識化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型標(biāo)識試劑、該標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物、包含該絡(luò)合物的熒光標(biāo)識劑，采用該絡(luò)合物作為標(biāo)識劑的熒光標(biāo)識方法，采用該熒光標(biāo)識劑的熒光測定方法以及螢光測定方法用試劑。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，作為生物試樣中微量物質(zhì)的分析方法，經(jīng)常使用的是利用抗體-抗原反應(yīng)的免疫測定和DNA雜交測定等。在這些分析方法中，需要使用標(biāo)識抗體、抗原、DNA、DNA堿基衍生物、DNA寡核苷酸等用的標(biāo)識劑，作為可高靈敏度進(jìn)行檢測的標(biāo)識劑，經(jīng)常使用的方式有利用熒光的標(biāo)識、利用放射性同位素的標(biāo)識或者利用酶的標(biāo)識等。
由放射性同位素進(jìn)行標(biāo)識的方式雖然具有高靈敏度，但是其缺點(diǎn)是在貯藏、使用和處理時伴有危險。此外，由酶進(jìn)行的標(biāo)識時，由于酶的分子量大，存在的問題是容易受溫度等外部環(huán)境的影響，不穩(wěn)定，并且再現(xiàn)性較低，由于酶標(biāo)識劑與被標(biāo)識物結(jié)合，存在酶和被標(biāo)識物活性下降的問題。
作為由熒光進(jìn)行的標(biāo)識方法，已知采用有機(jī)熒光色素進(jìn)行標(biāo)識的方法(例如熒光素、羅丹明和丹磺酰氯等)，但是由于激發(fā)光的散射光產(chǎn)生的背景噪音，以及來自試樣中存在的其它共存物質(zhì)的熒光產(chǎn)生的背景噪音，對有機(jī)熒光色素的熒光檢測產(chǎn)生較大的影響，難以高靈敏度的進(jìn)行檢測。
作為由熒光進(jìn)行標(biāo)識的方法，除此以外，還已知由稀土類熒光絡(luò)合物進(jìn)行標(biāo)識的方法。稀土類熒光絡(luò)合物具有的熒光特性包括具有較長的熒光壽命(與普通熒光物質(zhì)具有幾個納秒的熒光壽命相比，稀土類熒光絡(luò)合物具有幾十或幾百微秒或其以上的熒光壽命)，較大的斯托克斯頻移(スト一クスシフト)、尖銳的熒光峰。通過活用這些特性，已經(jīng)開發(fā)出將稀土類熒光絡(luò)合物作為標(biāo)識劑的時間分辨熒光測定法。由這些特性，通過采用時間分辨熒光測定法，可除去由激發(fā)光或生物試樣中產(chǎn)生的短壽命的背景熒光產(chǎn)生的障礙，可進(jìn)行高靈敏度的測定。
將稀土類絡(luò)合物作為標(biāo)識劑使用的時間分辨熒光測定系統(tǒng)的一個實(shí)例，為Perk in Elmer Life Sciences社(舊Wallac社)開發(fā)的“DELFIA”(Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用異硫代氰酸酯苯基-EDTA或者異硫代氰酸酯苯基-DTTA(DTTA＝二亞乙基三胺4乙酸)和稀土類離子的絡(luò)合物作為標(biāo)識劑，標(biāo)識蛋白質(zhì)或核酸等，在測定熒光之前，添加包含β-二酮-三辛基膦氧化物(TOPO)-三酮X-100的所謂熒光增強(qiáng)溶液，使稀土類金屬離子從非熒光性的絡(luò)合物游離出來的同時，生成β-二酮-稀土類離子-TOPO三元絡(luò)合物的微膠粒溶液，由此進(jìn)行熒光測定的方法(E.Soini，T.Lovgren，CRC Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105-154；E.P.Diamandis，T.K.Christopoulos，Anal.Chem.，1990，62，1149A-1157A；I.Hemmila，J.Alloys Compd.，1995，225，480-485)。但是在該DELFIA系統(tǒng)中，由于在測定溶液中存在過量的β-二酮和TOPO，如果與環(huán)境中的稀土類金屬離子發(fā)生反應(yīng)的話，可發(fā)出較強(qiáng)的熒光，因此存在所謂非常容易受到稀土類金屬離子的污染的較大缺點(diǎn)。此外，由于DELFIA系統(tǒng)需要添加熒光增強(qiáng)溶液，存在測定步多，以及不能進(jìn)行固相測定的缺點(diǎn)。
此外，另一采用稀土類絡(luò)合物作為標(biāo)識劑的時間分辨熒光測定系統(tǒng)，有加拿大的Diamandis等開發(fā)出的FIAgen系統(tǒng)。(E.P.Diamandis，Clin.Biochem.，1988，21，139-150；E.F.G.Dickson，A，Pollak，E.P.Diamandis，Pharmac.Ther.，1995，66，207-235)。FIAgen系統(tǒng)是采用可直接標(biāo)識蛋白質(zhì)的熒光性銪絡(luò)合物(4，7-二(氯代磺苯基)-1，10-菲繞啉)-2，9-二羧酸(BCPDA)-Eu3+)。該系統(tǒng)不存在環(huán)境中銪污染的問題，在固相下也可進(jìn)行測定。但是該系統(tǒng)的標(biāo)識劑的熒光強(qiáng)度與上述DELFIA系統(tǒng)相比，弱2位數(shù)或其以上，存在檢測靈敏度低，難以進(jìn)行高靈敏度分析的問題。
作為其它采用稀土類絡(luò)合物作為標(biāo)識劑的時間分辨熒光測定系統(tǒng)，有法國的CIS Bio International社的TRACE(time resolved amplifiedcryptate emission)測定系統(tǒng)(G.Mathis，Clin.Chem.，1995，41，1391-1397；G.Mathis，J.Clin.Ligand Assay，1997，20，141-147)。在該系統(tǒng)中，采用銪熒光標(biāo)識劑三(聯(lián)吡啶)穴狀化合物-Eu3+和有機(jī)熒光標(biāo)識劑別藻藍(lán)蛋白作為熒光能量移動的供體和受體使用，其優(yōu)點(diǎn)是在均勻的溶液中反應(yīng)完成后，可直接進(jìn)行時間分辨熒光測定，不使用固相材料，不用進(jìn)行B/F分離和清洗操作，但是由于存在靈敏度低的缺點(diǎn)，因此不能應(yīng)用于高靈敏度的測定。
為了克服上述稀土類熒光絡(luò)合物標(biāo)識劑以及采用這些標(biāo)識劑的時間分辨熒光測定方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明者等開發(fā)了一種具有氨基、可直接標(biāo)識蛋白質(zhì)的氯代磺?；?座β-二酮型的標(biāo)識劑，并研究了采用這些標(biāo)識劑的時間分辨熒光測定方法的應(yīng)用(特開平9-241233號公報；特開2000-111480號公報；J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem.，2001，73，1869-1876；S.Sueda，J.Yuan，K.Matsumoto，Bioconjugate Chem.，2000，11，827-831；K.Matsumoto，J.Yuan，G.Wang，H.Kimura，Anal.Biochem.，1999，276，81-87；J.Yuan，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596-601；J.Yuan，G.Wang，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Biochem.，1997，254，283-287)。
但是，上述氯代磺酰化4座β-二酮型的標(biāo)識劑一般水溶性差，因此在標(biāo)識較小的生物體物質(zhì)(例如具有氨基的分子量較小的核酸堿基或其它的有機(jī)化合物)時，所產(chǎn)生的問題是被標(biāo)識的生物體水溶性低，從溶液中沉淀出來。此外，由于螯合力不足，因此可使用的緩沖劑的種類也受到限制。因此，將這些物質(zhì)用于直接標(biāo)識還存在困難。
以下是與本申請的發(fā)明相關(guān)的在先技術(shù)文獻(xiàn)信息。
1 特開平9-241233號公報2 特開2000-111480號公報3 E.Soini，T.Lovgren，CRC Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105-154；
4 E.P.Diamandis，T.K.Christopoulos，Anal.Chem.，1990，62，1149A-1157A；5 I.Hemmila，J.Alloys Compd.，1995，225，480-4856 E.F.G.Dickson，A，Pollak，E.P.Diamandis，Pharmac.Ther.，1995，66，207-2357 E.P.Diamandis，Clin.Biochem.，1988，21，139-150；8 G.Mathis，Clin.Chem.，1995，41，1391-1397；9 G.Mathis，J.Clin.Ligand Assay，1997，20，141-14710 J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem.，2001，73，1869-1876；11 S.Sueda，J.Yuan，K.Matsumoto，Bioconjugate Chem.，2000，11，827-831；12 K.Matsumoto，J.Yuan，G.Wang，H.Kimura，Anal.Biochem.，1999，276，81-87；13 J.Yuan，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596-601；14 J.Yuan，G.Wang，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Biochem.，1997，254，283-287發(fā)明的公開本發(fā)明鑒于以上所述的現(xiàn)狀，目的是提供一種新型標(biāo)識試劑，其特征包括具有與被標(biāo)識物質(zhì)(例如來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)等)結(jié)合的基團(tuán)，容易與稀土類離子形成絡(luò)合物，并且該絡(luò)合物在水溶液中足夠穩(wěn)定，與緩沖劑的種類無關(guān)，具有足夠的熒光強(qiáng)度和長的熒光壽命。本發(fā)明還提供該標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物、包含該絡(luò)合物的熒光標(biāo)識劑，以及采用該熒光標(biāo)識劑的熒光測定方法等。
附圖的簡要說明

圖1是表示本發(fā)明ATTTA-Eu3+溶液的熒光光譜的圖。其中[ATTTA-Eu3+]＝1.0×10-6M，在pH為9.1的0.05M的硼酸緩沖液中。
圖2是表示本發(fā)明ATTTA-Eu3+稀釋溶液的時間分辨熒光測定的結(jié)果的圖。
圖3是表示通過本發(fā)明時間分辨熒光免疫測定所得的檢測量曲線的圖。
圖4是表示本發(fā)明的具有活性取代基的ATBTA-Eu3+絡(luò)合物的熒光光譜的圖。其中[ATBTA-Eu3+]＝1.5×10-6M，在pH為9.1的0.05M的硼酸緩沖液中。
圖5是表示采用SA(DTBTA-Eu3+)26(□)以及SA(BSA)0.9(DTBTA-Eu3)42(○)的時間分辨熒光免疫測定所得的人PSA測定的檢測量曲線的圖。
圖6是表示采用DTBTA-Eu3+標(biāo)識的小鼠抗人PSA單克隆抗體的時間分辨熒光免疫測定所得的人PSA測定的檢測量曲線的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳形式本發(fā)明涉及一種標(biāo)識試劑，其由具有2，2’6’，2”-三吡啶骨架或者2，6-二吡唑吡啶骨架，與被標(biāo)識物質(zhì)結(jié)合的基團(tuán)，以及與稀土類離子形成絡(luò)合物用的結(jié)合基團(tuán)的化合物形成，更詳細(xì)地說，涉及熒光標(biāo)識試劑。
此外，本發(fā)明還涉及由上述標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物、包含該絡(luò)合物的熒光標(biāo)識劑，以及以采用該絡(luò)合物作為標(biāo)識劑為特征的熒光標(biāo)識方法等。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及采用上述熒光標(biāo)識劑標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及以采用上述絡(luò)合物作為標(biāo)識劑為特征的熒光測定方法，包含該絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑的熒光測定方法用試劑，以及包含該絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑的試劑盒。
此外，本發(fā)明還涉及以采用上述標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子為特征的熒光標(biāo)識方法。
此外，本發(fā)明還涉及采用上述標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子進(jìn)行了熒光標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)。
另外，本發(fā)明還涉及以采用上述標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子為特征的熒光測定方法，包含上述標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子的熒光測定方法用試劑，以及包含上述標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子的試劑盒。
此外，本發(fā)明涉及通式[1]所示的化合物或其鹽。
(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
此外，本發(fā)明涉及通式[2]所示的化合物或其鹽。
(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
此外，本發(fā)明涉及通式[3]所示的化合物或其鹽。

(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
此外，本發(fā)明涉及通式[4]所示的化合物或其鹽。
(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
即，本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述課題進(jìn)行了專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)配體分子中具有2，2’6’，2”-三吡啶骨架或者2，6-二吡唑吡啶骨架，并且一并具有多個羧酸基或冠醚基的化合物容易溶解于水，并且與稀土類離子可容易地形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，此外，通過向該相同的有機(jī)配體分子中導(dǎo)入可與被標(biāo)識的物質(zhì)(被標(biāo)識物質(zhì))容易結(jié)合的活性取代基，可在溫和的條件下標(biāo)識蛋白質(zhì)等的生物體分子，由此完成了本發(fā)明。
可與被標(biāo)識的物質(zhì)(被標(biāo)識物質(zhì))結(jié)合的活性取代基是這樣的基團(tuán)，其與這些被標(biāo)識物質(zhì)具有的特定取代基反應(yīng)，可形成共價鍵。
此外，由于本發(fā)明的新型標(biāo)識試劑容易溶解于水，因此即使被標(biāo)識物質(zhì)為小分子，在標(biāo)識后也具有足夠的水溶性。
作為本發(fā)明中具有2，2’6’，2”-三吡啶骨架或者2，6-二吡唑吡啶骨架，與被標(biāo)識物質(zhì)結(jié)合的基團(tuán)，以及與稀土類離子形成絡(luò)合物用的結(jié)合基團(tuán)的化合物的具體實(shí)例，例如為以下通式[1]所示的化合物或其鹽，
(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
以下通式[2]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
以下通式[3]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
以下通式[4]所示的化合物或其鹽，
(式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
上述通式(1)-(4)所示的化合物均為新化合物。
在上述通式(1)-(4)中，作為R所表示的芳基、具有活性取代基的芳基中的芳基，可例舉出例如，碳原子數(shù)為6-30，優(yōu)選為6-20，更優(yōu)選為6-14的單環(huán)、多環(huán)或稠合環(huán)式的芳香族烴基，更具體地可例舉出例如，苯基、甲苯基、二甲苯基、萘基、甲基萘基、蒽基、菲基、2-聯(lián)苯基、3-聯(lián)苯基、4-聯(lián)苯基等。
另外，作為雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基中的雜環(huán)基，可列舉其環(huán)中至少有一個或其以上氮原子、氧原子或硫原子、1個環(huán)的大小為5-20元，優(yōu)選為5-10元，更優(yōu)選為5-7元，可與環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳基等的碳環(huán)式基縮合的飽和或不飽和單環(huán)、多環(huán)或稠合環(huán)式基團(tuán)，更具體地可例舉出例如，吡啶基、噻吩基、苯基噻吩基、噻唑基、呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯基、嗎啉基、咪唑基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基等。
作為這些芳基和雜環(huán)基的活性取代基，為可與被標(biāo)識的物質(zhì)(被標(biāo)識物質(zhì))結(jié)合的活性取代基，也可以為與這些被標(biāo)識物質(zhì)具有的特定取代基反應(yīng)，可形成共價鍵的基團(tuán)，作為優(yōu)選的基團(tuán)可例舉出例如氨基、異硫代氰酸酯基、鹵代乙酰基氨基、肼基、(4，6-二鹵代-1，3，5-三氮烯-2-基)氨基、羧基等。
在此，作為鹵代乙酰基氨基，(4，6-二鹵代-1，3，5-三氮烯-2-基)氨基中的鹵代基，可舉出-Cl、-Br、-I等。
作為上述通式(1)-(4)中優(yōu)選的R基，可舉出苯基，4-氨基苯基、2-吡啶基、6-氨基-2-吡啶基、2-噻吩基、5-氨基-2-噻吩基、4-聯(lián)苯基、4’-氨基-4-聯(lián)苯基等。
作為上述通式(1)-(4)中所示化合物的鹽，對于羧基等酸性基團(tuán)可舉出鈉、鉀等的堿金屬的鹽等，對于氨基等的堿性基可例示鹽酸、硫酸等酸的鹽。
對于由如上所述的本發(fā)明化合物制成的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物，在其結(jié)構(gòu)上沒有限制。作為稀土類離子的種類，通過考慮所形成的絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度、熒光波長、熒光壽命等可容易進(jìn)行選擇。優(yōu)選為與三價鑭系離子的絡(luò)合物，特別優(yōu)選與三價銪離子、三價鋱離子、三價釤離子和三價鏑離子的絡(luò)合物。
由稀土類金屬離子和本發(fā)明的標(biāo)識試劑絡(luò)合形成的絡(luò)合物為熒光絡(luò)合物，因此，本發(fā)明的絡(luò)合物可作為熒光標(biāo)識劑使用。
作為本發(fā)明的熒光標(biāo)識劑，其包含本發(fā)明的絡(luò)合物，但是本發(fā)明的熒光標(biāo)識劑，包含作為絡(luò)合物單獨(dú)分離的，包含該絡(luò)合物的溶液，以及包含稀土類金屬離子和本發(fā)明標(biāo)識試劑形成的溶液中的任何一種。
本發(fā)明的熒光標(biāo)識方法，其采用由本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為標(biāo)識劑，換言之，其通過使用上述本發(fā)明的熒光標(biāo)識劑，或者采用上述本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子，對各種被標(biāo)識物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)識來實(shí)施。
在采用標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子的情況下，可采用下述任何一種方法(1)首先使被標(biāo)識物質(zhì)與標(biāo)識試劑反應(yīng)，此后使適當(dāng)?shù)南⊥令惤饘匐x子作用，形成絡(luò)合物，由此進(jìn)行熒光標(biāo)識的方法，(2)使標(biāo)識試劑、稀土類金屬離子和被標(biāo)識物質(zhì)同時反應(yīng)，將絡(luò)合物的形成和熒光標(biāo)識同時實(shí)施的方法。
對由本發(fā)明標(biāo)識試劑或熒光標(biāo)識試劑標(biāo)識的被標(biāo)識物質(zhì)沒有特別限制，其可廣泛地適用于來自生物體的物質(zhì)，生理活性物質(zhì)以及其它的化學(xué)物質(zhì)等。此外，對被標(biāo)識物質(zhì)的分子尺寸，存在形態(tài)(溶液或固相)、為單獨(dú)的物質(zhì)還是組合物等沒有特別限制。作為采用本發(fā)明的熒光標(biāo)識劑標(biāo)識的被標(biāo)識物質(zhì)的條件，只要該被標(biāo)識物質(zhì)的一部分上具有至少一個可與本發(fā)明熒光標(biāo)識劑共價結(jié)合的反應(yīng)基的話即可。或者可導(dǎo)入這種基團(tuán)的話即可。
由此，作為可由本發(fā)明的熒光標(biāo)識劑標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)，可例舉出例如，酶、蛋白質(zhì)、肽(寡肽、多肽)、糖、糖蛋白質(zhì)、激素、脂質(zhì)、核酸、核酸衍生物、核酸探針、寡核苷酸、細(xì)胞、脂肪類化合物、氨基酸、藥物(包含抗生物質(zhì))等。
此外，作為蛋白質(zhì)的具體實(shí)例，可舉出抗體及其衍生物，抗原及其衍生物、抗生物素蛋白(包含鏈霉抗生物素蛋白)、血清白蛋白、各種半抗原、激素、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G等。
作為其它的化學(xué)物質(zhì)，可例舉出農(nóng)藥、日常化學(xué)品、化學(xué)試劑、工業(yè)化學(xué)品等。
本發(fā)明的熒光測定法的特征為通過采用以上本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑進(jìn)行測定，或者通過采用以上本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子，對各種被標(biāo)識物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)識來進(jìn)行測定。
作為熒光測定法的代表例，可例舉出時間分辨熒光測定法。
作為時間分辨熒光測定法的應(yīng)用實(shí)例，可例舉出時間分辨熒光免疫測定法、DNA雜交測定法、色譜法、熒光顯微鏡法等。
本發(fā)明的熒光測定法用試劑，為上述本發(fā)明的熒光測定法中所用的試劑，其特征為包含由上述本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑，或者包含上述本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子。
本發(fā)明的熒光測定法用試劑可在測定來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)和其它化學(xué)物質(zhì)等時使用，特別是在測定來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)時更加有效。
作為來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)的具體例，如上文所記載。
此外，作為本發(fā)明的試劑盒，為上述本發(fā)明的熒光測定法中所用的試劑盒，其特征為包含由上述本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑，或者包含上述本發(fā)明的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子的試劑盒。
本發(fā)明的標(biāo)識試劑的合成方法，對起始原料沒有特別限制，任何標(biāo)識試劑均可通過適宜地組合通常的有機(jī)合成方法合成得到。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確定可采用通常的有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析法，例如1H NMR、有機(jī)元素分析法等實(shí)施。
以下以R為5-氨基-2-噻吩基的情形為例，示出了本發(fā)明的通式[1]所示的標(biāo)識試劑的合成方法的反應(yīng)流程。

以下以R為5-氨基-2-噻吩基的情形為例，示出了本發(fā)明的通式[2]所示的標(biāo)識試劑的合成方法的反應(yīng)流程。

以下以R為5-氨基-2-噻吩基的情形為例，示出了本發(fā)明的通式[3]所示的標(biāo)識試劑的合成方法的反應(yīng)流程。

以下以R為5-氨基-2-噻吩基的情形為例，示出了本發(fā)明的通式[4]所示的標(biāo)識試劑的合成方法的反應(yīng)流程。
在本發(fā)明通式(1)-(4)所示的化合物或其鹽中，優(yōu)選的化合物的實(shí)例除了上述R基為5-氨基-2-噻吩基的化合物以外，還可舉出R基為聯(lián)苯基的化合物以及R基為4’-氨基-4-聯(lián)苯基的化合物。作為R基為聯(lián)苯基的化合物以及R基為4’-氨基-4-聯(lián)苯基的化合物的更具體實(shí)例，可舉出以下通式[1-1]所示的化合物，
作為更具體的實(shí)例可舉出以下通式[1-2]所示的化合物， 以及以下通式[2-1]所示的化合物等。
此外，本發(fā)明還將日本專利申請2002-063961的說明書以及日本專利申請2002-271924的說明書中記載的內(nèi)容全部引入本說明書中。
實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但是本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1N，N，N’，N’-[(4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]四(乙酸)(簡稱為ATTTA)的合成(1)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶(化合物(1))的合成將N-[2-(吡啶-2’-基)2-氧代乙基]吡啶鎓碘化物(16.3g，50mmol)、(E)-3-(2”-噻吩基)-1-(吡啶-2’-基)-2-丙烯酮(10.76g，50mmol)和乙酸銨(23.1g)加入到500ml干燥的甲醇中，在攪拌下回流24小時。將反應(yīng)液冷卻，并將沉淀過濾，在冷甲醇中充分洗凈后，從乙腈中重結(jié)晶，得到化合物(1)。真空干燥后的收率為43.8％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.74(d，J＝7.9Hz，2H)，8.69(s，2H)，8.64(d，J＝7.9Hz，2H)，7.87(t，J＝7.9Hz，2H)，7.78(d，J＝3.6Hz，1H)，7.44(d，J＝5.1Hz，1H)，7.38-7.32(m，1H)。
(2)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-1，1”-二氧化物(化合物(2))的合成將化合物1(12.6g，40mmol)溶解在500ml的CH2Cl2中后，加入40g的3-氯代過氧化苯甲酸，在室溫下攪拌20小時。將反應(yīng)液用4×200ml的10％的Na2CO3水溶液洗凈，用Na2SO4干燥有機(jī)層后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物溶解在300ml的甲醇中，濾去微量的不溶物之后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物用乙腈充分清洗，通過真空干燥獲得化合物(2)。產(chǎn)率為61.4％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ9.23(s，2H)，8.35(d，J＝6.6Hz，2H)，8.23(d，J＝7.9Hz，2H)，7.70(d，J＝3.6Hz，1H)，7.45-7.28(m，5H)，7.16-7.13(m，1H)(3)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二腈(化合物(3))的合成向300ml的CH2Cl2中加入化合物(2)(8.69g，25mmol)和(CH3)3SiCN(24.8g，250mmol)，在室溫下攪拌20分鐘后，花費(fèi)大約20分鐘慢慢滴加100mmol的氯化苯甲酰。在室溫下將反應(yīng)液攪拌20分鐘后，減壓下餾去溶劑，直至剩一半的量。向剩余的溶液中加入600ml 10％的K2CO3的水溶液，在室溫下攪拌1小時后，將沉淀過濾，用水充分洗凈，此后用冷的CH2Cl2洗凈，之后真空干燥得到化合物(3)。產(chǎn)率為98.5％。由1HNMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.95(d，J＝7.9Hz，2H)，8.62(s，2H)，8.32-8.26(m，2H)，8.19(t，J＝7.6Hz，2H)，8.07(d，J＝3.6Hz，1H)，7.86(d，J＝5.1Hz，1H)，7.28-7.31(m，1H)(4)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羧酸二甲基酯(化合物(4))的合成向H2SO445ml/CH3COOH 45ml/H2O 12ml的混合溶劑中加入4.40g化合物(3)，在75-80℃下攪拌48小時。向400g冰中加入反應(yīng)液，攪拌后，將沉淀過濾，用水和乙醇充分洗凈后，真空干燥得到4.85g水解產(chǎn)物。
向已用冰水冷卻了的400ml干燥甲醇中加入8g SOCl2，攪拌15分鐘后，加入如上所得的4.85g水解產(chǎn)物，在攪拌下回流20小時。減壓蒸餾除去溶劑，將生成物溶解在350ml的CHCl3中，采用15％的NaHCO3水溶液將有機(jī)層充分洗凈后，用Na2SO4干燥。減壓蒸餾除去溶劑，將生成物在硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝99∶1w/w)上進(jìn)行純化。從甲苯中將該生成物進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物(4)。產(chǎn)率為48.1％。
元素分析結(jié)果(C23H17N3O4S)
計算值(％)，C＝64.03，H＝3.97，N＝9.74實(shí)測值(％)，C＝63.76，H＝3.83，N＝9.52進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.16(d，J＝7.8Hz，2H)，8.78(s，2H)，8.20(d，J＝7.6Hz，2H)，8.03(t，J＝7.8Hz，2H)，7.82(d，J＝3.6Hz，1H)，7.49(d，J＝5.1Hz，1H)，7.22-7.19(m，1H)，4.08(s，6H)。
(5)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基(化合物(5))的合成向200ml干燥的乙醇中加入化合物(4)(2.89g，6.7mmol)和1.05gNaBH4，在室溫下攪拌3小時后，回流1小時，減壓蒸餾除去溶劑，將生成物加入到100ml的飽和NaHCO3水溶液中，攪拌下加熱直至沸騰。冷卻后，將沉淀過濾，用水充分洗凈后，進(jìn)行真空干燥。將生成物溶解在200ml的THF中，過濾除去微量的不溶物后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物用乙腈充分洗凈，真空干燥獲得化合物(5)。產(chǎn)率為72.2％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.63(s，2H)，8.50(d，J＝7.3Hz，2H)，8.03(t，J＝7.3Hz，2H)，7.93(d，J＝3.6Hz，1H)，7.82(d，J＝5.1Hz，1H)，7.61(d，J＝7.1Hz，2H)，7.28-7.31(m，1H)，4.74(s，4H)。
(6)4’-(5-硝基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基(化合物(6))的合成將化合物(5)(1.50g，4mmol)加入到15ml的乙酸酐中，在室溫下攪拌1小時后，在60℃下進(jìn)一步攪拌1小時。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入2g發(fā)煙硝酸和20ml乙酸的混和溶液后，在室溫下攪拌24小時。向反應(yīng)液中加入200ml的水，攪拌1晚后，用4×50ml的CHCl3進(jìn)行萃取。對CHCl3溶液進(jìn)行水洗，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物溶解在100ml乙醇中，加入4gKOH和5ml水，在室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾除去溶劑。將生成物用水洗后，真空干燥獲得化合物(6)。產(chǎn)率為75.1％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.57(s，2H)，8.40(d，J＝7.3Hz，2H)，8.15(d，J＝3.6Hz，1H)，7.96(t，J＝7.5Hz，2H)，7.89(d，J＝5.1Hz，1H)，7.57(d，J＝7.1Hz，2H)，5.50(sb，2H)，4.72(s，4H)。
(7)4’-(5-硝基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基(化合物(7))的合成將化合物(6)(1.26g，3mmol)加入到120mlTHF-15mlDMF的混和溶劑中，使其溶解，加入2.40g的PBr3，在攪拌下回流54時。減壓蒸餾除去溶劑后，向生成物中加入200ml的CHCl3，用4×80ml 10％的Na2CO3水溶液對CHCl3溶液進(jìn)行清洗。有機(jī)層用Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑后，向所得的殘渣用己烷充分洗凈，真空干燥得到化合物(7)。產(chǎn)率為70.1％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.55(s，2H)，8.46(d，J＝7.3Hz，2H)，8.16(d，J＝4.4Hz，1H)，7.97(t，J＝7.5Hz，2H)，7.88(d，J＝5.1Hz，1H)，7.65(d，J＝7.1Hz，2H)，4.80(s，4H)。
(8)N，N，N’，N’-[4’-(5-硝基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基]二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙基酯(化合物(8))的合成將化合物(7)(1.09g，2mmol)溶解在150ml的CH3CN中，并加入4.1mmol的亞胺二乙酸二乙酯和20mmol的K2CO3，攪拌下回流24小時。過濾除去不溶物，減壓蒸餾除去溶劑后，向生成物中加入200ml的CHCl3，用4×100ml的飽和Na2SO4水溶液洗凈CHCl3溶液。用Na2SO4對有機(jī)層進(jìn)行干燥，減壓蒸餾除去溶劑，獲得油狀產(chǎn)物，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH3COOEt-CH3OH-THF＝90∶6∶4w/w/w)進(jìn)行純化，獲得化合物(8)。產(chǎn)率為50.1％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.70(s，2H)，8.51(d，J＝7.8Hz，2H)，7.99(d，J＝4.4Hz，1H)，7.87(t，J＝7.6Hz，2H)，7.74(d，J＝4.4Hz，1H)，7.66(d，J＝7.8Hz，2H)，4.19(q，J＝7.2Hz，8H)，4.08(s，4H)，3.71(s，8H)，1.26(t，J＝7.2Hz，12H)(9)N，N，N’，N’-[4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基]二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙基酯(化合物(9))的合成將化合物(8)(0.76g，1mmol)溶解在70ml的EtOH中，加入SnCl2·2H2O(1.32g，6mmol)后，在70-80℃下攪拌1小時。冷卻至室溫后，注入已經(jīng)用冰水冷卻了的100mlH2O-5gDTPA的溶液中，攪拌后，向該溶液中加入20ml的飽和NaHCO3水溶液。室溫下攪拌30分鐘后，用3×100ml的CHCl3萃取水溶液，用Na2SO4對有機(jī)層進(jìn)行干燥。減壓蒸餾除去溶劑，對殘渣進(jìn)行真空干燥，獲得化合物(9)。產(chǎn)率為93.5％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.44(s，2H)，8.41(d，J＝7.2Hz，2H)，7.78(t，J＝7.6Hz，2H)，7.56(d，J＝7.2Hz，2H)，7.38(d，J＝4.2Hz，1H)，6.17(d，J＝4.2Hz，1H)，4.19(q，J＝7.2Hz，8H)，4.08(s，4H)，3.74(s，8H)，1.26(t，J＝7.2Hz，12H)。
(10)N，N，N’，N’-[4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基]二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙基酯[ATTTA，(化合物(10)]的合成將化合物(9)(586mg，0.8mmol)溶解在40mlEtOH-5mlH2O-1.2gKOH的溶液中，在室溫下攪拌24小時后，減壓蒸餾除去溶劑。將殘渣溶解在60ml的水中，在攪拌下慢慢滴加1％的CF3COOH水溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至約1。在室溫下攪拌3小時后，將沉淀過濾，用0.5％的CF3COOH水溶液充分洗凈后，真空干燥獲得化合物(10)。產(chǎn)率為90.0％。
元素分析結(jié)果(C29H28N6O8S)計算值(％)，C＝56.13，H＝4.55，N＝13.54
實(shí)測值(％)，C＝55.94，H＝4.38，N＝13.62進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d3)δ8.10(s，2H)，8.04(d，J＝7.2Hz，2H)，7.45(t，J＝7.2Hz，2H)，7.31(d，J＝7.2Hz，2H)，7.25(d，J＝4.2Hz，1H)，6.14(d，J＝4.2Hz，1H)，4.00(s，4H)，3.51(s，8H)。
實(shí)施例2 [(4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)(簡稱為ATTBB)的合成(1)[4’-(5-硝基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基]二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)的合成將4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基(1.09g，2mmol)溶解在150ml的CH3CN中后，加入2.1mmol的4，13-二氮雜-18-冠6-醚和20mmol的K2CO3，攪拌下回流24小時。將不溶物過濾除去，減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝9∶1w/w)純化生成物。產(chǎn)率為65.3％。通過FAB-MS確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和KBr的絡(luò)合物(1∶1，M.W.＝765.727)。
FAB-MS測定值766。
(2)[4’-(5-氨基-2-噻吩基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基]二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)(簡稱為ATTBB)的合成將上述(1)所得的KBr絡(luò)合物(765.7mg，1mmol)溶解在50ml干燥的甲醇中，加入150mg的10％的Pd/C催化劑后，加入40mg的NaBH4。在室溫下攪拌2小時，將不溶物過濾除去后，減壓蒸餾除去溶劑，將生成物溶解在30ml的水中。用4×50ml的CHCl3萃取水溶液，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑，真空干燥。產(chǎn)率為40.3％。通過FAB-MS確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和KBr的絡(luò)合物(1∶1，M.W.＝735.744)。
FAB-MS測定值736實(shí)施例3 N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-氨基-2”-噻吩基)吡啶]四乙酸(簡稱為BAPTA)的合成(1)2，6-二溴代-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物11)的合成在250ml的乙酸中溶解4-氨基-2，6-二溴代吡啶(3.25g，12.9mmol)和12.9g噻吩，攪拌下加入1.93g硝酸異戊酯，在室溫下攪拌24小時后，進(jìn)一步在大約45℃下攪拌3小時。減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣在40ml的10％K2CO3水溶液中中和后，用4×60ml的CHCl3萃取。用Na2SO4干燥有機(jī)層后，減壓蒸餾除去溶劑，殘渣用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝9∶1w/w)進(jìn)行純化，進(jìn)一步用甲醇進(jìn)行2次重結(jié)晶，得到化合物(11)。產(chǎn)率為47.9％元素分析結(jié)果(C9H5NBr2S)計算值(％)，C＝33.88，H＝1.58，N＝4.39。
實(shí)測值(％)，C＝33.46，H＝1.46，N＝4.23。
進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ7.60(s，2H)，7.50-7.48(m，2H)，7.16-7.13(m，1H)(2)2，6-二(3’-甲氧基羰基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶(化合物12)的合成向100ml干燥的THF中溶解10.1g 3-甲氧基羰基吡唑，向其中加入3.12g金屬鉀，在約60℃攪拌，直至金屬全部溶解。向該溶液中加入化合物(11)(6.38g，20mmol)，攪拌下回流1小時。減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣用6×150ml的CHCl3萃取后，再次減壓蒸餾除去溶劑。生成物用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝9∶1w/w)進(jìn)行純化，進(jìn)一步用苯重結(jié)晶，得到化合物(12)。產(chǎn)率為45.5％元素分析結(jié)果(C19H15N5O4S)
計算值(％)，C＝55.74，H＝3.69，N＝17.10實(shí)測值(％)，C＝55.47，H＝3.62，N＝16.82進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.60(d，J＝2.7Hz，2H)，8.22(s，2H)，7.79(d，J＝3.6Hz，1H)，7.53(d，J＝5.0Hz，1H)，7.20-7.18(m，1H)，7.03(d，J＝2.7Hz，2H)，4.01(s，6H)。
(3)2，6-二(3’-羥甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶(化合物13)的合成向300ml干燥的THF中加入1.30gLiAlH4和化合物(12)(2.72g，6.64mmol)，在室溫下攪拌4小時后，加入1.1ml水，此后慢慢滴加1.1ml15％的NaOH和4.5ml水。在室溫下攪拌30分鐘后，將沉淀過濾，進(jìn)一步用少量THF清洗沉淀，將其與THF溶液合并。減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣用乙腈充分洗凈后，真空干燥獲得化合物(13)。產(chǎn)率為71.3％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.88(d，J＝2.6Hz，2H)，7.96(d，J＝3.6Hz，1H)，7.90(s，2H)，7.85(d，J＝5.1Hz，1H)，7.29-7.26(m，1H)，6.60(d，J＝2.5Hz，2H)，4.58(s，4H)(4)2，6-二(3’-羥甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-硝基-2”-噻吩基)吡啶(化合物14)的合成將化合物(13)(1.59g，4.5mmol)加入到20ml的乙酸酐中，室溫下攪拌1小時后，在60℃下進(jìn)一步攪拌1小時。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入1.5g發(fā)煙硝酸和20ml乙酸的混和溶液后，在室溫下攪拌24小時。向反應(yīng)液中加入200ml的水，攪拌1晚后，用4×50ml的CHCl3進(jìn)行萃取。對CHCl3溶液進(jìn)行水洗，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑。將殘渣真空干燥后，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝9∶1w/w)進(jìn)行純化。將生成物溶解在100ml乙醇中，加入4gKOH和5ml水，在室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣用水洗后，真空干燥獲得化合物(14)。產(chǎn)率為70.4％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.01(d，J＝2.6Hz，2H)，8.15(d，J＝3.6Hz，1H)，7.89(s，2H)，7.84(d，J＝5.1Hz，1H)，6.71(d，J＝2.5Hz，2H)4.57(s，4H)(5)2，6-二(3’-溴代甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-硝基-2”-噻吩基)吡啶(化合物15)的合成將化合物(14)(1.59g，4mmol)溶解在200mlTHF中，向其中加入3.20g的PBr3，在攪拌下回流4小時。減壓蒸餾除去溶劑后，向殘渣中加入200ml的CHCl3，用4×80ml 10％NaHCO3水溶液對CHCl3溶液進(jìn)行清洗。有機(jī)層用Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑。所得的殘渣用己烷充分洗凈，真空干燥得到化合物(15)。產(chǎn)率為94.1％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ9.04(d，J＝2.6Hz，2H)，8.17(d，J＝3.6Hz，1H)，7.87(s，2H)，7.81(d，J＝5.1Hz，1H)，6.73(d，J＝2.5Hz，2H)，4.66(s，4H)。
(6)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-硝基-2”-噻吩基)吡啶]四乙酸四乙基酯(化合物(16))的合成將化合物(15)(1.05g，2mmol)溶解在150ml的CH3CN中，并加入4.1mmol的亞胺二乙酸二乙酯和20mmol的K2CO3，攪拌下回流24小時。過濾除去不溶物，減壓蒸餾除去溶劑后，向殘渣中加入200ml的CHCl3，用4×100ml的飽和Na2SO4對CHCl3溶液進(jìn)行清洗，用Na2SO4對有機(jī)層進(jìn)行干燥，減壓蒸餾除去溶劑后，獲得油狀產(chǎn)物，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH3COOEt-CH2Cl2＝9∶1w/w)進(jìn)行純化，獲得化合物(16)。產(chǎn)率為50.0％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ9.03(d，J＝2.6Hz，2H)，8.14(d，J＝3.6Hz，1H)，7.88(s，2H)，7.81(d，J＝5.1Hz，1H)，6.72(d，J＝2.5Hz，2H)，4.18(q，J＝7.2Hz，8H)，4.08(s，4H)，3.65(s，8H)，1.26(t，J＝7.2Hz，12H)。
(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-氨基-2”-噻吩基)吡啶]四乙酸四乙酯(化合物(17))的合成將化合物(16)(741mg，1mmol)溶解在70ml的EtOH中，向其中加入SnCl2·2H2O(1.32g，6mmol)后，在70-80℃下攪拌1小時。冷卻至室溫后，注入已經(jīng)用冰水冷卻了的100mlH2O-5gDTPA的溶液中，攪拌后，向該溶液中加入20ml的飽和NaHCO3水溶液。室溫下攪拌30分鐘后，用3×100ml的CHCl3萃取水溶液，用Na2SO4對有機(jī)層進(jìn)行干燥。減壓蒸餾除去溶劑后，對生成物進(jìn)行真空干燥，獲得化合物(17)。產(chǎn)率為91.7％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.81(d，J＝2.6Hz，2H)，7.58(s，2H)，7.38(d，J＝3.6Hz，1H)，6.72(d，J＝2.5Hz，2H)，6.52(d，J＝5.1Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，8H)，4.08(s，4H)，3.65(s，8H)，1.26(t，J＝7.2Hz，12H)。
(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-氨基-2”-噻吩基)吡啶]四乙酸(BAPTA、化合物(18))的合成將化合物(17)(569mg，0.8mmol)溶解在40mlEtOH-5mlH2O-1.2gKOH的溶液中，在室溫下攪拌24小時后，減壓蒸餾除去溶劑。將殘渣溶解在60ml水中，在攪拌下慢慢滴加1％的CF3COOH水溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至約1。在室溫下攪拌3小時后，將沉淀過濾，用0.5％的CF3COOH水溶液充分洗凈后，真空干燥獲得化合物(18)。產(chǎn)率為91.3％。
元素分析結(jié)果(C25H26N8O8S)計算值(％)，C＝50.17，H＝4.38，N＝18.71。
實(shí)測值(％)，C＝50.29，H＝4.25，N＝18.48。
進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.16(d，J＝2.6Hz，2H)，7.72(s，2H)，7.42(d，J＝3.6Hz，1H)，6.76(d，J＝2.5Hz，2H)，6.59(d，J＝5.1Hz，1H)，4.00(s，4H)，3.55(s，8H)。
實(shí)施例4 [2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-氨基-2”-噻吩基)吡啶]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)(簡稱為BAAPB)的合成(1)[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-硝基-2”-噻吩基)吡啶]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)的合成將2，6-二(3’-溴代甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-硝基-2”-噻吩基)吡啶(0.80g，2mmol)溶解在100ml的CH3CN中后，向其中加入2.1mmol的4，13-二氮雜-18-冠6-醚和20mmol的K2CO3，攪拌下回流24小時。將不溶物過濾除去，減壓蒸餾除去溶劑后，生成物(殘渣)用二氧化硅凝膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝9∶1w/w)進(jìn)行純化。產(chǎn)率為53.8％。通過FAB-MS確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和KBr的絡(luò)合物(1∶1，M.W.＝743.667)。
FAB-MS測定值744(2)[2，6-二(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-(5”-氨基-2”-噻吩基)吡啶]-NN’，NN’-二(3，6-二氧雜三亞乙基)(BAAPB)的合成將上述(1)所得的KBr絡(luò)合物(743.7mg，1mmol)溶解在50ml干燥的甲醇中，向其中加入10％的Pd/C催化劑后，加入40mg的NaBH4。在室溫下攪拌2小時，將不溶物過濾除去后，減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣溶解在30ml的水中。用4×50ml的CHCl3萃取水溶液，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣真空干燥獲得目標(biāo)化合物(絡(luò)合物)。產(chǎn)率為52.4％。通過FAB-MS確認(rèn)生成物為BAAPB和KBr的絡(luò)合物(1∶1，M.W.＝713.684)。
FAB-MS測定值714。
實(shí)施例5 各種配位體和銪的絡(luò)合物的合成實(shí)施例1-4所得的4種配體內(nèi)的ATTTA和BAPTA的銪絡(luò)合物的合成如下首先將配體溶解在pH為9.1的0.05M的硼酸緩沖液中，接著加入相同摩爾量的EuCl3，在室溫下攪拌1小時，獲得ATTTA-Eu3+和BAPTA-Eu3+的溶液。
而ATTBB和BAAPB的銪絡(luò)合物的合成如下首先將ATTBB·KBr和BAAPB·KBr溶解在乙醇中，此后加入兩倍摩爾量的EuCl3，在攪拌下回流2小時。減壓蒸餾除去溶劑，將殘渣溶解在CHCl3中，過濾除去不溶物后，減壓蒸餾除去溶劑，將所得的殘渣真空干燥，獲得絡(luò)合物ATTBB-Eu3+或BAAPB-Eu3+。
實(shí)施例6 4種銪絡(luò)合物的熒光特性的評價將實(shí)施例5所得的4種絡(luò)合物溶解在pH為9.1的0.05M的硼酸緩沖液中，配制成1.0×10-6M的溶液。采用這些溶液，分別對其UV光譜、熒光光譜、熒光量子產(chǎn)率、摩爾吸光系數(shù)和熒光壽命進(jìn)行了測定。結(jié)果示于表1。另外，ATTTA-Eu3+的熒光光譜示于圖1中。
表1

從表1可知，4種絡(luò)合物都具有較強(qiáng)的熒光和較長的熒光壽命，可有效地作為時間分辨熒光測定的標(biāo)記試劑使用。
實(shí)施例7 采用本發(fā)明的絡(luò)合物的時間分辨熒光測定采用ATTTA-Eu3+，通過時間分辨熒光測定對該絡(luò)合物的測定靈敏度進(jìn)行測定。絡(luò)合物稀釋用溶劑是pH為7.8的0.05M的Tris-鹽酸緩沖液，測定裝置為Victor 1420時間分辨熒光測定裝置(Perkin Elmer Life Science社制造)。測定條件為激勵波長＝340nm，測定波長＝615nm，延遲時間(Delay time)＝0.2ms，窗口時間(window time)＝0.4ms、循環(huán)時間(Cycle time)＝1.0ms。
圖2顯示了ATTTA-Eu3+稀釋溶液的時間分辨熒光測定結(jié)果。
通過采用背景信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的2倍進(jìn)行計算，結(jié)果為采用ATTTA-Eu3+的時間分辨熒光測定的最低檢測限度為8.0×10-13M。該結(jié)果表示采用ATTTA-Eu3+的時間分辨熒光測定具有非常高的靈敏度。
實(shí)施例8采用ATTTA-Eu3+對鏈霉抗生物素蛋白(SA)的標(biāo)識在進(jìn)行標(biāo)識前，首先采用2，4，6-三氯代-1，3，5-三嗪對ATTTA的氨基進(jìn)行活化。該方法如下。
將ATTTA(124mg，0.2mmol)溶解在5ml pH為4.9的0.5M乙酸鈉水溶液中，在攪拌下滴加1ml包含2，4，6-三氯代-1，3，5-三嗪(36mg，0.2mmol)的丙酮溶液，在室溫下攪拌30分鐘。用1MHCl將反應(yīng)溶液的pH調(diào)整至約1后，通過離心分離將沉淀回收，采用稀釋了100倍的HCl溶液進(jìn)行清洗后，真空干燥。采用該方法獲得具有活性取代基(4，6-二氯代-1，3，5-三嗪-2-基)的ATTTA衍生物。所得物質(zhì)不需純化，可直接用于蛋白質(zhì)的標(biāo)識。
將5mg的SA溶解在10ml pH為9.1的0.1M碳酸鈉緩沖液中后，加入10mg具有(4，6-二氯代-1，3，5-三嗪-2-基)的ATTTA衍生物，直接在室溫下攪拌1小時。將反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠過濾，將未反應(yīng)的標(biāo)識試劑和標(biāo)識的蛋白質(zhì)分離。使用1.0×40cm的交聯(lián)葡聚糖G-50柱，采用0.05M的NH4HCO3的水溶液進(jìn)行展開。獲取少量的標(biāo)識蛋白質(zhì)溶液，通過采用標(biāo)準(zhǔn)EuCl3水溶液進(jìn)行熒光滴定，對標(biāo)識SA溶液中的ATTTA濃度進(jìn)行測定，計算標(biāo)識SA的標(biāo)識率，獲得SA(ATTTA)21的溶液。向SA(ATTTA)21溶液中加入摩爾量為ATTTA摩爾量的1.5倍的EuCl3，攪拌后，加入25mg作為防腐劑的NaN3，此后加入50mg防止標(biāo)識蛋白質(zhì)吸附在容器上用的BSA(牛血清白蛋白)，此后，在-20℃下保存。在時間分辨熒光免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05MTris-鹽酸緩沖液稀釋1000倍后進(jìn)行使用。
實(shí)施例9 采用SA(ATTTA)21對人血清中的CEA(癌胎兒性抗原)的時間分辨熒光免疫測試測試是采用96-孔微量滴定板實(shí)施。具體操作方法如下。
(i)配制生物素化抗體將0.5ml(2.4mg/ml)的兔抗人CEA抗體溶液(Dako-immunoglobulins，丹麥)對3L生理鹽水在4℃下透析2次，每次24小時，之后加入純水0.5ml，NaHCO38.4ml，和6mg磺基琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰胺基)己酸酯(NHS-LC-生物素，Pierce Chem.Co.)，在室溫下攪拌1小時后，在4℃下進(jìn)行24小時溫育。將反應(yīng)溶液對于包含0.25g NaN3的，3L 0.1M的NaHCO3溶液在4℃下透析2次，每次24小時，之后加入10mg的BSA，直至在免疫測試中使用時，一直在-20℃下保存。在免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液中稀釋1000倍后進(jìn)行使用。
(ii)對96-孔微量滴定板的包被用pH為9.6的0.1M碳酸緩沖液對山羊抗人CEA多克隆抗體稀釋為8微克/ml后，在96孔的透明聚苯乙烯制得的微量滴定板(FluoroNunc plate)上每孔注入60μl，在4℃下溫育24小時。此后，用包含0.05％的Tween 20、pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液(緩沖液-1)清洗板兩次，進(jìn)一步用pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液(緩沖液-2)清洗一次。
(iii)CEA的免疫測試向已包被的96-孔微量滴定板的孔中各注入50μl的CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液(生化學(xué)工業(yè)株式會社)，在37℃下溫育1小時后，對板采用緩沖液-1清洗2次，采用緩沖液-2清洗1次。向各個孔中每次分別注入50μl生物素化的兔抗人CEA抗體，在37℃下溫育1小時后，對板采用緩沖液-1清洗2次，采用緩沖液-2清洗1次。向各個孔中每次分別注入50μl的SA(ATTTA)21溶液，在37℃下溫育1小時后，對板采用緩沖液-1清洗4次，直接在固相時間分辨熒光測定中使用。
在本測定中使用的時間分辨熒光測定裝置為Victor 1420時間分辨熒光測定裝置(PerkinElmer Life Science社制造)。測定條件為激勵波長＝340nm，測定波長＝615nm，延遲時間(Delay time)＝0.2ms，窗口時間(window time)＝0.4ms、循環(huán)時間(Cycle time)＝1.0ms。
以上免疫測試所得的檢測線如圖3所示。如果將背景信號+3SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)作為檢測限度的話，該方法中的檢測限度為60pg/ml。該值與市售的放射免疫測試或酶免疫測試相比，是約為其2倍的高靈敏度。
實(shí)施例10 通式[1-1]所示化合物的制造通過以下所示的反應(yīng)流程，制造了R基為4’-氨基-聯(lián)苯-4-基的通式[1-1]所示化合物。

通式[1-1]所示化合物[(4’-(4””-氨基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]四乙酸(以下簡稱為ATBTA))的合成(1)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶)(上述反應(yīng)流程中的化合物(1))的合成將N-[2-(吡啶-2’-基)-2-氧代乙基]吡啶輸?shù)饣?16.3g，50mmol)、(E)-3-(聯(lián)苯-4”-基)-1-(吡啶-2’-基)-2-丙烯酮(14.26g，50mmol)和乙酸銨(23.1g)加入到500ml干燥的甲醇中，在攪拌下回流24小時。將反應(yīng)液冷卻，并將沉淀過濾，在冷甲醇中充分洗凈后，從乙腈中重結(jié)晶，得到化合物(1)。真空干燥后收率為49.3％。
元素分析結(jié)果(C27H19N3)計算值(％)，C＝84.13，H＝4.97，N＝10.90實(shí)測值(％)，C＝84.01，H＝4.82，N＝10.88進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.80(s，2H)，8.75(d，J＝4.6Hz，2H)，8.69(d，J＝7.8Hz，2H)，8.01(d，J＝8.6Hz，2H)，7.89(t，J＝7.6Hz，2H)，7.75(d，J＝8.2Hz，2H)，7.68(d，J＝6.9Hz，2H)，7.48(t，J＝6.9Hz，2H)，7.41-7.33(m，3H)。
(2)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶)-1，1”-二氧化物(上述反應(yīng)流程中的化合物(2))的合成將上述反應(yīng)流程中的化合物(1)(19.27g，50mmol)溶解在700ml的CH2Cl2中，向其中加入50g的3-氯代過氧化苯甲酸，在室溫下攪拌20小時。將反應(yīng)液用3×300ml的10％Na2CO3水溶液洗凈，用Na2SO4干燥有機(jī)相后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物溶解在300ml的甲醇中，濾去微量的不溶物之后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物用乙腈充分清洗，通過真空干燥獲得化合物(2)。產(chǎn)率為91.4％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ9.29(s，2H)，8.38(d，J＝6.6Hz，2H)，8.25(d，J＝8.2Hz，2H)，7.94(d，J＝8.6Hz，2H)，7.72(d，J＝8.6Hz，2H)，7.66(d，J＝6.9Hz，2H)，7.50-7.43(m，2H)，7.41-7.29(m，5H)。
(3)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二腈(上述反應(yīng)流程中的化合物(3))的合成向450ml的CH2Cl2中加入25mmol上述反應(yīng)流程中的化合物(2)(15.65g，37.5mmol)和(CH3)3SiCN(37.2g，375mmol)，在室溫下攪拌20分鐘后，花費(fèi)大約20分鐘慢慢滴加150mmol的氯化苯甲酰。在室溫下將反應(yīng)液攪拌24小時后，減壓下餾去溶劑，直至一半量。向剩余的溶液中加入600ml 10％的K2CO3的水溶液，在室溫下攪拌1小時后，將沉淀過濾，用水充分洗凈，此后用冷的CH2Cl2洗凈，之后真空干燥得到化合物(3)。產(chǎn)率為80.8％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.99(d，J＝7.6Hz，2H)，8.75(s，2H)，8.31(t，J＝7.9Hz，2H)，8.20(d，J＝7.6Hz，2H)，8.10(d，J＝7.6Hz，2H)，7.92(d，J＝8.2Hz，2H)，7.78(d，J＝7.6Hz，2H)，7.54-7.42(m，3H)。
(4)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羧酸二甲基酯(上述反應(yīng)流程中的化合物(4))的合成向H2SO490ml/CH3COOH 90ml/H2O 20ml的混合溶劑中加入8.17g(20mmol)的上述反應(yīng)流程中的化合物(3)，在90-100℃下攪拌24小時。向800g冰中加入反應(yīng)液，攪拌后，將沉淀過濾，用水和乙醇充分洗凈后，真空干燥得到9.13g水解產(chǎn)物。
向已用冰水冷卻了的600ml干燥甲醇中加入24g亞硫酰氯SOCl2，攪拌15分鐘后，加入如上所得的9.13g水解產(chǎn)物，在攪拌下回流24小時。減壓蒸餾除去溶劑，將生成物溶解在1000ml的氯仿CHCl3中，采用15％的NaHCO3水溶液將有機(jī)層充分洗凈后，用Na2SO4干燥。減壓蒸餾除去溶劑，將生成物在硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝99∶1w/w)上進(jìn)行純化。從甲苯中將該生成物進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物(4)。產(chǎn)率為48.5％。
元素分析結(jié)果(C31H23N3O4)計算值(％)，C＝74.24，H＝4.62，N＝8.38
實(shí)測值(％)，C＝74.15，H＝4.55，N＝8.38進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.88(s，2H)，8.86(d，J＝7.9Hz，2H)，8.20(t，J＝7.6Hz，2H)，8.06(d，J＝7.9Hz，2H)，8.00(d，J＝7.2Hz，2H)，7.78(d，J＝6.6Hz，2H)，7.70(d，J＝6.9Hz，2H)，7.52-7.30(m，3H)4.07(s，6H)。
(5)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基(上述反應(yīng)流程中的化合物(5))的合成向400ml干燥的乙醇中加入上述反應(yīng)流程中的化合物(4)(7.02g，14mmol)和3.02gNaBH4，在室溫下攪拌3小時后，回流1小時，減壓蒸餾除去溶劑，將生成物加入到200ml的飽和NaHCO3水溶液中，攪拌下加熱直至沸騰。冷卻后，將沉淀過濾，用水充分洗凈后，進(jìn)行真空干燥，獲得化合物(5)。產(chǎn)率為92.0％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.75(s，2H)，8.55(d，J＝7.9Hz，2H)，8.07-8.00(m，4H)，7.92(t，J＝8.2Hz，2H)，7.78(d，J＝7.2Hz，2H)，7.61(d，J＝7.9Hz，2H)，7.57-7.50(m，2H)7.46-7.40(m，1H)5.57(t，J＝5.9Hz，2H)，4.47(d，J＝4.6Hz，4H)。
(6)4’-(4””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基(上述反應(yīng)流程中的化合物(6))的合成將上述反應(yīng)流程中的化合物(5)(1.78g，4mmol)加入到30ml的乙酸酐中，在60℃下攪拌15分鐘。減壓蒸餾除去溶劑，向生成物中加入20ml的乙酸酐，用冰水進(jìn)行外部冷卻的條件下，滴加3ml發(fā)煙硝酸和20ml乙酸的混和溶液后，用冰水進(jìn)行外部冷卻的條件下，攪拌2小時后，進(jìn)一步在室溫下攪拌24小時。向反應(yīng)液中加入250ml的水，攪拌1小時后，用3×100ml的CHCl3進(jìn)行萃取，用5％的NaHCO3水溶液對CHCl3溶液進(jìn)行清洗，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物溶解在150ml乙醇中，加入10gKOH和15ml水，在室溫下攪拌36小時。向反應(yīng)液中加入300ml的水，通過離心分離收集沉淀，真空干燥5小時后，用水充分洗凈。真空干燥獲得化合物(6)。產(chǎn)率為90.7％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和4’-(2””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基的混合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.81-8.79(m，2H)，8.61(d，J＝7.9Hz，2H)8.37(d，J＝7.2Hz，1H)，8.17-8.03(m，6H)，7.88-7.80(m，1H)7.75-7.58(m，4H)，4.78(s，1H)。
(7)4’-(4””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基(上述反應(yīng)流程中的化合物(7))的合成將上述反應(yīng)流程中的化合物(6)(1.78g，3.63mmol)加入到200mlTHF-80mlDMF的混和溶劑中，使其溶解，加入3.52g的PBr3，在攪拌下回流6小時。減壓蒸餾除去溶劑后，向生成物中加入300ml的CHCl3，用4×200ml飽和Na2SO4水溶液對有機(jī)層進(jìn)行清洗后，進(jìn)一步用200ml 10％的NaHCO3水溶液進(jìn)行洗凈。有機(jī)層用Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝99.5∶0.5v/v)對生成物進(jìn)行純化，減壓蒸餾除去溶劑，并真空干燥獲得化合物(7)。產(chǎn)率為56.3％。
元素分析結(jié)果(C29H20Br2N4O2)計算值(％)，C＝56.52，H＝3.27，N＝9.09。
實(shí)測值(％)，C＝56.64，H＝3.32，N＝9.10。
質(zhì)量分析結(jié)果(FAB-MS)m/e，617.3(M+H+)，571.3(M-NO2)進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和4’-(2””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基的混合物。
1H NMR(CDCL3)δ8.70(s，1H)，8.69(s，1H)，8.57(d，J＝7.9Hz，2H)，8.33(d，J＝8.8Hz，1H)，8.10-8.00(m，6H)，7.95(d，J＝8.2Hz，1H)，7.70-7.55(m，4H)，4.84(s，4H)(8)N，N，N’，N’[(4’-(4””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)-二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙酯(上述反應(yīng)流程中的化合物(8))的合成將1.98mmol上述反應(yīng)流程中的化合物(7)(1.22g，)溶解在250mlCH3CN-50mlTHF的混合溶劑中，并加入4.1mmol的亞胺二乙酸二乙酯和20mmol的K2CO3，攪拌下回流24小時。過濾除去不溶物，減壓蒸餾除去溶劑后，向生成物中加入250ml的CHCl3，用2×200ml的飽和Na2SO4水溶液對CHCl3溶液進(jìn)行清洗。用Na2SO4干燥有機(jī)相，減壓蒸餾除去溶劑后，獲得油狀產(chǎn)物，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH3COOEt)進(jìn)行純化，減壓蒸餾除去溶劑并真空干燥，獲得化合物(8)，產(chǎn)率為46.1％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物和4’-(2””-硝基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)-二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙酯的混和物。
1H NMR(CDCl3)δ8.77(s，2H)，8.57(d，J＝7.9Hz，2H)，8.36(d，J＝8.6Hz，1H)，8.05(d，J＝7.9Hz，1H)，7.98-7.79(m，6H)，7.66(d，J＝7.6Hz，2H)，7.57-7.42(m，2H)，4.21(s，4H)，4.17(q，J＝7.3Hz，8H)，3.71(s，8H)，1.24(t，J＝7.3Hz，12H)。
(9)N，N，N’，N’[(4’-(4””-氨基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)-二(亞甲基氮川)]四乙酸四乙酯(上述反應(yīng)流程中的化合物(9))的合成將0.91mmol上述反應(yīng)流程中的化合物(8)(0.76g)溶解在60ml的EtOH中，加入SnCl2·2H2O(1.25g，5.7mmol)后，在70-80℃下攪拌1小時。冷卻至室溫后，注入已經(jīng)用冰水冷卻了的120mlH2O-7.85g DTPA的溶液中，攪拌后，向該溶液中加入20ml的飽和NaHCO3水溶液。室溫下攪拌30分鐘后，用4×100ml的CHCl3萃取水溶液，用Na2SO4對有機(jī)層進(jìn)行干燥。減壓蒸餾除去溶劑，生成物用硅膠色譜柱(展開溶劑CH3COOEt-CH3OH＝98∶2v/v)對生成物進(jìn)行純化，減壓蒸餾除去溶劑，并真空干燥獲得化合物(9)。產(chǎn)率為79.2％。由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.76(s，2H)，8.55(d，J＝7.3Hz，2H)，8.00-7.84(m，4H)，7.72-7.62(m，4H)，7.51(d，J＝8.6Hz，2H)，6.81(d，J＝8.6Hz，2H)，4.21(s，4H)，4.17(q，J＝7.3Hz，8H)3.71(s，8H)，1.24(t，J＝7.3Hz，12H)。
(10)[(4’-(4””-氨基-聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)-二(亞甲基氮川)]四乙酸(ATBTA，上述反應(yīng)流程中的化合物(10))的合成將上述反應(yīng)流程中的化合物(9)(580mg，0.72mmol)溶解在100mlEtOH-5ml H2O-2.2gKOH的溶液中，在室溫下攪拌20小時后，減壓蒸餾除去溶劑。將生成物溶解在100ml的水中，在攪拌下慢慢滴加稀釋了10倍的鹽酸水溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至約1。在室溫下攪拌3小時后，將沉淀離心收集，用稀釋了100倍的鹽酸水溶液充分洗凈后，真空干燥獲得化合物(10)。產(chǎn)率為65.9％。
元素分析結(jié)果(ATBTA·3HCl·4H2O，C37H45N6O12Cl3)計算值(％)，C＝50.95，H＝5.20，N＝9.64。
實(shí)測值(％)，C＝51.05，H＝5.36，N＝9.65。
進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.89(s，2H)，8.75(d，J＝7.9Hz，2H)，8.23-8.05(m，4H)，7.96-7.80(m，2H)，7.75(d，J＝7.6Hz，2H)，7.60-7.45(m，4H)，4.68(s，4H)，4.24(s，8H)。
將上述ATBTA·3HCl·4H2O進(jìn)一步用純水和乙腈充分洗凈后，真空干燥獲得ATBTA。
元素分析結(jié)果(C37H34N6O8)計算值(％)，C＝64.34，H＝4.96，N＝12.17。
實(shí)測值(％)，C＝63.89，H＝5.11，N＝12.14。
進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.75(s，2H)，8.56(d，J＝7.9Hz，2H)，8.06-8.00(m，4H)，7.93-7.71(m，2H)，7.66(d，J＝7.6Hz，2H)，7.60-7.40(m，4H)，4.13(s，4H)，3.59(s，8H)。
實(shí)施例11 合成ATBTA和銪的絡(luò)合物將所述實(shí)施例10制造出的ATBTA·3HCl·4H2O(0.2mmol，164.4mg)加入到4.0ml水中，采用固體NaHCO3將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.5后，加入EuCl3·6H2O(0.22mmol，80.6mg)-H2O1.5ml的溶液，采用NaHCO3使溶液的pH值保持為6.5，攪拌1.5小時。采用1M的NaOH溶液將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至8.5，此后，過濾除去沉淀，回收濾液。向?yàn)V液中加入80ml的丙酮，析出絡(luò)合物。離心收集絡(luò)合物，用丙酮充分洗凈后，真空干燥獲得ATBTA和銪的絡(luò)合物。產(chǎn)量為180mg。
元素分析結(jié)果[Na[C37H30N6O8Eu]·(NaHCO3)3·(NaCl)2·(H2O)4]計算值(％)C＝36.88，H＝3.17，N＝6.45。
實(shí)測值(％)C＝36.74，H＝3.09，N＝6.26。
實(shí)施例12 向ATBTA-Eu3+絡(luò)合物中導(dǎo)入氨基反應(yīng)活性取代基
將按照實(shí)施例11中記載的方法制得的ATBTA-Eu3+絡(luò)合物溶解在3.0mlpH＝4.9的0.1M乙酸鈉緩沖溶液中，加入2，4，6-三氯代-1，3，5-三氮烯(36mg，0.2mmol)，在攪拌下加入2ml丙酮和2ml水。在室溫下攪拌30分鐘后。加入120ml的丙酮，析出絡(luò)合物。通過離心分離收集沉淀，用丙酮充分洗凈后，真空干燥，獲得具有活性取代基的絡(luò)合物。產(chǎn)量為139mg。
實(shí)施例13 具有活性取代基的ATBTA-Eu3+絡(luò)合物的熒光特性在1.5×10-6M、pH為9.1的0.05M的硼酸緩沖液中，測定實(shí)施例12制得的具有活性取代基的ATBTA-Eu3+絡(luò)合物的熒光特性。
測定結(jié)果示于圖4，圖4的縱軸表示相對熒光強(qiáng)度，橫軸表示波長(nm)。圖4中的Ex表示激勵光譜，Em表示發(fā)光光譜，Ex-TR表示時間分辨激勵光譜，Em-TR表示時間分辨發(fā)光光譜。
該物質(zhì)的熒光特性為最大吸收波長為335nm，摩爾吸光系數(shù)為3.11×104M-1cm-1，最大熒光波長為616nm，熒光量子產(chǎn)率為0.091，熒光壽命為1.02ms。
實(shí)施例14 通式[2-1]所示化合物的制造通過以下所示的反應(yīng)流程，制造R基為聯(lián)苯-4-基的通式[2-1]所示的化合物。

通式[2-1]所示化合物的合成(1)4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基的合成將4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二羥基甲基(4.46g，10mmol)加入到400mlTHF-150mlDMF的混和溶劑中，使其溶解，加入8.1g的PBr3，在攪拌下回流16小時。減壓蒸餾除去溶劑后，向生成物中加入400ml的CHCl3，用4×200ml飽和Na2SO4水溶液對有機(jī)層進(jìn)行清洗后，進(jìn)一步用200ml 10％的NaHCO3水溶液進(jìn)行洗凈。有機(jī)層用Na2SO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠色譜柱(展開溶劑CH2Cl2-CH3OH＝99∶1v/v)對生成物進(jìn)行純化，減壓蒸餾除去溶劑，并真空干燥獲得4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基。產(chǎn)率為80.6％。
元素分析結(jié)果(C29H21Br2N3)計算值(％)，C＝60.97，H＝3.70，N＝7.35實(shí)測值(％)，C＝60.94，H＝3.54，N＝7.33進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)生成物為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.81(s，2H)，8.59(d，J＝7.9Hz，2H)，7.99(d，J＝7.9Hz，2H)，7.89(t，J＝7.6Hz，2H)，7.79(d，J＝7.6Hz，2H)，7.69(d，J＝7.3Hz，2H)，7.55-7.47(m，4H)，7.50-7.35(m，1H)。
(2)[(4-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-(3，6-二氧雜三亞乙基)的合成將0.50mmol 4’-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二溴代甲基(0.29g)溶解在250ml的CH3CN中，并加入0.50mmol的4，13-二氮雜-18-冠-6-醚和5.0mmol的Na2CO3，攪拌下回流24小時。過濾除去不溶物，減壓蒸餾除去溶劑后，生成物用鋁柱(展開溶劑CHCl3-CH3OH＝97∶3w/w)進(jìn)行純化。產(chǎn)率為51％。由FAB-MS確定生成物為目標(biāo)化合物和NaBr以1∶1的絡(luò)合物(分子量694.7)。進(jìn)一步由1H NMR確認(rèn)為目標(biāo)化合物。
1H NMR(CDCl3)δ8.55(s，2H)，8.39(d，J＝7.9Hz，2H)，8.15-8.09(m，4H)，7.92(d，J＝8.6Hz，2H)，7.77(d，J＝8.2Hz，2H)，7.56-7.49(m，4H)，7.47-7.40(m，1H)，4.15(s，4H)，3.70-3.40(m，16H)；3.00-2.55(m，8H)。
實(shí)施例15[(4-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-(3，6-二氧雜三亞乙基)和銪的絡(luò)合物的合成將0.70mmol所述實(shí)施例14制造出的[(4-(聯(lián)苯-4-基)-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基)二(亞甲基氮川)]-NN’，NN’-(3，6-二氧雜三亞乙基)-NaBr的絡(luò)合物(0.54g)溶于160ml無水甲醇中，加入1mmol的EuCl3·6H2O，在攪拌下回流24小時。冷卻至室溫后，向反應(yīng)液中加入80ml乙醚，使絡(luò)合物析出。離心收集絡(luò)合物，真空干燥獲得目標(biāo)化合物。產(chǎn)率為62％。
由FAB-MS確定生成物為目標(biāo)化合物。
m/e894.6[M+Eu+2Cl]，859.7[M+Eu+Cl]，412.4[Crown+Eu+Cl]實(shí)施例16采用具有氨基反應(yīng)活性取代基的新型標(biāo)記試劑{{4’-[4-(4，6-二氯代-1，3，5-三氮烯-2-基)氨基-聯(lián)苯-4-基]-2，2’6’，2”-三吡啶-6，6”-二基}二(亞甲基氮川)四(乙酸合)}銪(III)(簡稱為DTBTA-Eu3+)，根據(jù)時間分辨熒光免疫測試測定人血清中的前列腺特異抗原(簡稱為PSA)1、采用DTBTA-Eu3+對鏈霉抗生物素蛋白(SA)的標(biāo)識將2mg的SA溶解于1.5ml pH為9.1的0.1M碳酸鈉緩沖溶液中，此后加入溶解于0.7ml pH為9.1的0.1M碳酸鈉緩沖溶液中的2.8mg的DTBTA-Eu3+，直接在室溫下攪拌3小時。將反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠過濾，將未反應(yīng)的標(biāo)識試劑和標(biāo)識的蛋白質(zhì)分離(使用1.0×40cm的交聯(lián)葡聚糖G-50柱，采用0.05M的NH4HCO3溶液進(jìn)行展開)。通過在335nm處測定標(biāo)識SA溶液的吸光度，計算標(biāo)識SA溶液中的DTBTA-Eu3+濃度(假設(shè)在標(biāo)識前后標(biāo)識試劑的摩爾吸光系數(shù)不發(fā)生變化的條件下)，計算標(biāo)識SA的標(biāo)識率，獲得SA(DTBTA-Eu3+)26的溶液。在SA(DTBTA-Eu3+)26的溶液中加入15mg作為防腐劑的NaN3，以及30mg防止標(biāo)識蛋白質(zhì)吸附在容器上用的BSA(牛血清白蛋白)，此后在-20℃下保存。在時間分辨熒光免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液稀釋400倍后進(jìn)行使用。
2、采用DTBTA-Eu3+對SA-BSA結(jié)合體的標(biāo)識將1mg的SA和1mg的BSA溶解于1.0ml的pH為7.1的0.1M磷酸鈉緩沖溶液中后，加入0.03ml的1％的戊二醛，攪拌后，在4℃下放置24小時。加入2mg的NaBH4，攪拌后，在室溫下放置2小時。在4℃下對所得的溶液用3L 0.9％的NaCl溶液透析2次后(每24小時一次)，加入0.6mlpH為9.1的0.5M碳酸鈉緩沖液，并加入溶解于0.82ml pH為9.1的0.1M碳酸鈉緩沖液中的1.64mg DTBTA-Eu3+，直接在室溫下攪拌3小時。通過對反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠過濾，將未反應(yīng)的標(biāo)識試劑和標(biāo)識的蛋白質(zhì)分離。通過在335nm處測定標(biāo)識SA-BSA溶液的吸光度，計算標(biāo)識SA-BSA溶液中的DTBTA-Eu3+濃度，計算標(biāo)識SA-BSA的標(biāo)識率，獲得大致為SA(BSA)0.9(DTBTA-Eu3+)42的溶液。在SA(BSA)0.9(DTBTA-Eu3+)42的溶液中加入15mg作為防腐劑的NaN3，以及30mg防止標(biāo)識蛋白質(zhì)吸附在容器上用的BSA，此后在-20℃下保存。在時間分辨熒光免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05MTris-鹽酸緩沖液稀釋400倍后進(jìn)行使用。
3、采用DTBTA-Eu3+對小鼠抗人PSA單克隆抗體的標(biāo)識向0.6ml透析后的小鼠抗人PSA單克隆抗體(OEM Concepts，0.5mg/ml，克隆No131-14234)中加入0.2ml pH為9.1的0.5M碳酸鈉緩沖溶液，此后加入溶解于0.032ml pH為9.1的0.1M碳酸鈉緩沖溶液中的0.117mg的DTBTA-Eu3+，直接在室溫下攪拌2.5小時。對反應(yīng)溶液進(jìn)行凝膠過濾，將未反應(yīng)的標(biāo)識試劑和標(biāo)識的蛋白質(zhì)分離。通過在335nm處測定標(biāo)識抗體溶液的吸光度，計算標(biāo)識抗體溶液中的DTBTA-Eu3+濃度，計算標(biāo)識抗體的標(biāo)識率，獲得標(biāo)識率約為20的標(biāo)識抗體溶液。在溶液中加入10mg作為防腐劑的NaN3，以及10mg防止標(biāo)識蛋白質(zhì)吸附在容器上用的BSA(牛血清白蛋白)，此后在-20℃下保存。在時間分辨熒光免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液稀釋200倍后進(jìn)行使用。
4、采用SA(DTBTA-Eu3+)26和(BSA)0.9SA(DTBTA-Eu3+)42對人PSA的時間分辨熒光測定在測試中使用96-孔微量滴定板。具體操作方法如下。
(1)配制生物素化抗體向透析后的0.4ml(0.5mg/ml)的小鼠抗PSA單克隆抗體溶液(OEM Concepts，克隆No131-14234)中加入0.6ml的純水、8.4mg的NaHCO3和2mg的磺基琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰胺基)己酸酯(NHS-LC-生物素，Pierce Chem.Co.)，在室溫下攪拌1小時后，在4℃下進(jìn)行溫育24小時。將反應(yīng)溶液采用包含0.25g NaN3的、3L 0.1M的NaHCO3溶液在4℃下每24小時進(jìn)行透析，并透析2次后，加入10mg的BSA，直至在免疫測試中使用之前，一直在-20℃下保存。在免疫測試中使用時，用包含0.2％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的、pH為7.8的0.05MTris-鹽酸緩沖液中稀釋1000倍后進(jìn)行使用。
(2)對96-孔微量滴定板的包被用pH為9.6的0.1M碳酸緩沖液對小鼠抗人PSA單克隆抗體溶液(OEM Concepts，克隆No131-11214)稀釋為12.5μg/ml后，在96孔的透明聚苯乙烯制得的微量滴定板(FluoroNunc plate)中每孔注入50μl，在4℃下溫育24小時。此后，用包含0.05％的Tween 20、pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液(緩沖液-1)清洗兩次，進(jìn)一步用pH為7.8的0.05M Tris-鹽酸緩沖液(緩沖液-2)清洗一次。
(3)PSA的免疫測試向已包被的96-孔微量滴定板的孔中各孔分別注入45μl的PSA標(biāo)準(zhǔn)溶液(Biogenesis Inc.)，在37℃下溫育2小時后，對板用緩沖液-1清洗2次，用緩沖液-2清洗1次。向各個孔中各注入45μl生物素化抗PSA抗體，在37℃下溫育1小時后，對板用緩沖液-1清洗2次，用緩沖液-2清洗1次。向各個孔中各注入45μl的SA(DTBTA-Eu3+)26或SA(BSA)0.9(DTBTA-Eu3+)42溶液，在37℃下溫育1小時后，對板采用緩沖液-1清洗4次，直接在固相時間分辨熒光測定中使用。
在本測定中使用的時間分辨熒光測定裝置為DELFIA 1234時間分辨熒光測定裝置(Wallac社制造)。測定條件為激勵波長＝340nm，測定波長＝615nm，延遲時間(Delay time)＝0.2ms，窗口時間(window time)＝0.4ms、循環(huán)時間(Cycling time)＝1.0ms。
以上免疫測試所得的檢測線如圖5所示。如果將背景信號+3SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)作為檢測限度的話，采用SA(DTBTA-Eu3+)26的方法中的檢測限度為22pg/ml，采用SA(BSA)0.9(DTBTA-Eu3+)42的方法中的檢測限度為8pg/ml。
5、采用DTBTA-Eu3+標(biāo)識的小鼠抗人PSA單克隆抗體的人PSA的時間分辨熒光免疫測試向已經(jīng)采用小鼠抗人PSA單克隆抗體(OEM Concepts，克隆No131-11214)包被的96-孔微量滴定板的孔中各注入45μl的PSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37℃下溫育2小時后，對板用緩沖液-1清洗2次，用緩沖液-2清洗1次。向各個孔中各分別注入45μl DTBTA-Eu3+標(biāo)識的小鼠抗人PSA單克隆抗體(OEM Concepts，克隆No131-14234)，在37℃下溫育1小時后，對板采用緩沖液-1清洗4次，直接在固相時間分辨熒光測定中使用。測定條件同上。
以上免疫測試所得的檢測線如圖6所示。如果將背景信號+3SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)作為檢測限度的話，該方法中的檢測限度為41pg/ml。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供一種具有與被標(biāo)識物質(zhì)(例如來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)等)的結(jié)合基，可與稀土類金屬離子容易地形成絡(luò)合物的新的標(biāo)識試劑。該絡(luò)合物在水溶液中非常穩(wěn)定，具有足夠的熒光強(qiáng)度和較長的熒光壽命。因此，通過使用該絡(luò)合物，可直接在水溶液中標(biāo)識具有氨基和巰基等官能基的酶、蛋白質(zhì)、肽(寡肽、多肽)、激素、核酸探針、寡核苷酸、藥物(包含抗生物質(zhì))以及其它的有機(jī)化合物等。
此外，本發(fā)明的新的標(biāo)識試劑通過共價鍵，與被標(biāo)識物質(zhì)(具體為具有氨基和巰基等官能基的酶、蛋白質(zhì)、肽(寡肽、多肽)、激素、核酸探針、寡核苷酸、藥物(包含抗生物質(zhì))以及其它的有機(jī)化合物等)形成非常穩(wěn)定的標(biāo)識復(fù)合體，通過使其與稀土類離子反應(yīng)，可獲得非常穩(wěn)定的稀土類熒光絡(luò)合物標(biāo)識復(fù)合體。該標(biāo)識復(fù)合體同樣具有非常長的熒光壽命和較強(qiáng)的熒光，可在時間分辨熒光免疫測試和DNA雜交測定等中直接應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種標(biāo)識試劑，其由具有2，2’6’，2”-三吡啶骨架或者2，6-二吡唑吡啶骨架，與被標(biāo)識物質(zhì)結(jié)合的基團(tuán)，以及與稀土類離子形成絡(luò)合物用的結(jié)合基團(tuán)的化合物形成。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)識試劑，該化合物為通式[1]所示的化合物， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
3.如權(quán)利要求2所述的標(biāo)識試劑，其中該化合物為通式[1]中的R基為4’-氨基-4-聯(lián)苯基的化合物。
4.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)識試劑，該化合物為通式[2]所示的化合物， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
5.如權(quán)利要求4所述的標(biāo)識試劑，其中該化合物為通式[2]中的R基為4-聯(lián)苯基的化合物。
6.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)識試劑，該化合物為通式[3]所示的化合物。 (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
7.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)識試劑，該化合物為通式[4]所示的化合物。 (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
8.由權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物。
9.一種熒光標(biāo)識試劑，其含有由權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物。
10.如權(quán)利要求9所述的熒光標(biāo)識試劑，其中稀土類金屬離子為三價銪離子、三價釤離子、三價鋱離子和三價鏑離子的絡(luò)合物。
11.一種熒光標(biāo)識方法，其特征為使用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為標(biāo)識試劑。
12.一種熒光標(biāo)識方法，其特征為使用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子。
13.一種被熒光標(biāo)識劑標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)，其中該熒光標(biāo)識劑含有權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物。
14.一種被熒光標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)，其中使用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子進(jìn)行標(biāo)識。
15.如權(quán)利要求13或14所述的被標(biāo)識的來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)，其中來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)為酶、蛋白質(zhì)、激素、肽、核酸、核酸探針、寡核苷酸或藥物(包含抗生物質(zhì))。
16.一種熒光測定方法，其特征為采用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識試劑。
17.一種熒光測定方法，其特征為使用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑和稀土類金屬離子。
18.如權(quán)利要求16或17所述的熒光測定方法，其特征為熒光測定方法為時間分辨熒光測定方法。
19.如權(quán)利要求18所述的熒光測定方法，其特征為時間分辨熒光測定方法為時間分辨熒光免疫測定法、時間分辨熒光DNA雜交測定法、時間分辨熒光顯微鏡成像法、或時間分辨熒光色譜法。
20.一種熒光測定法用試劑，其采用權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識試劑。
21.一種熒光測定法用試劑，其包含權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子。
22.如權(quán)利要求20或21所述的熒光測定方法用試劑，其特征為測定來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)。
23.如權(quán)利要求22所述的熒光測定方法用試劑，其特征為來自生物體的物質(zhì)或生理活性物質(zhì)為酶、蛋白質(zhì)、激素、肽、核酸、核酸探針、寡核苷酸或藥物(包含抗生物質(zhì))。
24.試劑盒，其包含權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物作為熒光標(biāo)識劑。
25.試劑盒，其包含權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子。
26.通式[1]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
27.如權(quán)利要求26所述的化合物或其鹽，其如通式[1-1]所示。
28.通式[2]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
29.如權(quán)利要求28所述的化合物或其鹽，其如通式[2-1]所示。
30.通式[3]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
31.通式[4]所示的化合物或其鹽， (式中，R表示芳基、具有活性取代基的芳基、雜環(huán)基或具有活性取代基的雜環(huán)基)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型的標(biāo)識試劑，其特征在于具有與被標(biāo)識物質(zhì)(例如來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)等)結(jié)合的基團(tuán)，容易與稀土類離子形成絡(luò)合物，并且該絡(luò)合物在水溶液中足夠穩(wěn)定，與緩沖劑的種類無關(guān)，具有足夠的熒光強(qiáng)度和較長的熒光壽命，本發(fā)明還提供該標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物、包含該絡(luò)合物的熒光標(biāo)識劑，以及采用該熒光標(biāo)識劑的熒光測定方法等。具體地，提供由具有2，2’ ∶6’，2”－三吡啶骨架或者2，6－二吡唑吡啶骨架，與被標(biāo)識物質(zhì)(例如來自生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)等)結(jié)合的基團(tuán)，以及與稀土類離子形成絡(luò)合物用的結(jié)合基團(tuán)的化合物形成的標(biāo)識試劑，以及該標(biāo)識試劑與稀土類金屬離子形成的絡(luò)合物，包含該絡(luò)合物的熒光標(biāo)識劑，采用該絡(luò)合物作為標(biāo)識劑用的熒光標(biāo)識方法，以及采用該熒光標(biāo)識劑的熒光測定方法和熒光測定法用試劑。
文檔編號C07D498/22GK1685232SQ0380552
公開日2005年10月19日 申請日期2003年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者松本和子, 袁景利, 王桂蘭, 譚明乾 申請人:松本和子, 袁景利