專利名稱：Ice1,一種植物冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組和耐寒調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有關(guān)植物冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組和耐凍調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)和核酸。
背景技術(shù)：
寒冷是一個限制許多植物物種地理分布和生長季節(jié)的環(huán)境因素，經(jīng)常不利于作物的質(zhì)量和產(chǎn)量(Thomashow 1999)。例如，大多數(shù)溫帶植物能夠獲得對冷凍溫度的耐受力，其通過眾所周知的這樣一個冷適應(yīng)過程，就是事先將植物暴露于低的非冷凍溫度下(Guy 1990；Hughes and Dunn 1996；Browseand Xin 2001)。但是，熱帶和亞熱帶起源的植物就無法適應(yīng)寒冷氣候，并且對驟冷溫度(0-10℃)很敏感。許多研究表明植物中冷調(diào)節(jié)基因表達對忍受驟冷(Gong et al.2002)和冷適應(yīng)(Thomashow 1999；Knight et al.1999；Tahtiharju and Palva 2001)是一個關(guān)鍵。冷反應(yīng)基因編碼一批不同的蛋白質(zhì)，比如參與碳水化合物的呼吸和代謝的酶、脂類、苯丙素(phenylpropanoids)和抗氧化物；分子陪伴蛋白質(zhì)、抗凍蛋白；以及其它可能具有由冷凍引起的脫水耐受性功能的物質(zhì)(Thomashow 1999；Guy 1990；Mohapatra et al.1989)。
許多冷凍和脫水反應(yīng)基因在它們的啟動子里具有一個或幾個DRE/CRTcis-成分的拷貝，具有核心序列CCGAC(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki1994；Stockinger et al.1997)。轉(zhuǎn)錄因子族如眾所周知的CBFs或DREB1s結(jié)合到這個成分上，激活冷凍和脫水反應(yīng)基因的下游轉(zhuǎn)錄(Stockinger et al.1997；Liu et al.1998)。有趣的是，CBF/DREB1基因本身受低溫誘導(dǎo)。這個誘導(dǎo)作用是瞬時的并且是先于帶有DRF/CRT cis-成分下游基因的誘導(dǎo)作用(Thomashow1999)。所以，有一個轉(zhuǎn)錄級聯(lián)引導(dǎo)DRE/CRT組的基因在寒冷壓力下進行表達。植物中CBFs/DREB1s的異位表達甚至在溫暖的溫度下開啟下游寒冷-反應(yīng)基因，并給與改進了的耐寒力(Jagglo-Ottosen et al.1998；Liu et al.1998)。
因為CBF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在植物暴露于寒冷中15分鐘內(nèi)開始積累，Gilmour etal(1998)認(rèn)為有一個轉(zhuǎn)錄因子在正常生長溫度下早已存在于細(xì)胞中，在暴露于寒冷壓力時識別CBF啟動子誘導(dǎo)CBF的表達。Gilmour et al(1998)將未知激活劑命名為“ICE”(Inducer of CBF Expression，CBF表達誘導(dǎo)劑)蛋白質(zhì)并假設(shè)將植物暴露于寒冷條件下，無論是ICE或與其相關(guān)的蛋白質(zhì)的改變，都使ICE結(jié)合到CBF啟動子上并激活CBF的轉(zhuǎn)錄。
在含有CRT/DRE成分的RD29A啟動子(Ishitani et al.1997)驅(qū)動下表達螢火蟲熒光素酶報道基因的擬南芥植物的基因?qū)W分析，已經(jīng)識別了幾種解除寒冷-反應(yīng)基因表達的突變體。hos1(high expression of osmoticallyresponsive genes，滲透反應(yīng)基因的高表達)突變體顯示了CBFs基因及它們下游寒冷反應(yīng)基因的增進了的寒冷誘導(dǎo)作用(Ishitani et al.1998)。在正常的生長溫度時HOS1編碼一個存在于細(xì)胞質(zhì)中的RING手指蛋白，但經(jīng)寒冷處理時蛋白累積在細(xì)胞核里。因為許多RING-手指蛋白作為泛蛋白E3酯酶，所以認(rèn)為HOS1是通過標(biāo)靶用于泛蛋白化作用和降解作用的CBFs一定的正調(diào)節(jié)劑，來行使功能的(Lee et al.2001)。CBF基因的轉(zhuǎn)錄也是在它本身的基因產(chǎn)物或它的下游靶基因產(chǎn)物的反饋抑制下進行。這是由對los1突變體研究揭示出來的，其在轉(zhuǎn)錄延長因子2基因上有缺陷(Guo et al.2002)。los1突變阻隔了帶有CRT/DRE成分基因的寒冷誘導(dǎo)作用，但是引起CBF基因的超誘導(dǎo)。有研究表明在los1突變體植物中的蛋白質(zhì)的合成尤其是在寒冷時受到破壞。因而寒冷-誘導(dǎo)CBF轉(zhuǎn)錄物不能被翻譯來激活下游基因，反饋抑制不會發(fā)生，導(dǎo)致CBF轉(zhuǎn)錄物的超誘導(dǎo)(Guo et al.2002)。
另一個擬南芥突變體los2，同樣削弱含CRT/DRE成分基因的寒冷誘導(dǎo)作用(Lee et al.，2002)。LOS2能編碼一個雙功能烯醇酶，其結(jié)合到ZAT10的啟動子上，即鋅指轉(zhuǎn)錄阻遏物。在野生型植物中，ZAT10在寒冷誘導(dǎo)下被迅速和瞬時地表達出來，并且這個誘導(dǎo)作用在los2突變體里更強更穩(wěn)定。所以，LOS2能夠通過ZAT10轉(zhuǎn)錄阻遏物控制延遲寒冷反應(yīng)基因的表達(Lee etal.，2002)。擬南芥基因座LOS4經(jīng)過冷處理參與CBF轉(zhuǎn)錄物的累積(Gong etal.，2002)。los4-1突變體植物對寒冷壓力是敏感的，并且冷敏感可被CBF3異位表達而拯救(Gong et al.，2002)。LOS4編碼一個DEAD框RNA解螺旋酶，此提示RNA代謝可能參與寒冷反應(yīng)。
因為環(huán)境因素如寒冷，限制了許多植物種類的地理分布和生長季節(jié)，并經(jīng)常有害于作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，因而仍舊需要增強植物的冷適應(yīng)力，尤其是那些極為有用的農(nóng)作物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是為增強植物的冷適應(yīng)力提供方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供具備增強了的冷適應(yīng)力的植物和植物細(xì)胞。
本發(fā)明的這些目的和其它的目的，是通過增強植物冷適應(yīng)力的方法得以實現(xiàn)，包括ICE1在植物中的過表達。
本發(fā)明的目的可以通過增強植物細(xì)胞冷適應(yīng)的方法得以實現(xiàn)，包括ICE1在植物細(xì)胞中的過表達。
本發(fā)明的目的可以通過含有編碼ICE1的核酸轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞得以實現(xiàn)。
因而，本發(fā)明還通過編碼ICE1的核酸轉(zhuǎn)化一種植物或植物細(xì)胞，提供產(chǎn)生這種植物或植物細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還提供具有氨基酸序列SEQ ID NO2的分離的和純化了的ICE1。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)如上所述的ICE1的方法，包括在ICE1表達的情況下，培養(yǎng)經(jīng)由編碼ICE1核酸轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞以及分離ICE1。
在另一項實施例中，本發(fā)明提供一種具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑功能的分離和純化了的酶，其中，酶的氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID NO2具有從70％到小于100％的同源性。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)如上所述的酶的方法，包括在該酶表達的情況下，培養(yǎng)經(jīng)由編碼該酶核酸轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞以及分離該酶。
本發(fā)明還提供增強植物寒冷適應(yīng)力的方法，包括ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑在植物中的過表達。
本發(fā)明還通過增加一或多個額外的轉(zhuǎn)錄因子的表達，其可從CBF轉(zhuǎn)錄因子和DREB1轉(zhuǎn)錄因子一組因子中選擇，和/或通過增加一或多個冷反應(yīng)基因，提供增強植物冷適應(yīng)力的方法。
本發(fā)明已經(jīng)完成利用基因篩選識別CBF蛋白質(zhì)冷信號元件上游。冷反應(yīng)生物發(fā)光體擬南芥植物通過在CBF3啟動子的控制下表達螢火蟲熒光素酶(LUC)編碼序列而改造。純合CBF3-LUC植物是經(jīng)過化學(xué)誘變處理和發(fā)光成像分離的、帶有改變的冷誘導(dǎo)CBF3-LUC表達的突變體。在本發(fā)明中，發(fā)明人報道了ice1(inducer of CBF expression 1，CBF表達1誘導(dǎo)劑)突變體，其在CBF3-LUC冷誘導(dǎo)下被削弱且在寒冷氣候下不表達。ICE1編碼似MYC堿性螺旋-環(huán)-螺旋激活劑，其結(jié)合到CBF3啟動子上。所以，ICE1在調(diào)節(jié)擬南芥冷反應(yīng)基因表達和寒冷耐受性方面起著關(guān)鍵的作用。
以上目的說明了本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明的其它目的、內(nèi)容和實施例將在以下說明書中作詳細(xì)的描述。


對本發(fā)明更全面的評價和優(yōu)勢將通過以下的附圖和詳細(xì)的

得以闡述。
圖1.icel突變阻隔了CBF3的冷誘導(dǎo)并影響了其它寒冷反應(yīng)基因的表達。(A)形態(tài)學(xué)(左)和野生型和ice1籽苗的CBF3-LUC發(fā)光成像(右)。植物的發(fā)光成像在冷處理(0℃)12小時后獲得。(B)野生型(實心圓)和icel(空心圓)籽苗在不同冷處理時間發(fā)光強度的定量分析。(C)植物的野生型和ice1對冷處理的CBFs及它們下游靶基因的轉(zhuǎn)錄物水平。籽苗在零時(0h)表示未處理以及經(jīng)寒冷處理(0℃)用時段(h)表示。微管蛋白基因用來作為裝填標(biāo)準(zhǔn)。WT表示野生型。
圖2.形態(tài)學(xué)，ice1突變體植物冷凍和寒冷的敏感性。(A)在瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基上正常生長條件下的野生型和ice1籽苗。(B)在土壤正常生長條件下的野生型和ice1籽苗。(C)ice1植物在冷適應(yīng)時呈缺陷形狀。在22℃條件下生長十天的籽苗在-12℃冷凍處理之前在光照和4℃條件下生長4天。照片顯示在冷凍處理三天之后的情況。(D)在不同溫度處理下存活率的比較?？招膱A和空心三角分別代表野生型和ice1植物。(E)ice1植物對延長的冷凍處理是敏感的。植物在22℃發(fā)芽后，在4℃下生長6個星期。(F)冷凍處理六個星期之后存活率的比較。
圖3.通過在野生型植物中ice1顯性突變表達的ICE1基因克隆的確證。(A)含有ice1突變基因組片段在野生型的表達，重現(xiàn)ice1突變表型。七天大的野生型、ice1和帶有生長在MS瓊脂培養(yǎng)基上的突變基因ice1轉(zhuǎn)化的野生型在寒冷(0℃)條件下處理12小時。(B)CBF3-LUC在野生型(WT)、ice1和帶有突變基因ice1轉(zhuǎn)化的野生型在寒冷(0℃)條件下處理12小時的生物發(fā)光水平的定量分析。
圖4.ICE1編碼一個bHLH蛋白。(A)ICE1蛋白質(zhì)的整個域結(jié)構(gòu)。一個公認(rèn)的酸性域(acidic)、富絲氨酸區(qū)(S-rich)、bHLH域結(jié)構(gòu)以及可能的拉鏈區(qū)(ZIP)被顯示出來。箭頭所指在ice1突變體氨基酸殘基發(fā)生變化。(B)ICE1的bHLH結(jié)構(gòu)域與ZIP區(qū)與其它植物和動物的bHLH蛋白的序列對比。相同和相似的殘基分別以黑色和灰色表示。粗線表示堿基區(qū)域，空心線與一個環(huán)相連，顯示螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。拉鏈區(qū)以點狀線表示。DDJB/EMBL/GenBank編號和氨基酸編號(在括弧內(nèi))為ICE1(SEQ ID NO2)，AY195621(300-398)；Atlg12860(SEQ ID NO3)；NM_101157(638-731)；At5g65640(SEQ ID NO4)；NM_125962.1(171-269)；At5g10570(SEQ ID NO5)；NM_121095.2(144-242)；rd22BP(SEQ ID NO6)；AB000875(446-544)；ATR2(SEQ ID NO7)；NM_124046.1(409-507)；maize R gene(SEQ ID NO8)；M26227(410-508)；TT8(SEQ ID NO9)；AJ277509(357-455)；PIF3(SEQ IDNO10)；AF100166(254-352)；PIF4(SEQ ID NO11)；AJ440755(255-353)；MAX(SEQ ID NO12)；P52161(21-107)；c-myc(SEQ ID NO13)；1001205A(354-435)。星號表示眾所周知與核苷酸相互作用的MAX氨基酸殘基(Grandori et al.2000)。
圖5.ICE1基因的表達和ICE1蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞的定位。(A)ICE1啟動子驅(qū)動GUS在一個野生型籽苗的表達。(B)ICE1啟動子-GUS在不同植物組織的表達，以及用RT-PCR分析的相應(yīng)的ICE1轉(zhuǎn)錄物水平。微管蛋白基因在RT-PCR內(nèi)用來作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。(C)在各種非生物條件下在野生型籽苗的ICE1表達的RNA印跡分析。植物所接受的處理為對照，僅給與MS鹽；NaCl，300mM NaCl 5個小時；ABA，100μM脫落酸3個小時；冷處理，0℃2個小時；脫水，空氣干燥30分鐘。(D)GFP-ICE1融合蛋白在細(xì)胞核的定位。平板(a)-(c)為GFP-ICE1轉(zhuǎn)基因植物的根細(xì)胞的共焦成像，平板(d)為丙啶(propidium)染色顯示的核定位。
圖6.ICE1蛋白在CBF3啟動子里結(jié)合到MYC-識別成份上。(A)在用于EMSA的CBF3啟動子寡核苷酸的序列和位置。黑體字母表明MYC-識別基序在MYC-1(SEQ ID NO38)，在MYC-2(SEQ ID NO37)，在MYC-3(SEQID NO36)，MYC-4(SEQ ID NO35)和MYC-5(SEQ ID NO34)的序列。在P1(SEQ ID NO39)寡核苷酸的黑體字母是公認(rèn)的MYB-識別基序。標(biāo)有P2，MYC-2(wt)和MYC-2(M)的序列分別相應(yīng)于(SEQ ID NO40)，(SEQID NO41)和(SEQ ID NO42)。(B)ICE1蛋白和32P標(biāo)記的MYC-1之間通過MYC-4 DNA片段的相互作用。(C)ICE1結(jié)合到MYC-2 DNA片段上更強于結(jié)合到其它DNA片段上。(D)在MYC-識別基序的共有的核苷酸殘基對于ICE1和MYC-2 DNA片段之間的互相作用很重要。(E)ice1突變體蛋白質(zhì)也結(jié)合到MYC-2DNA片段上。用于每一個實驗的標(biāo)記了的寡核苷酸顯示于每一個平板的上端。三角形代表用于(B)、(C)和(D)競爭未標(biāo)記的寡核苷酸的增加量，其相當(dāng)于每一個探針的50、100和250倍的超額量。
圖7.ICE1是一個轉(zhuǎn)錄激活劑并且它的過表達提高CBF調(diào)節(jié)子在寒冷條件下的功能并且改進冷凍耐受性。(A)圖解用于瞬時表達列的報道基因和效應(yīng)基因質(zhì)粒。一個GAL4反應(yīng)報道基因用于這個實驗中。Nos表示胭脂堿合成酶基因的終止信號。Ω表示煙草花葉病毒的轉(zhuǎn)錄增效劑。GAL4 DB是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域。(B)GAL4-LUC和35S-GAL4-ICE1或35S-GAL4-ice1轉(zhuǎn)染后相對熒光素酶活性。為將每一次轉(zhuǎn)染所得的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，從Renilla而來的熒光素酶基因用作內(nèi)對照。熒光素酶活性用相對于Renilla熒光素酶(如Ohta et al.，2001的文章所述)活性的任意單位來表示。數(shù)值為三個基因槍法的平均值，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差。(C)在野生型和ICE1過表達基因轉(zhuǎn)化(超-ICE1)植物中的ICE1 RNA印跡分析和冷反應(yīng)基因的表達。籽苗在零時不經(jīng)處理，在低溫(0℃)時進行3到6個小時的處理。菲啶溴紅染色的rRNA帶為裝填對照。(D)CBF3-LUC在野生型和ICE1過表達轉(zhuǎn)化基因(超-ICE1)植物中的表達(由發(fā)光強度表示)。(E)經(jīng)過冷凍處理之后，ICE1過表達轉(zhuǎn)化基因(超-ICE1)植物改進了的存活力。
本發(fā)明的詳細(xì)說明除非特別限定，此處所使用的所有的科技名詞與那些在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的熟練的技術(shù)人員所理解的術(shù)語都一樣。
所有與此處描述的相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?，可以利用此處描述的方法和材料，用于實踐中或?qū)Ρ景l(fā)明進行測試。所有在這里提到的出版物、專利申請、專利和提到的其它參考資料，都作為參考。在有沖突的情況下，由本說明書包括解釋支配。更一步說，材料、方法和實施例僅是用來說明而不是限制，除非作特別說明。
本發(fā)明所用參考書涉及含有定義和方法以及用于進行基本技術(shù)的手段的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書。比如，Maniatis et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1982)，和Sambrood et al.，Molecular CloningA laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)；Methods in Plant Molecular Biology，Maligaet al.，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)；擬南芥，Meyerowitz et al.，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1994)以及各種引用的參考資料。
術(shù)語“植物”包括整個的植物、植物器官(比如，葉，莖、根，等等)、種子和植物細(xì)胞及其后代。可用于本發(fā)明方法的植物種類，包括能進行轉(zhuǎn)化作用技術(shù)的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選植物包括大米、玉米、小麥、棉花、花生和大豆。
所以，在本發(fā)明的一項實施例中，冷適應(yīng)力可通過增加植物可利用蛋白質(zhì)的量得以增加或增強，優(yōu)選是通過增加植物體內(nèi)的ice1基因。
因而，本發(fā)明的一項實施例是植物細(xì)胞攜帶有多聚核苷酸，優(yōu)選的是帶有分離的多聚核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。
如本處所使用的，術(shù)語“增強”意指增加一個或多個植物細(xì)胞和/或植物內(nèi)酶的胞內(nèi)活性，酶被相應(yīng)的DNA編碼?！霸鰪姟笨山柚?xì)菌細(xì)胞的各種處理而獲得。為獲得“增強”，尤其是過表達，要增加相應(yīng)的基因拷貝數(shù)量，一個很強的啟動子，或者是位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子-和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合點可發(fā)生變異。連接于結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒可以起同樣的作用。另外，通過使用可誘導(dǎo)的啟動子來增加表達是可能的。一個編碼相應(yīng)的具有高活性酶的基因也可以被使用。表達亦可通過調(diào)節(jié)延長mRNA的壽命得以促進。更進一步地說，阻止酶的退化來增加酶整體的活性。更進一步地說，這些方法可選擇性地結(jié)合到任意一種所需的方式中。改變植物基因活性的這些和其它的方法如書里所述，如，在Methods in Plant Molecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)。
所述的“表達盒”包括一個在植物細(xì)胞里有功能的啟動子，連接于一個編碼ICE1蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO2的分離的核酸，其中，植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的增進表達增強了植物細(xì)胞的冷適應(yīng)力。在本發(fā)明的一項優(yōu)選實施例中，啟動子可從下列一組啟動子中選擇，病毒外套蛋白質(zhì)啟動子、特定組織啟動子、泛蛋白啟動子、壓力誘導(dǎo)啟動子、CaMV 35S啟動子、CaMV 19S啟動子、肌動蛋白啟動子、cab啟動子、蔗糖合成啟動子、微管蛋白啟動子、napinR基因復(fù)合體啟動子、西紅柿E8啟動子、patatin啟動子、甘露氨酸合成酶啟動子、大豆種子蛋白大豆球蛋白啟動子、大豆?fàn)I養(yǎng)貯存蛋白質(zhì)啟動子、噬菌體SP6啟動子、噬菌體T3啟動子、噬菌體T7啟動子、Ptac啟動子、根-細(xì)胞啟動子、ABA-誘導(dǎo)啟動子以及細(xì)胞膨脹-誘導(dǎo)啟動子。
編碼具有高活性的相應(yīng)的或變異的酶的基因也可使用。優(yōu)選相應(yīng)酶的活性應(yīng)高于原有酶的活性，最好是至少高于5、10、25％或50％以上的活性，更好是原有酶活性的兩倍。
在本申請的上下文中，按照本發(fā)明，一條多聚核苷酸序列在堿基組成和堿基序列上相應(yīng)于本發(fā)明序列具有至少70％，優(yōu)選是至少80％，最好至少是90％的“同源性”。按照本發(fā)明，“同源蛋白質(zhì)”應(yīng)該理解為所包括的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與序列SEQ ID NO2或被ice1基因編碼的序列SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少70％，優(yōu)選的是至少80％，最好的是至少90％的相應(yīng)性，此處的相應(yīng)性是指相應(yīng)的氨基酸具有相同的或共有的氨基酸?！巴窗被帷笔侵妇哂邢鄳?yīng)的特性，尤其是帶電性、疏水性、原子的空間排列特性等的氨基酸。因而，相應(yīng)于序列SEQ ID NO2，蛋白質(zhì)具有從70％到小于100％的同源性。
同源性，即核苷酸或氨基酸序列相似或序列相同，傳統(tǒng)上使用眾所周知的軟件或計算機程序來確定，如BestFit或Gap兩兩比較的程序(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。BestFit使用Simth and Waterman，Advances in AppliedMathematics 2482-489(1981)一書中的局部同源性公式，來尋找兩條序列間一致性或相似性最好的節(jié)片。Gap是進行總體序列對比，采用Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970)一書中的方法，即一整條序列與另一整條相似序列間的對比。當(dāng)使用程序序列對比如BestFit來確定序列同源性、相似性或一致性時，要進行預(yù)設(shè)值設(shè)定，或要選擇一個合適的計分矩陣來優(yōu)化一致性、相似性或同源性計分。相似地，當(dāng)運用一個程序如BestFit來確定兩條不同氨基酸序列之間的一致性、相似性或同源性時，同樣需要用預(yù)設(shè)值設(shè)定，或者一個適合的計分矩陣如blosum45或blosum80需要選擇來優(yōu)化一致性、相似性或同源性計分。
本發(fā)明還涉及含有帶有相應(yīng)于序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列的完整基因或其片段的多聚核苷酸，其可以通過使用探針進行相應(yīng)基因庫雜交的方法來進行篩選而獲得，探針含有所述相應(yīng)于序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸或其一個片斷，以及進行DNA序列分離而或得。
本發(fā)明的多聚核苷酸序列適于用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，用以分離那些表現(xiàn)出對ice1基因比較高的相似度，尤其是序列SEQ ID NO1的ice1基因的cDNA或基因。
本發(fā)明的多聚核苷酸序列也適用于作PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的引物，用于生產(chǎn)編碼帶有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性的酶的DNA。
作為探針或引物的寡聚核苷酸，可以含有超過30，優(yōu)選是到30，比較好是到20，最好是至少15個連續(xù)的核苷酸。至少40或50個核苷酸長度的寡聚核苷酸也是適合的。
術(shù)語“分離”是指從原來的環(huán)境中分開。
術(shù)語“多聚核苷酸”一般是指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，可用于表示未修飾的RNA或DNA或修飾了的RNA或DNA。
術(shù)語“多聚肽”是指肽或蛋白質(zhì)，其含有兩個或更多個由肽鍵相連的氨基酸。
本發(fā)明的多聚肽包括相應(yīng)于序列SEQ ID NO2的多聚肽，尤其是那些具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑生物活性的多聚肽，也包括那些與序列SEQ ID NO2具有至少70％，優(yōu)選至少是80％同源性的多聚肽，最好是那些與序列SEQ IDNO1具有至少90％到95％同源性并具有所述活性的多聚肽。所以，這些多聚肽與序列SEQ ID NO2具有從70％到100％的同源性。
本發(fā)明還涉及編碼DNA序列，其通過遺傳密碼簡并由序列SEQ ID NO1產(chǎn)生。本發(fā)明進一步涉及與序列SEQ ID NO1或與其部分雜交的DNA序列。更進一步地，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員會注意到保守氨基酸的替換，如蛋白質(zhì)中甘氨酸被丙氨酸替換或天冬氨酸被谷氨酸替換的“有意突變”，其不會導(dǎo)致任何蛋白質(zhì)活性的根本的改變，也就是說，這些突變是中性的。人們也知道，蛋白質(zhì)N-端和/或C-端的變化更本上不會削弱它們的功能，甚至?xí)€(wěn)定所述的功能。
同樣的，本發(fā)明還涉及與序列SEQ ID NO1或其部分進行雜交的DNA序列。最后，本發(fā)明涉及利用由序列SEQ ID NO1產(chǎn)生的寡聚核苷酸引物經(jīng)過PCR產(chǎn)生的DNA序列。典型的這個類型的寡聚核苷酸至少有15個核苷酸的長度。
述語“嚴(yán)格的條件”或“嚴(yán)格的雜交條件”是指在這樣的條件下，多聚核苷酸與它的靶序列進行雜交，以達到一個比其它序列較高的測試度(比如，至少2倍于自然背景)。嚴(yán)格的條件是序列依賴且隨條件不同而不同的。通過控制雜交嚴(yán)格度和/或清洗條件，具有與探針100％互補的靶序列可被測試出來(同源探查)。或者，嚴(yán)格的條件可被調(diào)節(jié)允許序列中某些錯配，以便較低相似度可被測出來(異源探查)。
典型的嚴(yán)格條件是那些鹽濃度是小于大約1.5M的鈉離子，典型的是大約0.01到1.0M的鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0到8.3，對短的探針(比如，10到50個核苷酸)，其溫度至少大約為30℃，對長的探針(比如，長于50個核苷酸)，溫度至少約為60℃。嚴(yán)格的條件也可以通過另加入失穩(wěn)劑甲酰胺來獲得。示范性的低嚴(yán)格條件包括在30到35％甲酰胺緩沖液，1MNaCl，1％SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸鈉)，37℃下條件下的雜交作用，以及在50到55℃，1X到2X SSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉鹽)條件下的清洗。示范性的適度的嚴(yán)格條件包括40到45％甲酰胺，1M NaCl，37℃下1％SDS的雜交作用，以及在55℃到60℃，0.5X到1X SSC條件下的清洗。示范性的高嚴(yán)格條件包括50％甲酰胺，1M NaCl，37℃下1％SDS的雜交作用，以及在60℃到65℃，0.1X到1X SSC條件下的清洗。
特征性在于典型的后雜交作用清洗功能，關(guān)鍵因素是離子強度和終清洗液的溫度。對于DNA-DNA雜交，Tm可以從Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284(1984)一書中得知Tm＝81.5oC.+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M為單價陽離子的摩爾濃度，％GC為DNA中的鳥嘌呤和胞嘧啶核苷的百分比，％form為雜交溶液的甲酰胺百分比，L為雜交堿基的長度。Tm為在其溫度下(在特定的離子強度和pH下)50％的互補靶序列與完全相配的探針雜交。Tm降低1℃有1％的錯配；因而，Tm，雜交和/或清洗條件可以被調(diào)節(jié)到與序列雜交到所需的一致性。例如，如果需要序列達到90％的一致性，Tm應(yīng)降低10℃。一般說來，嚴(yán)格的條件選擇低于熔點(Tm)5℃，用于特定的序列以及其在一個限定的離子強度和pH下進行互補。但是，特別嚴(yán)格的條件可進行雜交和/或清洗，在1、2、3或4℃，低于Tm；適度的嚴(yán)格條件進行雜交和/或清洗，在6、7、8、9或10℃，低于Tm；低嚴(yán)格條件進行雜交和/或清洗，在11、12、13、14、15或20℃，低于Tm。使用公式，雜交作用和清洗組合物，以及所需的Tm，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都可以理解雜交和/或清洗溶液嚴(yán)格性的變化已被描述。如果所需的錯配程度導(dǎo)致Tm小于45℃(水合溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，則最好是增加SSC濃度，以便得以使用一個較高的溫度。有關(guān)核酸雜交詳盡的指南可在書中找到，如，Current Protocols in MolecularBiology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(2000)。
所以，利用已掌握的信息，熟練的技術(shù)人員可以測試和分離與本發(fā)明的核苷酸極為相似的核苷酸。在分離這樣的核苷酸時，核苷酸可被視為比如增加植物冷適應(yīng)力的本發(fā)明的核苷酸。
本發(fā)明的一項實施例是有關(guān)篩選具有同本發(fā)明的多聚核苷酸有本質(zhì)同源性的多聚核苷酸的方法，最好是那些編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性的蛋白質(zhì)的多聚核苷酸。
如本領(lǐng)域用于植物或其類似物所熟知，本發(fā)明的多聚核苷酸序列可被一或多個適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體所攜帶。
在一項實施例中，將多聚核苷酸用帶有適當(dāng)?shù)倪m于細(xì)胞類型的細(xì)菌或真菌品系攜帶進行傳播有優(yōu)越之處。在這些類型的細(xì)胞內(nèi)傳播多聚核苷酸和產(chǎn)生蛋白質(zhì)的通用方法，已為本領(lǐng)域所熟知并已被描述，如，Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1982)和Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)。
在另一項優(yōu)選實施例中，多聚核苷酸序列包括序列SEQ ID NO1，與其互補的多聚核苷酸，與序列SEQ ID NO1一致性達到至少70％，80％和90％的多聚核苷酸；或者是那些在嚴(yán)格條件下與序列SEQ ID NO1雜交的多聚核苷酸，嚴(yán)格的條件包括在5X SSC，溫度為從50℃到68℃時清洗。因而，多聚核苷酸與序列SEQ ID NO1的一致性可以從70％到小于100％。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的多聚核苷酸在一個載體和/或一個宿主細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選是在一個植物細(xì)胞或一個轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)。優(yōu)選是擬南芥(Arabidopsis thaliania)或是從一組植物中選擇，包括小麥、玉米、花生、棉花、燕麥和大豆植物。在一項優(yōu)選實施例中，多聚核苷酸可以被操作連接到一個啟動子上，優(yōu)選是一個誘導(dǎo)啟動子。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供篩選編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性的蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的方法，包括將本發(fā)明的多聚核苷酸與所要篩選的多聚核苷酸進行雜交，表達多聚核苷酸以產(chǎn)生蛋白質(zhì)和測試蛋白質(zhì)中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性存在與否。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種方法，用于測試核酸具有與序列SEQ ID NO1至少70％同源性，其序列與序列SEQ ID NO1互補和/或編碼帶有序列SEQ ID NO2的氨基酸序列，包括用探針或引物接觸核酸樣品，探針或引物包括至少15個核苷酸序列SEQ ID NO1的連續(xù)的核苷酸，或至少15個連續(xù)的互補核苷酸。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種方法，用于產(chǎn)生具有與本發(fā)明的多聚核苷酸至少70％同源性的核酸，包括用引物接觸核酸樣品，引物包括至少15個核苷酸序列SEQ ID NO1的連續(xù)的核苷酸，或至少15個連續(xù)的互補核苷酸。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種制造ICE1蛋白質(zhì)的方法，包括在一定時間內(nèi)和適于ICE1表達的條件下，培養(yǎng)攜帶本發(fā)明多聚核苷酸的宿主細(xì)胞，以及收集ICE1。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將本發(fā)明的多聚核苷酸引入到植物中。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種增加所需植物冷適應(yīng)力的方法，包括將將本發(fā)明的多聚核苷酸引入到所述植物中。
本發(fā)明的方法、載體和轉(zhuǎn)化植物用的組合物以及植物細(xì)胞，對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來說都是公知常識，并沒有特殊限定。要更詳盡了解，請參閱Karimiet al.，Trends in Plant Science，Vol.7，No5，May 2002，pp.193-195。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一個分離的多肽，包括序列SEQ IDNO2的氨基酸序列或那些至少70％，優(yōu)選80％，優(yōu)選90％和優(yōu)選95％與序列SEQ ID NO2相同的蛋白質(zhì)，其中，多肽具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。所以，酶具有與序列SEQ ID NO2從70％到小于100％的同源性。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明還提供一個增加植物冷適應(yīng)力的方法，包括在植物中過表達ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑。
在另一項優(yōu)選實施例中，本發(fā)明還提供通過增加一個或多個額外的從CBF轉(zhuǎn)錄因子和DREB1轉(zhuǎn)錄因子中選擇的轉(zhuǎn)錄因子，和/或增加一個或多個冷-反應(yīng)基因，來增強植物的冷適應(yīng)力的方法。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“冷反應(yīng)基因”包括編碼從以下一組酶中選擇出的蛋白質(zhì)的基因，參與碳水化合物呼吸的酶、參與脂代謝的酶、參與苯丙素呼吸的酶、參與苯丙素代謝的酶、參與抗氧化物呼吸的酶、參與抗氧化物代謝的酶、陪伴分子、抗凍蛋白，以及參與由于冷凍導(dǎo)致脫水的耐脫水蛋白質(zhì)。
本發(fā)明已經(jīng)完成利用基因篩選識別CBF蛋白質(zhì)冷信號元件上游。冷反應(yīng)生物發(fā)光體擬南芥植物通過在CBF3啟動子的控制下表達螢火蟲熒光素酶(LUC)編碼序列而改造。純合CBF3-LUC植物是經(jīng)過化學(xué)誘變處理和發(fā)光成像分離的、帶有改變的冷誘導(dǎo)CBF3-LUC表達的突變體。在本發(fā)明中，發(fā)明人報道了ice1(inducer of CBF expression 1，CBF表達誘導(dǎo)劑)突變體，其在CBF3-LUC冷誘導(dǎo)下被削弱且在寒冷氣候下不表達。ICE1編碼似MYC堿性螺旋-環(huán)-螺旋激活劑，其結(jié)合到CBF3啟動子上。所以，ICE1在調(diào)節(jié)擬南芥冷反應(yīng)基因表達和寒冷耐受性方面起著關(guān)鍵的作用。
討論寒冷的溫度條件激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子CBF家系的轉(zhuǎn)錄作用，其反過來激活含有DRE/DRT啟動子元件基因的轉(zhuǎn)錄(Thomashow1999)。
CBF靶基因大概包括一些轉(zhuǎn)錄因子(Fowler和Thomashow 2002)。所以，用于抗凍的冷基因需要一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)級聯(lián)。在本研究當(dāng)中，我們確定了ICE1，這個級聯(lián)的一個非常上游的轉(zhuǎn)錄因子。我們的結(jié)果顯示ICE1是CBF3的一個正調(diào)節(jié)劑在冷適應(yīng)作用中起關(guān)鍵的作用。ICE1編碼一個似MYC bHLH的轉(zhuǎn)錄因子。五個推定的MYC識別序列存在于CBF3啟動子，而CBF1和CBF2啟動子每一個含有這樣的元件(Shinwari et al.1998)。這與CBF3要比CBF2或CBF1更強烈地被ice1突變所影響的事實是一致的。DNA結(jié)合試驗表明ICE1在CBF3啟動子上可以特意地結(jié)合到MYC識別序列，但不能結(jié)合到一個推定的MYB識別序列(圖6)。ice1突變廢除了CBF3的表達，并且減少了寒冷條件下CBF-靶基因的表達。與它在冷-反應(yīng)基因調(diào)節(jié)作用的作用一致，ICE1對擬南芥植物的抗寒和耐凍是非常重要的。
ice1突變也影響CBF1和CBF2的冷誘導(dǎo)；它們的表達在最初的寒冷條件下被輕微地減小，但之后表達不被減小。相反的，CBF2的表達在冷處理6到12小時后在ice1突變體里事實上增強了。眾所周知，CBF基因的表達被它們的基因產(chǎn)物或它們的下游靶基因所抑制(Guo et al.，2002)。減少了的CBF3的表達和增強了的CBF2的誘導(dǎo)之間的相關(guān)關(guān)系表明CBF3可以抑制CBF2的表達。當(dāng)CBF2基因受到破壞，CBF1和CBF3在寒冷條件下顯示了更穩(wěn)定的誘導(dǎo)作用(Julio和Salinas，私人通信)，這表明CBF2會抑制CBF1和CBF3的表達。CBF轉(zhuǎn)錄因子基因之間潛在的相互的負(fù)調(diào)節(jié)為確保它們的表達是瞬時的和受到嚴(yán)格控制的是重要的。
三個CBF基因一般認(rèn)為在功能上是重復(fù)的。它們各自的作用還沒有用功能缺失分析來驗證。即使ice1突變僅阻止CBF3的表達，那么下游基因如RD29A，COR15A和COR47也會受到根本的影響。這表明CBF3在這些基因的寒冷調(diào)節(jié)作用中起著關(guān)鍵的作用。相比較而言，KIN1的寒冷調(diào)節(jié)作用受ice1突變的影響較小。所以，三個CBF基因有它們各自一套優(yōu)選靶基因是可能的。
ICE1在所有組織里是固有表達的(圖5A和5B)，而且是被寒冷條件高調(diào)節(jié)的(圖5C)。與對“ICE”蛋白質(zhì)所推測的一致(Gilmour et al.，1998)，ICE1蛋白質(zhì)或一個轉(zhuǎn)錄輔助因子的冷誘導(dǎo)的改變，對于ICE1激活CBFs的表達似乎是必要的。我們的證據(jù)支持這個觀點。因為ICE1是固有表達的，并且位于細(xì)胞核中，但是CBF表達需要冷處理；并且固有過表達ICE1的轉(zhuǎn)基因品系在溫暖的條件下不顯示CBF3的表達，但在寒冷條件下顯示CBF3的較高的表達水平。轉(zhuǎn)錄因子激活基因轉(zhuǎn)錄的能力可以在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中經(jīng)磷酸化或去磷酸化作用得以調(diào)節(jié)(參考Liu et al.，1999)。ice1突變離潛在的絲氨酸磷酸化作用殘基(Ser243和Ser245)很近，可能影響ICE1的磷酸化作用和去磷酸化作用。
眾所周知，與MYC-相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子需要MYB輔轉(zhuǎn)錄因子和或/含WD-重復(fù)因子用于靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用(Spelt et al.，2000；Walker et al.，1999)。CBFs啟動子含有MYC以及潛在的MYB識別序列(Shinwari et al.，1998)，說明MYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子也參與CBFs的冷誘導(dǎo)。ice1突變，即組氨酸替代236位點的精氨酸，會干擾ICE1和似ICE1蛋白質(zhì)或MYB相關(guān)的輔因子之間異源-寡聚物的形成。另外，推定的ice1的重要負(fù)作用是ice1干擾潛在的ICE1同源-寡聚物形成、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞核定位，或ICE1冷誘導(dǎo)后翻譯修飾的結(jié)果。
在大概地描述了本發(fā)明后，對其進一步的了解可以通過特定的實施例。這里所提供的實施例，是用來對本發(fā)明作解釋而不是限定，除非特別指出。
實施例材料和方法植物材料和突變體分離作用CBF3啟動子，即從起始密碼子上游1126到100bp的一段區(qū)域，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得，利用以下的引物對5′-TCATGGATCCACCATTTGTTAATGCATGATGG-3′(14號序列)和5′-GCTCAAGCTTTCTGTTCTAGTTCAGC-3′(15號序列)。這個啟動子在植物轉(zhuǎn)化載體中置于螢火蟲熒光素酶(LUC)編碼序列的前面(Ishitani et al.，1997)。用floral dipping方法，將帶有CBF3-LUC構(gòu)件的根瘤土壤桿菌來轉(zhuǎn)化擬南芥Columbia生態(tài)型(帶有平滑1型突變作用)。純合CBF3-LUC轉(zhuǎn)基因植物從轉(zhuǎn)化作用之后的第二代選擇。這樣的帶有一套CBF-3LUC轉(zhuǎn)基因的植物被選出用來作以后的試驗(之后這種植物稱為野生型)。這個野生型植物在正常生長條件下不發(fā)出生物光，但施以冷處理后發(fā)光。CBF3-LUC植物種子用乙烯甲烷磺酸(EMS)進行誘變。突變2代(M2)的籽苗用熒光成像篩選冷調(diào)控CBF3-LUC表達中未表達出來的突變體。使用低光成像系統(tǒng)(Princeton Instruments)，用生長在含有3％蔗糖和1x Murashige和Skoog(MS)鹽(JRH Biosciences)的0.6％的瓊脂培養(yǎng)基上的7天齡籽苗，對0℃低溫處理12小時的去調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_進行篩選。每一個籽苗的發(fā)光強度，用攝像機生產(chǎn)商(Princeton Instruments)提供的WINVIEW軟件進行定量分析(Chinnusamy et al.，2002)。
耐冷和耐凍試驗當(dāng)籽苗剛一露出根就將其進行冷處理，用來測試ice1和野生植物的寒冷敏感性。在4℃條件下經(jīng)過2天成層，突變體和野生型種子在3％蔗糖和1.2％瓊脂的MS營養(yǎng)介質(zhì)和22℃條件下發(fā)芽。把籽苗置于4±1℃，在30±2μmol量子.m-2.s-1光下，進行冷處理培養(yǎng)。耐凍性試驗如所述(Xin和Browse，1998)。簡而言之，野生型和ice1種子置于Bamborg基鹽和1.5％蔗糖的瓊脂(0.9％)上培養(yǎng)。在4℃條件下經(jīng)過2天成層，培養(yǎng)皿置于22℃，50±2μmol量子.m-2.s-1持續(xù)光照下。十天齡的籽苗經(jīng)過4±1℃和30±2μmol量子.m-2.s-1進行4天的冷處理。培養(yǎng)皿上的這些植物被置于冷凍盒的冰上(Percival Scientific)，溫度設(shè)置為-1±0.1℃，16個小時。在將冷凍盒以1℃h-1冷卻之前，把冰屑撒在這些植物上。盛有植物的培養(yǎng)皿在設(shè)定的溫度冷凍兩個小時之后移走，除非特別指定，然后置于4℃下的黑暗中解凍12小時，然后轉(zhuǎn)移到22℃，進行50±2μmol量子.m-2.s-1的持續(xù)光照。兩天后計算籽苗的存活數(shù)。
基因表達分析用RNA進行分析，取一半10天齡生長在同樣的MS瓊脂培養(yǎng)基上的野生和ice1植物。從對照和處理的植物中提取的所有RNA用Liu和Zhu(1997)描述的方法進行RNA印跡法分析。RD29A特定基因探針從3′非編碼區(qū)而來(Liu和Zhu，1997)。COR15A和COR47cDNAs(Gilmouret al.，1992；Lin和Thomashow 1992)由M.F. Thomashow(Michigan StateUniversity)提供。CBF2和CBF3特定基因探針由PCR產(chǎn)生，用以下引物對CBF2-正向引物，5′-TTCGATTTTTATTTCCATTTTTGG-3′(序列SEQ ID NO16)；CBF2-逆向引物，5′-CCAAACGTCCTTGAGTCTTGAT-3′(17號序列)；CBF3-正向引物，5′-TAAAACTCAGATTATTATTTCCATTT-3′(序列SEQ IDNO18)；CBF3-逆向引物，5′-GAGGAGCCACGTAGAGGGCC-3′(序列SEQ IDNO19)。KIN1的探針(Kurkela和Franck，1990)是擬南芥EST克隆YAP368T7的0.4-kb的EcoRI片段。β-微管蛋白基因作為填裝對照并被PCR放大，用以下的引物對正向引物(5′-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3′(序列SEQ ID NO20))逆向引物(5′-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3′(序列SEQ ID NO21))。
為用于Affymetrix GeneChip排列分析，從經(jīng)過或不經(jīng)過冷處理(光照6個小時)的野生和ice1籽苗中，用Rneasy植物迷你試劑盒(Rneasy Plant MiniKit)(Qiagen)提取總共20μgRNA，所得RNA被用來制作生物素-標(biāo)記的cRNA靶。含有超過22,500套探針，代表大約24,000個基因的Affymetrix擬南芥ATH1基因組排列GeneChips被使用，并且雜交、清洗和染色按照廠商使用手冊進行。微陣列數(shù)據(jù)從掃描基因芯片(GeneChip)成象獲得，并用微陣組5.0.1版(Affymetrix)進行分析。
ICE1基因作圖和克隆ice1的F1和F2代與野生型雜交的遺傳分析表明，ice1是一個顯性突變。因而克隆ICE1，純合ice1植物與擬南芥的Landsbergerecta(Ler)生態(tài)型雜交，以及F1自體授粉產(chǎn)生的F2代用來選擇帶有野生型顯性性狀的作圖樣品。從這些籽苗提取的基因組DNA用于以簡單序列多態(tài)現(xiàn)象標(biāo)記或者分裂的擴增的多態(tài)現(xiàn)象序列標(biāo)記的基于PCR的作圖。新的對F16J4，MTC11，MLJ15，MDJ14，K17E12和T32N15 BAC克隆的SSLP作圖標(biāo)記，基于從Cereon擬南芥多態(tài)現(xiàn)象和Ler序列收集(httpwww.arabidopsis.org)而來的插入/缺失而得以發(fā)展。相應(yīng)于ice1突變體和野生型植物候選基因的基因組DNA通過PCR而擴增并測序來識別ice1突變。
對于ice1突變體互補，包括起始密碼子2,583bp上游和終止密碼子615bp下游的MLJ15.14基因，利用ice1突變體基因組DNA作為模板通過LA Taq聚合酶進行PCR擴增。所用的PCR引物如下正向引物5′-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGTAG-3′(序列SEQ IDNO22)；逆向引物5′-CGAATTCTAACCGCCATTAACTATGTCTCCTCTCTATCTC-3′(序列SEQ ID NO23)。所得5,035-bp片段末端加A克隆到T載體-Invitrogen TOPO載體，然后亞克隆到BamHI和EcoRI位點之間的載體pCAMBIA1200上。所描述的這個和其它的構(gòu)件被完全測序以保證不含PCR或克隆錯誤。然后雙元構(gòu)件被引入到土壤桿菌品系GV3101并被轉(zhuǎn)移到CBF3-LUC Columbia野生型植物。選擇抗-潮霉素轉(zhuǎn)基因植物并且它們的T2代用于測試CBF3-LUC對冷反應(yīng)的表達。
ICE1表達分析ICE1基因的啟動子區(qū)域(從起始密碼子2,589bp上游)以以下的引物對進行PCR擴增正向引物5′-AGGGATCCGGACCACCGTCAATAACATCGTTAAGT-3′(序列SEQ ID NO24)；逆向引物5′-CGAATTCGCCAAAGTTGACACCTTTACCCCAAAG-3′(序列SEQID NO25)。所得片段被BamHI和EcoRI所分解并插pCAMBIA139雙元載體。這個ICE1啟動子-GUS構(gòu)件被引入到土壤桿菌品系GV3101并被轉(zhuǎn)移到野生型擬南芥。T2代抗潮霉素轉(zhuǎn)基因品系被分析用于ICE1-啟動子驅(qū)動GUS表達。對于GUS染色，生長與MS瓊脂培養(yǎng)基上的T2代籽苗在37℃下用X-Gluc培養(yǎng)12小時，然后在70℃時用70％(v/v)乙醇清洗5次以清除葉綠素II。ICE1的表達也用從野生型的根、葉、莖和花制備的RNA的量化RT-PCR分析來測試。ICE1的cDNA通過RT-PCR利用以下引物正向引物5′-GCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列 SEQ ID NO26)；逆向引物5′-TCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQ ID NO27)。微管蛋白基因在RT-PCR分析中作為內(nèi)對照。微管蛋白cDNA用下列的引物進行擴增正向引物5′-GTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3′(序列SEQ ID NO28)和逆向引物5′-TCACCTTCTTGATCCGCAGTT-3′(序列SEQ ID NO29)。
ICE1的過表達ICE1的cDNA用下列引物經(jīng)過RT-PCR從擬南芥(Columbia生態(tài)型)的RNA被擴增正向引物5′-GCTCTAGAGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列SEQ IDNO30)和一個逆向引物5′-GGGGTACCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQID NO31)。PCR產(chǎn)物在超啟動子的控制下被XbaI和KpnI所分解并克隆到pBIB載體。超啟動子由三個位于甘露氨酸合成酶啟動子(Li et al.，2001)前面的章魚氨酸拷貝合成酶上游激活序列構(gòu)成。包含這個雙元構(gòu)件的根瘤土壤桿菌品系GV3101用來轉(zhuǎn)化擬南芥植物。轉(zhuǎn)化體被選出在含有潮霉素(30mg/l_的MS培養(yǎng)基上生長。
GFP-ICE1融合蛋白質(zhì)的表達和定位野生型的整個長度的ICE1 cDNA經(jīng)RT-PCR使用以下的引物獲得正向引物5′-AGGAATTCGCGATGGGTCTTGACGGAAACAATGGTG-3′(序列SEQID NO32)；逆向引物5′-CTGGATCCTCAGATCATACCAGCATACCCTGCTGTATCG-3′(序列SEQ ID NO33)。所得PCR片段用EcoRI和BamHI分解并被克隆到從CaMV35S啟動子而來的雙元構(gòu)件載體pEGAD下游。這個GFP-ICE1構(gòu)件被引入到土壤桿菌品系GV3101并被轉(zhuǎn)化到擬南芥植物。選擇和分析抗Basta(glufosinate，草丙磷胺)的T2代轉(zhuǎn)基因品系，用于GFP表達。為了看見細(xì)胞核，根細(xì)胞用碘化丙啶(1μg/mL)染色。轉(zhuǎn)基因植物的綠色熒光(GFP表達)和紅色熒光(碘化丙啶染色)分析，用共焦激光-掃描顯微鏡來進行。
DNA結(jié)合測試野生型和突變體ICE1 cDNA通過RT-PCR擴增并被插入到載體pET14b(Novagen)表達的NdeI和BamHI位點。按照His-Bind Buffer試劑盒(Novagen)說明書的指導(dǎo)，野生型和突變體His-ICE1融合蛋白從大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞(BL21DE3)制備。電泳遷移率變動分析(EMSA)按照說明進行(Hao et al.，1998)。以下列于圖6(MYC-1，MYC-2，MYC-3，MYC-4和MYC-5)的雙股寡核苷酸在EMSA中作為探針和競爭劑。核苷酸序列P1(-949到-930)和P2(-909到-890)也作為競爭劑。P1含有推定的MYB-識別位點。P2不含有任何典型的順式-元件。DNA探針末端用Klenow片段標(biāo)記上[γ-32P]的dCTP并通過Sephadex G-50柱純化。標(biāo)記的探針(大約0.02pmol)在添加有20pmol聚乙烯(dI-dC)的2.3μg純化的1X結(jié)合緩沖液中與His-ICE1融合蛋白一起在室溫下培養(yǎng)20分鐘。所得DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在0.5X緩沖液中的6％聚丙烯酰胺膠經(jīng)電泳解離，并且經(jīng)射線自顯跡法顯現(xiàn)。對于競爭試驗，未標(biāo)記的競爭劑在加入標(biāo)記的探針之前與His-ECE1融合蛋白一同在冰上培養(yǎng)30分鐘。
瞬時表達試驗野生型(ICE1)和突變體(ice1)的cDNA經(jīng)RT-PCR擴增和SalI分解，并且插入植物表達載體35S-GAL4DB的SmaI和SalI位點(Ohta et al.，2000)。所得效應(yīng)劑質(zhì)粒DNA，GAL4-ICE1和一個GAL4反應(yīng)報道基因及GAL4-LUC(Ohta et al.，2000)用粒子輻射運送到擬南芥葉子里(Ohta et al.，2001)。
試驗例ICE1位點識別用以上所述的基因篩選方法，含有CBF3-LUC轉(zhuǎn)移基因的擬南芥植物在對寒冷作出反應(yīng)時發(fā)出生物光(圖1A和1B)。純和CBF3-LUC植物(此處指野生型)用乙烯甲烷磺酸進行誘變，使用低光成像系統(tǒng)，用所得M2代在低溫下的異常生物發(fā)光反應(yīng)來篩選突變體(Chinnusamy et al.，2002)。幾個表現(xiàn)出CBF3-LUC表達的非正常冷調(diào)控的突變體被發(fā)現(xiàn)。其中一個稱為ice1的突變體在寒冷條件下的CBF3-LUC表達中被完全阻遏(圖1A和1B)。在0℃處理的反應(yīng)中，野生型發(fā)出強光，而ice1突變體在整個冷處理過程當(dāng)中表現(xiàn)出非常弱的發(fā)光誘導(dǎo)(圖1A和1B)。在冷處理12小時后，ice1植物要比野生型發(fā)光少將近10倍，并且在CBF3-LUC表達的冷調(diào)控中明顯地不表達(圖1B)。
ice1突變體植物與CBF3-LUC野生型雜交，所得F1代植物在12小時的0℃冷處理后，用來測試CBF3-LUC表達。經(jīng)發(fā)光成像確定，所有的F1代植物都顯現(xiàn)出減少了的冷誘導(dǎo)的CBF3-LUC表達，與ice1相似。由F1代自交產(chǎn)生的F2代在突變體和野生型之間出現(xiàn)了大約3比1的隔離。這些結(jié)果表明ice1在單核基因里是顯性突變。
ice1突變體植物在冷調(diào)控基因表達是缺陷型運用RNA印跡分析來分析內(nèi)生CBFs以及它們冷壓力反應(yīng)的靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的ice1突變的效果。與成像結(jié)果一致，內(nèi)生CBF3基因的冷誘導(dǎo)在ice1突變體植物被極大地削弱(幾乎徹底破壞)(圖1C)。野生型植物在冷處理1小時后表現(xiàn)出了CBF3的誘導(dǎo)作用，6小時后達到高峰。相反，CBF3誘導(dǎo)在ice1突變體植物幾乎完全被破壞(圖1C)。當(dāng)CBF1在1和3小時的冷處理后，在ice1突變體的誘導(dǎo)水平低于在野生型的水平，在經(jīng)過6到12小時處理后，它的誘導(dǎo)水平相當(dāng)于野生型的誘導(dǎo)水平。CBF2在1小時的冷處理后，在ice1突變體的誘導(dǎo)水平比較低，在經(jīng)過6到12小時處理后，它的誘導(dǎo)水平在突變體里比較高(圖1C)。我們也測試了CBFs下游靶基因的冷誘導(dǎo)作用。RD29A，COR15A和COR47A在寒冷壓力下在ice1的表達水平低于在野生型的表達水平，而KINI在ice1的誘導(dǎo)作用只是在經(jīng)過48小時的冷處理之后才表現(xiàn)比較低(圖1C)。
與這些RNA印跡結(jié)果一致，微陣列分析使用Affymetrix幾乎整個基因組的基因嵌片表明，在經(jīng)過6小時的冷處理之后，在野生型有3倍或更多倍誘導(dǎo)的306個基因當(dāng)中，217個在ice1突變體不被誘導(dǎo)或者比在野生型有少于50％或更少的誘導(dǎo)(表1A)。它們當(dāng)中的32個基因編碼推定的轉(zhuǎn)錄因子，表明ICE1可以控制許多冷反應(yīng)調(diào)節(jié)子。306個冷誘導(dǎo)的基因當(dāng)中的87個基因在野生型和ice1中的誘導(dǎo)水平的差別小于2倍(表1B)。有趣的是，有2個基因在ice1突變體中表現(xiàn)出了較高的冷誘導(dǎo)水平(表1C)。
表1.在野生型和ice1中冷反應(yīng)的基因表達。
在冷處理時，野生型和ice1的籽苗在光下被置于0±1℃6個小時。Affymetrix基因芯片(Affymetrix GeneChip)分析按照材料與方法部分的說明進行?；虮磉_的變化通過對每一個基因型冷處理的樣品與對照樣品的比較數(shù)值進行分析。+1或-1的“倍數(shù)變化”值說明基因表達沒有變化。正-調(diào)控或負(fù)-調(diào)控分別通過“倍數(shù)變化”數(shù)值的+或-來表達。在野生型的冷反應(yīng)基因由以下標(biāo)準(zhǔn)來確定1)冷處理樣品的信號強度要比本底大很多(即，在冷處理樣品中由Affymetrix Microarray Suite Program確定的帶有“存在”顯示的基因)；2)由Affymetrix Microarray Suite Program產(chǎn)生的“變化”顯示，在對對比較中是“I”(代表“增加”)；3)“倍數(shù)變化”在對對比較中是3倍或更高。所獲得的306基因作進一步分析并與ice1突變體里的基因作對比。野生型和ice1之間的變化的兩倍差別作為基因分類的極限值。轉(zhuǎn)錄因子用灰色方塊表示。用于RNA雜交分析的基因以黑體表示。22個在冷處理ice1的倍數(shù)變化值沒有確定(ND)，因為它們的信號強度與本底值相似(也就是說，在冷處理的ice1帶有“缺席”calls的基因)。這22個基因都是在野生型被冷誘出來的。所以，它們屬于在ice1比在野生型比較低的誘導(dǎo)作用的冷反應(yīng)基因類。
表1A在ice1低誘導(dǎo)的冷反映基因探針 AGI序號 基因名稱倍數(shù)變化野生型 ice1254074At4g25490CBF/DREB1B 445.7 64.0254066At4g25480CBF3/DREB1A 78.8 29.9258325At3g22830推定的熱激轉(zhuǎn)錄因子 42.2 5.7246432At5g17490似RGA蛋白質(zhì) 34.3 ND261648At1g27730耐鹽鋅指蛋白 24.3 6.5247655At5g59820鋅指蛋白Zat1219.7 7.0248160At5g54470CONSTANS B-框鋅指家系蛋白19.7 9.8250781At5g05410DRE結(jié)合蛋白(DREB2A) 14.9 4.925I745At3g55980鋅指轉(zhuǎn)錄因子(PE11) 13.9 3.0258139At3g24520熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF1，推定的 13.9 3.7245711At5g04340推定的c2h2鋅指轉(zhuǎn)錄因子 1.35.3245250At4g17490乙烯-反應(yīng)元素結(jié)合因子6(AtERF6) 8.64.3252214At3g50260EREBP-3同系物8.62.1261613At1g49720脫落酸應(yīng)答元件-結(jié)合因子 7.03.5245078At2g23340推定的AP2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子 5.71.4263379At2g40140推定的CCCH-型鋅指蛋白5.72.6253405At4g32800轉(zhuǎn)錄因子TINY，推定的 5.3ND245807At1g46768AP2結(jié)構(gòu)域蛋白RAP2.1 4.91.9259432At1g01520myb家系轉(zhuǎn)錄因子 4.92.3252278At3g49530似NAC2蛋白 4.62.0
253485At4g31800WRKY家系轉(zhuǎn)錄因子4.6 -1.2251272At3g61890同源框-亮氨酸拉鏈蛋白ATHB-124.3 1.3261470At1g28370乙烯-反應(yīng)元素結(jié)合因子11(AtERF11)4.3 1.7261892At1g80840WRKY家系轉(zhuǎn)錄因子4.3 1.2263783At2g46400WRKY家系轉(zhuǎn)錄因子4.3 1.4257022At3g19580鋅指蛋白，推定的3.7 1.4267252At2g23100富CHP鋅指蛋白，推定的 3.7 ND249746At5g24590似NAC2蛋白 3.5 1.6256093At1g20823推定的RING鋅指蛋白 3.5 1.4252009At3g52800似鋅指蛋白 3.2 1.3256185At1g51700Dof鋅指蛋白 3.2 1.6260763At1g49220RING-H2指蛋白RHA3a，推定的 3.2 ND245749At1g51090富脯氨酸蛋白，推定的73.57.5264217At1g60190假設(shè)蛋白質(zhì) 68.626.0246467At5g17040UDP葡萄糖似類黃酮3-氧-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)29.9ND251793At3g55580似染色體濃縮蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)劑27.96.1262452At1g11210表達的蛋白質(zhì)27.97.0264661At1g09950假設(shè)的蛋白質(zhì)27.9ND258947At3g01830表達的蛋白質(zhì)26.02.5246178s At5g28430推定的蛋白質(zhì)9.7 7.0253104At4g36010似奇異果甜蛋白 19.72.5257391At2g32050假設(shè)的蛋白質(zhì)19.7ND245627At1g56600水壓力誘導(dǎo)蛋白，推定的 18.4ND247208At5g64870似結(jié)瘤素18.41.2256114At1g16850表達的蛋白質(zhì)18.42.6256356s At1g66500假設(shè)的蛋白質(zhì)18.43.0250098At5g17350推定的蛋白質(zhì)17.13.2264758At1g61340胚胎發(fā)生后期豐富蛋白質(zhì)，推定的 17.15.3246099At5g20230藍色結(jié)合銅蛋白 16.01.3257280At3g14440新黃質(zhì)卵裂酶(NC1)(NCED1)，推定的16.01.0251336At3g61190推定的蛋白質(zhì)13.93.0
260264At1g68500假設(shè)的蛋白質(zhì)13.93.0263497At2g42540COR15a 13.93.5248337At5g52310RD29A/COR78/LT178 13.04.6248959At5g45630推定的蛋白質(zhì)13.02.0259977At1g76590表達的蛋白質(zhì)13.02.5260399At1g72520推定的脂肪氧化酶13.01.5259879At1g76650推定的鈣調(diào)蛋白 12.12.8265290At2g22590推定的花色素-3-葡糖苷rhamnosyltransferase 12.1ND267411At2g34930抗病性蛋白質(zhì)家系12.11.1250648At5g06760胚胎發(fā)生后期豐富似蛋白質(zhì)LEA 11.31.9257876At3g17130假設(shè)蛋白質(zhì) 11.32.3260727At1g48100多聚半乳糖醛酸酶，推定的11.32.3246125At5g19875表達的蛋白質(zhì)10.62.0251603At3g57760推定的蛋白質(zhì)10.61.1256017At1g19180表達的蛋白質(zhì)10.61.5264617At2g17660未知蛋白質(zhì) 10.6ND264787At2g17840推定的相關(guān)衰老蛋白質(zhì)12 10.63.5245757At1g35140磷誘導(dǎo)(phi-1)蛋白，推定的 9.8 1.6252346At3g48650假設(shè)蛋白質(zhì) 9.8 2.0253643At4g29780表達蛋白質(zhì) 9.8 3.2254667At4g18280似富甘氨酸細(xì)胞壁蛋白質(zhì) 9.8 1.2264389At1g11960未知蛋白9.8 1.7266545At2g35290假設(shè)蛋白質(zhì) 9.8 1.4266720S At2g46790表達蛋白質(zhì) 9.8 4.9245251At4g17615鈣調(diào)磷酸酶似B蛋白1 9.2 3.0247431At5g62520推定的蛋白質(zhì)9.2 1.5248964At5g45340細(xì)胞色素p450家系9.2 3.0252368At3g48520細(xì)胞色素p450，推定的9.2 1.3262164At1g78070表達蛋白質(zhì) 9.2 4.3252102At3g50970dehydrin Xero2 8.6 4.0262359At1g73070富亮氨酸重復(fù)蛋白家系8.6 ND
262731At1g16420假定蛋白質(zhì)總家系 8.62.8245677At1g56660假設(shè)蛋白質(zhì) 8.02.8245734At1g73480溶血磷脂酶同系物，推定的 8.02.6247177At5g65300表達的蛋白質(zhì) 8.03.7250053At5g17850似依賴鉀鈉-鈣交換體蛋白質(zhì)8.02.0254120At4g24570線粒體攜帶蛋白質(zhì)家系 8.03.0254926At4g11280ACC合成酶(AtACS-6) 8.02.3263789At2g24560推定的GDSL基序脂酶/水解酶8.0ND245346At4g17090糖基水解酶家系14(β-淀粉酶) 7.52.6253425At4g32190推定的蛋白質(zhì) 7.53.2254085At4g24960似脫落酸誘導(dǎo)蛋白質(zhì) 7.52.3259076At3g02140表達的蛋白質(zhì) 7.51.1260227At1g74450表達的蛋白質(zhì) 7.52.0260915At1g02660表達的蛋白質(zhì) 7.51.7262677At1g75860未知蛋白質(zhì) 7.52.6266532At2g16890葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 7.53.0247925At5g57560木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶 7.02.1252563At3g45970推定的蛋白質(zhì) 7.01.2254850At4g12000推定的蛋白質(zhì) 7.02.3260744At1g15010表達的蛋白質(zhì) 7.01.7263931At2g36220表達的蛋白質(zhì) 7.03.0245306At4g14690表達的蛋白質(zhì) 6.52.6246495At5g16200推定的蛋白質(zhì) 6.51.7248870At5g46710推定的蛋白質(zhì) 6.52.6253292At4g33985表達的蛋白質(zhì) 6.52.0253872At4g27410推定的蛋白質(zhì) 6.51.5258792At3g04640表達的蛋白質(zhì) 6.53.0259516At1g20450表達的蛋白質(zhì) 6.53.2262050At1g80130表達的蛋白質(zhì) 6.51.2245427At4g17550推定的蛋白質(zhì) 6.11.2253859At4g27657表達的蛋白質(zhì) 6.1ND
261187At1g32860糖基水解酶家系17 6.11.4262448At1g49450似En/Spm轉(zhuǎn)座子蛋白質(zhì)，推定的 6.1ND266757At2g46940未知蛋白質(zhì)6.11.3252131At3g50930似BCS1蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) 5.71.6255795At2g33380RD20蛋白質(zhì)5.7-1.3258321At3g22840初期光誘導(dǎo)蛋白質(zhì) 5.72.3262496At1g21790表達的蛋白質(zhì) 5.72.0265119At1g62570含黃素的單氧酶，推定的5.72.0246018At5g10695表達的蛋白質(zhì) 5.31.7248820At5g47060推定的蛋白質(zhì) 5.31.7249918At5g19240推定的蛋白質(zhì) 5.31.9253830At4g27652表達的蛋白質(zhì) 5.31.7246490At5g15950S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶 4.92.1253284At4g34150推定的蛋白質(zhì) 4.91.9253323At4g33920推定的蛋白質(zhì) 4.92.5253614At4g30350推定的蛋白質(zhì) 4.91.5264655At1g09070表達的蛋白質(zhì) 4.91.9245533At4g15130推定的膽堿磷酸胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶4.62.1246831At5g26340似己醣轉(zhuǎn)運蛋白4.62.0247137At5g66210鈣依賴蛋白激酶4.61.4247226At5g65100推定的蛋白質(zhì) 4.6ND250467At5g10100似海藻糖-6-磷酸磷酸酶蛋白質(zhì) 4.6ND252414At3g47420推定的蛋白質(zhì) 4.61.9252997At4g38400推定的花粉過敏原 4.61.1253595At4g30830推定的蛋白質(zhì) 4.6ND253832At4g27654表達的蛋白質(zhì) 4.61.3258188At3g17800表達的蛋白質(zhì) 4.61.4259479At1g19020表達的蛋白質(zhì) 4.61.7261405At1g18740表達的蛋白質(zhì) 4.62.0262881At1g64890表達的蛋白質(zhì) 4.62.1264000At2g22500線粒體載體蛋白質(zhì)家系 4.62.0
265668At2g32020推定的丙氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶4.62.3265797At2g35715表達的蛋白質(zhì)4.6ND248686At5g48540似33kDa分泌蛋白質(zhì) 4.31.6250676At5g06320似牽條誘導(dǎo)蛋白質(zhì)4.31.6251259At3g62260蛋白質(zhì)磷酸酶2C(PP2C)4.32.1254300At4g22780翻譯因子EF-1似α蛋白質(zhì) 4.31.1261356At1g79660未知蛋白質(zhì) 4.31.6264636At1g65490表達的蛋白質(zhì)4.31.4246468At5g17050UDP葡萄糖類黃酮3-氧-葡糖基轉(zhuǎn)移酶 4.02.0248607At5g49480似NaCl誘導(dǎo)Ca2+結(jié)合蛋白質(zhì)；似鈣調(diào)蛋白 4.01.5250279At5g13200似ABA-反應(yīng)蛋白質(zhì)4.01.2252053At3g52400圖觸融合蛋白SYP122 4.01.9256633At3g28340未知蛋白質(zhì) 4.02.0258207At3g14050推定的GTP焦磷酸激酶 4.01.7258805At3g04010糖基水解酶家系174.01.3261912s At1g66000假設(shè)蛋白質(zhì) 4.0ND264989At1g27200表達的蛋白質(zhì)4.01.6265276At2g28400假設(shè)蛋白質(zhì) 4.0-1.1267261At2g23120表達的蛋白質(zhì)4.01.7247693At5g59739推定的蛋白質(zhì)3.71.9253113At4g35985推定的蛋白質(zhì)3.71.4253165At4g35320推定的蛋白質(zhì)3.71.9253879s At4g27570似UDP鼠李糖-花色素-3-糖苷鼠李糖苷轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì) 3.71.2253915At4g27280推定的蛋白質(zhì)3.71.9259426At1g01470假設(shè)蛋白3.71.6259445At1g02400加雙氧酶3.71.9260410At1g69870推定的肽轉(zhuǎn)移蛋白3.71.1261581At1g01140絲氨酸蘇氨酸激酶，推定的3.71.5262113At1g02820后胚胎發(fā)育豐富蛋白質(zhì)3.71.1262382At1g72920抗疾病蛋白(TIR-NBS類)，推定的 3.71.9265665At2g27420半胱氨酸蛋白酶 3.71.0
267069At2g41010未知蛋白質(zhì) 3.71.2245450At4g16880似抗疾病RPP5蛋白質(zhì)(片段)3.5ND246289At3g56880推定的蛋白質(zhì)3.51.3249204At5g42570表達的蛋白質(zhì)3.51.5249622At5g37550推定的蛋白質(zhì)3.51.4250335At5g11650溶血磷脂酶 3.51.7251372At3g60520推定的蛋白質(zhì)3.51.5254707At4g18010推定的蛋白質(zhì)3.51.1257154At3g27210表達的蛋白質(zhì)3.51.5259705At1g77450似GRAB1蛋白質(zhì) 3.51.3261037At1g17420脂氧化酶3.51.2261937At1g22570肽轉(zhuǎn)移蛋白，推定的 3.51.6264024At2g21180表達的蛋白質(zhì)3.51.1264458At1g10410未知蛋白質(zhì) 3.51.2266799At2g22860未知蛋白質(zhì) 3.51.4247280At5g64260似phi-1蛋白質(zhì) 3.21.6251356At3g61060推定的蛋白質(zhì)3.21.5252316At3g48700推定的蛋白質(zhì)3.21.3253824At4g27940推定的蛋白質(zhì)3.21.1256526At1g66090抗疾病蛋白質(zhì)(TIR-NBS類) 3.21.4256595x At3g28530假設(shè)蛋白質(zhì) 3.21.1265648At2g27500糖基水解酶家系173.21.1266097At2g37970表達的蛋白質(zhì)3.21.6267335s At2g19440糖基水解酶家系173.21.6245699At5g04250推定的蛋白質(zhì)3.01.2247467aI At5g62130推定的蛋白質(zhì)3.01.5249583At5g37770鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)2，觸誘導(dǎo)(TCH2) 3.01.1249626At5g37540推定的蛋白質(zhì)3.01.2252474At3g46620推定的蛋白質(zhì)3.01.3253628At4g30280木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶 3.01.4253835At4g27820葡基水解酶家系 3.01.2
254158At4g24380推定的蛋白質(zhì) 3.01.4254188At4g23920似UDP葡萄糖表異構(gòu)酶蛋白 3.01.2254634At4g18650推定的蛋白質(zhì) 3.0ND254973At4g10460推定的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子3.0ND256763At3g16860未知蛋白質(zhì)3.01.0257519At3g01210含RRM的蛋白質(zhì) 3.0-1.1258894At3g05650抗疾病蛋白質(zhì)家系 3.01.4265841At2g35710推定的糖原生成起始蛋白3.01.5266271At2g29440推定的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 3.01.2266316At2g27080表達的蛋白質(zhì) 3.01.1267631At2g42150假設(shè)蛋白質(zhì)3.01.1
表1B在野生型和ice1具相似誘導(dǎo)性的冷反應(yīng)基因探針 AGI序號基因名稱倍數(shù)變化野生型ice1254075At4g25470 CBF2/DREB1C 104.0 137.2261263At1g26790 Dof鋅指蛋白 68.6 55.7257262At3g21890 CONSTANS B框鋅指家系蛋白-7.5 5.3259834At1g69570 Dof鋅指蛋白 7.05.7256430At3g11020 DREB2B 6.14.9248389At5g51990 DRE結(jié)合蛋白 5.34.0257053At3g25210 AtERF4 5.32.8248744At5g48250 CONSTANS B框鋅指家系蛋白4.93.0249606At5g37260 CCA1.，推定的 4.99.2267028At2g38470 WRKY家系轉(zhuǎn)錄因子4.93.0246523At5g15850 CONSTANS-LIKE 14.0 3.2248799At5g47230 AtERF5 4.03.5247452At5g62430 Dof鋅指蛋白 3.73.7251190At3g62690 RlNG-H2鋅指蛋白ATL5 3.72.1253722At4g29190 鋅指蛋白，推定的3.74.6259992At1g67970 推定的熱擊轉(zhuǎn)錄因子 3.72.3263252At2g31380 似CONSTANS B框鋅指蛋白 3.73.7263739At2g21320 CONSTANS B框鋅指家系蛋白3.72.3252429At3g47500 Dof鋅指蛋白 3.54.3253140At4g35480 RING-H2指蛋白RHA3b 3.52.0258742At3g05800 bHLH蛋白質(zhì) 3.56.5265939At2g19650 富CHP鋅指蛋白 3.52.8249415At5g39660 Dof鋅指蛋白 3.23.7259364At1g13260 DNA結(jié)合蛋白(RAV1) 3.22.1262590At1g15100 推定的RING-H2鋅指蛋白 3.22.0263823s At2g40350 AP2域轉(zhuǎn)錄因子 3.05.7264511At1g09350 推定的肌醇半乳糖苷合成酶17.1 12.1264314At1g70420 表達的蛋白質(zhì)13.0 9.8247478At5g62360 似DC1.2同源性蛋白質(zhì) 11.3 11.3
253322At4g33980 推定的蛋白質(zhì) 11.3 8.0249741At5g24470 推定的蛋白質(zhì) 8.06.5247047At5g66650 推定的蛋白質(zhì) 7.04.3263495At2g42530 COR15b 6.59.8265536At2g15880 未知蛋白質(zhì) 6.55.3249174At5g42900 推定的蛋白質(zhì) 6.13.5249191At5g42760 推定的蛋白質(zhì) 6.14.3264153At1g65390 抗疾病蛋白(TIR類)，推定的 6.14.9250099At5g17300 表達的蛋白質(zhì) 5.77.5265725At2g32030 推定的丙氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶 5.73.0246922At5g25110 似絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白質(zhì) 4.94.9251494At3g59350 似蛋白激酶蛋白質(zhì) 4.92.8246821At5g26920 結(jié)合鈣調(diào)蛋白蛋白質(zhì) 4.62.6255733At1g25400 表達的蛋白質(zhì) 4.63.0257650At3g16800 蛋白質(zhì)磷酸酶2C(PP2C) 4.62.5266832At2g30040 推定的蛋白激酶 4.62.8267357A2tg40000 推定的抗線蟲蛋白質(zhì) 4.63.7249411At5g40390 糖基水解酶家系36 4.33.5256266At3g12320 表達的蛋白質(zhì) 4.34.0252956At4g38580 相關(guān)的銅分子伴侶(CCH) 4.02.3253455At4g32020 推定的蛋白質(zhì) 4.02.6259570At1g20440 假設(shè)蛋白質(zhì) 4.02.3262383At1g72940 抗病蛋白質(zhì)(TIR-NBS類) 4.02.1247393At5g63130 未知蛋白質(zhì) 3.73.2252661At3g44450 推定的蛋白質(zhì) 3.72.5259990s At1g68050 F-框蛋白質(zhì)FKF1/ADO3.AtFBX2a3.72.3264213At1g15400 假設(shè)蛋白質(zhì) 3.72.0245777At1g73540 未知蛋白質(zhì) 3.52.5248745At5g48260 未知蛋白質(zhì) 3.52.5248846At5g46500 推定的蛋白質(zhì) 3.52.6249063At5g44110 ABC轉(zhuǎn)移蛋白家系蛋白質(zhì) 3.52.1257654At3g13310 DonJ蛋白質(zhì)，推定的 3.52.1
257925At3g23170 表達的蛋白質(zhì)3.51.9261048At1g01420 黃酮醇3-氧-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 3.52.0263216s At1g30720 FAD-連接的氧化還原酶家系 3.52.3265184At1g23710 表達的蛋白質(zhì)3.52.3245558At4g15430 假設(shè)蛋白質(zhì) 3.23.5248164At5g54490 推定的蛋白質(zhì)3.22.5248502At5g50450 推定的蛋白質(zhì)3.24.3252010At3g52740 表達的蛋白質(zhì)3.22.5253679At4g29610 胞苷脫氨酶6(CDA6) 3.22.0256548At3g14770 表達的蛋白質(zhì)3.21.9256577At3g28220 未知蛋白質(zhì) 3.22.3257083s At3g20590 非特定性抗疾病蛋白，推定的 3.22.3260046At1g73800 表達的蛋白質(zhì)3.22.0261958At1g64500 肽轉(zhuǎn)移蛋白 3.22.6263352At2g22080 似En/Spm轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)3.21.9263452At2g22190 海藻糖-6-磷酸鹽磷酸酶 3.22.3265093At1g03905 ABC轉(zhuǎn)移蛋白家系蛋白質(zhì) 3.21.7267293At2g23810 假設(shè)蛋白質(zhì) 3.21.7245119At2g41640 表達的蛋白質(zhì)3.02.6246270At4g36500 推定的蛋白質(zhì)3.03.0247793At5g58650 推定的蛋白質(zhì)3.01.7256442At3g10930 表達的蛋白質(zhì)3.01.9256487At1g31540 抗疾病蛋白質(zhì)(TIR-NBS-LRR類)，推定的 3.02.1259428At1g01560 MAP激酶 3.01.7266834s At2g30020 蛋白磷酸酶2C(PP2C) 3.02.6267364At2g40080 表達的蛋白質(zhì)3.02.3Table 1C在ice1高誘導(dǎo)性冷反應(yīng)基因探針 AGI序號基因名稱倍數(shù)變化野生型ice1261248At1g20030 鈣網(wǎng)蛋白 4.613.9258383At3g15440 假設(shè)蛋白質(zhì)4.39.2
ice1突變削弱耐寒耐凍性在正常生長溫度下，ice1和野生型籽苗大小相似(圖2A)。雖然成體ice1植物比較小，但它們的開花期和生殖期與野生型差不多(圖2B)。10天齡的ice1和野生型各占一半放在同一個瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，在4℃下冷適應(yīng)四天，然后作耐凍試驗。在所有的冷凍處理過程中，ice1突變體的耐凍性比野生型的差(圖2C和2D)。在2個小時的-10℃處理中，約50％的ice1突變體死亡，而野生型死亡不到20％(圖2D)。當(dāng)把新發(fā)芽的(22℃)ice1突變體和野生型籽苗轉(zhuǎn)移到4℃條件下(30±2μmol quanta.m-2.s-1的光照)，經(jīng)過四星期的冷處理，凍傷在突變體里變得很明顯(圖2E)。六個星期的冷處理之后，野生型100％存活，而icel突變體只有20％存活下來(圖2F)。
ICE1的定位克隆為對ice1突變體作圖，在CBF3-LUC Columbia本底的純合ice1突變體與Ler生態(tài)型的野生型植物雜交。雜交F1代自交產(chǎn)生F2種子。因為ice1突變體是顯性性狀，我們從隔離F2代選擇帶有野生型性狀(基于植物的大小和形態(tài))的籽苗作圖。一共選擇662個野生型植物用來作圖，利用簡單序列長度多態(tài)現(xiàn)象和分裂的擴增的多態(tài)現(xiàn)象序列標(biāo)記(具體參考材料與方法部分)，其最初把ice1放在3號染色體的中部，然后縮小其定位到MLJ15合MDJ14BAC克隆的58kb區(qū)域。這個區(qū)域的候選基因從純合ice1突變體植物擴增并測序。將序列與發(fā)表的擬南芥序列作對比，發(fā)現(xiàn)假定的MLJ15.14基因有一個單一的G替換A的突變。
為了確定MLJ15.14就是ICE1基因，MLJ15.14基因，包括其上游的2，583bp的起始密碼子和615bp下游的終止密碼子，從ice1突變植物克隆出來。這個片段被插入到一個雙元載體并通過土壤桿菌做媒介的轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入到CBF3-LUC Columbia野生型植物。依據(jù)它們的抗潮霉素特性，選擇轉(zhuǎn)基因植物，以及將T2代品系冷誘導(dǎo)生物發(fā)光與野生型冷誘導(dǎo)生物發(fā)光進行比較。ice1的MLJ15.14基因抑制野生型的冷誘導(dǎo)發(fā)光(圖3A和3B)并將植物高度減小到ice1突變體的高度。因而可以確定MLJ15.14就是ICE1。
ICE1編碼一個組成型表達和核定位的似MYC的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子ICE1的閱讀筐(SEQ ID NO1)通過對由RT-PCR獲得的cDNA測序來決定。確定的閱讀筐如下1 atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct61 ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaattc atgaaatcct cgtgattcta121 ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt181 tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac241 tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg301 ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa361 gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct421 atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta431 cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt541 cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt601 gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat661 gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt721 cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac781 agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc841 aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt901 ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag961 gtgttagcat cgtctggtgc acagcctact ctgttccaga aacgtgcagc tatgcgtcag1021 agctctggaa gcaaaatggg aaattcggag agttcgggaa tgaggaggtt tagtgatgat1081 ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata1141 aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag1201 aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat1261 aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata1321 cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat1381 gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg1441 acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta1501 ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg1561 aacattcata tgttctgtgg tcgtagaccg ggtctgttgc tcgctaccat gaaagctttg1621 gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg1681 gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa1741 gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag1801 tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt1861 tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa1921 tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa1981 cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtc t預(yù)測ICE1編碼一個有494個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測的分子量是53.5kDa，序列如下(SEQ ID NO2)MGLDGNNGGGVWLNGGGGEREENEEGSWGRNQEDGSSQFKPMLEGDWFSSNQPHPQDLQMLQNQPDFRYFGGFPFNPNDNLLLQHSIDSSSSCSPSQAFSLDPSQQNQFLSTNNNKGCLLNVPSSANPFDNAFEFGSESGFLNQIHAPISMGFGSLTQLGNRDLSSVPDFLSARSLLAPESNNNNTMLCGGFTAPLELEGFGSPANGGFVGNRAKVLKPLEVLASSGAQPTLFQKRAAMRQSSGSKMGNSESSGMRRFSDDGDMDETGIEVSGLNYESDEINESGKAAESVQIGGGGKGKKKGMPAKNLMAERRRRKKLNDRLYMLRSVVPKJSKMDRASILGDAIDYLKELLQRINDLHNELESTPPGSLPPTSSSFHPLTPTPQTLSCRVKEELCPSSLPSPKGQQARVEVRLREGRAVNIHMFCGRRPGLLLATMKALDNLGLDVQQAVISCFNGFALDVFRAEQCQEGQEILPDQIKAVLFDTAGYAGMI
數(shù)據(jù)庫檢索表明ICE1在它的C末端一半處含有一個似MYC堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域(圖4A和4B)。在整個蛋白質(zhì)的長度上，ICE1顯示出其氨基酸序列與一個擬南芥(Atlg12860)未知蛋白質(zhì)序列相似。在這兩種擬南芥蛋白質(zhì)里是保守的，但在ice1突變中，Argg236變成His。ICE1的bHLH結(jié)構(gòu)域?qū)σ阎腗YC-相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列有很高的相似性(圖4B)。所有的MYC結(jié)合啟動子元件含有CA核苷酸，其被bHLH拉鏈結(jié)構(gòu)域保守的谷氨酸所接觸(Grandori et al.，2000)。這個谷氨酸殘基(Glu312)在ICE1的堿性DNA結(jié)合域也是保守的(圖4B)?？拷被说乃嵝越Y(jié)構(gòu)域以轉(zhuǎn)錄因子bHLH家系為特征，以及靠近羧基末端以保守的bHLH的DNA結(jié)合位點和二聚化結(jié)構(gòu)域為特征(Purugganan和Wessler1994)。所有這些特征在ICE1蛋白質(zhì)里存在(圖4A)。
為分析ICE1在不同組織內(nèi)的表達形式，表達IC1啟動子-GUS轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的T2代被用來作分析。GUS的表達在根、葉、莖和花的部位都可測試到。半量化RT-PCR分析表明ICE1被組成型地表達，而且在葉和莖的表達比在其它的組織表達強(圖5A和5B)。RNA印跡分析顯示ICE1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被寒冷、NaCl和ABA稍有正調(diào)控，但不被脫水正調(diào)控(圖5C)。
為了測定ICE1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，將ICE1符合讀框融合到綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的C-末端一側(cè)，并且在CaMV35S啟動子的控制下進行表達。T2轉(zhuǎn)基因植物的GFP熒光共焦成像顯示GFP-ICE1融合蛋白存在于細(xì)胞核中無論是在溫暖或寒冷的條件下(圖5D)。
ICE1在CBF3啟動子結(jié)合MYC的識別位點ICE1有一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域，而且它的氨基酸序列在堿性區(qū)域與其它bHLH蛋白質(zhì)是高度保守的(圖4B)，因此，可以識別與已知bHLH蛋白質(zhì)DNA結(jié)合位點相似的啟動子元件。這些蛋白質(zhì)用契合序列CANNTG識別DNA(Meshi和Iwabuchi，1995)。在CBF3的啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點的1kb區(qū)域上游內(nèi)有五個潛在的MYC-識別元件(ShinWariet al.，1998)。這些可能的MYC-識別位點從MYC-1到MYC-5，分成四個組，因為MYC-3和MYC-5的契合序列是一樣的，即，CATTTG(圖6A)。因而，MYC-3可以用來代表MYC-3和MYC-5。為了確定在CBF3啟動子內(nèi)ICE1是否結(jié)合到這些MYC識別位點，我們將His-ICE1融合蛋白在大腸桿菌里進行表達和純化。四個包含可能的每一個MYC結(jié)合位點的DNA片段用來在電泳遷移率變動分析(EMSA)中與His-ICE1相互作用。
當(dāng)把ICE1與四個DNA片段(MYC-1到MYC-4)中的任意一個片段一起培養(yǎng)，可以觀測到幾個復(fù)合體。這表明ICE1是能夠結(jié)合到這些序列上的(圖6B)。MYC-2片段與ICE1形成一個主要復(fù)合體，而其它的DNA片段與ICE1形成幾個復(fù)合體。這些復(fù)合體隨著帶有相同序列的冷競爭劑的增加而被破壞，但不被P1和P2所破壞，其分別含有一個推定的MYB識別點和一個非相關(guān)序列(圖6B)。這項競爭特殊性更加強化了我們的假設(shè)，即DNA和ICE1之間的相互作用需要MYC識別序列。當(dāng)MYC-2片段作為探針的時候，復(fù)合體被MYC-2競正劑最有效地競爭掉。這說明ICE1在MYC-2位點比其它位點有更高的親和力(圖6C)。由ICE1和MYC-2片段形成的復(fù)合體受到突變體競爭劑的影響小于野生型(圖6D)?？傊?，這些結(jié)果說明，ICE1在CBF3啟動子里特有地與MYC識別位點相互作用。ice1突變體似乎不影響ICE1與CBF3啟動子的相互作用，因為ICE1的Arg236變成His的突變形式也能結(jié)合到MYC-2探針上(圖6E)。
ICE1是正調(diào)控CBF表達的轉(zhuǎn)錄激活劑利用瞬即表達試驗來確定ICE1是否起轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制劑的作用。通過將ICE1與酵母GAL4轉(zhuǎn)錄激活劑的DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建一個效應(yīng)器質(zhì)粒(GAL4-ICE1，圖7A)。當(dāng)把野生型的GAL4-ICE1和GAL4反應(yīng)報道基因GAL4-LUC通過粒子轟擊轉(zhuǎn)移到擬南芥的葉子里時，不管是帶有或不帶有僅含有GAL4DNA結(jié)合域的效應(yīng)器質(zhì)粒，熒光素酶活性相對于對照增加了20倍(圖7B)。ICE1的Arg236變成His的突變形式也激活GAL4反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄(圖7B)。這些結(jié)果表明ICE1是一個轉(zhuǎn)錄激活劑，而且ice1突變不影響轉(zhuǎn)錄活性域的功能。
由T-DNA插入產(chǎn)生的無效等位基因不表現(xiàn)出任何ice1突變體的顯性性狀。這表明ICE1基因家系有功能豐余。我們使用強的組型超啟動子在野生型擬南芥過表達ICE1。沒有一個過表達品系顯示出ice1突變體的表型。RNA印跡分析說明在溫暖的條件下，ICE1-過表達不激活CBF3的表達。但是ICE1-過表達在寒冷條件下增進內(nèi)生性CBF3基因以及CBF3-LUC報道基因的表達(圖7C和圖7D)。CBF2、RD29A和COR15A在超ICE1轉(zhuǎn)基因植物的冷誘導(dǎo)也得到增強(圖7C)。當(dāng)把在同一個瓊脂培養(yǎng)皿上的超ICE1轉(zhuǎn)基因植物和野生型對照植物在4℃進行冷適應(yīng)5天然后施以-8℃的冷凍處理4小時之后，ICE1過表達轉(zhuǎn)基因籽苗表現(xiàn)了一個比對照植物(37.2±12.6％)高的存活率(75.9±6.5％)(圖7E)。ICE1過表達轉(zhuǎn)基因植物也沒有表現(xiàn)出生長或發(fā)育異常。結(jié)果表明，ICE1是CBF3的正調(diào)控劑，并且ice1的顯性性狀有可能是突變作用的顯性負(fù)作用引起的。
根據(jù)以上的說明，各種針對本發(fā)明的修飾和改動都是可能的。因而理解本發(fā)明在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實施，除非特別指出外。
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權(quán)利要求
1.一個分離的多聚核苷酸，其編碼含有氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的多聚核苷酸，其中所述的蛋白質(zhì)具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的活性。
3.一個分離的多聚核苷酸，其含有序列SEQ ID NO1的多聚核苷酸。
4.一個分離的多聚核苷酸，其與權(quán)利要求3的多聚核苷酸互補。
5.一個分離的多聚核苷酸，其與權(quán)利要求3的多聚核苷酸至少70％相同。
6.一個分離的多聚核苷酸，其與權(quán)利要求3的多聚核苷酸至少80％相同。
7.一個分離的多聚核苷酸，其與權(quán)利要求3的多聚核苷酸至少90％相同。
8.一個分離的多聚核苷酸，其在嚴(yán)格的條件下與權(quán)利要求3的多聚核苷酸雜交；其中所述的嚴(yán)格的條件包括在5X SSC，溫度為55-68℃的條件下清洗。
9.如權(quán)利要求3所述的分離的多聚核苷酸，其編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性的蛋白質(zhì)。
10.一個載體，含有權(quán)利要求1所述的分離的多聚核苷酸。
11.一個載體，含有權(quán)利要求3所述的分離的多聚核苷酸。
12.一個宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求1所述的分離的多聚核苷酸。
13.一個宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求3所述的分離的多聚核苷酸。
14.一個植物細(xì)胞，含有權(quán)利要求1所述的分離的多聚核苷酸。
15.一個植物細(xì)胞，含有權(quán)利要求3所述的分離的多聚核苷酸。
16.一個轉(zhuǎn)基因植物，含有權(quán)利要求1所述的分離的多聚核苷酸。
17.一個轉(zhuǎn)基因植物，含有權(quán)利要求3所述的分離的多聚核苷酸。
18.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是擬南芥。
19.如權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是擬南芥。
20.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是從以下一組植物中選擇，小麥，玉米，花生，棉花，燕麥和大豆。
21.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中分離的多聚核苷酸操作連接到誘導(dǎo)啟動子上。
22.如權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中分離的多聚核苷酸操作連接到誘導(dǎo)啟動子上。
23.一種篩選編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的方法，包括將權(quán)利要求1的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸進行雜交；表達多聚核苷酸生產(chǎn)蛋白質(zhì)；以及檢測所述蛋白質(zhì)是否具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
24.一種篩選編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的方法，包括將權(quán)利要求3的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸進行雜交；表達多聚核苷酸生產(chǎn)蛋白質(zhì)；以及檢測所述蛋白質(zhì)是否具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
25.一種篩選編碼具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的方法，包括將權(quán)利要求8的分離的多聚核苷酸與要篩選的多聚核苷酸進行雜交；表達多聚核苷酸生產(chǎn)蛋白質(zhì)；以及檢測所述蛋白質(zhì)是否具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
26.一種檢測具有與權(quán)利要求1的核苷酸至少70％同源性的核酸的方法，包括用含有權(quán)利要求1核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸或其互補鏈至少15個連續(xù)核苷酸的探針或引物接觸核酸樣品。
27.一種生產(chǎn)具有與權(quán)利要求1的核苷酸至少70％同源性的核酸的方法，包括用含有權(quán)利要求1核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸或其互補鏈的至少15個連續(xù)核苷酸的探針接觸核酸樣品。
28.一種檢測權(quán)利要求3的核苷酸的方法，包括用含有權(quán)利要求3核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸或其互補鏈的至少15個連續(xù)核苷酸的探針或引物接觸核酸樣品。
29.一種生產(chǎn)權(quán)利要求3的核苷酸的方法，包括用含有權(quán)利要求3核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸或其互補鏈的至少15個連續(xù)核苷酸的探針接觸核酸樣品。
30.一種制造ICE1蛋白質(zhì)的方法，包括將權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞在適合于ICE1表達的條件下培養(yǎng)一定時間，并收集ICE1蛋白質(zhì)。
31.一種制造ICE1的方法，包括將權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞在適合于ICE1表的的條件下培養(yǎng)一定時間，并收集ICE1蛋白質(zhì)。
32.一種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將權(quán)利要求1的多聚核苷酸引入植物。
33.一種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將權(quán)利要求1的多聚核苷酸引入植物。
34.一種增強所需植物冷適應(yīng)力的方法，包括將權(quán)利要求1的多聚核苷酸引入到所述植物里。
35.一種增強所需植物冷適應(yīng)力的方法，包括將權(quán)利要求3的多聚核苷酸引入到所述植物里。
36.一種增強所需植物冷適應(yīng)力的方法，包括增強ice1基因在所述植物中的表達。
37.一個分離的多肽，含有序列SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
38.如權(quán)利要求37所述的分離的多肽，具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
39.一個分離的多肽，其與權(quán)利要求37的分離的多肽至少70％相同，并且具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
40.一個分離的多肽，其與權(quán)利要求37的分離的多肽至少80％相同，并且具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
41.一個分離的多肽，其與權(quán)利要求37的分離的多肽至少90％相同，并且具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
42.一個分離的多肽，其與權(quán)利要求37的分離的多肽至少95％相同，并且具有ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑活性。
43.一種增強植物冷適應(yīng)力的方法，包括ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑在植物中的過表達。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被具有序列SEQID NO1的核酸所編碼。
46.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被具有與序列SEQ ID NO1 70％相同的核酸編碼。
47.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被具有與序列SEQ ID NO1 90％相同的核酸編碼。
48.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被在嚴(yán)格的條件下與序列SEQ ID NO1互補鏈雜交的核酸所編碼，其中所述的嚴(yán)格的條件包括在5X SSC，溫度為55-68℃的條件下清洗。
49.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸的序列與序列SEQ ID NO2具有80％的同源性。
50.如權(quán)利要求43所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸的序列與序列SEQ ID NO2具有90％的同源性。
51.如權(quán)利要求43所述的方法，其中植物為擬南芥。
52.如權(quán)利要求43所述的方法，其中植物選自小麥，玉米，花生，棉花，燕麥和大豆。
53.如權(quán)利要求43所述的方法，其中植物有從CBF轉(zhuǎn)錄因子和DREB1轉(zhuǎn)錄因子中選擇的一個或多個轉(zhuǎn)錄因子的增加的表達。
54.如權(quán)利要求43所述的方法，其中植物有一個或多個冷反應(yīng)基因的增加的表達。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中冷反應(yīng)基因編碼一種蛋白質(zhì)，其選自參與碳水化合物呼吸的酶，參與碳水化合物代謝的酶，參與脂呼吸的酶，參與脂代謝的酶，參與苯丙素呼吸的酶，參與苯丙素代謝的酶，參與抗氧化物呼吸的酶，參與抗氧化物代謝的酶，分子陪伴蛋白質(zhì)，抗凍蛋白，以及參與由于冷凍引起的脫水耐受性的蛋白質(zhì)。
56.如權(quán)利要求43所述的方法，其中植物用一個編碼ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的載體轉(zhuǎn)化。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被序列SEQ IDNO1的核酸編碼。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被與序列SEQID NO1 70％相同的核酸編碼。
60.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被與序列SEQID NO1 90％相同的核酸編碼。
61.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被在嚴(yán)格的條件下與序列SEQ ID NO1的互補鏈進行雜交的核酸編碼，其中所述的嚴(yán)格的條件包括在5X SSC，溫度為55-68℃的條件下清洗。
62.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸序列與序列SEQ ID NO2有至少80％的同源性。
63.如權(quán)利要求56所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸序列與序列SEQ ID NO2有至少90％的同源性。
64.如權(quán)利要求56所述的方法，其中植物是擬南芥。
65.如權(quán)利要求56所述的方法，其中植物選自小麥，玉米，花生，棉花，燕麥和大豆。
66.如權(quán)利要求56所述的方法，其中植物有從CBF轉(zhuǎn)錄因子和DREB1轉(zhuǎn)錄因子中選擇的一個或多個轉(zhuǎn)錄因子的增加的表達。
67.如權(quán)利要求56所述的方法，其中植物有一個或多個冷反應(yīng)基因的增加的表達。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中冷反應(yīng)基因編碼一種蛋白質(zhì)，其選自參與碳水化合物的呼吸的酶，參與碳水化合物代謝的酶，參與脂呼吸的酶，參與脂代謝的酶，參與苯丙素呼吸的酶，參與苯丙素代謝的酶，參與抗氧化物呼吸的酶，參與抗氧化物代謝的酶，分子陪伴蛋白質(zhì)，抗凍蛋白，以及參與由于冷凍引起的脫水耐受性的蛋白質(zhì)。
69.一種增強植物中一個或多個冷反應(yīng)基因表達的方法，包括用一個編碼ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的載體轉(zhuǎn)化植物。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中植物具有增強了的冷適應(yīng)性。
71.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑具有氨基酸序列SEQ ID NO2。
72.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被序列SEQ IDNO1的核酸編碼。
73.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被與序列SEQID NO1 70％相同的核酸編碼。
74.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被與序列SEQID NO1 90％相同的核酸編碼。
75.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑被在嚴(yán)格的條件下與序列SEQ ID NO1的互補鏈進行雜交的核酸編碼，其中所述的嚴(yán)格的條件包括在5X SSC，溫度為55-68℃的條件下清洗。
76.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸序列與序列SEQ ID NO2至少有80％的同源性。
77.如權(quán)利要求69所述的方法，其中ICE1轉(zhuǎn)錄激活劑的氨基酸序列與序列SEQ ID NO2至少有90％的同源性。
78.如權(quán)利要求69所述的方法，其中植物是擬南芥。
79.如權(quán)利要求69所述的方法，其中植物選自小麥，玉米，花生，棉花，燕麥和大豆。
80.一個表達盒，包括在植物細(xì)胞中的功能性啟動子，可操作連于編碼序列SEQ ID NO2 ICE1蛋白質(zhì)的分離的核酸，其中植物細(xì)胞中增強的蛋白質(zhì)的表達增強了所述植物細(xì)胞的冷適應(yīng)力。
81.如權(quán)利要求80所述的表達盒，其中啟動子選自病毒外套蛋白質(zhì)啟動子、特定組織啟動子、單子葉植物啟動子、泛蛋白啟動子、壓力誘導(dǎo)啟動子、CaMV 35S啟動子、CaMV 19S啟動子、肌動蛋白啟動子、cab啟動子、蔗糖合成啟動子、微管蛋白啟動子、napin R基因復(fù)合體啟動子、西紅柿E8啟動子、patatin啟動子、甘露氨酸合成酶啟動子、大豆種子蛋白大豆球蛋白啟動子、大豆?fàn)I養(yǎng)貯存蛋白質(zhì)啟動子、噬菌體SP6啟動子、噬菌體T3啟動子、噬菌體T7啟動子、Ptac啟動子、根細(xì)胞啟動子、ABA-誘導(dǎo)以及細(xì)胞膨脹—誘導(dǎo)啟動子。
全文摘要
本發(fā)明提供用來改進植物冷適應(yīng)力的方法和組合物。更確切地說，本發(fā)明利用ICE1在植物和植物細(xì)胞中的過表達。
文檔編號C07K14/415GK1649483SQ03809834
公開日2005年8月3日 申請日期2003年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者朱健康, 維斯瓦納坦·欽努撒麥, 太田賢, 西達爾塔·坎雷爾, 李炳賀, 馬努·阿加瓦爾 申請人:美國亞利桑那大學(xué)董事會