專利名稱：肝細(xì)胞癌血清生物標(biāo)記的制作方法
本申請(qǐng)基于美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/370,239，該申請(qǐng)于2002年4月8日提出，此處引用其作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般涉及肝細(xì)胞癌(HCC)血清生物標(biāo)記領(lǐng)域。更確切的說，本發(fā)明涉及能夠?qū)CC與其他病癥(比如慢性肝臟疾病和肝硬化)區(qū)分開來的血清生物標(biāo)記。
HCC位居全球最常見癌癥的第八位，是男性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率為每年一百萬新發(fā)病例。該疾病每年導(dǎo)致約一百萬人死亡，死亡主要發(fā)生在不發(fā)達(dá)和發(fā)展中國(guó)家。在美國(guó)，5年(1992-1996)總生存率為5％[EI-Serag等，Hepatology 3362-65(2001)]。與病毒(例如乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒)感染、酒精性肝損傷和alfatoxin B暴露有關(guān)的肝臟功能紊亂通常導(dǎo)致惡變。事實(shí)上，全世界80％的HCC在病因?qū)W角度與乙型肝炎病毒(HBV)有關(guān)，據(jù)估計(jì)，在美國(guó)非亞洲裔HCC病例中，每4例HCC中有1例與HBV有關(guān)。目前，尚無標(biāo)準(zhǔn)治療，預(yù)后不佳。
傳統(tǒng)的HCC生物標(biāo)記是甲胎蛋白(AFP)。
然而，慢性肝病患者也具有升高的血清AFP水平。由于HCC一般出現(xiàn)在同時(shí)患有慢性肝臟疾病的患者身上，因此單獨(dú)的AFP水平不是理想的生物標(biāo)記，而且其癌癥預(yù)測(cè)值僅在40％范圍內(nèi)。對(duì)AFP同種型的定量分析能夠?qū)⒃\斷值增加到75％，但是非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。另外，約有20％的HCC患者AFP水平非常低，低于20ng/ml。p53蛋白質(zhì)和各種醛脫氫酶同種型都曾被作為可能的標(biāo)記來檢測(cè)，然而，沒有一個(gè)具有與AFP同樣高的預(yù)測(cè)值。
活組織檢查可以用來診斷HCC，但是由于這是一個(gè)侵入性手段而不盡人意。其他用作診斷HCC的方法包括超聲和計(jì)算機(jī)X射線斷層攝影(CT)掃描。小于2cm的HCC結(jié)節(jié)中，僅有25-28％可以在動(dòng)脈造影過程中，經(jīng)超聲和CT掃描檢出。
十分需要有一個(gè)生物標(biāo)記或者生物標(biāo)記組合，其不僅能夠鑒定HCC，而且還可以將HCC與慢性肝臟疾病(CLD)和其他病癥區(qū)分開來。然而，有關(guān)HCC診斷的文獻(xiàn)尚未公開這樣的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合。
發(fā)明概要依照本發(fā)明，生物標(biāo)記及其組合用于鑒定HCC。該方法成功的將HCC與CLD區(qū)分開來。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于確診某個(gè)體肝細(xì)胞癌狀態(tài)的方法包含分析來自該個(gè)體的生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)的診斷水平，該蛋白質(zhì)選自(A)組I-M1，I-M2，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M8，I-M9，I-M10，I-M11，I-M12，I-M13，I-M14，I-M15，I-M16，I-M17，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M24，I-M25，I-M26，I-M27，I-M28，I-M29，I-M30，I-M31，I-M32，I-M33，I-M34，I-M35，I-M36，I-M37，I-M38，I-M39，I-M40，I-M41，I-M42，I-M43，I-M44，I-M45，I-M46，I-M47，I-M48，I-M49，I-M50，I-M51，I-M52，I-M53，I-M54，I-M55，I-M56，I-M57，I-M58，I-M59，I-M60，I-M61，I-M61，I-M62，I-M63，I-M64，I-M65，I-M66，I-M67，I-M68，I-M69，I-M70，I-M71，I-M72，I-M73，I-M74，I-M75，I-M76，I-M77，I-M79，I-M80，I-M81，I-M82，I-M83，I-M84，I-M85，I-M86，I-M87，I-M88，I-M89，I-M90，I-M91，I-M92，I-M93，I-M94，I-M95，I-M96，I-M97，I-M98，I-M99，I-M100和/或(B)組W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M6，W-M7，W-M8，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M24，W-M25，W-M26，W-M27，W-M28，W-M29，W-M30，W-M31，W-M32，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M37，W-M38，W-M39，W-M40，W-M41，W-M42，W-M43，W-M44，W-M45，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M51，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M56，W-M57，W-M58，W-M59，W-M60，W-M61，W-M61，W-M62，W-M63，W-M64，W-M65，W-M66，W-M67，W-M68，W-M69，W-M70，W-M71，W-M72，W-M73，W-M74，W-M75，W-M76，W-M77，W-M79，W-M80，W-M81，W-M82，W-M83，W-M84，W-M85，W-M86，W-M87，W-M88，W-M89，W-M90，W-M91，W-M92，W-M93，W-M94，W-M95，W-M96，W-M97，W-M98，W-M99，W-M100，其中該生物標(biāo)記在HCC個(gè)體和CLD個(gè)體中呈現(xiàn)差異。
優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)選自(A)I-M1，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M9，I-M11，I-M12，I-M13，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M25，I-M26，I-M28，I-M32，I-M34，I-M36，I-M37，I-M41，I-M44，I-M46，I-M47，I-M52，I-M53，I-M64，I-M68，I-M69，I-M77，I-M79，I-M81，I-M84，I-M87，I-M88，I-M89，和I-M92和/或(B)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M7，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M25，W-M26，W-M27，W-M30，W-M31，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M39，W-M40，W-M41，W-M43，W-M44，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M58，W-M60，W-M62，W-M63，W-M70，W-M71，W-M73，W-M76，W-M78，W-M84，W-M86，W-M88，W-M89，W-M90，W-M93，W-M95，W-M96，W-M98，和W-M100。
自身能夠鑒定HCC的生物標(biāo)記包括I-M13、I-M18、I-M19、W-M2和W-M23蛋白質(zhì)生物標(biāo)記。
本發(fā)明還提供一種確定患者罹患肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括(A)對(duì)上述病人生物學(xué)樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析從而提供圖譜，所述質(zhì)譜分析包括表征(profiling)在化學(xué)衍生化的親和表面上的特性，和(B)將所述圖譜進(jìn)行輸入(keyed)了至少一個(gè)峰的模式識(shí)別分析，此峰選自
(i)I-M1，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M9，I-M11，I-M12，I-M13，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M25，I-M26，I-M28，I-M32，I-M34，I-M36，I-M37，I-M41，I-M44，I-M46，I-M47，I-M52，I-M53，I-M64，I-M68，I-M69，I-M77，I-M79，I-M81，I-M84，I-M87，I-M88，I-M89，和I-M92和/或(ii)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M7，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M25，W-M26，W-M27，W-M30，W-M31，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M39，W-M40，W-M41，W-M43，W-M44，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M58，W-M60，W-M62，W-M63，W-M70，W-M71，W-M73，W-M76，W-M78，W-M84，W-M86，W-M88，W-M89，W-M90，W-M93，W-M95，W-M96，W-M98，和W-M100。
模式識(shí)別分析可以例如輸入了一對(duì)峰，選自(A)I-M13和I-M25，I-M13和I-M7，I-M25和I-M46，I-M37和I-M77，I-M5和I-M36和/或(B)W-M14和W-M98，W-M21和W-M46，W-M11和W-M52，W-M16和W-M89，W-M1和W-M46，W-M21和W-M76，W-M11和W-M33，W-M13和W-M18，W-M2和W-M46，W-M33和W-M54，W-M2和W-M46，W-M16和W-M46，W-M11和W-M5。
作為選擇，模式識(shí)別分析可以輸入3個(gè)峰，選自(A)I-M1，I-M4和I-M36；I-M5，I-M7和I-M19；I-M7，I-M19和I-M46；I-M9，I-M34和I-M52；I-M7，I-M18和I-M47；I-M11，I-M13和I-M36；I-M9，I-M77和I-M84；和I-M18，I-M22和I-M79
和/或(B)W-M21，W-M22和W-M35；W-M7，W-M21和W-M46；W-M13，W-M14和W-M98；W-M14，W-M54和W-M70；W-M11，W-M33和W-M46；W-M17，W-M36和W-M98；W-M19，W-M21和W-M22；W-M14，W-M15，W-M54；W-M55，W-M58和W-M98；W-M11，W-M14和W-M98；W-M1，W-M33和W-M46；W-M40，W-M46和W-M49；W-M15，W-M21和W-M22；W-M14，W-M36和W-M98；W-M5，W-M11和W-M54；W-M14，W-M22和W-M25；W-M14，W-M58和W-M98；W-M5，W-M14和W-M89；W-M7，W-M14和W-M89；W-M14，W-M21和W-M98；W-M11，W-M58和W-M71；W-M14，W-M25和W-M54；W-M14，W-M60和W-M89；W-M21，W-M46和W-M100。
在其他實(shí)施方案中，模式識(shí)別分析可以輸入由三個(gè)以上峰組成的組合，尤其是由4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)峰組成的組合，該組合選自(A)I-M11，I-M13，I-M19和I-M89；I-M13，I-M19，I-M22和I-M26；I-M1，I-M5，I-M36和I-M41；I-M19，I-M33，I-M44和I-M46；I-M3，I-M18，I-M68和I-M81；I-M3，I-M12，I-M34和I-M81；I-M12，I-M13，I-M32和I-M37；I-M18，I-M44，I-M46和I-M79；I-M7，I-M13，I-M21和I-M23；I-M3，I-M18，I-M77和I-M92；I-M12，I-M13，I-M77和I-M87；I-M6，I-M13，I-M34和I-M81；I-M8，I-M19，I-M53，I-M64，I-M69；I-M4，I-M18，I-M28，I-M47和I-M88；和I-M1，I-M4，I-M18，I-M36，I-M41和I-M47和/或(B)W-M25，W-M55，W-M62和W-M98；W-M7，W-M14，W-M17和W-M89；W-M17，W-M31，W-M93和W-M98；W-M11，W-M19，W-M46和W-M50；W-M4，W-M33，W-M55和W-M98；W-M5，W-M11，W-M36和W-M54；W-M16，W-M36，W-M43和W-M46；W-M11，W-M41，W-M54和W-M73；W-M5，W-M11，W-M52和W-M89；W-M4，W-M14，58和W-M89；W-M2，W-M12，W-M14，W-M89；W-M5，W-M11，W-M20和W-M40；W-M21，W-M46，W-M70和W-M88；W-M21，W-M33，W-M34和W-M46；W-M17，W-M20，W-M40和W-M58；W-M17，W-M33，W-M52和W-M98；W-M3，W-M7，W-M21和W-M46；W-M10，W-M22，W-M30和W-M95；W-M1，W-M46，W-M54和W-M70；W-M11，W-M14，W-M25和W-M54；W-M11，W-M33，W-M46和W-M90；W-M11，W-M14，W-M54和W-M89；W-M7，W-M18，W-M21和W-M22；W-M17，W-M20，W-M52和W-M98；W-M2，W-M15，W-M19，W-M22和W-M55；W-M17，W-M19，W-M26，W-M47和W-M98；W-M9，W-M11，W-M27，W-M46和W-M78；W-M5，W-M11，W-M33，W-M46和W-M53；W-M2，W-M9，W-M15，W-M19和W-M89；W-M5，W-M11，W-M52，W-M89和W-M96；W-M16，W-M25，W-M40，W-M52和W-M89；W-M14，W-M15，W-M21，W-M22和W-M89；W-M5，W-M13，W-M16，W-M20和W-M98；W-M9，W-M23，W-M26，W-M40和W-M89；W-M20，W-M27，W-M30，W-M35，W-M40和W-M70；W-M13，W-M26，W-M39，W-M44，W-M63和W-M98；W-M5，W-M13，W-M35，W-M39，W-M86和W-M89；和W-M3，W-M18，W-M21，W-M22，W-M48，和W-M84。
在每種情況中，生物標(biāo)記在HCC個(gè)體和CLD個(gè)體中呈現(xiàn)差異。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和診斷HCC的試劑盒。
本發(fā)明中的試劑盒包括，例如，(i)吸附于基質(zhì)上的吸附劑，具有

圖1或圖2中一種或多種生物標(biāo)記，和(ii)檢測(cè)生物標(biāo)記的說明書，其教導(dǎo)了將樣品與吸附劑接觸來檢測(cè)生物并檢測(cè)由吸附劑保留的生物標(biāo)記。本發(fā)明的試劑盒可以更進(jìn)一步包括清洗溶液和/或制備清洗溶液的說明書。
本發(fā)明還提供用于鑒定個(gè)體肝細(xì)胞癌狀態(tài)的軟件，包括對(duì)取自圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的算法，所述圖譜由對(duì)個(gè)體生物學(xué)樣品作質(zhì)譜分析產(chǎn)生，其中所述數(shù)據(jù)與一個(gè)或多個(gè)選自(i)組
I-M1，I-M2，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M8，I-M9，I-M10，I-M11，I-M12，I-M13，I-M14，I-M15，I-M16，I-M17，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M24，I-M25，I-M26，I-M27，I-M28，I-M29，I-M30，I-M31，I-M32，I-M33，I-M34，I-M35，I-M36，I-M37，I-M38，I-M39，I-M40，I-M41，I-M42，I-M43，I-M44，I-M45，I-M46，I-M47，I-M48，I-M49，I-M50，I-M51，I-M52，I-M53，I-M54，I-M55，I-M56，I-M57，I-M58，I-M59，I-M60，I-M61，I-M61，I-M62，I-M63，I-M64，I-M65，I-M66，I-M67，I-M68，I-M69，I-M70，I-M71，I-M72，I-M73，I-M74，I-M75，I-M76，I-M77，I-M79，I-M80，I-M81，I-M82，I-M83，I-M84，I-M85，I-M86，I-M87，I-M88，I-M89，I-M90，I-M91，I-M92，I-M93，I-M94，I-M95，I-M96，I-M97，I-M98，I-M99，I-M100或選自(ii)組W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M6，W-M7，W-M8，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M24，W-M25，W-M26，W-M27，W-M28，W-M29，W-M30，W-M31，W-M32，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M37，W-M38，W-M39，W-M40，W-M41，W-M42，W-M43，W-M44，W-M45，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M51，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M56，W-M57，W-M58，W-M59，W-M60，W-M61，W-M61，W-M62，W-M63，W-M64，W-M65，W-M66，W-M67，W-M68，W-M69，W-M70，W-M71，W-M72，W-M73，W-M74，W-M75，W-M76，W-M77，W-M79，W-M80，W-M81，W-M82，W-M83，W-M84，W-M85，W-M86，W-M87，W-M88，W-M89，W-M90，W-M91，W-M92，W-M93，W-M94，W-M95，W-M96，W-M97，W-M98，W-M99，W-M100，的生物標(biāo)記有關(guān)。
該算法可以執(zhí)行輸入了與至少一個(gè)生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)的模式識(shí)別分析。作為選擇，該算法可以包括輸入了與至少一個(gè)生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)的分類樹分析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該算法包括輸入了與至少一個(gè)生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。
圖表簡(jiǎn)要描述圖1為使用IMAC3Cu ProteinChiparray形式鑒定的前100個(gè)生物標(biāo)記列表，按照student t-檢驗(yàn)中的p值排序。
圖2為使用WCX ProteinChiparray形式鑒定的前100個(gè)生物標(biāo)記列表，按照student t-檢驗(yàn)中的p值排序。
優(yōu)選方案詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，一系列與HCC有關(guān)的生物標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)。在本文中，生物標(biāo)記為有機(jī)生物分子，尤其是與CLD個(gè)體相比，在來自HCC個(gè)體的生物樣品中呈現(xiàn)差異的多肽或者蛋白質(zhì)。與來自未患HCC的CLD患者的生物學(xué)樣品相比，如果來自HCC患者的生物樣品中，某生物標(biāo)記存在水平升高或降低，則該標(biāo)記在取自HCC和CLD患者的樣品中呈現(xiàn)差異。更特別的是，生物標(biāo)記是以通過氣相離子光譜分析測(cè)定的表觀分子量為特征的多肽，并且與CLD個(gè)體相比，其水平在HCC個(gè)體樣品中升高或者降低。如果生物標(biāo)記在一個(gè)樣品中的含量與其在另一個(gè)樣品中的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，則該生物標(biāo)記在兩個(gè)樣品中呈現(xiàn)差異。
本發(fā)明中的生物標(biāo)記可用于評(píng)定個(gè)體的肝細(xì)胞癌狀態(tài)。在本文中“肝細(xì)胞癌狀態(tài)”包括出現(xiàn)或未出現(xiàn)疾病、發(fā)展疾病的風(fēng)險(xiǎn)、疾病階段和疾病治療效果?？稍诖藸顟B(tài)基礎(chǔ)上指導(dǎo)進(jìn)一步的程序，包括診斷性檢驗(yàn)或治療性程序或方案，例如內(nèi)窺鏡檢查、活組織檢查、外科手術(shù)、化學(xué)治療、免疫治療和放射治療。尤其特別的是，本發(fā)明中的生物標(biāo)記可以鑒定HCC，并且成功的將其與CLD區(qū)分。在某些例子中，單個(gè)生物標(biāo)記即可鑒定HCC，預(yù)測(cè)成功率至少達(dá)到85％，然而，在其他例子中，使用生物標(biāo)記組合以獲得不低于85％的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。因此，生物標(biāo)記及其組合可以用于確定患者HCC風(fēng)險(xiǎn)。
在某些例子中，單個(gè)生物標(biāo)記鑒定HCC的靈敏度和特異性至少達(dá)到85％，然而，在其他例子中，使用生物標(biāo)記組合或多個(gè)生物標(biāo)記以獲得不低于85％的靈敏度和特異性。因此，生物標(biāo)記及其組合可以用于確定個(gè)體或者患者的肝細(xì)胞癌狀態(tài)。
依照本發(fā)明，生物標(biāo)記出現(xiàn)在血清中。然而，依照本發(fā)明，使用的生物學(xué)樣品不必是血清。因此，盡管優(yōu)選血清樣品，用于確定肝細(xì)胞癌狀態(tài)的生物學(xué)樣品可以是血清、血漿或全血樣品。
所有生物標(biāo)記以分子量為特征，圖1和圖2提供了本發(fā)明中生物標(biāo)記列表。這些圖表分別列出使用此處描述的Cu(II)IMAC3和WCX2ProteinChip陣列方案，用p值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定的前100個(gè)生物標(biāo)記。在每個(gè)圖中，第一列數(shù)據(jù)是生物標(biāo)記的標(biāo)識(shí)符。因此，圖1中第一行涉及生物標(biāo)記I-M1，第二行涉及生物標(biāo)記I-M2，依此類推(“I-M”表示生物標(biāo)記使用IMAC芯片鑒定)。相似的，圖2中第一行涉及生物標(biāo)記W-M1，第二行涉及生物標(biāo)記W-M2，依此類推(“W-M”表示生物標(biāo)記使用WCX2芯片鑒定)。圖中第二列數(shù)據(jù)是生物標(biāo)記的道爾頓分子量，用氣相離子光譜分析測(cè)定。圖中最后一列字母表示此處描述的方案中生物標(biāo)記洗脫的級(jí)分；即，“A”洗脫的生物標(biāo)記是第一級(jí)分，“B”洗脫的生物標(biāo)記是第二級(jí)分，依此類推。
生物標(biāo)記洗脫的各個(gè)級(jí)分都與其等電點(diǎn)(pI)相關(guān)，在較高pH洗脫的生物標(biāo)記具有較高的pI，在較低pH洗脫的生物標(biāo)記具有較低的pI。
在本說明書中，對(duì)于該發(fā)明給定的生物標(biāo)記，用質(zhì)量和親和力表征該生物標(biāo)記，使得每個(gè)人都能夠按照此處的教導(dǎo)得到該生物標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。如果需要，任何一個(gè)生物標(biāo)記都可以進(jìn)行測(cè)序以得到其氨基酸序列，但在本發(fā)明實(shí)踐過程中，實(shí)施這一步驟不是必需的。
例如，某生物標(biāo)記能用許多酶(如胰蛋白酶和V8蛋白酶)作肽圖譜，消化片段的分子量可以用來進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，檢索出與各種酶產(chǎn)生的消化片段分子量一致的序列。作為選擇，如果該生物標(biāo)記不在已知數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)，可以以其N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)制作簡(jiǎn)并探針，在由最初檢測(cè)到此生物標(biāo)記的樣品所制作的基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中，使用該簡(jiǎn)并探針進(jìn)行篩查。對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定和擴(kuò)增，并使用廣為人知的方法對(duì)陽性克隆的重組序列進(jìn)行亞克隆。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)記可以使用蛋白質(zhì)梯度測(cè)序法(protein ladder sequencing)進(jìn)行測(cè)序。將分子片段化后，把得到的片段進(jìn)行酶切，或者使用其他方法，順次去除片段末端的單個(gè)氨基酸，從而得到蛋白質(zhì)梯度。然后使用質(zhì)譜對(duì)梯度進(jìn)行分析，通過梯度片段之間的質(zhì)量差鑒定從分子末端去除的氨基酸。
依照本發(fā)明，血清生物標(biāo)記是通過比較新診斷的HCC和CLD兩組個(gè)體血清樣品的質(zhì)量圖譜而確定的。
個(gè)體依照標(biāo)準(zhǔn)化臨床標(biāo)準(zhǔn)診斷。HCC個(gè)體通過組織學(xué)證實(shí)，CLD個(gè)體被采集血清后，對(duì)各種HCC體征隨訪至少18個(gè)月以排除無癥狀HCC個(gè)體。
采集各組個(gè)體的血清，使用Q Ceramic HyperDF離子交換樹脂(Biosepra，Cipergen Biosystems，Inc.)進(jìn)行分級(jí)，血清按照不同的洗脫pH被分為6個(gè)級(jí)分。A級(jí)分包括直流物(flow through)加上pH9的洗脫物，B級(jí)分包括pH7的洗脫物，C級(jí)分包括pH5的洗脫物，D級(jí)分包括pH4的洗脫物，E級(jí)分包括pH3的洗脫物，F(xiàn)級(jí)分包括異丙醇/乙腈TFA洗脫物。
各級(jí)分都被稀釋并應(yīng)用于Cu(II)(IMAC3)或WCX2 ProteinChip陣列。這些芯片陣列都由Ciphergen Biosystems，Inc.(Fremont，CA)制造。
Cu(II)IMAC3是“固定金屬親合捕獲(immobilized metalaffinity-capture)”芯片，其次氮基三乙酸表面具有高度的銅結(jié)合能力，從而對(duì)具有金屬結(jié)合殘基的蛋白質(zhì)進(jìn)行親合捕獲。
咪唑可以用在結(jié)合和清洗溶液當(dāng)中，來緩和蛋白質(zhì)結(jié)合，包括非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。在清洗溶液中增加咪唑濃度，可減少靶蛋白結(jié)合。這是通過使用核黃素(0.02wt％)為光敏引發(fā)劑，將5-甲基酰氨基-2-(N，N-二羧甲基氨基)戊酸(7.5wt％)和N，N′-亞甲基-雙叉丙烯酰胺(0.4wt％)進(jìn)行光聚合所致。將單體溶液置于芯片基質(zhì)上，經(jīng)照射進(jìn)行光聚合，芯片遂對(duì)Cu(II)具有活性。
WCX2是弱陽離子交換芯片，具有結(jié)合帶正電荷蛋白質(zhì)的羧酸表面。WCX2表面帶負(fù)電荷的羧酸基團(tuán)與靶蛋白暴露的正電荷相互作用。增加清洗緩沖液的鹽濃度或pH將降低靶蛋白結(jié)合。
洗脫級(jí)分加至芯片后，孵育芯片使洗脫液中的多肽通過親合相互作用與芯片上的位點(diǎn)結(jié)合。孵育后，清洗每個(gè)芯片陣列以去除非特異性結(jié)合多肽以及緩沖液雜質(zhì)。
隨后，芯片經(jīng)過干燥，加以能量吸收分子或基質(zhì)以便于在質(zhì)譜儀中解吸附和離子化。
在質(zhì)譜儀中，保留的多肽在ProteinChipReader中經(jīng)激光解吸附和離子化從芯片陣列上洗脫，ProteinChipReader整合有ProteinChip軟件和個(gè)人電腦，對(duì)捕獲在芯片陣列上的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。ProteinChipReader的離子光學(xué)和激光光學(xué)技術(shù)可檢測(cè)從低于1000Da的小肽到高于300KDa的蛋白質(zhì)，并以飛行時(shí)間為基礎(chǔ)計(jì)算質(zhì)量。飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜檢測(cè)離子化多肽并精確測(cè)量其質(zhì)量。
對(duì)從各組獲得的質(zhì)量圖譜進(jìn)行散點(diǎn)分析(scatter plotanalysis)，來消除組間差異(run-to-run variation)。將在HCC和CLD中具有相同模式的散點(diǎn)圖上的蛋白質(zhì)簇作為潛在生物標(biāo)記消除，即在兩種病癥中都升高或降低的蛋白質(zhì)簇。對(duì)剩余多肽，要進(jìn)一步分析它們精確區(qū)分HCC和CLD的能力。使用student t-test對(duì)HCC和CLD組散點(diǎn)中每個(gè)蛋白質(zhì)簇進(jìn)行比較，選擇在兩組間具有顯著性差異(p＜0.001)的蛋白質(zhì)簇。
由于分子量得自散點(diǎn)分析，以及質(zhì)譜儀對(duì)分子量分辨能力的限制，圖1和圖2中給出的“絕對(duì)”分子量值實(shí)際上代表近似分子量。因此，生物標(biāo)記的給定分子量應(yīng)該解釋為質(zhì)量范圍的中點(diǎn)。圖中所給出的“絕對(duì)”值的變化范圍不大于+/-0.15％(I-M1為8840到8867)，通常不多于+/-0.10％(I-M1為8844到8863)，往往低至+/-0.05％(1-M1為8850到8858Da)。
在備選實(shí)施方案中，使用一種被稱為“微陣列顯著分析”(Significant Analysis of Microarray，SAM)的蛋白質(zhì)濾除方法來鑒定潛在的生物標(biāo)記。該蛋白質(zhì)濾除方法執(zhí)行的是原本為cDNA/寡核苷酸微陣列分析而開發(fā)的SAM算法。Tusher等，“Significance analysisof microarrays applied to the ionizing radiation response”，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 985116-21(2001)。在分組鑒定的情況下，使用SAM比較腫瘤組(40例HCC病例)和對(duì)照組(20例AFP＜500ng/ml的CLD病例)之間標(biāo)準(zhǔn)化的log10蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，并且確定在中值假顯著值(median false significant value)＜0.000005時(shí)具有顯著性差異的蛋白質(zhì)組特征。對(duì)照組定義為“1”，腫瘤組定義為“2”。選擇“兩類未匹配數(shù)據(jù)”為數(shù)據(jù)類型。執(zhí)行總共1000次置換。
在血清樣品中總共發(fā)現(xiàn)2384個(gè)蛋白質(zhì)組特征使用IMAC3 copperProteinChip Array發(fā)現(xiàn)了1087個(gè)，使用WCX2 ProteinChip Array發(fā)現(xiàn)了1297個(gè)。適用于蛋白質(zhì)濾除法的SAM用來搜索在HCC和CLD病例間具有顯著性差異的血清蛋白質(zhì)/多肽。設(shè)定中值假顯著值＜0.000005，79個(gè)蛋白質(zhì)組特征被確認(rèn)為在HCC血清中顯著性升高，160個(gè)蛋白質(zhì)組特征顯著性降低。因此，總共發(fā)現(xiàn)239個(gè)潛在的鑒定HCC的血清學(xué)標(biāo)記。表1列出顯著性升高和顯著性降低的各自前5個(gè)蛋白質(zhì)組特征。
表1 用于區(qū)分HCC和CLD的前五個(gè)顯著高的蛋白質(zhì)組特征和前五個(gè)顯著低的蛋白質(zhì)組特征
使用兩種方法來測(cè)定是否一個(gè)潛在的生物標(biāo)記對(duì)于評(píng)定HCC具有預(yù)測(cè)價(jià)值。在第一種途徑中，采用Biomarker Pattern Software(Ciphergen Biosystems，F(xiàn)remont，CA)來測(cè)定是否一個(gè)潛在的生物標(biāo)記對(duì)于評(píng)定肝細(xì)胞癌具有預(yù)測(cè)價(jià)值。Biomarker Pattern Software實(shí)施一個(gè)混雜的多變量分析程序，從SELDI蛋白質(zhì)圖譜中識(shí)別隱藏的相關(guān)關(guān)系和模式。
第二種方法使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)分析。也就是說，開發(fā)包括差異蛋白質(zhì)組特征的ANN模型，計(jì)算區(qū)分HCC和CLD的診斷分值。ANN算法采用人工智能來進(jìn)行分類、模式識(shí)別和預(yù)測(cè)，如Poon等，Oncology61275-83(2001)和Xu等，Cancer Res.623493-7(2002)中所描述。ANN模型由組織成層的處理原件(神經(jīng)元)組成。從訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中，ANN模型能夠“學(xué)習(xí)”輸入變量與結(jié)果之間的交聯(lián)模式，并且將這種模式應(yīng)用于新的案例中。使用Ea syNN(version 8.1，StephenWolstenholme，Cheshire，UK)開發(fā)ANN模式。
發(fā)展方法為前饋型，網(wǎng)絡(luò)使用back-propagation進(jìn)行訓(xùn)練。學(xué)習(xí)速率和要素都由軟件自動(dòng)優(yōu)化。ANN包括3層，一個(gè)輸入層、一個(gè)隱蔽層和一個(gè)輸出層。在中間隱蔽層有7個(gè)節(jié)點(diǎn)。
用作ANN模型發(fā)展的輸入變量是顯著性蛋白質(zhì)組特征的相對(duì)水平，而輸出變量則是每個(gè)病例的診斷分值(范圍0-1.0000)。
在訓(xùn)練ANN模型過程中，對(duì)于CLD病例和HCC病例，診斷分值分別定義為0.0000和1.0000。
隨著ANN模型的發(fā)展，實(shí)行10倍交叉確認(rèn)(10-fold crossvalidation)計(jì)算每個(gè)HCC病例和CLD病例的ANN診斷分值。
交叉確認(rèn)分析(Cross validation analysis)顯示，由數(shù)據(jù)組訓(xùn)練而來的ANNs的靈敏度和精確度分別為92.5％和90％。
此外，ANNs將所有AFP未確認(rèn)的HCC病例分類為AFP水平低于500ng/mL。另外，一個(gè)AFP為903ng/mL的預(yù)先未知的CLD病例，三個(gè)預(yù)先未知的分別收集于AFP＞500ng/mL的HCC病例、AFP＜500ng/mL的HCC病例、以及CLD病例的血清樣品，都被ANNs正確分類。從由WCX2芯片確認(rèn)的生物標(biāo)記也得到相似結(jié)果。通過計(jì)算在不同ANN診斷分值截取值處的用于區(qū)分HCC病例和CLD病例的測(cè)試的靈敏性和特異性，構(gòu)建接收器-算子特征(Receiver-operator characteristic)(ROC)曲線。
HCC病例的診斷分值(0.8985±0.2689)顯著高于(p＜0.0005，Mann-Whitney test)CLD病例診斷分值(0.1647±0.3091)。ROC曲線分析顯示，無論血清AFP水平如何，ANN診斷分值都可用于區(qū)別HCC和CLD病例。對(duì)于所有病例，ROC曲線下面積為0.934(95％CI0.871-0.996，p＜0.0005)，然而對(duì)于具有非診斷性血清AFP水平(＜500ng/mL)的病例，該區(qū)域面積為0.966(95％CI0.917-1.015，p＜0.0005)。ANN診斷分值截取值為0.5000時(shí)，靈敏性和特異性分別為93％(40個(gè)病例中37個(gè)，SE為4％)和90％(20個(gè)對(duì)照病例中18個(gè)，SE為7％)。對(duì)于具有非診斷性血清AFP水平的HCC病例，95％HCC病例(22個(gè)病例中21個(gè)，SE為5％)被正確分類。
作為選擇，使用分類樹確認(rèn)具有最高預(yù)測(cè)價(jià)值的生物標(biāo)記和生物標(biāo)記組合。在這種方法中，使用由MathSoft，Inc.(Cambridge，MA)銷售的統(tǒng)計(jì)軟件包S-plus(版本4.5)將潛在生物標(biāo)記的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分類樹發(fā)展。
除了分析蛋白質(zhì)組特征的預(yù)測(cè)值，還可以通過雙路分級(jí)聚類分析獲得經(jīng)SAM確認(rèn)的蛋白質(zhì)組特征有關(guān)的附加信息。分析前，每個(gè)顯著蛋白質(zhì)組特征的中值強(qiáng)度被標(biāo)準(zhǔn)化為等于1，然后，所有標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度數(shù)據(jù)被減去1。在此數(shù)據(jù)處理后，當(dāng)強(qiáng)度數(shù)據(jù)大于中值強(qiáng)度時(shí)為正，小于中值強(qiáng)度時(shí)為負(fù)。使用Eisen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 9514863-8(1998)描述的Cluster和TreeView，將經(jīng)加工的顯著蛋白質(zhì)組特征和血清樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行雙路分級(jí)聚類分析。使用Pearson相關(guān)法(非居中)計(jì)算距離，進(jìn)行完整的聯(lián)結(jié)聚類。
大多數(shù)AFP低于500ng/mL的CLD典型病例(20個(gè)病例中19個(gè))，以及一個(gè)具有高血清AFP的病例被聚類在一起以組成一個(gè)特別的群體。HCC病例大體上聚類在一起。他們組成一個(gè)具有17個(gè)病例的主要子群和幾個(gè)較小子群。
為了測(cè)定這個(gè)HCC子群是否具有升高的血清AFP水平，使用Mann-Whitney test比較這個(gè)HCC子群與其他HCC病例之間的血清AFP水平。
HCC主要子群的血清AFP水平顯著較高(p＝0.05)。所以，本結(jié)果證明，不需知道血清AFP水平，具有升高的AFP的HCC亞型可以在血清蛋白質(zhì)組特性的基礎(chǔ)上得到鑒定。因此，全面的血清蛋白質(zhì)組特性可以將HCC分為幾個(gè)亞型。
由IMAC芯片鑒定的1087個(gè)蛋白質(zhì)簇中，student t-檢驗(yàn)分析鑒定137個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.0001)，而ANN分析鑒定了151個(gè)蛋白質(zhì)簇為潛在的生物標(biāo)記，鑒定了沒有通過t-檢驗(yàn)分析鑒定的生物標(biāo)記。這些附加的生物標(biāo)記中，有些繼而顯示在HCC檢測(cè)中具有顯著值。
根據(jù)本描述鑒定的生物標(biāo)記和生物標(biāo)記的組合可以用于確定病人的HCC風(fēng)險(xiǎn)。尤其是，生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合能夠以高預(yù)測(cè)成功分?jǐn)?shù)將HCC患者與CLD患者區(qū)分開來，即，大于至少85％，優(yōu)選大于至少90％，更優(yōu)選高于95％。
根據(jù)本描述鑒定的生物標(biāo)記和生物標(biāo)記的組合可以用于確認(rèn)個(gè)體的肝細(xì)胞癌狀態(tài)。尤其是，生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合能夠以高靈敏度和特異性將肝細(xì)胞癌患者與正?；颊邊^(qū)分開來，即，大于至少85％，優(yōu)選大于至少90％，更優(yōu)選高于95％。
因此，依照本發(fā)明的一個(gè)方面，檢測(cè)生物標(biāo)記來診斷肝細(xì)胞癌狀態(tài)需要將來自個(gè)體的樣品與基質(zhì)(例如SELDI探針)接觸，基質(zhì)上有吸附劑，接觸條件允許生物標(biāo)記和吸附劑之間結(jié)合，接著使用氣相離子光譜分析(例如質(zhì)譜)檢測(cè)結(jié)合到吸附劑上的生物標(biāo)記。其他可以在此使用的檢測(cè)方法包括光學(xué)方法、電化學(xué)方法(電壓分析和電流分析技術(shù))、原子力顯微鏡和無線電頻率方法(例如，多級(jí)共振光譜術(shù))。除了顯微鏡，光學(xué)方法(包括共聚焦和非共聚焦)的例子為熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、吸光率、反射系數(shù)、透射系數(shù)和雙折射或折射率(例如表面胞質(zhì)團(tuán)共振、橢圓偏光法、共振鏡像方法、光柵波導(dǎo)方法或干涉測(cè)量法)檢測(cè)法。
一方面，本發(fā)明中的標(biāo)記使用涉及利用氣相離子光譜儀檢測(cè)氣相離子的氣相離子光譜法進(jìn)行檢測(cè)。氣相離子光譜儀是檢測(cè)氣相離子的儀器。氣相離子光譜儀包含提供氣相離子的離子源。氣相離子光譜儀包括例如質(zhì)譜儀、離子遷移光譜儀和總離子流測(cè)量裝置。
“質(zhì)譜儀”指測(cè)量可轉(zhuǎn)化為氣相離子的質(zhì)量-電荷比的參數(shù)的氣相離子光譜儀。質(zhì)譜儀通常包括離子源和質(zhì)量分析器。質(zhì)譜儀實(shí)施例有飛行時(shí)間、磁力部分、四級(jí)濾波器、離子阱、離子回旋加速器共振，靜電部分分析器及其組合?！百|(zhì)譜分析”指使用質(zhì)譜儀檢測(cè)氣相離子?！凹す饨馕|(zhì)譜儀”指將激光作為對(duì)分析物解吸、揮發(fā)和離子化手段的質(zhì)譜儀。
“質(zhì)量分析器”指質(zhì)譜儀的組成部分，包括測(cè)量可轉(zhuǎn)化為氣相離子的質(zhì)量-電荷比的參數(shù)的手段。在飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中，質(zhì)量分析器包括離子光學(xué)部件、飛行管和離子檢測(cè)器。
“離子源”指氣相離子光譜儀中提供氣相離子的部件。在一個(gè)實(shí)施方案中，離子源通過解吸附/離子化過程提供離子。這些實(shí)施方案通常包括探針界面，其在位置上參與探針與離子化能量源(如激光解吸附/離子化源)的互相交流，同時(shí)使其在大氣壓或低于大氣壓下參與與氣相離子光譜儀檢測(cè)器的通訊。
將分析物從固相解吸附/離子化的離子化能的形式包括，例如(1)激光能；(2)快原子(用于快原子轟擊)；(3)放射性核β衰變產(chǎn)生的高能粒子(用于等離子體解吸附)；和(4)產(chǎn)生二級(jí)離子的一級(jí)離子(用于二級(jí)質(zhì)譜分析)。
用于固相分析物的離子化能形式優(yōu)選是激光(用于激光解吸附/離子化)，尤其是氮激光、Nd-Yag激光和其他脈沖激光源?！傲髁俊敝副谎芯繄D像每單位面積傳遞的激光能。一般，樣品置于與探針界面接洽的探針表面，探針表面在離子化能控制下。離子化能將分析物分子從表面解吸附為氣相并且將其離子化。
用于分析物的其他離子化能形式包括，例如(1)電離氣相中性物的電子；(2)誘導(dǎo)氣相、固相或液相中性物產(chǎn)生電離的強(qiáng)電場(chǎng)；和(3)使用電離粒子或電場(chǎng)與中性化學(xué)物的組合的源，誘導(dǎo)固相、氣相和液相中性物產(chǎn)生化學(xué)電離。
本發(fā)明優(yōu)選的質(zhì)譜技術(shù)為Surface Enhanced Laser Desorptionand Ionization(SELDI)，例如Hutchens和Yip的美國(guó)專利No.5,719,060和No.6,225,047所描述的，其中將分析物(此處為一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記)呈遞給能量源的探針表面在分析物分子解吸附/離子化中起積極作用。在這里，“探針”指接合到探針界面、并且將分析物呈遞給離子化能以離子化和將其傳入氣相離子光譜儀(例如質(zhì)譜儀)的裝置。探針一般包括柔軟或剛硬的固相基質(zhì)，該基質(zhì)具有將分析物呈遞給離子化能量源的樣品呈遞表面。
SELDI的一個(gè)版本稱為“Surface-Enhanced Affinity Capture”或“SEAC”，涉及使用包含化學(xué)選擇性表面的探針(“SELDI探針”)。“化學(xué)選擇性表面”結(jié)合有吸附劑(也稱為“結(jié)合部分”或“捕獲試劑”)或能結(jié)合捕獲試劑(例如，通過反應(yīng)形成共價(jià)鍵或配位共價(jià)鍵)的反應(yīng)部分。
此處“反應(yīng)部分”一詞表示能夠結(jié)合捕獲試劑的化學(xué)部分。環(huán)氧化物和carbodiimidizole是與例如抗體或細(xì)胞受體等多肽捕獲試劑共價(jià)結(jié)合的有用的反應(yīng)部分。次氮基乙酸和亞氨基二乙酸是有用的反應(yīng)部分，作為螯合劑，與非共價(jià)結(jié)合含組氨酸肽段的金屬離子結(jié)合。“反應(yīng)表面”是反應(yīng)部分結(jié)合的表面?！拔絼被颉安东@試劑”是能夠與本發(fā)明中生物標(biāo)記結(jié)合的任何物質(zhì)。依照本發(fā)明，適用于SELDI的吸附劑描述于前述美國(guó)專利No.6,225,047。
吸附劑的一種類型是“色譜吸附劑”，一般是用于色譜分析的物質(zhì)。色譜吸附劑包括，例如，離子交換物質(zhì)、金屬螯合劑、固定金屬螯合劑、疏水相互作用吸附劑、親水相互作用吸附劑、染料、簡(jiǎn)單生物分子(例如核苷酸、氨基酸、單糖和脂肪酸)和混合模式吸附劑(例如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)?！吧锾禺愋晕絼笔橇硪活惏锓肿拥奈絼?，包含核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、多糖、脂、類固醇或其綴合物(例如糖蛋白、脂蛋白和糖脂)。在某些實(shí)例中，生物特異性吸附劑可以是大分子，諸如多蛋白復(fù)合物、生物膜或病毒。示例性的生物特異性吸附劑是抗體、受體蛋白和核酸。
對(duì)于靶分析物，生物特異性吸附劑一般比色譜吸附劑具有更高的特異性。
SELDI的另一個(gè)版本是Surface-Enhanced Neat Desorption(SEND)，涉及使用包含化學(xué)結(jié)合于探針表面的能量吸收分子的探針(“SEND探針”)?！澳芰课辗肿?EAM)”一詞表示能夠從激光解吸附離子化源吸收能量，然后在與分析物分子接觸中促進(jìn)其解吸附和離子化。EAM類包括應(yīng)用于MALDI的分子，常指“基質(zhì)”，以肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羥基-肉桂酸(CHCA)、二羥基苯甲酸、阿魏酸和羥基乙酰苯酮衍生物為例。此類也包括應(yīng)用于SELDI的能量吸收分子，舉例見2002年2月25日申請(qǐng)的U.S.5,719,060和U.S.60/351,971(Kitagawa)。
SELDI的另一個(gè)版本稱為Surface-Enhanced PhotolabileAttachment and Release(SEPAR)，涉及使用探針，探針表面附有可共價(jià)結(jié)合分析物的部分，暴露于光源(如激光)后，通過斷裂光不穩(wěn)定鍵釋放分析物。舉例見U.S.5,719,060。依照本發(fā)明，SEPAR和其他形式的SELDI適用于檢測(cè)生物標(biāo)記或者生物標(biāo)記特性。
依照本發(fā)明，對(duì)生物標(biāo)記的檢測(cè)可以通過使用某些選擇性條件(例如，吸附劑或清洗溶液)得到加強(qiáng)。“清洗溶液”一詞指用來影響或改進(jìn)分析物對(duì)吸附表面的吸附，和/或從表面去除未結(jié)合物質(zhì)的試劑，一般為溶液。清洗溶液的洗脫特征依賴于諸如pH、離子強(qiáng)度、疏水性、無序性程度、去垢劑強(qiáng)度和溫度等條件。
依照本發(fā)明一個(gè)方面，樣品使用“生物芯片”方法進(jìn)行分析，“生物芯片”這個(gè)術(shù)語表示附有捕獲試劑(吸附劑)的固相基質(zhì)，一般具有平面表面。通常，生物芯片表面包含大量設(shè)定的位置，每個(gè)位置都結(jié)合有捕獲試劑。生物芯片可以接合探針界面，從而在氣相離子光譜分析，優(yōu)選質(zhì)譜分析中起到探針的作用。作為選擇，本發(fā)明中的生物芯片能夠裝在另一個(gè)基質(zhì)上，構(gòu)成能夠插入分光光度儀的探針。
用來捕獲本發(fā)明的生物標(biāo)記的多種生物芯片可以通過商業(yè)來源獲得，例如Ciphergen Biosystems(Fremont，CA)，Perkin Elmer(PackardBioScience Company(Meriden CT)，Zyomyx(Hayward，CA)和Phylos(Lexington，MA)。這些生物芯片的例子描述于前述美國(guó)專利No.6,225,047和No.6,329,209(Wagner等)，以及PCT出版物WO99/51773(Kuimelis和Wagner)和WO00/56934(Englert等)。
更明確的，Ciphergen Biosystems生產(chǎn)的生物芯片顯現(xiàn)為條帶形式的鋁制基質(zhì)，基質(zhì)表面的設(shè)定位置上附以色譜或生物特異性吸附劑。條帶表面以二氧化硅包被。
Ciphergen ProteinChip陣列的示例是H4、SAX-2、WCX-2和IMAC-3生物芯片，包含水凝膠形式的功能化交聯(lián)聚合體，物理地或者通過硅烷共價(jià)附著于生物芯片表面。H4生物芯片具有異丙基官能團(tuán)，用于疏水結(jié)合。SAX-2生物芯片具有季銨官能團(tuán)，用于陰離子交換。WCX-2生物芯片具有羧酸官能團(tuán)，用于陽離子交換。IMAC-3生物芯片具有次氮基乙酸官能團(tuán)，通過螯合作用吸附過渡金屬離子，例如Cu++和Ni++。這些固定金屬離子繼而通過配位共價(jià)鍵吸附生物標(biāo)記。因而，Ciphergen′s IMACProtein Chip陣列連同反應(yīng)部分一起出售，在加入金屬溶液時(shí)，反應(yīng)部分成為吸附劑。
與上述原理一致，帶有吸附劑的基質(zhì)與含有血清的樣品接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使可能存在的生物標(biāo)記與吸附劑結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，不止一種帶有吸附劑的基質(zhì)用來與生物樣品接觸。例如，一個(gè)樣品可以應(yīng)用于WCX和IMAC芯片。
這種技術(shù)可以允許對(duì)癌癥狀態(tài)進(jìn)行更加確定的評(píng)價(jià)。經(jīng)過孵育階段后，清洗基質(zhì)以去除未結(jié)合物質(zhì)?？梢允褂萌魏芜m宜的清洗溶液，優(yōu)選使用水溶液。
然后將能量吸收分子加至結(jié)合生物標(biāo)記的基質(zhì)上。如文中所指出，能量吸收分子是從諸如激光的能量源吸收能量，繼而幫助生物標(biāo)記從基質(zhì)解吸附的分子。示例性的能量吸收分子包括，如上文所述，肉桂酸衍生物、芥子酸和二羥基苯甲酸。優(yōu)選芥子酸。
結(jié)合于基質(zhì)的生物標(biāo)記在氣相離子光譜儀中檢測(cè)，例如飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。生物標(biāo)記被離子源(例如激光)離子化，產(chǎn)生的離子被離子光學(xué)裝置收集，然后由質(zhì)量分析器將經(jīng)過的離子分散、分析。檢測(cè)器隨后將檢測(cè)到的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)量-電荷比。生物標(biāo)記的檢測(cè)一般涉及信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)。因此，生物標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量都可以得到測(cè)定。
生物標(biāo)記解吸附和檢測(cè)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以利用可編程的數(shù)字計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。計(jì)算機(jī)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，以顯示檢測(cè)到的標(biāo)記數(shù)量，還可以顯示每個(gè)檢測(cè)到的標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度和確定的分子量。數(shù)據(jù)分析可以包括測(cè)定生物標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度、去除偏離預(yù)先確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布的數(shù)據(jù)。例如，觀察到的峰可以通過計(jì)算每個(gè)峰相對(duì)于參照的峰高度進(jìn)行歸一化。參照可以是由設(shè)備和設(shè)置為零刻度的化學(xué)物(例如能量吸收分子)產(chǎn)生的背景噪音。
計(jì)算機(jī)能夠?qū)a(chǎn)生的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為不同顯示形式。可以顯示標(biāo)準(zhǔn)圖譜，但是在一種有用的形式中，僅僅保留圖譜中的峰高和質(zhì)量信息，以產(chǎn)生更清楚的圖像，可以輕易辨認(rèn)具有幾乎相同的分子量的生物標(biāo)記。在另一種有用的形式中，將兩個(gè)或兩個(gè)以上圖譜進(jìn)行比較，方便的突出樣品之間特有的峰和上調(diào)或下調(diào)的生物標(biāo)記。使用任何形式，都能容易的確定某個(gè)特定生物標(biāo)記是否出現(xiàn)在樣品中。
用于分析數(shù)據(jù)的軟件可以包括應(yīng)用某個(gè)算法的編碼，應(yīng)用算法分析信號(hào)，來確定一個(gè)信號(hào)是否代表一個(gè)與本發(fā)明生物標(biāo)記相應(yīng)的信號(hào)峰。該軟件同樣可以將有關(guān)觀測(cè)到的生物標(biāo)記峰送交分類樹或ANN分析，來確定其中是否出現(xiàn)指示肝細(xì)胞癌狀態(tài)的生物標(biāo)記峰或生物標(biāo)記峰的組合。數(shù)據(jù)分析可以輸入直接或者間接的從樣品質(zhì)譜分析獲得的多種參數(shù)。
這些參數(shù)包括但是并不受限于出現(xiàn)或缺少一個(gè)或多個(gè)峰、單個(gè)峰或一組峰的形狀、一個(gè)或多個(gè)峰的高度、一個(gè)或多個(gè)峰高的對(duì)數(shù)，以及其他對(duì)于峰高數(shù)據(jù)的算法操作。
另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)本發(fā)明生物標(biāo)記的試劑盒，以幫助診斷肝細(xì)胞癌狀態(tài)。試劑盒對(duì)來自正常個(gè)體和肝細(xì)胞癌個(gè)體的樣品表現(xiàn)出差異的生物標(biāo)記和生物標(biāo)記的組合進(jìn)行篩查。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括帶有適于結(jié)合本發(fā)明中生物標(biāo)記的吸附劑的基質(zhì)，以及清洗溶液或制作清洗溶液的說明書，其中吸附劑和清洗溶液聯(lián)合允許使用氣相離子光譜法(例如質(zhì)譜)檢測(cè)生物標(biāo)記。試劑盒可以包括一種以上吸附劑，每種在不同的基質(zhì)上呈現(xiàn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可以包括第一基質(zhì)和第二基質(zhì)，第一基質(zhì)包括其上的吸附劑，并且定位到第二基質(zhì)上，形成可以插入氣相離子光譜儀(例如質(zhì)譜)的探針。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可以包含能夠插入分光光度計(jì)的單個(gè)基質(zhì)。
在一個(gè)更深入的實(shí)施方案中，這樣一個(gè)試劑盒可以包括以標(biāo)簽或者單獨(dú)插入物形式的說明書，提供適宜的操作參數(shù)。例如，此說明書可以告訴用戶如何采集樣品或者如何清洗探針。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以包括一個(gè)或者多個(gè)裝有生物標(biāo)記樣品的容器，作為標(biāo)準(zhǔn)用于校正。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過檢測(cè)生物標(biāo)記來診斷個(gè)體肝細(xì)胞癌，需要將其上帶有吸附劑的基質(zhì)與來自于個(gè)體或病人的樣品(優(yōu)選血清)在允許生物標(biāo)記與吸附劑結(jié)合的條件下接觸，然后由氣相離子光譜法(優(yōu)選SELDI)檢測(cè)與吸附劑結(jié)合的生物標(biāo)記。生物標(biāo)記被離子源(例如激光)離子化。產(chǎn)生的離子被離子光學(xué)裝置收集并且向離子檢測(cè)器加速。撞擊檢測(cè)器的離子產(chǎn)生電勢(shì)能，被數(shù)字捕獲模擬信號(hào)的高速時(shí)間陣列記錄裝置數(shù)字化。Ciphergen的ProteinChips采用模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)實(shí)現(xiàn)這一過程。ADC將檢測(cè)器在常規(guī)時(shí)間間隔的輸出整合為時(shí)間依賴的二進(jìn)制信號(hào)。時(shí)間間隔一般長(zhǎng)為1到4納秒。此外，最終分析的飛行時(shí)間圖譜一般不代表樣品離子化能量單個(gè)脈沖得到的信號(hào)，而是許多脈沖信號(hào)的總和。這樣能減少噪聲并增加動(dòng)力學(xué)范圍。于是對(duì)這些飛行時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在Ciphergen的ProteinChip軟件中，數(shù)據(jù)處理一般包括TOF到M/Z轉(zhuǎn)換、基線減除和高頻率噪聲濾除。因此，生物標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量都可以確定。
對(duì)生物標(biāo)記的檢測(cè)可以通過使用某些選擇性條件得到加強(qiáng)，例如吸附劑或清洗溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，在檢測(cè)樣品中生物標(biāo)記的方法里，使用與發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記相同或者相近的選擇性條件。例如，固定金屬親合捕獲芯片(例如Cu(II)IMAC3)和弱陽離子交換芯片(例如WCX2)芯片為用于生物標(biāo)記檢測(cè)的優(yōu)選的吸附劑。
其他吸附劑仍然可以使用，只要它們具有適合結(jié)合生物標(biāo)記的結(jié)合特征。
尤其，具有了關(guān)于此處確定的生物標(biāo)記的信息，就可以使用多種方法去識(shí)別本發(fā)明中兩個(gè)、三個(gè)和更多生物標(biāo)記的組合模式。這些方法獲取關(guān)于出現(xiàn)哪些峰及其強(qiáng)度的原始資料，并對(duì)一個(gè)樣品提供肝細(xì)胞癌與正常的鑒別診斷。
因此，本發(fā)明的步驟可以分為學(xué)習(xí)階段和分類階段。在學(xué)習(xí)階段，將學(xué)習(xí)算法應(yīng)用于數(shù)據(jù)組，該數(shù)據(jù)組包括預(yù)定分類的不同類成員，例如，來自于多個(gè)診斷為癌癥樣品的數(shù)據(jù)和來自于多數(shù)陰性診斷樣品的數(shù)據(jù)。
數(shù)據(jù)分析方法包括但是不限制于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、support vectormachines、遺傳學(xué)算法和自組裝圖和分類及回歸樹分析。這些方法描述于例如WO01/31579，2001年5月3日(Barnhill等)；WO02/06829，2002年1月24日(Hitt等)和WO02/42733，2002年5月30日(Paulse等)。學(xué)習(xí)算法產(chǎn)生分類算法。把能夠?qū)⒁粋€(gè)未知樣品劃分到兩類之一的數(shù)據(jù)元件輸入分類器，例如特定的標(biāo)記和特定標(biāo)記的強(qiáng)度(通常為其組合)。分類器最終用作診斷測(cè)試。
無論免費(fèi)軟件還是專有軟件，都可用來分析數(shù)據(jù)中的這些模式，并且可以根據(jù)任何預(yù)定的成功標(biāo)準(zhǔn)作出額外的模式。這些本身對(duì)于肝細(xì)胞癌和CLD的鑒別診斷具有預(yù)見性的生物標(biāo)記，不需要模式識(shí)別軟件來分析數(shù)據(jù)。
以下實(shí)施例用于說明，而非限制性的。
實(shí)施例1.患者群體在患者同意下，向40名HCC病人和21名慢性肝臟疾病病人采集凝集血樣品，在化驗(yàn)前保存于-70℃。HCC患者系根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化臨床標(biāo)準(zhǔn)診斷。所有HCC病例均經(jīng)過組織學(xué)證實(shí)。在HCC病例中，18名血清AFP水平＞500ng/ml，22名血清AFP水平＜500ng/ml。使用來自于20例CLD且AFP＜500ng/ml的血清樣品作為對(duì)照組。對(duì)于所有CLD患者的任意HCC體征隨訪至少18個(gè)月，以排除無癥狀HCC個(gè)體。在此研究中，同樣對(duì)一個(gè)來自于CLD患者、AFP水平＞500ng/mL(905ng/mL)的血清樣品進(jìn)行分析。除了單獨(dú)分析每個(gè)血清樣品外，將來自HCC病人、AFP＞500ng/ml的血清樣品，以及來自HCC病人、AFP＜500ng/ml的血清樣品分別被集中為樣品HCCP1和HCCP2，來自對(duì)照組的血清樣品被集中為樣品CLDP1。樣品的血清AFP水平使用微粒(microparticle)EIA(MEIA，Abbott Laboratories，Chicago，USA)進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例2.血清分級(jí)緩沖液1.U9(9M脲，2％CHAPS，50mM Tris-HCI pH9)2.U1(1M脲，0.22％CHAPS，50mM Tris-HCI pH9)3.清洗緩沖液150mM Tris-HCI，含有0.1％正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)，pH94.清洗緩沖液2100mM磷酸鈉，含有0.1％OGP，pH75.清洗緩沖液3100mM醋酸鈉，含有0.1％OGP，pH56.清洗緩沖液4100mM醋酸鈉，含有0.1％OGP，pH47.清洗緩沖液550mM檸檬酸鈉，含有0.1％OGP，pH38.清洗緩沖液633.3％異丙醇/16.7％乙腈/0.1％三氟乙酸水溶液陰離子交換分級(jí)可以看作是雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(2DPAGE)當(dāng)中第一向等電聚焦的類似技術(shù)。
這兩種技術(shù)都基于其等電點(diǎn)(pI)值而分離蛋白質(zhì)。將30ul U9緩沖液加入置于管中的20ul血清當(dāng)中，于4℃混和20分鐘。離子交換樹脂(Q Ceramic HyperDF離子交換樹脂，Biosepra SA，F(xiàn)rance)用5倍床體積的50mM Tris-HCl，pH9沖洗3次，以50％的懸濁液保存。在Biomek 2000 Automation Workstation(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)上，將96孔濾板(96孔Silent Screen濾板，Loprodyne膜，0.45微米孔徑，Nalge Nunc International，USA)的每個(gè)孔加以125ul離子交換樹脂(50％懸濁液)，用150uL U1緩沖液清洗3次并真空干燥。把經(jīng)尿素處理的血清轉(zhuǎn)移到各孔的離子交換樹脂上。血清管用50ul U1緩沖液漂洗，也轉(zhuǎn)移到濾板內(nèi)相應(yīng)孔。濾板在平面搖床上，于4℃混和30分鐘。直流級(jí)分被真空泵收集于96孔板內(nèi)(第1級(jí)分)。隨后，給濾板各孔加入100ul清洗緩沖液1，于室溫混和10分鐘。
洗脫液收集到同一個(gè)96孔板中(第1級(jí)分)。依次用清洗緩沖液2、3、4、5和6將濾板中的樹脂各清洗2次，每次100ul。每份洗脫液(總體積為200ul)收集于96孔板中(第2、3、4、5和6級(jí)分)。
實(shí)施例3.分級(jí)血清的SELDI分析ProteinChipArrays裝配在96孔生物處理器內(nèi)。緩沖液輸送和樣品孵育在Biomek 2000 Automation Workstation上進(jìn)行。每個(gè)血清級(jí)分以雙樣本在IMAC3(裝載有銅)和WCX2 ProteinChipArrays上分析。不同的ProteinChip表面(第二維)幫助識(shí)別非常低豐度的蛋白質(zhì)。IMAC3銅和WCX2 ProteinChip表面根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)優(yōu)先保留不同的蛋白質(zhì)基團(tuán)。
IMAC3銅和WCX2陣列(Ciphergen Biosystems Inc，F(xiàn)remont，CA)使用150ul結(jié)合緩沖液(對(duì)于IMAC3100mM磷酸鈉+0.5M NaCI pH7，對(duì)于WCX2100mM醋酸鈉pH4)平衡2次。每個(gè)血清級(jí)分使用相應(yīng)的結(jié)合緩沖液稀釋(對(duì)于IMAC3，1/5稀釋，對(duì)于WCX2，1/10稀釋)，并將100μl加樣于每個(gè)ProteinChip陣列。在平面搖床上于室溫條件下孵育30分鐘。
每個(gè)陣列使用相應(yīng)的結(jié)合緩沖液150ul洗滌3次，再用水漂洗2次。ProteinChip陣列在空氣中干燥。芥子酸基質(zhì)(準(zhǔn)備于50％乙腈和0.5％三氟乙酸中)加于每個(gè)陣列。
ProteinChip陣列在ProteinChipPBSII Reader(CiphergenBiosystems Inc.)上讀取，以測(cè)量蛋白質(zhì)峰(Ciphergen)的質(zhì)量和強(qiáng)度。每個(gè)陣列平均總共253次激光轟擊。使用ProteinChipPBSIIReader進(jìn)行質(zhì)譜分析(第三維)可視為2D PAGE中第二向分離(SDS-PAGE)的具有更高分辨率的替代物。這兩種技術(shù)都在蛋白質(zhì)分子量基礎(chǔ)上將其分離。每個(gè)質(zhì)量范圍從0到200kDa的陣列平均235次激光轟擊。對(duì)所有的質(zhì)量圖譜進(jìn)行歸一化，使其具有相同的總離子流。峰強(qiáng)度的CV低于15％(制造商信息)。共有的蛋白質(zhì)峰被ProteinChip軟件的Biomarker WizardTM功能挑出(Ciphergen)。
權(quán)利要求
1.鑒定個(gè)體中肝細(xì)胞癌狀態(tài)的方法，包括對(duì)來自所述個(gè)體生物樣品的蛋白質(zhì)的診斷水平進(jìn)行分析，所述蛋白質(zhì)選自(A)I-M1，I-M2，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M8，I-M9，I-M10，I-M11，I-M12，I-M13，I-M14，I-M15，I-M16，I-M17，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M24，I-M25，I-M26，I-M27，I-M28，I-M29，I-M30，I-M31，I-M32，I-M33，I-M34，I-M35，I-M36，I-M37，I-M38，I-M39，I-M40，I-M41，I-M42，I-M43，I-M44，I-M45，I-M46，I-M47，I-M48，I-M49，I-M50，I-M51，I-M52，I-M53，I-M54，I-M55，I-M56，I-M57，I-M58，I-M59，I-M60，I-M61，I-M61，I-M62，I-M63，I-M64，I-M65，I-M66，I-M67，I-M68，I-M69，I-M70，I-M71，I-M72，I-M73，I-M74，I-M75，I-M76，I-M77，I-M79，I-M80，I-M81，I-M82，I-M83，I-M84，I-M85，I-M86，I-M87，I-M88，I-M89，I-M90，I-M91，I-M92，I-M93，I-M94，I-M95，I-M96，I-M97，I-M98，I-M99，I-M100和/或(B)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M6，W-M7，W-M8，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M24，W-M25，W-M26，W-M27，W-M28，W-M29，W-M30，W-M31，W-M32，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M37，W-M38，W-M39，W-M40，W-M41，W-M42，W-M43，W-M44，W-M45，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M51，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M56，W-M57，W-M58，W-M59，W-M60，W-M61，W-M61，W-M62，W-M63，W-M64，W-M65，W-M66，W-M67，W-M68，W-M69，W-M70，W-M71，W-M72，W-M73，W-M74，W-M75，W-M76，W-M77，W-M79，W-M80，W-M81，W-M82，W-M83，W-M84，W-M85，W-M86，W-M87，W-M88，W-M89，W-M90，W-M91，W-M92，W-M93，W-M94，W-M95，W-M96，W-M97，W-M98，W-M99，W-M100，其中所述水平高于標(biāo)準(zhǔn)。
2.權(quán)利要求1的鑒定患者肝細(xì)胞癌狀態(tài)的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自(A)I-M1，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M9，I-M11，I-M12，I-M13，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M25，I-M26，I-M28，I-M32，I-M34，I-M36，I-M37，I-M41，I-M44，I-M46，I-M47，I-M52，I-M53，I-M64，I-M68，I-M69，I-M77，I-M79，I-M81，I-M84，I-M87，I-M88，I-M89，和I-M92和/或(B)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M7，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M25，W-M26，W-M27，W-M30，W-M31，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M39，W-M40，W-M41，W-M43，W-M44，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M58，W-M60，W-M62，W-M63，W-M70，W-M71，W-M73，W-M76，W-M78，W-M84，W-M86，W-M88，W-M89，W-M90，W-M93，W-M95，W-M96，W-M98，和W-M100。.
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白質(zhì)為I-M13、I-M18、I-M19、W-M2或W-M23。
4.確定患者中肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括(A)提供來自該患者的生物樣品的質(zhì)譜分析產(chǎn)生的圖譜，和(B)從該圖譜提取數(shù)據(jù)，并將此數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，其中所述模式識(shí)別分析輸入了至少一個(gè)選自下列的峰(i)I-M1，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M9，I-M11，I-M12，I-M13，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M25，I-M26，I-M28，I-M32，I-M34，I-M36，I-M37，I-M41，I-M44，I-M46，I-M47，I-M52，I-M53，I-M64，I-M68，I-M69，I-M77，I-M79，I-M81，I-M84，I-M87，I-M88，I-M89，和I-M92，和/或(ii)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M7，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M25，W-M26，W-M27，W-M30，W-M31，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M39，W-M40，W-M41，W-M43，W-M44，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M58，W-M60，W-M62，W-M63，W-M70，W-M71，W-M73，W-M76，W-M78，W-M84，W-M86，W-M88，W-M89，W-M90，W-M93，W-M95，W-M96，W-M98，和W-M100。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述模式識(shí)別輸入了選自下列的一對(duì)峰(A)I-M13和I-M25，I-M13和I-M7，I-M25和I-M46，I-M37和I-M77，I-M5和I-M36，和/或(B)W-M14和W-M98，W-M21和W-M46，W-M11和W-M52，W-M16和W-M89，W-M1和W-M46，W-M21和W-M76，W-M11和W-M33，W-M13和W-M18，W-M2和W-M46，W-M33和W-M54，W-M2和W-M46，W-M16和W-M46，W-M11和W-M5。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述模式識(shí)別分析輸入了選自下列的三峰(A)I-M1，I-M4和I-M36；I-M5，I-M7和I-M19；I-M7，I-M19和I-M46；I-M9，I-M34和I-M52；I-M7，I-M18和I-M47；I-M11，I-M13和I-M36；I-M9，I-M77和I-M84；和I-M18，I-M22和I-M79，和/或(B)W-M21，W-M22和W-M35；W-M7，W-M21和W-M46；W-M13，W-M14和W-M98；W-M14，W-M54和W-M70；W-M11，W-M33和W-M46；W-M17，W-M36和W-M98；W-M19，W-M21和W-M22；W-M14，W-M15，W-M54；W-M55，W-M58和W-M98；W-M11，W-M14和W-M98；W-M1，W-M33和W-M46；W-M40，W-M46和W-M49；W-M15，W-M21和W-M22；W-M14，W-M36和W-M98；W-M5，W-M11和W-M54；W-M14，W-M22和W-M25；W-M14，W-M58和W-M98；W-M5，W-M14和W-M89；W-M7，W-M14和W-M89；W-M14，W-M21和W-M98；W-M11，W-M58和W-M71；W-M14，W-M25和W-M54；W-M14，W-M60和W-M89；W-M21，W-M46和W-M100。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述模式識(shí)別分析輸入了選自下列的峰組合(A)I-M11，I-M13，I-M19和I-M89；I-M13，I-M19，I-M22和I-M26；I-M1，I-M5，I-M36和I-M41；I-M19，I-M33，I-M44和I-M46；I-M3，I-M18，I-M68和I-M81；I-M3，I-M12，I-M34和I-M81；I-M12，I-M13，I-M32和I-M37；I-M18，I-M44，I-M46和I-M79；I-M7，I-M13，I-M21和I-M23；I-M3，I-M18，I-M77和I-M92；I-M12，I-M13，I-M77和I-M87；I-M6，I-M13，I-M34和I-M81；I-M8，I-M19，I-M53，I-M64，I-M69；I-M4，I-M18，I-M28，I-M47和I-M88；和I-M1，I-M4，I-M18，I-M36，I-M41和I-M47，和/或(B)W-M25，W-M55，W-M62和W-M98；W-M7，W-M14，W-M17和W-M89；W-M17，W-M31，W-M93和W-M98；W-M11，W-M19，W-M46和W-M50；W-M4，W-M33，W-M55和W-M98；W-M5，W-M11，W-M36和W-M54；W-M16，W-M36，W-M43和W-M46；W-M11，W-M41，W-M54和W-M73；W-M5，W-M11，W-M52和W-M89；W-M4，W-M14，58和W-M89；W-M2，W-M12，W-M14，W-M89；W-M5，W-M11，W-M20和W-M40；W-M21，W-M46，W-M70和W-M88；W-M21，W-M33，W-M34和W-M46；W-M17，W-M20，W-M40和W-M58；W-M17，W-M33，W-M52和W-M98；W-M3，W-M7，W-M21和W-M46；W-M10，W-M22，W-M30和W-M95；W-M1，W-M46，W-M54和W-M70；W-M11，W-M14，W-M25和W-M54；W-M11，W-M33，W-M46和W-M90；W-M11，W-M14，W-M54和W-M89；W-M7，W-M18，W-M21和W-M22；W-M17，W-M20，W-M52和W-M98；W-M2，W-M15，W-M19，W-M22和W-M55；W-M17，W-M19，W-M26，W-M47和W-M98；W-M9，W-M11，W-M27，W-M46和W-M78；W-M5，W-M11，W-M33，W-M46和W-M53；W-M2，W-M9，W-M15，W-M19和W-M89；W-M5，W-M11，W-M52，W-M89和W-M96；W-M16，W-M25，W-M40，W-M52和W-M89；W-M14，W-M15，W-M21，W-M22和W-M89；W-M5，W-M13，W-M16，W-M20和W-M98；W-M9，W-M23，W-M26，W-M40和W-M89；W-M20，W-M27，W-M30，W-M35，W-M40和W-M70；W-M13，W-M26，W-M39，W-M44，W-M63和W-M98；W-M5，W-M13，W-M35，W-M39，W-M86和W-M89；和W-M3，W-M18，W-M21，W-M22，W-M48，和W-M84。
8.用于檢測(cè)和診斷肝細(xì)胞癌的試劑盒，包括(A)附于基質(zhì)上的吸附劑，其保留一個(gè)或者多個(gè)選自下列的生物標(biāo)記(i)I-M1，I-M2，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M8，I-M9，I-M10，I-M11，I-M12，I-M13，I-M14，I-M15，I-M16，I-M17，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M24，I-M25，I-M26，I-M27，I-M28，I-M29，I-M30，I-M31，I-M32，I-M33，I-M34，I-M35，I-M36，I-M37，I-M38，I-M39，I-M40，I-M41，I-M42，I-M43，I-M44，I-M45，I-M46，I-M47，I-M48，I-M49，I-M50，I-M51，I-M52，I-M53，I-M54，I-M55，I-M56，I-M57，I-M58，I-M59，I-M60，I-M61，I-M61，I-M62，I-M63，I-M64，I-M65，I-M66，I-M67，I-M68，I-M69，I-M70，I-M71，I-M72，I-M73，I-M74，I-M75，I-M76，I-M77，I-M79，I-M80，I-M81，I-M82，I-M83，I-M84，I-M85，I-M86，I-M87，I-M88，I-M89，I-M90，I-M91，I-M92，I-M93，I-M94，I-M95，I-M96，I-M97，I-M98，I-M99，I-M100或(ii)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M6，W-M7，W-M8，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M24，W-M25，W-M26，W-M27，W-M28，W-M29，W-M30，W-M31，W-M32，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M37，W-M38，W-M39，W-M40，W-M41，W-M42，W-M43，W-M44，W-M45，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M51，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M56，W-M57，W-M58，W-M58，W-M60，W-M61，W-M61，W-M62，W-M63，W-M64，W-M65，W-M66，W-M67，W-M68，W-M69，W-M70，W-M71，W-M72，W-M73，W-M74，W-M75，W-M76，W-M77，W-M79，W-M80，W-M81，W-M82，W-M83，W-M84，W-M85，W-M86，W-M87，W-M88，W-M89，W-M90，W-M91，W-M92，W-M93，W-M94，W-M95，W-M96，W-M97，W-M98，W-M99，W-M100，(B)檢測(cè)所述生物標(biāo)記的說明書，教導(dǎo)了將樣品與所述吸附劑接觸并檢測(cè)被所述吸附劑保留的生物標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，進(jìn)一步包括清洗溶液或者制備清洗溶液的說明書。
10.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述基質(zhì)為SELDI探針，該探針包括(i)通過螯合作用吸附過渡金屬離子的官能團(tuán)，或(ii)允許陽離子交換的官能團(tuán)。
11.用于鑒定個(gè)體肝細(xì)胞癌狀態(tài)的軟件，包括對(duì)提取自圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的算法，所述圖譜由取自該個(gè)體的生物樣品經(jīng)質(zhì)譜分析產(chǎn)生，其中所述的數(shù)據(jù)與一個(gè)或多個(gè)選自下列的生物標(biāo)記有關(guān)(i)I-M1，I-M2，I-M3，I-M4，I-M5，I-M6，I-M7，I-M8，I-M9，I-M10，I-M11，I-M12，I-M13，I-M14，I-M15，I-M16，I-M17，I-M18，I-M19，I-M20，I-M21，I-M22，I-M23，I-M24，I-M25，I-M26，I-M27，I-M28，I-M29，I-M30，I-M31，I-M32，I-M33，I-M34，I-M35，I-M36，I-M37，I-M38，I-M39，I-M40，I-M41，I-M42，I-M43，I-M44，I-M45，I-M46，I-M47，I-M48，I-M49，I-M50，I-M51，I-M52，I-M53，I-M54，I-M55，I-M56，I-M57，I-M58，I-M59，I-M60，I-M61，I-M61，I-M62，I-M63，I-M64，I-M65，I-M66，I-M67，I-M68，I-M69，I-M70，I-M71，I-M72，I-M73，I-M74，I-M75，I-M76，I-M77，I-M79，I-M80，I-M81，I-M82，I-M83，I-M84，I-M85，I-M86，I-M87，I-M88，I-M89，I-M90，I-M91，I-M92，I-M93，I-M94，I-M95，I-M96，I-M97，I-M98，I-M99，I-M100或(ii)W-M1，W-M2，W-M3，W-M4，W-M5，W-M6，W-M7，W-M8，W-M9，W-M10，W-M11，W-M12，W-M13，W-M14，W-M15，W-M16，W-M17，W-M18，W-M19，W-M20，W-M21，W-M22，W-M23，W-M24，W-M25，W-M26，W-M27，W-M28，W-M29，W-M30，W-M31，W-M32，W-M33，W-M34，W-M35，W-M36，W-M37，W-M38，W-M39，W-M40，W-M41，W-M42，W-M43，W-M44，W-M45，W-M46，W-M47，W-M48，W-M49，W-M50，W-M51，W-M52，W-M53，W-M54，W-M55，W-M56，W-M57，W-M58，W-M59，W-M60，W-M61，W-M61，W-M62，W-M63，W-M64，W-M65，W-M66，W-M67，W-M68，W-M69，W-M70，W-M71，W-M72，W-M73，W-M74，W-M75，W-M76，W-M77，W-M79，W-M80，W-M81，W-M82，W-M83，W-M84，W-M85，W-M86，W-M87，W-M88，W-M89，W-M90，W-M91，W-M92，W-M93，W-M94，W-M95，W-M96，W-M97，W-M98，W-M99，W-M100。
12.權(quán)利要求11的軟件，其中所述算法執(zhí)行模式識(shí)別分析，所述模式識(shí)別分析輸入了與至少一個(gè)所述生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)。
13.權(quán)利要求12的軟件，其中所述算法包括分類樹分析，所述分析輸入了與至少一個(gè)所述生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)。
14.權(quán)利要求12的軟件，其中所述算法包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，所述分析輸入了與至少一個(gè)所述生物標(biāo)記有關(guān)的數(shù)據(jù)。
全文摘要
某些生物標(biāo)記和生物標(biāo)記組合可用于在患者中鑒定肝細(xì)胞癌狀態(tài)。利用這些生物標(biāo)記和組合的診斷方法可以區(qū)分例如肝細(xì)胞癌和慢性肝病。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1649613SQ03809631
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者T－T·伊普, T·C·W·波恩, P·約翰遜, V·F·伊普, C·L·伊普, A·T·C·錢 申請(qǐng)人:賽弗根生物系統(tǒng)股份有限公司, 香港中文大學(xué)