專利名稱：內(nèi)在化抗－cd74抗體和使用方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人源化、嵌合和人抗-CD74抗體或其片段或包含至少一種抗-CD74抗體，尤其是單克隆抗體(mAb)的抗體融合蛋白，人源化、嵌合和人抗-CD74 mAb或其片段的治療性和診斷性綴合物，和使用這些人源化、嵌合和人抗-CD74 mAb或其片段來治療和診斷B細(xì)胞淋巴瘤和白血病，除淋巴瘤和白血病以外的其中細(xì)胞是CD74抗原陽性的惡性腫瘤和多種自身免疫病和免疫失調(diào)病的方法。本發(fā)明涉及多價和/或多特異性抗-CD74 mAb或其片段，其包含抗-CD74 mAb或其片段的至少一個臂和針對毒性物質(zhì)，如病原生物體，如癌細(xì)胞、寄生蟲或感染因子的多特異性mAb的至少一個臂。本發(fā)明還涉及與抗原肽綴合的抗-CD74 mAb或其片段。所述人源化、嵌合和人抗-CD74 mAb，其片段，及其綴合物可單獨(dú)或作為多元治療方案的部分進(jìn)行施用。本發(fā)明涉及編碼人源化、嵌合和人抗-CD74抗體，和多價和/或多特異性抗-CD74mAb及其片段，及其治療性，診斷性和抗原性綴合物的DNA序列，包含所述DNA序列的載體和宿主細(xì)胞，和制備人源化、嵌合和人抗-CD74抗體的方法。
2.發(fā)明背景免疫療法的一個主要目標(biāo)是固定防御腫瘤細(xì)胞或感染性生物體的患者免疫系統(tǒng)。關(guān)于癌癥治療，該目標(biāo)涉及防御腫瘤細(xì)胞的患者免疫系統(tǒng)。非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多發(fā)性骨髓瘤和慢性和急性淋巴細(xì)胞性白血病是仍為癌癥死亡重要原因的B細(xì)胞惡性腫瘤。這些惡性腫瘤對多種治療的應(yīng)答是混合性的。
誘導(dǎo)T-淋巴細(xì)胞應(yīng)答是個體的免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵初始步驟。T細(xì)胞活化導(dǎo)致T細(xì)胞增殖，T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和T細(xì)胞-介導(dǎo)的效應(yīng)子作用的產(chǎn)生。T細(xì)胞活化需要通常被稱為初級活化信號的抗原-特異性信號，該信號由存在于T細(xì)胞表面的同源分布的T細(xì)胞受體(TcR)的刺激生成。該抗原-特異性信號通常的形式是與抗原呈遞細(xì)胞(APC)的表面上呈遞的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類蛋白質(zhì)或MHC II類蛋白質(zhì)結(jié)合的抗原肽。人類的MHC分子被稱為HLA(人白細(xì)胞抗原)分子。
發(fā)現(xiàn)II類分子存在于有限數(shù)量的細(xì)胞類型，主要是B細(xì)胞，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上，在大多數(shù)情況下，其呈遞源自來自細(xì)胞外環(huán)境的蛋白的肽。MHC II類位于與細(xì)胞外環(huán)境交通的細(xì)胞區(qū)室中。在人中，MHC-II分子包含HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP分子，其存在于多種遺傳編碼的等位基因上。因此，例如，來自細(xì)胞外環(huán)境的細(xì)菌抗原可被攝取和被抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)處理后呈遞在其細(xì)胞表面上。CD4+T細(xì)胞識別與II類分子相關(guān)的肽。
與放射性核素或其它細(xì)胞毒害劑綴合的靶向性單克隆抗體的使用提供了將所述藥劑直接遞送至腫瘤位點(diǎn)的可能性，從而限制了正常組織暴露于毒性藥劑(Goldenberg，Semin.Nucl.Med.，19332(1989))。近年來，基于抗體的治療的潛能及其在腫瘤相關(guān)抗原定位中的準(zhǔn)確度已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室和臨床研究中得到證實(shí)(例如，參見Thorpe，TIBTECH，1142(1993)；Goldenberg，Scientific American，Science & Medicine，164(1994)；Baldwin等U.S.4,925,922和4,916,213；Young，U.S.4918163；U.S.5,204,095；Irie等U.S.5,196,337；Hellstrom等U.S.5,134,075和5,171,665)。一般而言，抗腫瘤相關(guān)標(biāo)記物的放射標(biāo)記的抗體或抗體片段在腫瘤定位中的應(yīng)用要比治療更成功，部分因?yàn)槟[瘤對抗體的攝取通常低，僅為總注射劑量的0.01％～0.001％(Vaugban等Brit.J.Radio.，60567(1987))。增加放射性標(biāo)記物的濃度來增加對腫瘤的劑量通常起反作用，因?yàn)槠湟苍黾恿私】到M織對放射能的暴露量。
鼠LL1(mLL1或鼠抗-CD74抗體)是與CD74，II類HLA樣抗原，即，B-淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和組織細(xì)胞，人B-淋巴瘤細(xì)胞系，黑素瘤，T細(xì)胞淋巴瘤和多種其它腫瘤細(xì)胞類型表面上的不變鏈(Ii決定子)發(fā)生反應(yīng)的特異性單克隆抗體(mAb)(Hansen等Biochem.J.320293(1996))。結(jié)合于細(xì)胞表面的LL1被溶酶體區(qū)室快速內(nèi)在化然后被快速地分解，速度要遠(yuǎn)快于其它mAb，如抗-CD19和抗-CD22。同前。LL1的該固有特性克服了免疫治療的某些前述困難。
鼠LL1由小鼠骨髓瘤細(xì)胞和來自用源自Raji B-淋巴瘤細(xì)胞系的制劑(在Pawlak-Byczkowska等Can.Res.，494568(1989)中稱為EPB-1)免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞融合發(fā)展而來。mLL1的臨床應(yīng)用，如同大多數(shù)其它確信的鼠抗體一樣，由于人抗-小鼠抗體(HAMA)響應(yīng)在人中的發(fā)展而受到局限。在注射了mLL1 Fab′后，通常不能檢測到HAMA響應(yīng)，如通過利用99MTC標(biāo)記的mLL1 Fab′骨髓成像研究所示。Juweid等Nuc.Med Comm.18142-148(1997)。然而，在某些治療性和診斷性用途中，可優(yōu)選全長抗-CD74 mAb。該全長抗-CD74mAb的用途可限制所述抗體和抗體綴合物的診斷和治療有效性，不僅僅是因?yàn)闈撛诘闹逻^敏問題，還可能是因?yàn)槠渥鳛檠h(huán)綴合物的主要部分可與循環(huán)抗-小鼠抗體復(fù)合并被隔離。
雖然mLL1的抗體片段的應(yīng)用可以繞過免疫原性問題，仍存在更需要完整IgG和誘導(dǎo)用于治療的細(xì)胞免疫或增強(qiáng)的抗體存活時間的情況。一般而言，HAMA響應(yīng)是對鼠抗-CD74 mAb的全部診斷和治療潛能認(rèn)識的障礙。因此，嵌合、人源化和人抗-CD74 mAb及其片段，其抗體融合蛋白及其片段，免疫綴合物用于治療和診斷的發(fā)展，多價和/或多特異性mAb，及其片段及其疫苗綴合物將在降低人抗-小鼠抗體制備的情況下非常適用于治療和診斷。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可被快速內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞的抗-CD74抗體及其片段及其抗體融合蛋白，尤其是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
本發(fā)明還涉及包含彼此融合和/或與本發(fā)明的其它抗體及其片段融合的抗體或其片段的抗-CD74抗體融合蛋白。
本發(fā)明還涉及包含連接于診斷劑或治療劑上的本發(fā)明的抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段的免疫綴合物。
本發(fā)明還涉及包含抗體綴合物的疫苗，所述抗體綴合物含有連接于抗原肽的本發(fā)明的抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段。
本發(fā)明還涉及雙特異性或多特異性抗體，其包含抗體綴合物，所述綴合物包含連接于特異性針對癌標(biāo)記物、感染性疾病生物體上的表位或血液或其它體液中毒性物質(zhì)的抗體或抗體片段的本發(fā)明的抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的CD74抗體及其片段或其抗體融合蛋白及其綴合物治療和診斷疾病的方法。
本發(fā)明還涉及編碼CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段，免疫綴合物和抗體綴合物及其多特異性抗體的DNA序列，包含該DNA序列的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，和表達(dá)本發(fā)明的這些CD74抗體的方法。
附圖簡介

圖1顯示了鼠LL1重和輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖1A顯示了由RT-PCR獲得的LL1VH的DNA和氨基酸序列。圖1B顯示了由5′-RACE獲得的LL1Vk的DNA和氨基酸序列。由相應(yīng)DNA序列編碼的氨基酸序列以核苷酸序列下的單字母代碼表示。核苷酸序列的編號位于右側(cè)。CDR區(qū)中的氨基酸殘基以粗體和下劃線顯示。將Kabat′s Ig分子編號法用于氨基酸殘基，如氨基酸殘基頂部的編號所示。用特定數(shù)字后跟字母進(jìn)行編號的殘基表示用Kabat編碼方案確定的插入殘基。用字母進(jìn)行編號的插入殘基具有相同的在前數(shù)字。例如，將圖1A中的殘基82A，82B和82C表示為82A，B和C。
圖2顯示了在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的嵌合LL1(cLL1)重和輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖2A顯示了cLL1VH的DNA和氨基酸序列。圖2B顯示了cLL1Vk的雙鏈DNA和氨基酸序列。由相應(yīng)DNA序列編碼的氨基酸序列以單字母代碼表示。CDR區(qū)中的氨基酸殘基以粗體和下劃線顯示。核苷酸和氨基酸的編號與圖1中相同。將用于構(gòu)建cLL1的限制性位點(diǎn)用方框標(biāo)出顯示。
圖3顯示了人抗體，cLL1和hLL1的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比對。圖3A顯示了人抗體RF-TS3，cLL1和hLL1的VH氨基酸序列比對而圖3B顯示了人抗體HF-21/28，cLL1和hLL1的Vk氨基酸序列比對。圓點(diǎn)表示cLL1中與人抗體中相應(yīng)殘基相同的殘基?？騾^(qū)代表CDR區(qū)。cLL1的N-和C-末端殘基(下劃線)用所使用的staging載體固定而無法與人抗體進(jìn)行比較。使用如圖1的Kabat′s Ig分子編號方案。
圖4顯示了在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)的人源化LL1(hLL1)重和輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖4A顯示了hLL1VH的DNA和氨基酸序列而圖4B顯示了hLL1Vk的DNA和氨基酸序列。由相應(yīng)DNA序列編碼的氨基酸序列以單字母代碼表示。CDR區(qū)中的氨基酸殘基以粗體和下劃線顯示。將如圖。1A和圖。1B的Kabat′s Ig分子編號方法用于氨基酸殘基。
圖5顯示了構(gòu)建hLL1VH基因的示意圖。用作模板和引物的寡核苷酸以箭頭線表示。箭頭表示3′-末端。有義DNA鏈(模板，引物和PCR產(chǎn)物)用實(shí)線表示而反義鏈用虛線表示。Vk基因以相似的方法構(gòu)建。
圖6顯示了競爭性細(xì)胞表面結(jié)合測試法比較cLL1和鼠LL1的結(jié)合親和力的結(jié)果。將變化濃度的cLL1(三角形)或mLL1(菱形)與恒量的125I標(biāo)記的mLL1混合，然后和Raji細(xì)胞在40℃孵育1小時。在洗滌后計(jì)數(shù)結(jié)合于細(xì)胞表面的放射性標(biāo)記的mLL1。cLL1和鼠LL1對放射性標(biāo)記的LL1與Raji細(xì)胞的結(jié)合的競爭完全相同，證實(shí)了克隆的V基因是可信的。
圖7顯示了在Raji細(xì)胞膜包被的微孔中比較cLL1和hLL1的結(jié)合親和力的競爭性結(jié)合檢測法的結(jié)果。將變化濃度的hLL1(三角形)或cLL1(菱形)與恒量的HRP綴合的LL1混合，然后在用Raji細(xì)胞膜提取物包被的96孔微量滴定板中于室溫孵育1小時。檢測膜結(jié)合的HRP-LL1。hLL1和cLL1對HRP-LL1綴合的競爭完全相同，顯示出mAbLL1的特異性和親和力在人源化LL1中得以保存。
圖8顯示了與Raji細(xì)胞表面結(jié)合的125I-標(biāo)記的hLL1和mLL1的結(jié)局。將放射性標(biāo)記的hLL1(帶有標(biāo)記的實(shí)線)或mLL1(帶有標(biāo)記的虛線)與Raji細(xì)胞一起孵育然后通過洗滌除去未結(jié)合的Ab。然后正常培養(yǎng)細(xì)胞并在所示時間點(diǎn)檢測與細(xì)胞相關(guān)的(菱形線)，在培養(yǎng)基中的分泌的(三角線)或降解的(圓形線)放射性標(biāo)記的Abs。圖8A顯示了結(jié)合的Ab在3日后的結(jié)局。圖8B顯示了在早期時間點(diǎn)(少于3小時)hLL1加工研究的結(jié)果。將兩個實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均。
圖9顯示了交聯(lián)的LL1Abs對Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。將5×105Raji細(xì)胞在0日接種于包含(如圖頂部所示)5μg/ml mLL1，cLL1或hLL1，或無任何Ab(Nil)，含有50μg/ml α-mFc或α-hFc Ab，或無任何交聯(lián)劑(Nil)的1ml培養(yǎng)基中，如圖右側(cè)所示。全部和存活細(xì)胞的數(shù)量以每日一次計(jì)數(shù)3日。計(jì)算存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(正方形)和存活細(xì)胞占在時間點(diǎn)0的存活細(xì)胞的比例(菱形)并以培養(yǎng)時間繪圖。
圖10顯示了交聯(lián)的hLL1對Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。將5×105Daudi細(xì)胞在0日接種于包含(如頂部圖所示)5μg/ml hLL1或hLL2(抗-CD22，內(nèi)在化Ab)，或無任何Ab(Nil)，含有50μg/mlα-hFcAb，或無(Nil)的1ml培養(yǎng)基中，如圖右側(cè)所示。全部和存活細(xì)胞的數(shù)量以每日一次計(jì)數(shù)3日。計(jì)算存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(正方形)和存活細(xì)胞占在時間點(diǎn)0的存活細(xì)胞的比例(菱形)并以培養(yǎng)時間繪圖。
發(fā)明詳述除非另有特指，術(shù)語“a”或“an”是指“一個或多個”。
1.概述本發(fā)明提供了單獨(dú)、作為綴合物或與其它治療劑(包括其它作為多元治療法部分的裸抗體和抗體治療性綴合物)聯(lián)合用于治療哺乳動物個體(人和家畜)的人源化、嵌合和人抗-CD74 mAb，其片段，抗體融合蛋白，及其治療性和診斷性綴合物。還公開了治療和診斷B細(xì)胞惡性腫瘤，其它CD74陽性惡性腫瘤和自身免疫性疾病的方法。
2.定義在下面描述中，使用了多個術(shù)語，提供如下定義以便于理解本發(fā)明。
如本說明書所述，抗體是指全長(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性結(jié)合)部分，如抗體片段。
抗體片段是抗體的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等。不考慮結(jié)構(gòu)，抗體片段與由完全抗體識別的相同抗原結(jié)合。例如，抗-CD74單克隆抗體片段與CD74的表位結(jié)合。術(shù)語“抗體片段”還包括任何一種合成的或基因工程改造的蛋白，該蛋白通過與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合物而象抗體一樣發(fā)揮作用。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離片段，如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段，其中的輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽聯(lián)結(jié)子(“scFv蛋白”)連接的重組單鏈多肽分子，和由模擬高可變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單位。
裸抗體通常是一種不與治療劑綴合的完全抗體。這樣是因?yàn)榭贵w分子的Fc部分提供了效應(yīng)子作用，如補(bǔ)體結(jié)合和ADCC(依賴抗體的細(xì)胞毒性)，其啟動可導(dǎo)致細(xì)胞裂解的機(jī)制。然而，F(xiàn)c部分可能不是治療作用所需要的，而其它機(jī)制，如凋亡開始活動。裸抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，以及某些重組抗體，如嵌合抗體，人源化抗體或人抗體。
嵌合抗體是一種重組蛋白，其含有來源于一種物種的抗體優(yōu)選是嚙齒動物抗體的包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的可變域，而抗體分子的恒定域則來源于人抗體。為了獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，嵌合抗體的恒定區(qū)可來源于其它物種，如貓或犬。
人源化抗體是重組蛋白，其中將來源一個物種的抗體，例如，嚙齒動物抗體的CDR從嚙齒動物抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移至人的重鏈可變域和輕鏈可變域。該抗體分子的恒定域來源于人抗體。
人抗體是獲自已被“工程處理”以響應(yīng)抗原性激發(fā)而產(chǎn)生特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體。在該方法中，將人重和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入源自包含內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的靶向斷裂的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中。該轉(zhuǎn)基因小鼠能合成特異性針對人抗原的人抗體，該小鼠可用于制備分泌人抗體的雜交瘤。Green等Nature Genet.713(1994)，Lonberg等Nature 368856(1994)和Taylor等Int.Immun.6579(1994)描述了從轉(zhuǎn)基因鼠中獲得人抗體的方法。完全人抗體還可以用基因或染色體轉(zhuǎn)染法，以及噬菌體展示技術(shù)(phagedisplay technology)進(jìn)行構(gòu)建，所有這些方法均為本領(lǐng)域已知的。例如，參見McCafferty等Nature 348552-553(1990)從來自未免疫的供者的免疫球蛋白可變區(qū)基因庫中于體外制備人抗體及其片段。在該方法中，將抗體可變區(qū)基因的框架內(nèi)克隆至絲狀噬菌體的主要或次要外膜蛋白質(zhì)基因，并被顯示為噬菌體微粒表面上的功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀微粒包含噬菌體基因組的單股DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇還會導(dǎo)致選擇編碼表現(xiàn)出這些特性的抗體的基因。在該方法中，噬菌體模擬了B細(xì)胞的某些特性?？梢远喾N形式實(shí)施噬菌體展示，對其的綜述，可參見例如Johnson和Chiswell，Current Opinionin Structural Biology 35564-571(1993)。
還可以用體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體。參見美國專利5,567,610和5,229,275，將其全文引入作為參考。
治療劑是與抗體部分分開、同時或順序施用的或綴合于抗體部分，即抗體或抗體片段或亞片段，并可用于疾病治療中的分子或原子。治療劑的實(shí)例包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、螯合劑、硼化合物、光活化劑或染料和放射性同位素。
診斷劑是一種可與抗體部分即，抗體或抗體片段或亞片段結(jié)合施用，且可通過定位包含抗原的細(xì)胞而用于疾病診斷中的分子或原子。可用的診斷劑的包括，但不限于，放射性同位素、染料(如含有生物素-鏈親和素復(fù)合體)，造影劑，熒光化合物或用于磁共振成像(MRI)的分子和增強(qiáng)劑(例如，順磁性離子)。美國專利6,331,175公開了MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體的制備，將其全文引入作為參考。優(yōu)選地，診斷劑選自放射性同位素，用于磁共振成像的增強(qiáng)劑和熒光化合物。為了用放射性金屬或顧磁性離子加載抗體成分，或許必需將其與具有附有用于結(jié)合所述離子的多種螯合基團(tuán)的長尾的試劑進(jìn)行反應(yīng)。所述尾可以是聚合物如聚賴氨酸，多糖或其它具有懸吊基團(tuán)的衍生的或可衍生的鏈，所述懸吊基團(tuán)可結(jié)合于螯合基團(tuán)，例如乙二胺四醋酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉，聚胺，冠醚，二-縮氨基硫脲，泊咯沙姆(polyoxime)和已知可用于該目的類似基團(tuán)。利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法將螯合劑與肽抗原偶聯(lián)。螯合劑通常經(jīng)由能形成與所述分子的鍵，且具有免疫反應(yīng)性最少丟失和最大聚合和/或內(nèi)部交聯(lián)的基團(tuán)與抗體相連。Hawthorne的美國專利4,824,659(名為“Antibody Conjuates”，1989年4月25日公布)描述了用于將螯合劑與抗體結(jié)合的其它，更不常見的，方法和試劑，將所述專利的公開內(nèi)容全文引入此處作為參考。特別適用的金屬螯合劑組合包括與一般能量為60～4,000keV的診斷性同位素，如125I，131I，123I，124I，62Cu，64Cu，18F，111In，67Ga，68Ga，99mTc，94mTc，11C，13N，15O，76Br一起用于放射成像的2-芐基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物。當(dāng)與本發(fā)明的抗體一起使用時，相同的螯合劑，當(dāng)與非放射性金屬如錳，鐵和釓復(fù)合時適用于MRI。大環(huán)螯合劑如NOTA，DOTA和TETA適用于多種金屬和放射性金屬，最特別地是分別適于鎵，釓和銅的放射性核素?？赏ㄟ^按選取的金屬定制環(huán)的大小從而制備非常穩(wěn)定的所述金屬螯合復(fù)合物。本發(fā)明還包括適于穩(wěn)定結(jié)合核素，如用于RAIT的223RA的其它環(huán)型螯合螯合劑如大環(huán)聚醚。
免疫綴合物是抗體成分與治療劑或診斷劑的綴合物。診斷劑可包括放射性或非放射性的標(biāo)記物、造影劑(如用于磁共振成像，計(jì)算機(jī)控制斷層掃描術(shù)或超聲)，而放射性標(biāo)記物可以是發(fā)射γ，β，α，俄歇電子或正電子的同位素。
表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通常，將基因表達(dá)置于包括組成型或可誘導(dǎo)的啟動子，組織-特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子的特定調(diào)節(jié)元件的調(diào)控之下。所述基因被稱為“操作性連接于”調(diào)節(jié)元件。
重組宿主可以是任何含有克隆載體或表達(dá)載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語還包括那些原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動物，其已被實(shí)施了基因工程操作以便宿主細(xì)胞的染色體或基因組中包含克隆的基因。適用的哺乳動物宿主細(xì)胞包括骨髓瘤細(xì)胞，如SP2/0細(xì)胞和NSO細(xì)胞，以及中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞系及其它可用于表達(dá)抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞。人細(xì)胞系，PER.C6同樣特別適用于表達(dá)mAb及其它融合蛋白，該細(xì)胞系公開于WO0063403A2中，其與常規(guī)哺乳動物細(xì)胞系，如CHO、COS、Vero、Hela、BHK和SP2-細(xì)胞系相比可制備高于2～200倍的重組蛋白質(zhì)。具有修飾的免疫系統(tǒng)的特定轉(zhuǎn)基因動物尤其適用于制備完全人抗體。
如本說明書所使用的，術(shù)語抗體融合蛋白是重組制備的抗原-結(jié)合分子，其中兩個或多個具有相同或不同特異性的相同或不同的單鏈抗體或抗體片段相連接。融合蛋白的效價顯示了抗體融合蛋白具有多少針對單個抗原或表位的結(jié)合臂或位點(diǎn)；即，單價、二價、三價或多價。抗體融合蛋白的多效價是指其能利用與抗原的結(jié)合中的多重相互作用，由此增加了結(jié)合抗原的親和力。特異性顯示了一個抗體融合蛋白能夠結(jié)合多少抗原或表位；即，單特異性，雙特異性，三特異性，多特異性。使用這些定義，天然抗體，例如，IgG，是二價的，因?yàn)槠渚哂袃蓚€結(jié)合臂，但其是單特異性的，因?yàn)槠渑c一個表位結(jié)合。單特異性，多價融合蛋白具有針對表位的超過一個的結(jié)合位點(diǎn)但僅結(jié)合一個表位，例如具有兩個可與相同抗原反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體。抗體融合蛋白可包含單個抗體成分，不同抗體成分或相同抗體成分的多個拷貝的多價或多特異性的組合?？贵w融合蛋白還可包含抗體或抗體片段和治療劑。適用于所述融合蛋白的治療劑的實(shí)例包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑抗體融合蛋白”)和毒素(“抗體-毒素抗體融合蛋白”)。一種優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNase)，優(yōu)選為重組RNase。
多特異性抗體是能同時與至少兩個具有不同結(jié)構(gòu)的靶位，例如，兩個不同的抗原，相同抗原上的兩個不同的表位，或半抗原和/或抗原或表位結(jié)合的抗體。一個特異性應(yīng)針對B細(xì)胞，T細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位。另一個特異性可是針對相同細(xì)胞類型上的不同抗原，如B-細(xì)胞上的CD20，CD19，CD21，CD23，CD46，CD80，HLA-DR，CD74和CD22。多特異性，多價的抗體的結(jié)構(gòu)具有多于一個結(jié)合位點(diǎn)，且所述結(jié)合位點(diǎn)具有不同特異性。例如，雙特異性抗體，其一個結(jié)合位點(diǎn)與一種抗原反應(yīng)而另一結(jié)合位點(diǎn)與另一抗原反應(yīng)。
雙特異性抗體是同時結(jié)合兩個具有不同結(jié)構(gòu)的靶位的抗體。雙特異性抗體(bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)具有至少一個特異性結(jié)合，例如B細(xì)胞，T細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞細(xì)胞抗原或表位的臂和至少另一個特異性結(jié)合可靶向的攜帶有治療劑或診斷劑的綴合物的臂。利用分子工程操作可制備多種雙特異性融合蛋白。一種形式中，雙特異性抗體融合蛋白是單價的，包含，例如具有針對一種抗原的單個結(jié)合位點(diǎn)的scFv和具有針對第二種抗原的單個結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段。在另一形式中，雙特異性抗體融合蛋白是二價的，包含，例如具有針對一種抗原的結(jié)合位點(diǎn)的IgG和具有針對第二種抗原的兩個結(jié)合位點(diǎn)的兩個scFv。
犬源化(caninized)或貓?jiān)椿?felinized)抗體是其中已將嚙齒動物(或另一物種)的單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)從嚙齒動物(或另一物種)免疫球蛋白的重和輕可變鏈分別轉(zhuǎn)移至犬或貓的免疫球蛋白可變區(qū)的重組蛋白質(zhì)。
家畜包括大型動物如馬，牛，綿羊，山羊，駱駝，羊駝和豬，以及寵物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，家畜是馬。
寵物包括作為寵物的動物。其主要是犬和貓，而小型嚙齒動物，如豚鼠，倉鼠，大鼠和白鼬也是被包括的，如低于人的靈長類動物如猴。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寵物是犬或貓。
3.包括嵌合、人源化和人抗體在內(nèi)的單克隆抗體的制備單克隆抗體(MAb)是針對特定抗原的均一類型的抗體且該抗體僅包括一種類型的抗原結(jié)合位點(diǎn)并僅與一種抗原性決定位點(diǎn)上的表位結(jié)合。針對特異性抗原的嚙齒動物單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得。例如，參見Kohler和Milstein，Nature 256495(1975)，和Coligan等(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，VOL.1，2.5.1-2.6.7頁(John Wiley & Sons 1991)[在下文中“Coligan”]。簡言之，單克隆抗體的制備可以通過用包含抗原的組合物注射小鼠，通過取血清樣品鑒定抗體產(chǎn)生的存在，取脾獲得B-淋巴細(xì)胞，融合B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞來制備雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)該產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的克隆，和從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。
可采用多種已良好建立的方法從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化MAb。所述分離方法包括使用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析，大小排阻層析和離子交換層析。例如，參見Coligan 2.7.1-2.7.12頁和2.9.1-2.9.3頁。同樣，參見Baines等，“Purification ofImmunoglobulin G(IgG)”METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，VOL.10，79-104頁(The Humana Press，Inc.1992)。
在針對免疫原的抗體初始生成后，可對抗體進(jìn)行測序并隨后用重組技術(shù)進(jìn)行制備。鼠抗體和抗體片段的人源化和嵌合化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)通過從小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移至人可變區(qū)中，然后用鼠相對物置換構(gòu)架區(qū)中的人類殘基從而制備人源化單克隆抗體。源自人源化單克隆抗體的抗體成分的應(yīng)用避免了與鼠恒定區(qū)免疫原性相關(guān)的潛在問題。
克隆鼠免疫球蛋白可變區(qū)的一般方法描述于，例如Orlandi等Proc.NAT’L Acad.SCI USA 863833(1989)中，將其全文引入作為參考。構(gòu)建嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，Leung等，Hybridoma 13469(1994)描述了他們?nèi)绾瓮ㄟ^將編碼LL2單克隆抗體，一種抗-CD22抗體的Vκ和VH區(qū)的DNA序列，分別與人K和IgG1恒定區(qū)重組而制備LL2嵌合體。該出版物還提供了LL2輕鏈和重鏈可變區(qū)，Vκ和VH，各自的核苷酸序列。制備人源化MAb的方法描述于，例如Jones等，Nature 321522(1986)，Riechmann等，Nature332323(1988)，Verhoeyen等，Science 2391534(1988)，Carter等，Proc.NAT’L Acad.SCI USA 894285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12437(1992)，和Singer等J.Immun.1502844(1993)，由此將上述每一文件均引入作為參考。
為了該目的，本發(fā)明描述了可與CD74抗原結(jié)合并能用于診斷和治療方法的嵌合、人源化和人抗體及其片段。人源化抗體和抗體片段描述于名為“抗-CD20抗體和其融合蛋白及使用方法”的，代理人卷號18733/1073的美國臨時申請，美國臨時申請?zhí)?0/356,132，美國臨時申請60/416,232和代理人卷號18733/1155中；hMN-14抗體，如公開于美國申請?zhí)?5,874,540中的那些抗體，其是III類抗-癌胚抗原抗體(抗-CEA抗體)；Mu-9抗體，如公開于美國申請?zhí)?10/116,116中的那些抗體；AFP抗體，如公開于美國臨時申請60/399,707的那些抗體；PAM4抗體，如公開于名為“單克隆抗體”的美國臨時申請，代理人卷號18733/1102中的那些抗體；RS7抗體，如公開于美國臨時申請60/360,229中的那些抗體；和CD22抗體，如公開于美國專利5,789,554和6,187,287和美國申請09/741,843和09/988,013中的那些抗體，上述全部文件均全文引入此處作為參考。
嵌合抗體是含有包括源自一種動物物種，如嚙齒動物抗體的CDR的可變區(qū)，而抗體分子的其余部分，即恒定區(qū)，源自人抗體的重組蛋白質(zhì)。因此，嵌合單克隆抗體還可通過用一個或多個不同的人FR置換嵌合mAb可變區(qū)中鼠FR的序列的方法進(jìn)行人源化。具體地，將小鼠CDR從小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移至人抗體的相應(yīng)的可變區(qū)。因?yàn)閷⑿∈驝DR簡單轉(zhuǎn)移至人FR通常會導(dǎo)致抗體親和力的降低甚至喪失，故可能需要額外的修飾以便恢復(fù)鼠抗體的原始親和力。這可通過將FR區(qū)中一個或多個某些人類殘基用其鼠相對物置換從而獲得具有對其表位良好結(jié)合親和力的抗體的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，參見Tempest等Biotechnology 9266(1991)和Verhoeyen等Science 2391534(1988)。此外，人源化，嵌合和人Mab針對特異性表位的親和力可通過CDR的誘變而得增加，從而較少劑量的抗體可產(chǎn)生與在謗變前較低親和力Mab的較高劑量相同的效果。例如，參見WO0029584A1。
制備本發(fā)明的抗體的另一種方法是通過在轉(zhuǎn)基因的牲畜的乳液中制備。例如，參見Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；美國專利5,827,690，將此二者文件全文引入作為參考。制備分別包含編碼配對免疫球蛋白重和輕鏈的DNA片段的兩個DNA構(gòu)建體。將該DNA片段克隆至包含優(yōu)選在哺乳動物上皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列的表達(dá)載體中。實(shí)例包括，但不限于，來自兔，母牛和綿羊的酪蛋白基因，母牛α-乳球蛋白基因，綿羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因的啟動子。優(yōu)選地，插入片段在其3′側(cè)與來自乳腺-特異性基因的同源基因組序列側(cè)接。其提供了聚腺苷酸位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定化序列。將表達(dá)盒共注射至受精的哺乳動物卵的前核中，然后將卵移植至磁性受體的子宮內(nèi)并使之孕育。出生后，用Southern分析篩選同時存在兩種轉(zhuǎn)基因的子代。為了呈現(xiàn)抗體，必需將重和輕鏈基因二者在相同細(xì)胞中同時表達(dá)。采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法分析來自轉(zhuǎn)基因雌性動物的乳液中抗體或抗體片段的存在和功能性?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從乳液中純化抗體。
本發(fā)明的完全人抗體，即，用于與人源化，嵌合或人抗-CD74抗體聯(lián)合治療的人抗-CD74 MAb或其它人抗體，如抗-CD22，抗-CD19，抗-CD23，抗-CD20或抗-CD21Mab，可獲自轉(zhuǎn)基因的非-人類的動物。例如，參見Mendez等Nature Genetics，15146-156(1997)；美國專利號5,633,425，其全文引入作為參考。例如，人抗體可從具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收。通過滅活內(nèi)源免疫球蛋白基因和導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座將該小鼠體液免疫系統(tǒng)人源化。人免疫球蛋白基因座非常復(fù)雜且包含大量的不連續(xù)區(qū)段，其總共幾乎占人基因組的0.2％。為確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生足夠抗體庫，必須將大部分人重鏈和輕鏈基因座導(dǎo)入小鼠基因組。這要用分步法來完成，開始要構(gòu)建含有以種系構(gòu)型的人重鏈輕鏈的免疫球蛋白基因座的酵母人工染色體(YAC)。因?yàn)槊總€插入物的大小大約是1Mb，故構(gòu)建YAC需要免疫球蛋白基因座重復(fù)片段的同源重組。將兩種YAC，一種含有重鏈基因座而一種含有輕鏈基因座，經(jīng)由含YAC-酵母球芽與小鼠胚胎干細(xì)胞的融合而分別導(dǎo)入小鼠。然后將胚胎干細(xì)胞克隆顯微注射至小鼠胚泡。根據(jù)經(jīng)由其種系傳輸YAC的能力篩選結(jié)果得到的嵌合雄性然后將其與鼠抗體產(chǎn)生缺陷的小鼠進(jìn)行繁殖。培養(yǎng)這兩個轉(zhuǎn)基因品系，一個含有人重鏈基因座而其它含有人輕鏈基因座，產(chǎn)生響應(yīng)免疫而生成人抗體的子代。
更為新近的制備雙特異性mAb的方法包括工程化重組mAb，其中含有附加半胱氨酸殘基從而使得其交聯(lián)比普通的免疫球蛋白同種型強(qiáng)。例如，參見FitzGerald等Protein Eng.10(10)1221-1225，1997.另一方法是連接兩個或多個不同單鏈抗體或抗體片段的具有所需雙特異性的工程化重組融合蛋白。例如，參見Coloma等NatureBiotech.15159-163，1997。利用分子工程操作可制備多種雙特異性融合蛋白。一種形式中，雙特異性抗體融合蛋白是單價的，包含，例如具有針對一種抗原的單個結(jié)合位點(diǎn)的scFv和具有針對第二種抗原的單個結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段。在另一形式中，雙特異性抗體融合蛋白是二價的，包含，例如具有針對一種抗原的兩個結(jié)合位點(diǎn)的IgG和具有針對第二種抗原的兩個結(jié)合位點(diǎn)的兩個scFv。
連接兩個或多個不同單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白用相似的方法制備的?？蓪⒅亟M方法用于制備多種融合蛋白。例如，可制備包含源自人源化單克隆抗-CD74抗體的Fab片段和源自鼠抗-diDTPA的scFv的融合蛋白。柔性連接子，如GGGS將scFv與抗-CD74抗體重鏈的恒定區(qū)相連?；蛘撸瑂cFv可與另一人源化抗體輕鏈的恒定區(qū)相連。重鏈Fd與scFv框架內(nèi)連接所需的適宜的連接子序列經(jīng)PCR反應(yīng)而導(dǎo)入Vλ和Vκ區(qū)。然后編碼scFv的DNA片段連接至包含編碼CH1區(qū)的DNA序列的staging載體。剪切結(jié)果得到的scFv-CH1構(gòu)建體然后連接至包含編碼抗-CD74抗體的VH區(qū)的DNA序列的載體。得到的載體可用于轉(zhuǎn)染適宜的宿主細(xì)胞，如用于表達(dá)雙特異性抗體融合蛋白的哺乳動物細(xì)胞。
4.抗體片段的制備識別特異性表位的抗體片段可通過已知方法生成?？贵w片段是抗體的抗原結(jié)合部，如F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，sFv等。其它抗體片段包括，但不限于可通過抗體分子的胃蛋白酶消化制備的F(ab)′2片段，和可通過將F(ab)′2片段的二硫鍵還原而產(chǎn)生的Fab′片段?；蛘撸蓸?gòu)建Fab′表達(dá)文庫(Huse等1989，Science，2461274-1281)以便快速和簡便的鑒定具有所需特異性的單克隆Fab′片段。本發(fā)明包括抗體和抗體片段。
單鏈Fv分子(scFv)包括VL區(qū)和VH區(qū)。VL和VH區(qū)聯(lián)合形成靶結(jié)合位點(diǎn)。這兩個區(qū)進(jìn)一步由肽連接子(L)共價連接。如果VL區(qū)是scFv分子的N-端部分則將scFv分子表示為VL-L-VH，或如果VH區(qū)是scFv分子的N-端部分則表示為VH-L-VL。用于制備scFv分子和設(shè)計(jì)適宜的肽連接子的方法描述于美國專利號4,704,692，美國專利號4,946,778，R.Raag和M.Whitlow，“SINGLE Chain FVS?！盕ASEBVol 973-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker，”Single Chainantibody Variable Regions，”TIBTECH，Vol 9132-137(1991)中。這些參考文件全文引入此處作為參考。
抗體片段可通過全長抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌或另一宿主中表達(dá)編碼所述片段的DNA而制備?？刹捎贸Ｒ?guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶裂解全長抗體而獲得抗體片段。例如，抗體片段可通過用胃蛋白酶酶法裂解抗體而提供表示為F(ab′)2的5S片段而制備。該片段還可用巰基還原劑，和可任選地用于由二硫鍵的裂解而產(chǎn)生的巰基的阻斷劑進(jìn)一步裂解，以產(chǎn)生3.5S Fab′單價片段?；蛘撸媚竟系鞍酌该阜呀庵苯由蓛蓚€單價Fab片段和Fc片段。這些方法描述于，例如，Goldenberg，美國專利號4,036,945和4,331,647和其中包括的參考文件，所有專利均全文引入此處作為參考。還可參見NISONOFF等Arch Biochem.Biophys.89230(1960)；Porter，Biochem.J 73119(1959)，Edelman等METHODS IN ENZYMOLOGYVOL.1，422頁中(Academic Press 1967)，和Coligan 2.8.1-′2.8.10和2.10.-2.10.4頁抗體片段的另一形式是編碼單個互補(bǔ)決定區(qū)的(CDR)的肽。CDR是抗體的可變區(qū)的片段，其在結(jié)構(gòu)上與抗體所結(jié)合表位互補(bǔ)且其比可變區(qū)的其它部分更可變。因此，CDR有時是指高可變區(qū)。可變區(qū)包括三個CDR。可通過構(gòu)建編碼所需要抗體的CDR的基因來獲得CDR肽。所述基因可通過，例如使用聚合酶鏈反應(yīng)以從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)來制備。例如，參見Larrick等方法A COMPANION TOMETYHODS IN ENZYMOLOGY 2106(1991)；Courtenay-Luck，”GeneticManipulation of單克隆抗體”，MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(eds.)，166-179頁中(Cambridge University Press 1995)；和Ward等“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”，MONOCLONALPRINCIPLES AND APPLICATION S，Birch等(eds.)，137-185頁中(Wiley-Liss，Inc.1995)。
其它剪切抗體的方法，如分離重鏈以便形成單價輕鏈-重鏈片段，片段的進(jìn)一步剪切，或其它酶，化學(xué)或遺傳技術(shù)也是可以使用的，只要片段能與被完整抗體識別的抗原結(jié)合。
5.抗-CD74抗體本發(fā)明的抗-CD74 mAb包含具有針對CD74抗原特異性的特異性鼠CDR。本發(fā)明的抗-CD74 mAb是人源化，嵌合或人mAb且其包含鼠抗-CD74 mAb，鼠LL1MAB的CDR的氨基酸。人源化抗-CD74單克隆抗體(mAb)或其片段包含鼠抗-CD74 mAb的輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，此外，人源化抗-CD74單克隆抗體或其片段包括所述人源化mAb的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb的重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。此外，人源化mAb基本保持導(dǎo)致這些mAb，其片段或mAb綴合物快速內(nèi)在化和分解的針對CD74的特異性，其中CD74即為MHC II類可變鏈，Ii，其在細(xì)胞，如B-淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和組織細(xì)胞，以及B細(xì)胞淋巴瘤和白血病，以及骨髓瘤細(xì)胞上呈遞的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明CD74抗體是包含含有鼠抗-CD74(mLL1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)的輕鏈和重鏈可變區(qū)的人源化抗-CD74單克隆抗體(mAb)或其片段，其中人源化mAb的輕鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，而其中人源化mAb的重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。重和輕鏈可變區(qū)的鼠CDR分別顯示于圖1A和1B中。輕鏈和重鏈可變區(qū)的人FR可通過取代至少一種從相應(yīng)的鼠mAb FR中取代的氨基酸進(jìn)行修飾而保持其對CD74的特異性。更具體地，與圖.3B的CLLIVk序列的鼠輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基2，3，4，46，87和100，和圖.3A的cLL1 VH序列的鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基5，37，38，46，68，91和93等同的來自鼠mAb的一個或多個特異性氨基酸可保持在人源化抗-CD74的人FR中以便保持特異性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將包含圖.4A的重鏈可變區(qū)和圖.4B的輕鏈可變區(qū)的人源化抗-CD74 mAb、人源化LL1(hLL1)或其片段用于本發(fā)明披露的方法中。更具體地，人源化抗-CD74 mAb或其片段包含人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)或其部分。此外，本文所描述的任何一種人源化抗-CD74 mAb或其片段的人源化抗-CD74 mAb或其片段可以是人源化IgG1。
雖然人源化抗-CD74 mAb是優(yōu)選的，本發(fā)明還包括嵌合抗-CD74(cCD74)mAb或其片段。在一個實(shí)施方案中，嵌合抗-CD74(cCD74)單克隆抗體、(mAb)或其片段包括鼠抗-CD74 mAb的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3。在另一實(shí)施方案中，嵌合抗-CD74單克隆抗體或其片段包括鼠抗-CD74mAb的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。在另一實(shí)施方案中，嵌合抗-CD74mAb包括含有鼠抗-CD74 mAb的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和鼠抗-CD74 mAb的構(gòu)架區(qū)(FR)的輕鏈和重鏈可變區(qū)和人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中嵌合mAb的輕鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，并且其中所述嵌合mAb的重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。優(yōu)選的嵌合抗-CD74 mAb或其片段包括圖.2A的重鏈可變區(qū)和圖.2B的輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明還包括人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其包含人抗-CD74 mAb輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3。此外，還包括人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其包含所述人mAb的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。更優(yōu)選地，本發(fā)明公開了包含人抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其中人抗-CD74 mAb輕鏈可變區(qū)的huCD74 CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，并且其中人mAb的重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74 mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
本發(fā)明的每個人、嵌合或人源化抗-CD74 mAb優(yōu)選是IgG1，其中恒定區(qū)優(yōu)選是人IgG1，但I(xiàn)gG1可分別指人IgGI、嵌合IgG1或人源化IgG1。特別地，人源化CD74 mAb，hLL1，含有來自人IgG1的恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)。優(yōu)選地，嵌合和人LL1 mAb均含有相同的恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)。然而，可進(jìn)行修飾以便用人IgG2a、IgG3或IgG4的人恒定區(qū)置換IgG1的恒定區(qū)。
本發(fā)明還涉及鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段，其包含鼠抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，此外，鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段，包含鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。更優(yōu)選地，鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段包含鼠抗-CD74(mLL1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和鼠抗-CD74抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)，其中所述鼠mAb的輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，及其中所述鼠mAb的重鏈可變區(qū)包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
本發(fā)明的每個人、嵌合、人源化或鼠抗-CD74 mAb或其片段均具有至少一種下述特性其與抗原，CD74特異性結(jié)合和反應(yīng)，其與CD-74的結(jié)合被特異性針對或與CD74反應(yīng)的抗體或其片段阻斷；其被培養(yǎng)物中的Raji淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)在化；和當(dāng)其與具有與鼠IgG1 mAb的Fc反應(yīng)性的山羊抗血清交聯(lián)時其誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中Raji細(xì)胞的凋亡。
人、嵌合或人源化抗-CD74 mAb的片段可以是片段，如是F(ab′)2、Fab、scFv、Fv或F(ab′)2、Fab、scFv或Fv的部分或全部輕鏈和重鏈的融合構(gòu)建體。重要的是所述片段要與CD74結(jié)合。
6.多特異性和多價的抗體用于聯(lián)合治療的抗-CD74抗體，以及其它具有不同特異性的抗體，如本文所述，還可制備為多特異性抗體(包含至少一個對CD74表位或抗原的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個對CD74上另一表位的或另一抗原的結(jié)合位點(diǎn))和多價的抗體(包含對相同表位或抗原的多個結(jié)合位點(diǎn))，或該抗體可同時具有多價的和多特異性。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體融合蛋白包括本文所述的人源化、嵌合、人或鼠抗-CD74mAb或其片段的四個或多個Fv，或Fab′。此外，另一優(yōu)選的抗體融合蛋白包含本文所述的人源化、嵌合、人或鼠抗-CD74 mAb或其片段的一個或多個Fv，或Fab′，和一個或多個來自另外抗體的Fv或Fab′，所述另外抗體特異性針對另一抗原，所述另一抗原具有對腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的特異性，所述腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物不是CD74抗原，由表達(dá)CD74的細(xì)胞表達(dá)，如，用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤的選自B細(xì)胞家族抗原，如CD19，CD20或CD22的腫瘤標(biāo)記物；以及導(dǎo)致其它類型惡性腫瘤其它CD74陽性細(xì)胞，如黑素瘤中的S100等。此外，腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物可以是選自HLA-DR，CD30，CD33，CD52 MUC1和TAC的非-B細(xì)胞家族抗原。
本發(fā)明還提供了雙特異性或多特異性抗體，其中本發(fā)明的抗-CD74mAbs或其片段或其抗體融合蛋白聯(lián)于特異性針對癌癥或炎性細(xì)胞標(biāo)記物、感染性疾病生物體表面上的表位或血液或其它體液中的有毒物質(zhì)的抗體或抗體片段。本發(fā)明的雙特異性和多特異性抗體特別適用于誘導(dǎo)多種毒性物質(zhì)清除的方法中，其中雙特異性抗體具有至少一種針對有毒物質(zhì)如病原生物體的特異性，和至少一種針對CD74(HLA II類非可變鏈(II)，如提交于1999年5月19日的，名為“Theraputic Usinga Bispecific antibody”的美國序列號09/314,135(其全文引入此處作為參考)所詳述的)的特異性。
本發(fā)明還提供了含有至少一個特異性結(jié)合靶定細(xì)胞標(biāo)記物的結(jié)合區(qū)和至少一種特異性結(jié)合可靶向的綴合物的其它結(jié)合區(qū)的雙特異性抗體或抗體片段。所述可靶向的綴合物包括包含或攜帶至少一個由雙特異性抗體或抗體片段至少一個結(jié)合區(qū)所識別的表位的載體部分。
可使用多種重組方法制備上述雙特異性抗體和抗體片段。
本發(fā)明中還涉及抗-CD74多價抗體。該多價的靶位結(jié)合蛋白質(zhì)通過聯(lián)合第一和第二個多肽進(jìn)行構(gòu)建。第一個多肽包括共價連于第一個免疫球蛋白-樣區(qū)，優(yōu)選是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的第一個單鏈Fv分子。第二個多肽包括共價連于第二個免疫球蛋白-樣區(qū)，優(yōu)選是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的第二個單鏈Fv分子。每個第一和第二個單鏈Fv分子形成靶位結(jié)合位點(diǎn)，而第一和第二個免疫球蛋白-樣區(qū)聯(lián)合而形成第三靶位結(jié)合位點(diǎn)。
具有VL-L-VH構(gòu)型，其中L是連接子的單鏈Fv分子，可與另一具有VL-L-VH構(gòu)型的單鏈Fv分子聯(lián)合以形成二價二聚物。在這種情況下，第一個scFv的VL區(qū)和第二個scFv分子的VH區(qū)聯(lián)合以形成一個靶位結(jié)合，而第一個scFv的VH區(qū)和第二個scFv分子的VL區(qū)聯(lián)合以形成其它靶位結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是CD74雙特異性，三特異性靶向蛋白質(zhì)，其包含非共價聯(lián)合從而形成三個結(jié)合位點(diǎn)的兩個異種肽鏈，其中兩個結(jié)合位點(diǎn)具有對一個靶位的親和力而第三個具有對可制備并連于載體而用作診斷劑和/或治療劑的半抗原的親和力。優(yōu)選地，結(jié)合蛋白質(zhì)含有兩個CD20結(jié)合位點(diǎn)和一個CD22結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性，三價靶向劑含有兩個不同的scFv，一個scFv包含兩個來自第一個經(jīng)由短連接子與另一抗體的VL區(qū)相連的抗體的VH區(qū)，而第二個scFv包含兩個來自第一個經(jīng)由短連接子與另一抗體的VH區(qū)相連的抗體的VL區(qū)。從VH和VL區(qū)制備多價的，多特異性試劑的方法提供了由在宿主生物體中的DNA質(zhì)粒合成的獨(dú)立鏈完全由VH區(qū)(VH-鏈)或完全由VL區(qū)(VL-鏈)以任何多價和多特異性的試劑可通過一個VH鏈和一個VL鏈的非共價聯(lián)合而制備的方式組成。例如，構(gòu)建三價，三特異性試劑，VH-鏈將由三個VH區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成，每個VH區(qū)來自具有不同特異性的抗體，由多種長度的肽連接子相連，而VL-鏈將由互補(bǔ)的VL區(qū)組成，由與用于VH鏈的相似的肽連接子相連。因?yàn)榭贵w的VH和VL區(qū)以反-平行模式聯(lián)合，本發(fā)明中的優(yōu)選方法含有以與VH鏈中的VH區(qū)相反順序排列的VL鏈中的VH區(qū)。
6.雙抗體，三抗體和四抗體本發(fā)明的抗-CD74抗體還可用于制備功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，也稱為雙抗體，且可使用重組方法在哺乳動物細(xì)胞中制備。例如，參見Mack等Proc.Natl.ACAD.SCI.，927021-7025，1995，引入的。例如，通過經(jīng)甘氨酸-絲氨酸連接子連接兩個單鏈Fv片段利用重組方法制備bscAb。利用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法分離兩個所需要抗體的V輕鏈(VL)和V重鏈(VH)區(qū)。然后將獲自各雜交瘤的VL和VH cDNA連接從而在兩步融合PCR中形成單鏈片段。第一個PCR步驟導(dǎo)入(Gly4-Ser1)3連接子，而第二步連接VL和VH擴(kuò)增子。然后將每個單鏈分子克隆至細(xì)菌表達(dá)載體中。擴(kuò)增后，切離一個單鏈分子然后亞克隆至其它包含第二個單鏈所需分子載體中。將得到的bscAb片段亞克隆至真核表達(dá)載體中。功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)可通過將所述載體轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細(xì)胞中而獲得。采用相似方法制備雙特異性融合蛋白。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合蛋白包括于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
例如，人源化，嵌合或人抗-CD74單克隆抗體可用于制備抗原特異性雙抗體，三抗體和四抗體。單特異性雙抗體，三抗體和四抗體選擇性結(jié)合靶定的抗原且隨著分子上結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目的增加，對靶細(xì)胞的親和力增加并在所需位置觀察到更長的停留時間。對于雙抗體，使用包含經(jīng)五個氨基酸殘基連接子而將人源化CD74 mAb的VH多肽與人源化CD74 mqAb的VK多肽相連接的兩條鏈。每條鏈形成半個人源化CD74雙抗體。在三抗體的情況下，使用包含不經(jīng)連接子而將人源化CD74 mAb的VH多肽與人源化CD74 mAb的VK多肽相連接的三條鏈。每條鏈形成三分之一個hCD74三抗體。
本文描述的雙抗體的最終用途是預(yù)靶定CD74陽性腫瘤以便隨后特異性遞送診斷性或治療劑。這些雙抗體選擇性的與靶定的抗原結(jié)合能產(chǎn)生親和力增加且在所需位置更長的駐留時間。此外，無抗原結(jié)合的雙抗體可被快速從體內(nèi)清除且將正常組織的暴露量最小化。診斷劑和治療劑可包括同位素，藥物，毒素，細(xì)胞因子，激素，酶，寡核苷酸，生長因子，綴合物，放射性核素和金屬。例如，用于磁共振成像(MRI)的釓金屬。放射性核素的實(shí)例是225Ac，18F，68Ga，67Ga，90Y，86Y，111In，131I，125I，123I，99mTc，94mTc，186Re，188Re，177Lu，62Cu，64Cu，67Cu，212Bi，213Bi，32P，11C，13N，15O，76Br，和211At。其它放射性核素也可用作診斷劑和治療劑，尤其是那些用作診斷劑的能量為60～4,000keV和用作治療劑的能量為60～700的放射性核素。
更為近來，具有雙特異性的四價串聯(lián)雙抗體(稱為tandab)也已經(jīng)被報(bào)道(Cochlovius等Cancer Research(2000)604336-4341)。雙特異性tandab是兩個相同多肽的二聚物，每個多肽包含兩個不同抗體的以便于形成兩個潛在結(jié)合位點(diǎn)的方向連接的四個可變區(qū)(VH1，VL1，VH2，VL2)，其中每兩個不同特異性自相連。
7.綴合的多價的和多特異性抗-CD74抗體在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中是綴合的多價的抗-CD74抗體?？蓪⒏郊拥陌被釟埢又恋谝换虻诙€多肽的N末端或C末端。附加的氨基酸殘基可包含肽標(biāo)簽，信號肽，細(xì)胞因子、酶(例如，前藥活化酶)、激素，肽毒素，如假單胞菌外毒素，肽藥物，細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)或其它功能性蛋白質(zhì)。如本文所使用的，功能性蛋白質(zhì)是具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。
在一個實(shí)施方案中，藥物，毒素，放射性化合物，酶，激素，細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)，螯合劑，細(xì)胞因子及其它功能性試劑可與多價的靶結(jié)合蛋白質(zhì)綴合，優(yōu)選經(jīng)由與多價的靶結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的側(cè)鏈例如氨基，羧基，苯基，巰基或羥基共價連接。多種常規(guī)連接子可用于該目標(biāo)，例如，二異氰酸酯，二異硫氰酸酯，二(羥基琥珀酰亞胺)酯，碳二亞胺，馬來酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯，戊二醛等。試劑與多價蛋白質(zhì)的綴合優(yōu)選不顯著影響該蛋白質(zhì)的對其靶位結(jié)合特異性或親和力。如本文所使用的，功能性試劑是具有生物學(xué)功能的試劑。優(yōu)選的功能性試劑是細(xì)胞毒害劑。
在其它實(shí)施方案中，將治療性或前藥聚合物至體內(nèi)靶位的雙特異性抗體-導(dǎo)向的遞送可與放射性核素的雙特異性抗體遞送聯(lián)合，以便實(shí)現(xiàn)化學(xué)治療和放射性免疫治療的聯(lián)合。每個治療劑可與可靶向的綴合物綴合并同時施用，或核素作為第一個可靶向的綴合物的部分給予而藥物在隨后的步驟中以第二個可靶向的綴合物的部分給予。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞毒害劑可與聚合載體綴合，而多聚載體可隨后與多價的靶結(jié)合蛋白質(zhì)綴合。對于該方法，參見Ryser等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753867-3870，1978，美國專利號4,699,784和美國專利號4,046,722，其全文引入此處作為參考。綴合優(yōu)選不會顯著影響多價結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性或親和力。
8.人源化，嵌合和人抗體用于治療和診斷人源化，嵌合和人單克隆抗體，即，本文描述的抗-CD74 mAb及其它MAb，根據(jù)本發(fā)明適用于治療性方法和診斷性方法中。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人源化，嵌合和人抗體作為裸抗體單獨(dú)施用或作為多元的治療施用，暫時根據(jù)給藥方案，但不與治療劑綴合。免疫綴合物是綴合物，其包括包含本發(fā)明所述的與CD74結(jié)合的人源化，嵌合或人CD74 mAb的至少一種與診斷劑或治療劑相連接的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的抗體成分。
裸抗-CD74 mAb的功效可通過用以下物質(zhì)補(bǔ)充裸抗體而得到提高一種或多種其它裸抗體，即，針對特異性抗原，如CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD19，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD80，CD126，B7，MUC1，Ia，腱生蛋白，HM1.24，或HLA-DR，優(yōu)選成熟HLA-DR二聚物的mAb，一種或多種抗-CD74的免疫綴合物，或針對這些列舉的抗原，與治療劑，包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、治療性放射性核素等綴合的抗體，一種或多種與mAb一起同時或次序或按所述劑量方案進(jìn)行給藥的治療劑，包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、治療性放射性核素等。優(yōu)選的B細(xì)胞-相關(guān)抗原包括與人CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD46，CD52，CD74，CD80，和CD5抗原等效的那些抗原。優(yōu)選的T細(xì)胞抗原包括與人CD4，CD8和CD25(IL-2受體)抗原等效的那些抗原。HLA-DR抗原的等效物可用于治療B細(xì)胞和T細(xì)胞病癥。特別優(yōu)選的B細(xì)胞抗原是與人CD19，CD22，CD21，CD23，CD74，CD80，和HLA-DR抗原等效的那些抗原。特別優(yōu)選的T細(xì)胞抗原是與人CD4，CD8和CD25抗原等效的那些抗原。CD46是癌細(xì)胞表面上阻斷補(bǔ)體依賴的細(xì)胞裂解(CDC)的抗原。優(yōu)選的惡性黑素瘤相關(guān)抗原是與MART-1，TRP-1，TRP-2和GPLO0等效的那些抗原。此外，優(yōu)選的多發(fā)性骨髓瘤-相關(guān)抗原是與MUC1和CD38等效的那些抗原。
此外，本發(fā)明涉及免疫綴合物的施用在診斷和治療B細(xì)胞淋巴瘤及其它疾病或病癥中的用途。免疫綴合物，如本文所述，是包含抗體成分和治療劑或診斷劑的分子，包括可以載有診斷劑或治療劑的肽。免疫綴合物保持了抗體成分的免疫反應(yīng)性，即抗體部分在綴合后仍具有與綴合前大致相同的和輕微降低的對同類抗原的結(jié)合能力。
多種診斷和治療試劑可方便地與本發(fā)明的抗體結(jié)合。此處提及的治療劑是也可用于與上述裸抗體分開施用的那些試劑。治療劑包括，例如，化學(xué)治療藥物如長春花生物堿，蒽環(huán)類抗生素，表鬼臼毒素(epidophyllotoxinw)，紫杉烷類，抗代謝物，烷化劑，抗生素，Cox-2抑制劑，抗有絲分裂物，抗血管生成劑和調(diào)亡劑，特別是阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉醇，CPT-11，喜樹堿和來自這些及其它類抗癌藥等的其它藥物。用于制備免疫綴合物和抗體融合蛋白的其它有用的癌癥化學(xué)治療藥物包括氮芥，烷基磺酸鹽類，亞硝基脲，三氮烯，葉酸類似物，COX-2抑制劑，嘧啶類似物，嘌呤類似物，鉑配位絡(luò)合物，激素等。適用的化學(xué)治療劑描述于REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，19TH Ed。(Mack Publishing Co.1995)，和GOODMAN和GILMAN′STHE PHARMACOLOGICAL BASIS OF治療性S，7th Ed。(MacMillanPublishing Co.1985)中以及這些出版物的修訂版。其它適宜的化學(xué)治療劑，如實(shí)驗(yàn)藥物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
此外，螯合劑如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或適宜的肽，可檢測的標(biāo)記物，如熒光分子，或細(xì)胞毒害劑，如重金屬或放射性核素可與其結(jié)合。例如，通過將光活化劑或染料與抗體復(fù)合物可獲得治療上有用的免疫綴合物。熒光組合物，如熒光染料，和其它色原，或染料，如對可見光敏感的卟啉已經(jīng)通過將適宜的光對準(zhǔn)損害處而用于檢測和治療損害。在治療中，其被稱為光輻射，光照療法或光動力療法(Jori等(eds.)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain 22430(1986))。而且，單克隆抗體已經(jīng)偶聯(lián)于光活化的染料以便獲得光治療。Mew等Y Immunol.1301473(1983)；Idem.，Cancer Res.454380(1985)；Oseroff等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838744(1986)；Idem.，Photochem.Photobiol.4683(1987)；Hasan等Proc.ClinlBiol.Res.288471(1989)；Tatsuta等LasersSurg.Med19422(1989)；Pelegrin等Cancer 672529(1991)。然而，這些早期的研究未包括內(nèi)窺鏡療法的使用，特別是抗體片段或亞片段的使用。因此，本發(fā)明涉及含光活化劑或染料的免疫綴合物的治療用途。
本發(fā)明還涉及放射性和非放射性試劑作為診斷劑的用途。適用的非放射性診斷劑是適用于磁共振成像，計(jì)算機(jī)控制斷層掃描術(shù)或超聲的造影劑。磁成像劑包括，例如非放射性金屬，如錳，鐵和釓，當(dāng)與本發(fā)明的抗體一起使用時，其與包括2-芐基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物的金屬-螯合劑組合物復(fù)合。參見與2001年10月10日提交的美國序號09/921,290，其全文引入作為參考。
此外，放射性標(biāo)記的抗體或免疫綴合物可包含用于診斷性成像的Y-發(fā)射性放射性同位素或正電子-發(fā)射體。適用的，特別是能量為60～4,000keV的放射性同位素，包括131I，123I，124I，86Y，62Cu，64Cu，111In，67Ga，68Ga，99mTc，94mTc，18F，11C，13N，15O，76Br等。例如，參見名為″Labeling Targeting Agents with Gallium-68″發(fā)明人為G.L.Griffiths和W.J.McBride的美國專利申請(美國臨時申請?zhí)?0/342,104)，其公開了為了成像目的正電子發(fā)射體，如18F，68Ga，99mTc等，所述申請全文引入作為參考。
還可將毒素，如假單胞菌外毒素復(fù)合于或形成本發(fā)明的抗-CD74抗體的抗體融合蛋白的治療劑部分。其它適用于制備所述綴合物或其它融合蛋白的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I，葡萄球菌腸毒素-A，美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。例如，參見Pastan等CELL47641(1986)，和Goldenberg，CA-A Cancer Journal For Clinicians4443(1994)。適用于本發(fā)明的其它毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并被描述于美國專利6,077,499中，所述美國專利全文引入作為參考。
還可將免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子綴合于，或形成抗體融合蛋白的治療劑部分或與本發(fā)明的人源化抗-CD20抗體一起施用。適用于本發(fā)明的細(xì)胞因子包括，但不限于，干擾素和白介素，如下述。
本發(fā)明還涉及包含人源化、嵌合或人CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白與I類或II類MHC抗原肽共價連接而形成抗體綴合物的疫苗，其中所述疫苗用于治療患有癌癥或感染性疾病的患者。當(dāng)抗體綴合物被包含CD74標(biāo)記物的細(xì)胞內(nèi)在化時，I類或II類MHC抗原肽可通過由抗原呈遞細(xì)胞，如樹突細(xì)胞細(xì)胞蛋白水解消化而從連接于mab或其片段的較大肽或蛋白質(zhì)上釋放出來。該抗體綴合物通過融合編碼mAb或其片段cDNA和編碼抗原肽或蛋白質(zhì)的cDNA，然后在細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)抗體融合蛋白來制備。包含本發(fā)明的人源化，嵌合或人CD74 mAb或其片段或抗體融合蛋白的抗體綴合物特別適用于提交于1995年12月22日，名為“Use of Immunoconjugates toEnhance the Efficacy of Multi-Stage Cascade BoostingVaccines”的未決美國序列號08/577,106描述的治療方法，所述申請全文引入此處作為參考。本發(fā)明的人源化抗-CD74 mAb特別適用于實(shí)施例5中鼠LL1的情況下。
9.免疫綴合物的制備本發(fā)明的任何抗體或抗體融合蛋白可與一種或多種治療劑或診斷劑綴合。通常，一種治療劑或診斷劑綴合至每個抗體或抗體片段，但可將超過一種治療劑或診斷劑綴合至相同的抗體或抗體片段上。本發(fā)明的抗體融合蛋白包含兩個或多個抗體或其片段其每個包括該抗體融合蛋白的抗體可包含治療劑或診斷劑。此外，抗體融合蛋白的一個或多個抗體可具有與其綴合的診斷劑的超過一種治療性。此外，治療劑無須相同而可以是不同的治療劑。例如，一個可將藥物和放射性同位素結(jié)合相同的抗體融合蛋白。特別地，IgG可以是用I放射性標(biāo)記的并與藥物綴合。131I可被摻至IgG的酪氨酸和與IgG賴氨酸的ε氨基連接的藥物。治療劑和診斷劑均還可與還原的巰基綴合和與糖側(cè)鏈綴合。
本發(fā)明的雙特異性抗體可用于預(yù)先靶定的方法并提供了將兩種治療劑或兩種診斷劑遞送給個體的優(yōu)選方式。美國序列號09/382,186公開了利用雙特異性抗體預(yù)先靶定的方法，其中雙特異性抗體被標(biāo)記的且遞送給個體，然后用99MTC標(biāo)記的二價肽。遞送導(dǎo)致了非常好的LESS和99MTC的腫瘤/正常組織比率，因此顯示了兩中診斷性放射性同位素的實(shí)用性。已知治療劑或診斷劑的任何組合可用于標(biāo)記抗體和抗體融合蛋白。mAb綴合物的抗體成分的結(jié)合特異性，治療劑或診斷劑功效和抗體的Fc部分的效應(yīng)子活性可通過對綴合物的標(biāo)準(zhǔn)檢測進(jìn)行測定。
治療劑或診斷劑可通過二硫鍵的形成在還原抗體成分的鉸鏈區(qū)連接。作為一種選擇，還可利用異雙官能交聯(lián)劑，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)將所述肽合抗體連接。Yu等，Int.J.Cancer.，56244(1994)。用于所述綴合的一般方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，參見例如，參見Wong，CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″在MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(eds.)中，187-230頁(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production和Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERING和CLINICAL APPLICATION，Ritter等(eds.)中，60-84頁(CambridgeUniversity Press 1995)?；蛘?，治療劑或診斷劑可經(jīng)由抗體Fc區(qū)中的糖部分進(jìn)行綴合。糖基團(tuán)可用于增加肽與巰基結(jié)合的相同肽的裝載，或糖基團(tuán)可用于結(jié)合不同的肽。
肽經(jīng)由抗體糖部分與抗體成分結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，參見Shih等Int.J.Cancer 41832(1988)；Shih等Int.J.Cancer 461101(1990)；和Shih等美國專利號5,057,313，所述文件均全文引入作為參考。一般方法包括使具有氧化糖部分的抗體成分與載體聚合物反應(yīng)，所述載體聚合物具有至少一個游離的胺官能團(tuán)并轉(zhuǎn)載多種肽。該反應(yīng)可產(chǎn)生起始席夫堿(亞胺)鍵，其通過還原成仲胺形成最終的綴合物而穩(wěn)定。
如果用作免疫綴合物抗體成分的抗體是抗體片段，則缺少Fc區(qū)。然而，可以將糖部分導(dǎo)入全長抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)中。例如，參見Leung等J.Immunol.1545919(1995)；Hansen等美國專利號5,443,953(1995)，Leung等美國專利號6,254,868，其均全文引入作為參考。將工程改造的糖部分用于綴合治療劑或診斷劑。
10.藥學(xué)上可接受的賦形劑將被遞送給個體的人源化，嵌合和人抗-CD74 mAb可僅包含mAb，免疫綴合物，抗體融合蛋白或可包含一種或多種藥學(xué)上適用的賦形劑，一種或多種附加成分，或這些的某些組合。
本發(fā)明的免疫綴合物或裸抗體可按已知方法配制成藥學(xué)上有用的組合物，由此免疫綴合物或裸抗體和藥學(xué)上適用的賦形劑在混合物中組合。無菌磷酸鹽-緩沖鹽水是藥學(xué)上適用的賦形劑的一個實(shí)例。其它適用的賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，參見Ansel等PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS和DRUG DELIVERY SYSTEMS，5THEdition(Lea & Febiger 1990)，和GENNARO(ed.)，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，18TH Edition(Mack Publishing Company1990)及其修訂版。
本發(fā)明的免疫綴合物或裸抗體可被配制成借助，例如彈丸注射或連續(xù)輸注的靜脈內(nèi)給藥。用于注射的配方可以是單位劑型，例如，安瓿中或多劑量容器中，和附加的保存劑。組合物可采用所述劑型如在油性或水性在中的懸液，溶液或乳液，并可包含配方劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是在使用前用適宜的載體，例如，無熱原滅菌水配制的粉劑形式。
可使用額外的藥學(xué)方法控制治療性或診斷性綴合物或裸抗體的作用時間。通過使用聚合物來復(fù)合或吸收免疫綴合物或裸抗體可制成控釋劑。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯共聚乙酸乙烯酯)基質(zhì)和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基質(zhì)。Sherwood等，Bio/Technology 101446(1992)。免疫綴合物或抗體從所述基質(zhì)中釋放的速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、基質(zhì)內(nèi)免疫綴合物，抗體的量和分散的顆粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55163(1989)；Sherwood等，如上。其它固體劑型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，5THEdition(Lea & Febiger 1990)和Gennaro(ed.)，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，18TH Edition(Mack Publishing Company1990)及其修訂版中。
免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸抗體還可采取皮下或甚至是其它胃腸外途徑而施用于哺乳動物。而且，可采取連續(xù)輸注，或單次或多次大丸劑進(jìn)行施用。通常，免疫綴合物，抗體融合蛋白或裸抗體對人的施用劑量根據(jù)諸如患者年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學(xué)狀況和既往醫(yī)學(xué)史等因素而改變。典型地，合乎需要的是將免疫綴合物，抗體融合蛋白或裸抗體以劑量約1mg/kg～20mg/kg，單次靜脈內(nèi)輸注提供給受者，但也可以根據(jù)環(huán)境需要施用較低或較高的劑量。該劑量可按需重復(fù)施用，例如，一周一次持續(xù)4～10周，優(yōu)選一周一次持續(xù)8周，更優(yōu)選地，一周一次持續(xù)4周。其還可以以較低頻率給予，如隔周一次持續(xù)數(shù)月。劑量可用多種胃腸外途徑給予，可對劑量和方案進(jìn)行適宜的調(diào)整。
為了治療的目的，將免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸抗體以治療有效量施用于哺乳動物。本發(fā)明所針對的適宜個體一般是人類，但非人類的動物個體也是可預(yù)期的。如果所施用的量是生理學(xué)上顯著的，則抗體制劑被稱為以“治療有效量”進(jìn)行施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致受體哺乳動物生理學(xué)上可檢測的變化，則該藥劑就是生理學(xué)上的顯著的。特別地，如果本發(fā)明的抗體制劑的存在能引起抗腫瘤應(yīng)答或減輕了自身免疫性疾病狀態(tài)的體征和癥狀，則其就是生理學(xué)上的顯著的。生理學(xué)上的顯著的作用還可以是在受體哺乳動物中引起體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
11.治療方法本發(fā)明預(yù)期了本發(fā)明的裸抗-CD74抗體作為主要組合物用于治療表達(dá)CD74的惡性腫瘤的用途，其中疾病或病癥選自免疫失調(diào)病、身免疫性疾病、器官移植排斥和移植物抗宿主病。表達(dá)CD74的惡性腫瘤選自實(shí)體瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，另一B細(xì)胞惡性腫瘤和T細(xì)胞惡性腫瘤。實(shí)體瘤選自黑素瘤、癌和肉瘤而癌選自腎癌、肺癌、腸癌、胃癌和黑素瘤。B細(xì)胞惡性腫瘤選自非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，慢性淋巴性白血病，急性淋巴性白血病，和多發(fā)性骨髓瘤，B細(xì)胞失調(diào)及其它疾病。特別地，本文所述的組合物特別適用于治療多種自身免疫病以及低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，慢性淋巴性白血病，急性淋巴性白血病，多發(fā)性骨髓瘤，和Wadlenstrm氏巨球蛋白血癥。例如，人源化抗-CD74抗體成分和免疫綴合物可用于治療低度惡性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤。
更具體地，本發(fā)明預(yù)期了治療B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，包含給予對患有B細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤， 包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種本發(fā)明的人源化、嵌合或人抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物，其中B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤或白血病。更具體地，B細(xì)胞惡性腫瘤是非霍奇金淋巴瘤，低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，慢性淋巴性白血病，或急性淋巴性白血病。CD74 mAb或其片段以20～2000mg的劑量靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。本方法還包括在施用至少一種治療劑治療B細(xì)胞惡性腫瘤之前、同時或之后施用抗-CD74 mAb或其片段。所述治療劑包括裸抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、細(xì)胞毒害劑、酶、與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的抗體、放射性標(biāo)記物、激素、酶或細(xì)胞毒害劑或其組合。所述免疫調(diào)節(jié)劑優(yōu)選是細(xì)胞因子而所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。作為裸抗體或作為補(bǔ)充性免疫綴合物而聯(lián)合給藥的抗體可與CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD80，CD126，B7，MUC1，Ia，HM1.24，腱生蛋白和HLA-DR，優(yōu)選成熟HLA-DR二聚物反應(yīng)，并在藥學(xué)上可接受的載體中配制。
本發(fā)明還涉及治療惡性腫瘤的方法，包含對患有淋巴瘤或白血病以外的CD74抗原-陽性的惡性腫瘤的個體給予包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種如本發(fā)明所述的抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物?？?CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白以20～2000mg的劑量靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給藥。此外，抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白在給予至少一種用于治療惡性腫瘤的治療劑之前、期間或之后給藥。該治療劑，如上述以及貫穿本說明書全文，包括抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、細(xì)胞毒害劑、與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的抗體、放射性標(biāo)記物、酶、激素、細(xì)胞毒害劑、反義寡核苷酸或其組合，其中免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子和所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。當(dāng)將抗體與抗-CD74 mAb或其片段聯(lián)合施用以治療非B細(xì)胞惡性腫瘤的惡性腫瘤，其應(yīng)與除CD74外的腫瘤標(biāo)記物發(fā)應(yīng)，由包含被治療的惡性腫瘤的細(xì)胞所表達(dá)的，并在藥學(xué)上可接受的載體中配方制備?？墒┯糜趷盒院谒亓鱿嚓P(guān)抗原的抗體的實(shí)例是與MART-1，TRP-1，TRP-2和gp100反應(yīng)的那些抗體。此外，針對多發(fā)性骨髓瘤-相關(guān)抗原的優(yōu)選抗體是與MUC1和CD38反應(yīng)的那些抗體。
用于治療的組合物包含至少一種單獨(dú)的人源化、嵌合或人單克隆抗-CD74抗體或與其它抗體，如其它人源化、嵌合或人抗體，治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑的組合。特別地，使用完全人抗體的聯(lián)合治療也是被預(yù)期的，被用上述方法制備。
針對相同或不同表位或抗原的裸或綴合的抗體還可與本發(fā)明的一個或多個的抗體聯(lián)合。例如，人源化、嵌合或人裸抗-CD74抗體可與另一裸人源化，裸嵌合或裸人抗-CD74 mAb聯(lián)合；人源化、嵌合或人裸抗-CD74抗體可與抗-CD74免疫綴合物聯(lián)合；裸抗-CD74抗體可與抗-CD22放射性綴合物聯(lián)合；或抗-CD22裸抗體可與綴合于同位素或一種或多種化學(xué)治療劑、細(xì)胞因子、酶、毒素或其組合的人源化、嵌合或人抗-CD74抗體聯(lián)合。人源化、嵌合或人CD20抗體和毒素或免疫調(diào)節(jié)劑的抗體融合蛋白，或至少兩種不同B細(xì)胞抗體(例如，CD74和CD22mAb，CD20 mAb或CD19 mAb)的抗體融合蛋白也可用于本發(fā)明。參照提交于2001年10月1日的名為“Immunotherapy of B-CellMalignancies Using Anti-CD-22 Antibodies”的未決美國序號09/965,796，該申請是美國專利號6,306,393的接續(xù)，二者均全文引入此處作為參考，其公開了抗-CD22抗體聯(lián)合其它裸抗體的治療方法。多種不同的抗體組合，靶向至少兩個與B細(xì)胞失調(diào)相關(guān)的不同抗原，如上述，可或作為裸抗體或作為部分裸的和部分與治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑綴合的，或僅與另一治療劑，如細(xì)胞毒性藥物或與放射聯(lián)合構(gòu)建。
如本文所使用的，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素，如腫瘤壞死因子(TNF)和血細(xì)胞生成因子，如白介素(例如，白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18，和IL-21)、集落刺激因子(例如，粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如，干擾素S-A，-P和-Y)、被稱為“S1因子的”干細(xì)胞生長因子，促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。適宜的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實(shí)例包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21，及其組合，和干擾素-γ，TNF-α等?；蛘撸瑐€體可接受裸抗-CD74抗體和單獨(dú)施用的細(xì)胞因子，其可在施用裸抗-CD74抗體之前、同時或之后進(jìn)行施用。如上所述，抗-CD74抗體還可與免疫調(diào)節(jié)劑綴合。免疫調(diào)節(jié)劑還可以與含有與不同抗原結(jié)合的一個或多個抗體的雜合抗體綴合。
本發(fā)明的多元治療還包括以施用抗-CD22，抗-CD19，抗-CD21，抗-CD20，抗-CD80，抗-CD23，抗-CD46或HLA-DR，優(yōu)選成熟HLA-DR二聚物抗體以裸抗體，融合蛋白的形式或以免疫綴合物作為補(bǔ)充的采用裸抗-CD74抗體的免疫治療。這些抗體包括識別這些抗原性決定子上的至少一種表位的多克隆、單克隆、嵌合、人或人源化抗體。抗-CD19和抗-CD22抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，參見Ghetie等Cancer Res.482610(1988)；Hekman等Cancer Immunol.Immunother.32364(1991)；Longo，CURR。Opin。ONCOL。8353(1996)和美國專利5,798,554和6,187,287，全文引入作為參考。
在多元治療的另一形式中，個體接受裸抗-CD74抗體，和/或免疫綴合物，聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)癌化學(xué)治療。例如，“CVB”(1.5G/M2環(huán)磷酰胺，200-400MG/M2足葉乙甙，和150-200MG/M2卡氯芥)是用于治療非霍奇金淋巴瘤的療法。Patti等Eur.JHaematol.5118(1993)。其它適宜的聯(lián)合化學(xué)治療是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，參見Freedman等“NON-Hodgkin’s lymphoma”，CANCER MEDICINE，VOLUME2，3rd Edition中，Holland等(eds.)，2028-2068頁(Lea & Febiger1993)。作為說明，用于治療中級的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的第一代化學(xué)治療包括C-MOPP(環(huán)磷酰胺，長春新堿，甲基芐肼和強(qiáng)的松)和CHOP(環(huán)磷酰胺，阿霉素，長春新堿和強(qiáng)的松)。有效的第二代化學(xué)治療是M-BACOD(甲氨蝶呤，博萊霉素，阿霉素，環(huán)磷酰胺，長春新堿，地塞米松和甲酰四氫葉酸)，而適用的第三代化學(xué)治療是MACOP-B(甲氨蝶呤，阿霉素，環(huán)磷酰胺，長春新堿，強(qiáng)的松，博萊霉素和甲酰四氫葉酸)。其它有用的藥物包括丁酸苯酯和brostatin-1。在優(yōu)選的多元治療中，將化學(xué)治療藥物和細(xì)胞因子與根據(jù)本發(fā)明的抗體，免疫綴合物或抗體融合蛋白共同給藥。細(xì)胞因子，化學(xué)治療藥物和抗體或免疫綴合物可按任何順序或一起給藥。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以4個每周一次的輸注的方式用人源化抗-CD74抗體以200～400mg/m2的劑量每周一次連續(xù)4周或隔周一次(2～8小時靜脈注射)治療NHL，下一月/年按需重復(fù)。還優(yōu)選，以上述4個半月一次的輸注，但不在同一日聯(lián)合依帕珠單抗(抗-CD22人源化抗體)，以360mg/M2的劑量，或以1小時靜脈輸注，或在抗-CD74單克隆抗體輸注之前、同時或之后的方法治療NHL。還優(yōu)選，NHL用上述抗-CD74抗體的4周一次的輸注的4個每周一次的輸注，聯(lián)合一個或多個含有用治療性同位素如釔-90(Y90的劑量為5～5mCi/m2)作為在一周或月期間內(nèi)一個或多個注射劑的標(biāo)記的CD22 mAb注射劑進(jìn)行治療。
此外，本發(fā)明的治療組合物可包含導(dǎo)向不同的，非阻滯性的CD74表位的單克隆裸抗-CD74抗體的混合物或雜合分子。因此，本發(fā)明涉及包含與至少兩個CD74表位結(jié)合的單克隆抗-CD74抗體的混合物的治療組合物。此外，本文所述的治療組合物可包含具有變化的CDR序列的抗-CD74抗體的混合物。
雖然裸抗-CD74抗體是治療B細(xì)胞淋巴瘤和自身免疫性疾病的基本治療組合物，所述抗體治療的功效可通過補(bǔ)充裸抗體，補(bǔ)充劑，如免疫調(diào)節(jié)劑，如干擾素，包括IFNα，IFNβ和IFNγ，白介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21，及其組合，和細(xì)胞因子包括G-CSF和GM-CSF而得到增強(qiáng)。因此，CD74抗體可不僅與或作為混合物(分開或以某些預(yù)先確定的劑量方案給予)或與抗-CD74抗體的作為綴合物或融合蛋白的抗體和細(xì)胞因子聯(lián)合，還可以與藥物和反義寡核苷酸聯(lián)合給藥。例如，抗-CD74抗體可與作為4種藥物的化學(xué)治療法的CHOP聯(lián)合。此外，裸抗-CD74抗體可與裸抗-CD22抗體和CHOP或氟達(dá)拉濱聯(lián)合作為NHL治療的聯(lián)合用藥。補(bǔ)充性治療組合物可在給予抗-CD74抗體之前、同時或之后給藥。裸抗-CD74mAb還可與反義bcl寡核苷酸聯(lián)合。
如上所述，本發(fā)明的抗體可用于治療B細(xì)胞淋巴瘤和白血病，及其它B細(xì)胞疾病或病癥以及其它被作用的或相關(guān)的惡性細(xì)胞與CD74反應(yīng)的惡性腫瘤。例如，抗-CD74抗體可用于治療免疫失調(diào)病和相關(guān)的自身免疫性疾病，包括III類自身免疫性疾病如免疫-介導(dǎo)的血小板減少癥，如急性自發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性自發(fā)性血小板減少性紫癜，皮肌炎，干燥綜合征，多發(fā)性硬化，西登哈姆氏舞蹈病，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，狼瘡腎炎，風(fēng)濕熱，狼瘡腎炎，大皰性類天皰瘡，糖尿病，亨-舍二氏紫癜，鏈球菌感染后腎炎，結(jié)節(jié)性紅斑，高安氏動脈炎，阿狄森氏綜合征，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，潰瘍性結(jié)腸炎，多形性紅斑，IgA腎病，結(jié)節(jié)性多動脈炎，結(jié)節(jié)性多動脈炎，結(jié)節(jié)性多動脈炎，thromboangitis ubiterans，原發(fā)性膽汁性肝硬變，橋本甲狀腺炎，橋本甲狀腺炎，硬皮病，慢性活動性肝炎，多肌炎/多肌炎，多肌炎，尋常天皰瘡(pamphigus vulgaris)，韋格納氏肉芽腫病，膜性腎病，肌萎縮側(cè)索硬化，脊髓癆，巨細(xì)胞動脈炎/脊髓癆，惡性貧血，急進(jìn)性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎。
特別地，將本發(fā)明的人源化，嵌合或人抗-CD74 mAb或其片段或抗體融合蛋白給予患有一種或多種這些自身免疫性疾病的個體。本發(fā)明的抗-CD74抗體特別適用于治療自體免疫失調(diào)的方法，如2000年6月9日提交的名為“Immunotherapy of Autoimmune Disorder usingantibodys that Target B-cell”的未決美國序列號09/590,284所描述的，其全文引入作為參考。優(yōu)選地，抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白以20～2000mg的劑量靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給藥。此外，抗-CD74mAb或其片段或其抗體融合蛋白在用于治療病癥的至少一種治療劑給藥之前、同時或之后給藥。治療劑，如上述和貫穿本說明書全文，包括抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、細(xì)胞毒害劑、與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的抗體、放射性標(biāo)記物、激素，酶，或細(xì)胞毒害劑，反義寡核苷酸或其組合，其中免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子而所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。作為裸抗體或作為補(bǔ)充性免疫綴合物聯(lián)合給藥的抗體可與CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD80，CD126，B7，MUC1，Ia，HM1.24，腱生蛋白，和成熟HLA-DR，優(yōu)選成熟HLA-DR二聚物反應(yīng)，在藥學(xué)上可接受的載體中配制。
此外治療選自淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、其它表達(dá)CD-74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病、自身免疫性疾病及其組合的疾病的方法，包括施用包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種本發(fā)明的抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物，其中至少一種治療劑通過化學(xué)綴合或基因融合與mAb或其片段或其抗體融合蛋白的Fv或Fab′相連。治療劑可以是免疫調(diào)節(jié)劑、放射性標(biāo)記、激素、酶，或細(xì)胞毒害劑，免疫調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞因子而所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。
抗-CD74抗體還可以在表達(dá)CD74抗原的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。該誘導(dǎo)證據(jù)在本發(fā)明的樣品中得到支持。其它抗體以及正面凋亡可通過具有與CD20 mAb交聯(lián)的IgGL-FC反應(yīng)的Fc-受體的淋巴樣細(xì)胞誘導(dǎo)。參見Shan等CANCER IMMUNOL.IMMUNOTHER.48(12)673-683(2000)。此外，已經(jīng)報(bào)道了嵌合CD20MAb的聚集物，即，同聚物，能誘導(dǎo)凋亡。參見Ghetie等Blood 97(5)1392-1398(2000)和Ghetie等Proc.Natl.Acad.Sci USA 94(14)7509-7514(1997)。
可將特異性針對B細(xì)胞的CD74表面抗原的抗體注射至哺乳動物個體，其然后與正常和惡性B細(xì)胞的CD74細(xì)胞表面抗原結(jié)合。哺乳動物個體包括人和家畜動物，包括寵物，如犬和貓。本發(fā)明的抗-CD74 mAb，即，人源化，嵌合，人，犬源化和貓?jiān)椿蜕踔潦罂?CD74 mAbs，可用于治療非人類哺乳動物個體，所述個體是具有與CD74抗原交叉反應(yīng)性的物種。在人中具有免疫原性的鼠mAb，通常在非人類的哺乳動物個體中具有較低的免疫原性。與CD74表面抗原結(jié)合的抗-CD74抗體導(dǎo)致腫瘤B細(xì)胞的破壞和減少。
12.診斷方法本發(fā)明還提供了診斷已診斷為或疑為患有至少一種選自淋巴瘤、白血病、其它表達(dá)CD-74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病，自身免疫性疾病及其組合的個體中疾病的方法，包括對所述個體施以診斷有效量的診斷性綴合物與藥學(xué)上可接受的載體和至少一種抗-CD74 mAb或其片段或其抗體融合蛋白，其中通過化學(xué)綴合將診斷劑連接于mAb或其片段或其融合蛋白的Fv或Fab′上。用于本發(fā)明的診斷劑是放射性同位素，其中通過放射閃爍照相或PET檢測放射性同位素的光子，或可通過MRI檢測的金屬，或脂質(zhì)體或氣充脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體可通過超聲掃描設(shè)備檢測。
鼠抗-CD74 mAb，嵌合抗-CD74 mAb和人源化抗-CD74 mAb進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)在化可發(fā)生在基本上根據(jù)Pirker等J.Clin.Invest.，761261(1985)(其引入作為參考)的方法進(jìn)行的熒光標(biāo)記之前。離心培養(yǎng)的Raji細(xì)胞然后在新鮮培養(yǎng)基中將細(xì)胞重懸至濃度約5×106細(xì)胞/ml。將100μl的細(xì)胞懸液加入96-孔微量滴定板的每個孔中。將抗體，40μg/ml，以100μl的體積以時間間隔加入反應(yīng)孔中以便同時終止全部反應(yīng)。將滴定板在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)。在培養(yǎng)結(jié)束時用冷1％FCS/PBS沖洗細(xì)胞三次以除去未結(jié)合的抗體。然后用1mlFormaid-Fresh[10％福爾馬林溶液(Fisher，F(xiàn)air Lawn，NJ)]40℃處理細(xì)胞15分鐘。沖洗后，通過用FITC-標(biāo)記的山羊抗-小鼠抗體(Tago，Burlingame，CA)，或FITC-標(biāo)記的山羊抗-人抗體(JacksonIMMUNORESEARCH，West Grove，PA)處理來檢測或細(xì)胞表面上或細(xì)胞內(nèi)存在的抗體，這要依賴于進(jìn)行檢測的抗體是否分別是鼠、嵌合或人源化的。利用BH-2熒光顯微鏡(Olympus，Lake Success，NY)評估熒光分布。
在相關(guān)靜脈中，Juweid等1999描述了用于篩選/診斷骨癌的方法，其可受益于本發(fā)明的優(yōu)良抗-CD74 mAb。因此，預(yù)期了包含99mTc-標(biāo)記的人源化抗體或嵌合抗-CD74 mAb的方法。
13.表達(dá)載體DNA序列編碼人源化，嵌合或人抗-CD74 mAb。更具體地DNA序列包括編碼選自下述的mAb或其片段的核酸，(a)本文描述的抗-CD74mAb或其片段；(b)包含本文描述的任一種抗-CD74mAb或其片段的免疫綴合物，(c)包含至少兩種本文描述的所述抗-CD74 mAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段；(d)本文的抗體融合蛋白或其片段；(e)本文描述的疫苗；和本文描述的雙特異性或多特異性抗體。本發(fā)明的任何DNA序列可用重組工程操作而進(jìn)入多種已知的提供核酸復(fù)制的宿主載體中。這些載體可采用已知方法進(jìn)行設(shè)計(jì)從而包含所述核酸在其遞送的細(xì)胞中導(dǎo)向轉(zhuǎn)錄、翻譯或二者所需要的元件?？墒褂靡阎姆椒▉碇苽浒僮餍赃B接于適宜的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的蛋白質(zhì)編碼序列的表達(dá)構(gòu)建體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)和合成技術(shù)。例如，參見Sambrook等1989，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory(New York)；Ausubel等1997，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons(New York)。本發(fā)明還提供了不與載體相關(guān)的多核苷酸的遞送。
本發(fā)明中適用的載體可以是病毒載體或非病毒載體。病毒載體的具體實(shí)施包括腺病毒、AAV、單純皰疹病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。非病毒載體的實(shí)例是質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒。
如此處所述，表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的多核苷酸。表達(dá)載體是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的DNA分子。通常，將基因表達(dá)置于包括組成型或可謗導(dǎo)的啟動子，組織-特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子的特定調(diào)節(jié)元件的調(diào)控之下。所述基因被稱為“操作性連接于”調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選的表達(dá)載體是PDH12和GS載體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體包括編碼包括重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的人源化，嵌合或人抗-CD74 mAb的DNA序列。然而，可使用兩個表達(dá)載體，其中一個包含重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)而另一個包含輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。更優(yōu)選地，表達(dá)載體還包括啟動子。因?yàn)榭墒褂萌魏螐?qiáng)啟動子，編碼分泌信號肽的DNA序列，編碼人IgG1重鏈恒定區(qū)的基因組序列，Ig增強(qiáng)子元件和至少一種編碼選擇標(biāo)記的DNA序列。
一種使用本發(fā)明表達(dá)抗-CD74mAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的方法，包含(a)用編碼抗-CD74 mAb或其片段或其免疫綴合物，抗體融合蛋白或雙特異性或多特異性抗體的DNA序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；和(b)培養(yǎng)分泌該抗-CD74 mAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的細(xì)胞。宿主細(xì)胞來源于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選地，來源于哺乳動物細(xì)胞，在一個實(shí)施方案中其是淋巴細(xì)胞性細(xì)胞，如骨髓瘤細(xì)胞。
本文還涉及表達(dá)人源化抗-CD74 mAb的方法，包含(i)線性化至少一種包含編碼人源化、嵌合或人抗-CD74 mAb的DNA序列的表達(dá)載體，(ii)用至少一種所述線性化載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，(iii)選擇表達(dá)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，和(iv)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中鑒別分泌人源化抗-CD74 mAb的細(xì)胞。
發(fā)明人分離了編碼鼠抗-CD74單克隆抗體(mLL1mAb)的VL和VH區(qū)的cDNA并將其重組亞克隆至包含分別編碼人抗體的κ和IgG1，恒定區(qū)的基因的哺乳動物表達(dá)載體中。用這兩個表達(dá)嵌合抗-CD74 mAb(cLL1)的重組DNA共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，所述嵌合抗-CD74 mAb(cLL1)，類似親本mLL1 mAb，強(qiáng)結(jié)合于B-淋巴瘤細(xì)胞，并被其快速內(nèi)在化。
VK和VH DNA的CDR已經(jīng)用相似的重組方法分別連接于人VK和VH區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)序列，其隨后分別連接于人κ和IgG1恒定區(qū)，以便如上述在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)人源化抗-CD74 mAb(hLL1)。
其它剪切抗體的方法，如分離重鏈以便形成單價輕鏈-重鏈片段，片段的進(jìn)一步剪切，或其它酶，化學(xué)或遺傳技術(shù)也是可以使用的，只要片段能與被完整抗體識別的抗原結(jié)合。
此處所述的抗體是單克隆抗體(mAb)。單克隆抗體是針對特定抗原的抗體的同質(zhì)群而該抗體僅包括一種類型核酸特異性地與之結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得針對特異性抗原的嚙齒動物單克隆抗體。例如，參見Kohler和Milstein，Nature256495(1975)，和Coligan等(eds.)，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，VOL.1，頁2.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)[下文中為“Coligan”]。簡言之，單克隆抗體的制備可以通過用包含抗原的組合物注射小鼠，通過取血清樣品鑒定抗體制備的存在，取脾獲得B-淋巴細(xì)胞，融合B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞來制備雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)該產(chǎn)生針對所述抗原的抗體的克隆，和從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。
可采用多種已良好建立的方法從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化MAb。所述分離方法包括使用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。例如，參見Coligan 2.7.1-2.7.12頁和2.9.1-2.9.3頁。還可參見，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，VOL.10，79-104頁(The Humana Press，Inc.1992)中的Baines等“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”。
14.制備方法用于嵌合或人源化抗-CD74 mAb的Vk和VH序列可采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，如Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，863833(1989))(將其引入作為參考)所述。Vk序列可利用引物CK3BH和Vk5-3進(jìn)行擴(kuò)增(Leung等BioTechniques，15286(1993)，其引入作為參考，而VH序列可利用引物與鼠IgG的CH1區(qū)退火的CH1B，和VHIBACK進(jìn)行擴(kuò)增(Orlandi等1989如上)。將包含10μl第一鏈cDNA產(chǎn)物，9μl 10×PCR緩沖液[500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.3)，15mM MgCl2和0.01％(W/V)明膠](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)的PCR反應(yīng)混合物實(shí)施30個PCR循環(huán)。每個PCR循環(huán)優(yōu)選包括94℃變性1分鐘，50℃退火1.5分鐘，和72℃聚合1.5分鐘。擴(kuò)增的Vk和VH片段可在2％瓊脂糖上純化(BioRad，Richmond，CA)。參見實(shí)施例3的在自動化Cyclone Plus DNA synthesizer(Milligan-Biosearch)上合成的用于構(gòu)建人源化V基因的oligo A(149-mer)和oligo B(140-mer)的方法。
可將Vk的PCR產(chǎn)物亞克隆至staging載體，如基于pBR327的staging載體VkpBR，其包含Ig啟動子，信號肽序列和便于Vk PCR產(chǎn)物的框架內(nèi)連接方便的限制性位點(diǎn)?？蓪H的PCR產(chǎn)物亞克隆至相似staging載體，如基于pBluescript的VHpBS。包含各PCR產(chǎn)物的各克隆可用，被引入作為參考的Sanger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463(1977)的方法進(jìn)行測序。
本文所描述的DNA序列應(yīng)被理解為包括所有其等位基因，突變體和變體，無論是天然存在的還是誘導(dǎo)的。
可將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至適宜的細(xì)胞中，例如，骨髓瘤Sp2/0-AGL4，選擇潮霉素抗性的克隆，和采用例如，ELISA檢測法，如下述檢測上清液中嵌合抗體或人源化抗-CD74 mAb的產(chǎn)生。
轉(zhuǎn)染，和通過ELISA對分泌抗體的克隆的檢測，可按下述方法實(shí)施。根據(jù)被引入作為參考的Co等J.Immunol.，1481149(1992)，可將約10μg hLL 1 pKh(輕鏈表達(dá)載體)和20μg hLL1 pG1g(重鏈表達(dá)載體)通過電穿孔而用于轉(zhuǎn)染5×106SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(BioRad，Richmond，CA)。轉(zhuǎn)染后，可在96-孔微量滴定板上于完全HSFM培養(yǎng)基(GIBCO，Gaithersburg，MD)中以37℃，5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞。可在加入終濃度500μg/ml潮霉素的潮霉素選擇培養(yǎng)基(Calbiochem，SanDiego，CA)中2日后開始選擇步驟?？寺⊥ǔＴ陔姶┛缀?～3周出現(xiàn)。然后將培養(yǎng)物擴(kuò)展以用于進(jìn)一步的分析。
用ELISA測試法鑒別分泌嵌合抗體或人源化重鏈的陽性轉(zhuǎn)染瘤克隆。簡言之，將來自轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物的上清樣品(100μl)以三份加入用山羊抗-人(GAH)-IgG，F(xiàn)(ab′)2片段-特異性抗體(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)預(yù)包被的ELISA微量滴定板上。滴定板室溫下孵育1小時。用洗滌緩沖液(含0.05％聚山梨醇酯-20的PBS)洗板三次以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。將辣根過氧化物酶(HRP)綴合的GAH-IgG，F(xiàn)c片段-特異性抗體(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)加入孔內(nèi)，(100μl抗體稀釋儲存液×104，用未結(jié)合的抗體補(bǔ)充至終濃度1.0g/ml)。孵育1小時后，通常洗板三次。每孔加入反應(yīng)液[100μl含有167μg鄰苯二胺(OPD)(Sigma，St.Louis，MO)，0.025％過氧化氫的PBS]。在黑暗中顯色30分鐘。在每孔中加入50μl 4M HCI溶液終止反應(yīng)，然后用自動化ELISA讀數(shù)儀(Bio-Tekinstruments，Winooski，VT)測定490nm處吸光度。然后相對無關(guān)聯(lián)的嵌合抗體標(biāo)準(zhǔn)(可獲自Scotgen，Ltd.，Edinburg，Scotland)測定結(jié)合的嵌合抗體。
抗體可按下述方法從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物適于無血清培養(yǎng)基。為制備嵌合抗體，利用HSFM在滾瓶中將細(xì)胞生長為500ml培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物離心使細(xì)胞成團(tuán)，上清液經(jīng)0.2μm膜過濾。使過濾的培養(yǎng)基以1ml/分的速度通過A蛋白柱(1×3cm)。然后用約10個柱體積的PBS洗柱，用含10mM EDTA的0.1M甘氨酸的緩沖液(pH3.5)從柱上洗脫蛋白A結(jié)合的抗體。在10μl 3M Tris(pH8.6)的存在下，搜集1ml洗脫部分，測定280/260nm處吸光度確定蛋白質(zhì)濃度。將峰值洗脫級分集中，對PBS透析，用例如，Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)濃縮蛋白質(zhì)。用ELISA測定抗體濃度，如前，用PBS將其濃度調(diào)整至約1mg/ml。0.01％(w/v)的疊氮化鈉益于加入樣品作為保存劑。
本文中引用的所有出版物，專利以及專利申請均以全文引入作為參考。參照下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅用于舉例說明。本發(fā)明并不局限于實(shí)施例，而還包括根據(jù)此處提供的教導(dǎo)可明顯得出的所有變化形式。
實(shí)施例實(shí)施例1LL1重和輕鏈可變區(qū)的分子克隆和序列闡明。
采用如Leung等1993和Orlandi等(PNAS 863833-3837(1989)分別描述的VK5′-4和VK1FOR引物通過RT-PCR獲得mLL1的Vκ基因，然后將其克隆至pCR2.1 A T-克隆載體(Invitrogen)。對多個克隆測序以消除由PCR反應(yīng)導(dǎo)致的可能誤差。多數(shù)克隆(6)包含同樣的鼠Vκ序列，其被命名為LL1Vκ，然后將該序列顯示于圖1B中。與其它小鼠Vk序列的比較顯示出LL1Vk是κ輕鏈II亞類的成員。
因?yàn)镽T-PCR未能生成編碼小鼠VH基因的全長序列，故使用第二種克隆方法，cDNA 5′-末端(5′-RACE)的快速擴(kuò)增。采用通用錨引物(Life Technologies)和與鼠重鏈的CH1區(qū)退火的基因特異性引物，CH-1B(Leung等1994)通過PCR擴(kuò)增經(jīng)由LL1雜交瘤細(xì)胞制備結(jié)合體連接的cDNA。將PCR得到的～650bp的主要PCR種類克隆至pCR2.1A T-克隆載體并用DNA測序?qū)Χ鄠€克隆測序。PCR產(chǎn)物包含由非編碼序列和′5-端的分泌信號肽和γ1鏈的CH1區(qū)的部分編碼序列側(cè)接的全長VH序列(圖1A)。在編碼VH的被命名為LL1VH的序列中未發(fā)現(xiàn)缺陷突變。hLL1VH與其它小鼠VH序列的比較顯示出其屬于小鼠重鏈亞型多樣性(Kabat等1991)。通過LL1 VH和Vκ的氨基酸序列與Kabat數(shù)據(jù)庫中的鼠Ab V基因的比較并參照Kabat的定義，hLL1 VH和Vκ的CDR區(qū)分別如圖1A和B中所示進(jìn)行鑒別。通過LL1 VH和Vκ的氨基酸序列與Kabat數(shù)據(jù)庫中的鼠Ab V基因的比較并參照Kabat的定義，hLL1 VH和Vκ的CDR區(qū)分別如圖1A和B中所示進(jìn)行鑒別。
實(shí)施例2嵌合LL1的表達(dá)載體的構(gòu)建。
為評估克隆的Fv對LL1的真實(shí)性，構(gòu)建并表達(dá)嵌合LL1(cLL1)。采用引物為LL1VK-PvuII和VK1FOR的PCR，將LL1 Vk的核苷酸殘基7～12修飾為PvuII限制性位點(diǎn)，CAGCTG。所得PCR產(chǎn)物用PvuII和BgIII進(jìn)行酶切消化(部分地，因?yàn)閂k中存在內(nèi)在BgIII位點(diǎn))然后將其強(qiáng)制克隆至基于pBR327的staging載體(用PvuII和BcII酶切消化)，VkpBR2，其包括如Orlandi等1989和Leung等1994所使用的相同的Ig啟動子，信號肽序列和便于Vk PCR產(chǎn)物框內(nèi)連接的適宜的限制性位點(diǎn)。
LL1VK-PvuII5’-GAT GTTCAG CTGACC CAA ACT CCA CTC TCC-3’相似的，采用引物為LL1B-1和LL1F-1的PCR，將LL1VH的10-15和345-351位核苷酸序列分別轉(zhuǎn)變?yōu)镻stI和BstEII。然后VH PCR產(chǎn)物用PstI和BstEII進(jìn)行酶切消化然后將其連接至用PstI和BstEII酶切消化的VHpBS2，基于pBluescript的staging載體，其包括信號肽序列和便于VH PCR產(chǎn)物框內(nèi)連接的適宜的限制性位點(diǎn)(Orlandi，Gussow，等1989 741/ID}，其由VHpBS修飾而來(Leung，S.O.，Shevitz，J.，Pellegrini，M.C.，Dion，A.S.，Shih，L.B.，Goldenberg，D.M.，和Hansen，H.J.(1994))。
LL1B-15’-CAG ATC CAGCTG CAGCAG TCT GGA CCT GAG-3’LL1F-15’-GA GACGGT GAC CAG AGT CCC TTG GCC CCA A-3’cLL1VH和Vk的序列均用DNA測序進(jìn)行證實(shí)然后分別示于圖2A和2B中。
通過XbaI和BamHI雙限制性酶切消化將包含cLL1的Vk序列的片段與信號肽序列一起從LL1VkPBR2中切下。然后將～550bp Vk片段亞克隆至哺乳動物表達(dá)載體，pdHL2的XbaI/BamHI位點(diǎn)。將所得載體命名為cLL1VkpdHL2。相似的，通過XhoI和BamHI雙限制性酶切消化將包含LL1VH的約750bp的片段與信號肽序列一起從LLIVHPBS2中切下然后在瓊脂糖凝膠中通過電泳進(jìn)行分離。采用可與BamHI和HindIII二者的末端相比的連接子將該片段亞克隆至cLL1 VkPDHL2的XhoI和HindIII位點(diǎn)，得到最終表達(dá)載體，將其命名為cLL1PDHL2。
實(shí)施例3cLL1的轉(zhuǎn)染和表達(dá)將約30μg的cLL1PDHL2通過SalI酶切消化而線性化然后用電穿孔轉(zhuǎn)染至SP2/0-AGL4細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于96-孔板2日然后選擇MTX抗性。用ELISA測試法檢測來自存活于用于篩選人嵌合抗體分泌的選擇的克隆的上清。擴(kuò)展陽性細(xì)胞克隆然后在A蛋白柱上通過親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化cLL1。
實(shí)施例4結(jié)合活性檢測。
實(shí)施競爭細(xì)胞結(jié)合檢測以便評估cLL1相對親本mLL1的免疫反應(yīng)性。將恒量的125I-標(biāo)記的mLL1(100,000cpm)和Raji細(xì)胞在存在變化濃度的cLL1或mLL1的情況下于40℃孵育1-2h。洗滌后測定與細(xì)胞相關(guān)的放射活性。如圖中所示5，cLL2抗體表現(xiàn)出與mLL1相差不大的結(jié)合活性，證實(shí)了克隆的V基因的確實(shí)性。
該結(jié)果由基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的第二個競爭檢測得以證實(shí)。簡言之，使用前述Raji細(xì)胞和相對其它抗體而改變一種抗體的濃度，如前，結(jié)合的mLL1或cLL1的量用FITC-標(biāo)記的抗-小鼠Fc或抗-人Fc抗體然后利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的分析進(jìn)行測定。
在Raji細(xì)胞膜包被平板中實(shí)施ELISA競爭性結(jié)合檢測以便評估cLL1相對親本mLL1的免疫反應(yīng)性。通過超聲裂解和離心準(zhǔn)備Raji細(xì)胞膜碎片。將粗制膜提取物在96-孔平底PVC板上通過離心而包被并用0.1％戊二醛固定。將與變化濃度的mLL1或cLL1混合的恒量生物素化mLL1加至膜包被的孔中然后于室溫孵育1-2h。洗滌后，加入HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白，然后于室溫孵育1h。通過在加入包含4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽和0.04％ H2O2的底物溶液后于A490nm讀數(shù)來顯示HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白與膜結(jié)合的生物素化mLL1結(jié)合的量。
實(shí)施例5 人構(gòu)架區(qū)的選擇和LL1單克隆抗體的人源化的序列設(shè)計(jì)。
通過將cLL1的可變(V)區(qū)構(gòu)架區(qū)(FR)序列和Kabat數(shù)據(jù)庫中人抗體的進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)cLL1 VH和Vk的FR表現(xiàn)出分別與人抗體，RF-TS3 VH和HF-21/28Vk最高的序列同一性程度。將氨基酸序列顯示于圖3A和3B中并與cLL1VH和Vk序列比較。因此，分別選擇RF-TS3 VH的FR和HF-21/28 Vk的FR作為LL1 VH和Vk的CDR將移植至其上的人構(gòu)架區(qū)。然而，NEWM的FR4序列，而非RF-TS3的，用于替換用于LL1重鏈人源化的RF-TS3 FR4序列。參見圖3A。LL1 FR中靠近潛在CDR的少量氨基酸殘基保留在在基于前述指導(dǎo)(Qu等Clin.Cancer Rec.53095S-3100S(1990))的hLL1中。這些殘基是Vk的L46，F(xiàn)87和Q100(圖3B)和VH的I36，K37，Q46，A68，F(xiàn)91和S93(圖3A)。圖3A和3B比較了人、嵌合和人源化VH和Vk的氨基酸序列。圓點(diǎn)顯示了cLL1和hLL1中與人VH和Vk序列中相應(yīng)殘基相同的殘基。圖4A和4B中分別顯示了hLL1VH和Vk的DNA和氨基酸序列。
實(shí)施例6 人源化V基因的PCR/基因合成。
將Leung等(Leung等1994)所描述的改良策略利用聯(lián)合長寡核苷酸合成和PCR如圖5中所述而用于構(gòu)建hLL1的設(shè)計(jì)Vk和VH基因。為構(gòu)建hLL1 VH區(qū)，在自動化DNA合成儀(Applied Biosystem)上合成兩個長寡核苷酸，hLL1VHA(176-mer)和HLUVHB(165-mer)。hLL1 VHA序列代表hLL1 VH區(qū)的20～195nt5’-GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGGCCTCAG TGAAGGTTTCCTGCAAGGCT TCTGGATACA CCTTCACTAA CTATGGAGTG AACTGGATAAAGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTCAGTGGA TGGGCTGGAT AAACCCCAACACTGGAGAGC CAACATTTGA TGATGACTTC AAGGGA-3’hLL1 VHB序列代表與173～337nt互補(bǔ)的hLL1 VH區(qū)的負(fù)鏈5’-TCCCTTGGCC CCAATAAGCA AACCAGGCTT CGTTTTTACC CCTCGATCTTGAACAGAAAT ACACGGCAGT GTCGTCAGCC TTTAGGCTGC TGATCTGGAGATATGCCGTG CTGACAGAGG TGTCCAAGGA GAAGGCAAAT CGTCCCTTGAAGTCATCATC AAATG-3’hLL1 VHA和B的3′-末端序列(22nt殘基)彼此互補(bǔ)。在所述PCR條件下，hLL1VHA和B3′-末端退火而形成由長寡核苷酸的剩余部分側(cè)接的雙鏈DNA。每個退火的末端均作為單鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物，結(jié)果得到包含hLL1VH的nt20～337的雙鏈DNA。該DNA在存在兩個短寡核苷酸，hLL1VHBACK和hLL1VHFOR下進(jìn)一步擴(kuò)增以形成全長hLL1VH。
hLL1VHBACK5’-GTG GTGCTG CAGCAA TCT GGG TCT GAG TTC AAGAAG CC-3’hLL1VHFOR 5’-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA TTA ATG-3’以10μl 10×PCR緩沖液(500mM KCl，100mM Tris.HCL緩沖液，pH8.3，15mM MgCl2)，2μmol hLL1 VHBACK和hLL1VHFOR，和2.5單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，Ct)擴(kuò)增hLL 1 VHA和B的最小量(經(jīng)驗(yàn)確定的)。將該反應(yīng)混合物進(jìn)行3個循環(huán)的PCR反應(yīng)94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，和72℃聚合1.5分鐘，然后進(jìn)行27個循環(huán)的PCR反應(yīng)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，和72℃聚合1分鐘。凝膠純化hLL1VH的雙鏈PCR-擴(kuò)增的產(chǎn)物，用PstI和BstEII限制性酶切然后克隆至重鏈staging載體，VHpBS2的互補(bǔ)PstI/BstEII位點(diǎn)。
為構(gòu)建人源化Vk序列的全長DNA，按上述方法合成hLL1 VkA(159-mer)和hLL1VkB(169-mer)。通過如上述的兩個短寡核苷酸hLL1VkBACK和hLL1VkFOR擴(kuò)增hLL1VkA和B。
hLL1VHA序列代表hLL1VH區(qū)的16～174nt。
5’-CAGTCTCCAC TCTCCCTGCC CGTCACCCTT GGACAGCCGG CCTCCATCTCCTGCAGATCA AGTCAGAGCC TTGTACACAG AAATGGAAAC ACCTATTTACATTGGTTTCA GCAGAGGCCA GGCCAATCTC CAAGGCTCCT GATCTACACAGTTTCCAAC-3’hLL1 VHB序列代表與153～321nt互補(bǔ)的hLL1 VH區(qū)的負(fù)鏈。
5’-TGTCCCAGCA CCGAACGTGG GAGGAACATG TGAACTTTGAGAGCAGAAAT AAACCCCAAC ATCCTCAGCC TCCACCCTGC TGATTTTCAGTGTGAAATCA GTGCCTGACC CACTGCCGCT GAATCTGTCT GGGACCCCAGAAAATCGGTT GGAAACTGTG TAGATCAGG-3’hLL1VKBACK 5’-GAT GTTCAG CTGACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG-3’hLL1VKFOR 5’-G TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC AGC ACC GAA CG-3’
凝膠純化的hLL1Vk PCR產(chǎn)物用PvuII和BgLIII進(jìn)行限制性酶切然后克隆至輕鏈staging載體，VκpBR2的互補(bǔ)PvuI/BcII位點(diǎn)。通過分別將hLL1Vk和VH的XbaI-BamHI和XhoI/BamHI片段次序亞克隆至上述pdHL2而構(gòu)建最終的表達(dá)載體hLL1pdHL2。
實(shí)施例7 hLL1的轉(zhuǎn)染、表達(dá)和結(jié)合活性測定。
hLL1表達(dá)和結(jié)合活性測定的方法與關(guān)于cLL1所描述的相同。
利用Raji細(xì)胞膜提取物包被的平板實(shí)施ELISA競爭性結(jié)合檢測以便評估hLL1免疫反應(yīng)性。通過超聲裂解和離心準(zhǔn)備Raji細(xì)胞膜碎片。將粗制膜提取物在96-孔平底PVC板上通過離心而包被并用0.1％戊二醛固定。
將與變化濃度的mLL1或cLL1混合的恒量生物素化mLL1加至膜包被的孔中然后于室溫孵育1-2h。洗滌后，加入HRP-結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白然后于室溫孵育1h。通過在加入包含4mM鄰苯二胺二鹽酸鹽和0.04％ H2O2的底物溶液后于A490nm讀數(shù)來顯示HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白與膜結(jié)合的生物素化mLL1結(jié)合的量。如圖6中的競爭檢測所示，mLL1和cLL1抗體表現(xiàn)出相似的結(jié)合活性。同樣的，圖7中的競爭檢測，hLL1和cLL1抗體表現(xiàn)出相似的結(jié)合活性。
實(shí)施例8 hLL1的內(nèi)在化將標(biāo)準(zhǔn)抗體處理檢測用于評估hLL1在Raji細(xì)胞中的內(nèi)在化和代謝(Hansen等1996)。將細(xì)胞(107)1ml包含125I-標(biāo)記的hLL1或LL1(107cpm)的組織培養(yǎng)基中于37℃孵育1h。為確保Ab結(jié)合的特異性，在每個具有和不具有過剩標(biāo)記的Ab(終濃度為100μg/ml)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)立1/10樣本體積的對照(細(xì)胞，放射活性和培養(yǎng)基)。在結(jié)合孵育后，通過洗滌除去未結(jié)合的放射活性。計(jì)數(shù)特異性對照。在所有實(shí)驗(yàn)中，放射活性與細(xì)胞的結(jié)合至少90％被未標(biāo)記的Ab阻滯。然后將細(xì)胞在30ml新鮮培養(yǎng)基中重懸然后以1.5ml/孔分配到24-孔板上。保留1.5ml的樣品用于確定放射活性，其時起始結(jié)合的cpm。在CO2孵育器內(nèi)孵育平板。在3，24，48和72小時，按下述方法收集細(xì)胞。通過反復(fù)吸打?qū)⒓?xì)胞再懸浮然后移至錐形瓶?？缀鸵埔汗茏佑?ml新鮮培養(yǎng)基沖洗，將所述新鮮培養(yǎng)液加至初始細(xì)胞懸液中。將管以600×g離心10分鐘然后小心地收集1ml上清液(全部上清液的40％)然后計(jì)數(shù)放射活性。加入作為載體蛋白的BSA至終濃度1％然后用5ml冷10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)。在于40℃孵育30分鐘后以5000×g離心15分鐘，棄上清液，然后計(jì)數(shù)沉淀的蛋白質(zhì)的放射活性。未被TCA沉淀放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)被認(rèn)為發(fā)生了降解，而沉淀的放射性蛋白質(zhì)被認(rèn)為是完整的。在沖洗后計(jì)算細(xì)胞片狀沉淀物的仍保留在細(xì)胞中的放射活性。將每部分中的放射活性以初始結(jié)合的放射性的百分?jǐn)?shù)表示。如圖8A中所示，hLL1顯示出與鼠LL1在與Raji細(xì)胞結(jié)合后相似的快速內(nèi)在化和代謝模式，即幾乎全部的結(jié)合的放射活性被分解代謝然后在3小時內(nèi)釋放至上清中。這要遠(yuǎn)快于其它Abs的內(nèi)在化，如抗-CD22和抗-CD19(Hansen等1996)。早期時間點(diǎn)的研究證實(shí)了hLL1和mLLI具有相似的加工模式。大部分分解代謝在1小時內(nèi)完成(圖8B)。
實(shí)施例9 hLL1的細(xì)胞毒性在Raji細(xì)胞，人淋巴瘤細(xì)胞系中比較hLL1與mLL1以及cLL1的細(xì)胞毒性作用。將山羊抗-人IgG Fc片段特異性Ab(α-hFc)用作hLL1和cLL1的交聯(lián)劑而將山羊抗-小鼠IgG Fc特異性Ab(α-mFc)用于mLL1。在第0日將5×105Raji細(xì)胞接種于包含5μg/ml LL1 Ab和50μg/ml的適宜交聯(lián)劑的1ml培養(yǎng)基中。3日內(nèi)每日計(jì)數(shù)全部和存活細(xì)胞的數(shù)量。如圖9中所示，正常Raji細(xì)胞的總量在3日內(nèi)增加了4～5倍而在3日結(jié)束時細(xì)胞存活力保持＞80％。單獨(dú)用交聯(lián)劑，單獨(dú)用LL1 Ab或用LL1 Ab和不能比較的交聯(lián)劑(例如hLL1和山羊抗-小鼠IgG Fc特異性Ab)進(jìn)行處理的細(xì)胞無法與正常Raji細(xì)胞區(qū)分。然而，hLL1和抗-人IgG Fc特異性Ab的聯(lián)合有效地導(dǎo)致細(xì)胞死亡在一日內(nèi)細(xì)胞活力降低＞40％而在3日內(nèi)細(xì)胞幾乎全部死亡。將hLL1的效力與mLL1和cLL1的效力比較。當(dāng)使用Daudi細(xì)胞時觀測到相似結(jié)果(圖10)。在用另一內(nèi)在化Ab，hLL2(人源化抗-CD22 Ab)時未觀測到所述作用。這些結(jié)果證明了hLL1對淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒害作用要特別依賴細(xì)胞表面上Ab的交聯(lián)。
權(quán)利要求
1.人源化、人或嵌合抗-CD74抗體或其片段。
2.權(quán)利要求1的人源化抗-CD74單克隆抗體(mAb)或其片段，其中包含鼠抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3。
3.權(quán)利要求1的人源化抗-CD74單克隆抗體或其片段，其中包含所述人源化mAb的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
4.權(quán)利要求1的人源化抗-CD74單克隆抗體(mAb)或其片段，其中包含包括鼠抗-CD74(mLL1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其中所述人源化mAb的輕鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，及其中所述人源化mAb的重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
5.權(quán)利要求4的人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的FR包含至少一種從所述鼠mAb的所述相應(yīng)的FR取代的氨基酸。
6.權(quán)利要求5的人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述來自所述鼠mAb的氨基酸選自圖.3B的cLL1Vk序列的鼠輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基2，3，4，46，87和100，和圖.3A的cLL1VH序列的鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基5，37，38，46，68，91和93。
7.權(quán)利要求4的人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段包括圖.4A的重鏈可變區(qū)和圖.4B的輕鏈可變區(qū)。
8.權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段還包括人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)或其部分。
9.權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)的人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段是人源化IgG1。
10.權(quán)利要求1的嵌合抗-CD74(cCD74)單克隆抗體、(mAb)或其片段，其中包含鼠抗-CD74mAb的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3。
11.權(quán)利要求1的嵌合抗-CD74單克隆抗體或其片段，其中包含鼠抗-CD74mAb的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2，和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
12.權(quán)利要求11的嵌合抗-CD74(cCD74)單克隆抗體、(mAb)或其片段，其中包含含有鼠抗-CD74mAb的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和鼠抗-CD74mAb的構(gòu)架區(qū)(FR)的輕鏈和重鏈可變區(qū)和人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中所述嵌合mAb的輕鏈可變區(qū)包含鼠抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，而其中所述嵌合mAb的重鏈可變區(qū)包含鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
13.權(quán)利要求12的嵌合抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段包括圖.2A的重鏈可變區(qū)和圖.2B的輕鏈可變區(qū)。
14.權(quán)利要求12的嵌合抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段是嵌合IgG1。
15.權(quán)利要求1的人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其中包含人抗-CD74mAb的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有氨基酸序列TVSNRFS的CDR2，和含有氨基酸序列SQSSHVPPT的CDR3。
16.權(quán)利要求1的人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其中包括包含鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR的所述人mAb的重鏈可變區(qū)，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
17.權(quán)利要求1的人抗-CD74(huCD74)單克隆抗體(mAb)或其片段，其中包含人抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述人抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的huCD74 CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，而其中所述人mAb的重鏈可變區(qū)包括鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
18.權(quán)利要求17的人抗-CD74mAb或其片段，其中所述mAb或其片段是人IgG1。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的人、嵌合或人源化抗-CD74mAb或其片段，其中包含至少一種下述特性(a)所述mAb或其片段與CD-74的結(jié)合被特異性針對CD74的抗體或其片段阻斷；(b)所述mAb或其片段被培養(yǎng)物中的Raji淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)在化；和(c)所述mAb或其片段當(dāng)與山羊抗血清交聯(lián)時誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中的Raji淋巴瘤細(xì)胞的凋亡，所述山羊抗血清可與鼠IgG1 mAb的Fc反應(yīng)。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的人、嵌合或人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述片段是P(ab′)2、Fab、scFv、Fv、或使用F(ab′)2、Fab、scFv或Fv的部分或全部輕鏈和重鏈的融合構(gòu)建體，及其中所述片段與CD74結(jié)合。
21.權(quán)利要求20的人、嵌合或人源化抗-CD74MAb或其片段，其中所述融合蛋白是多價的，或多價且多特異性的。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的人、嵌合或人源化抗-CD74mAb或其片段，其中所述IgG1的恒定區(qū)被人IgG2A、IgG3或IgG4的人恒定區(qū)置換。
23.包含鼠抗-CD74mAb輕鏈可變區(qū)的CDR的鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段，所述CDR包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3。
24.包含鼠抗-CD74mAb重鏈可變區(qū)的CDR的鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段，所述CDR包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
25.包含鼠抗-CD74(mLL1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和鼠抗-CD74抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)的鼠抗-CD74單克隆抗體或其片段，其中所述鼠mAb的輕鏈可變區(qū)包括含有RSSQSLVHRNGNTYLH氨基酸序列的CDR1，含有TVSNRFS氨基酸序列的CDR2，和含有SQSSHVPPT氨基酸序列的CDR3，及其中所述鼠mAb的重鏈可變區(qū)包括含有NYGVN氨基酸序列的CDR1，含有WINPNTGEPTFDDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有SRGKNEAWFAY氨基酸序列的CDR3。
26.包含四個或多個權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的mAb或其片段的Fv或Fab的抗體融合蛋白。
27.包含一個或多個權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的mAb或其片段的Fv或Fab′，和一個或多個來自特異性針對不是CD74抗原的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的Fv或Fab′的抗體融合蛋白。
28.權(quán)利要求27的抗體融合蛋白，其中所述腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物選自B細(xì)胞家族抗原。
29.權(quán)利要求28的抗體融合蛋白，其中所述腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物是選自CD19，CD20和CD22的抗原。
30.權(quán)利要求27的抗體融合蛋白，其中所述腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物是選自HLA-DR，CD30，CD33，CD52 MUC1和TAC的抗原。
31.一種免疫綴合物，其中包括包含至少一種權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的與CD74結(jié)合的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的抗體成分，其中將所述抗體成分連接于診斷劑或治療劑上。
32.一種治療疾病或病癥的方法，包括對個體施以包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白或免疫綴合物的治療組合物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述疾病或病癥是表達(dá)CD74的惡性腫瘤。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述疾病或病癥選自免疫失調(diào)病，自身免疫性疾病，器官移植排斥和移植物抗宿主病。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述表達(dá)CD74的惡性腫瘤選自實(shí)體瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，另一B細(xì)胞惡性腫瘤和T細(xì)胞惡性腫瘤。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述實(shí)體瘤選自黑素瘤、癌和肉瘤。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述癌選自腎癌、肺癌、腸癌、胃癌和黑素瘤。
38.權(quán)利要求35的治療疾病或病癥的方法，其中所述B-細(xì)胞惡性腫瘤選自非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤，侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病和多發(fā)性骨髓瘤。
39.權(quán)利要求32-38任一項(xiàng)的治療疾病或病癥的方法，其中所述mAb或其片段或其抗體融合蛋白以20～2000mg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。
40.權(quán)利要求32-38任一項(xiàng)的治療疾病或病癥的方法，還包括施用至少一種治療劑或診斷劑。
41.權(quán)利要求40的治療疾病或病癥的方法，其中所述mAb或其片段在施用至少一種治療劑之前、期間或之后施用。
42.權(quán)利要求41的治療疾病或病癥的方法，其中所述治療劑選自抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、細(xì)胞毒害劑、酶和與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑、放射性核素、酶、激素、細(xì)胞毒害劑、反義寡核苷酸或其組合綴合的抗體。
43.權(quán)利要求42的治療疾病或病癥的方法，其中所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、血細(xì)胞生成因子、集落刺激因子、干擾素、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述血細(xì)胞生成因子是選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21及其組合的白介素。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾素。
48.權(quán)利要求44的方法，其中所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
49.權(quán)利要求42的治療疾病或病癥的方法，其中所述抗體選自可與CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD80，CD126、B7、MUC1、腱生蛋白、Ia、HM1.24和HLA-DR反應(yīng)的mAb或其片段，在藥學(xué)上可接受的載體中配制。
50.一種治療惡性腫瘤的方法，包括對患有除淋巴瘤或白血病外的CD74抗原陽性惡性腫瘤的個體施用包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物。
51.權(quán)利要求50的治療惡性腫瘤的方法，其中所述mAb或其片段或其抗體融合蛋白以20～2000mg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。
52.權(quán)利要求50的治療惡性腫瘤的方法，其中mAb或其片段或其抗體融合蛋白在施用至少一種用于治療惡性腫瘤的治療劑之前、期間或之后施用。
53.權(quán)利要求52的治療惡性腫瘤的方法，其中所述治療劑包括抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、細(xì)胞毒害劑、酶、放射性核素和與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑、酶、放射性標(biāo)記物、激素、反義寡核苷酸或細(xì)胞毒害劑或其組合綴合的抗體。
54.權(quán)利要求53的治療惡性腫瘤的方法，其中所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、血細(xì)胞生成因子、集落刺激因子、干擾素，促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述血細(xì)胞生成因子是選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21及其組合的白介素。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾素。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
60.權(quán)利要求53的治療惡性腫瘤的方法，其中所述抗體選自可與除CD74外的，由包含要被治療的惡性腫瘤的細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤標(biāo)記物反應(yīng)的mAb或其片段，所述mAb或其片段在藥學(xué)上可接受的載體中配制。
61.一種治療患有至少一種按免疫失調(diào)病和自身免疫性疾病進(jìn)行診斷的疾病的個體的方法，包括對所述個體施以包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物。
62.權(quán)利要求61的疾病治療方法，其中所述mAb或其片段或其抗體融合蛋白以20～2000mg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。
63.權(quán)利要求61或62的疾病治療方法，其中mAb或其片段或其抗體融合蛋白在施用至少一種用于治療疾病的治療劑之前、期間或之后施用。
64.權(quán)利要求63的疾病治療方法，其中治療劑包括抗體、酶、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、細(xì)胞毒害劑和與至少一種免疫調(diào)節(jié)劑、放射性標(biāo)記物、激素、酶、細(xì)胞毒害劑、反義寡核苷酸或其組合綴合的抗體。
65.權(quán)利要求64的疾病治療方法，其中所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、血細(xì)胞生成因子、集落刺激因子、干擾素、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述血細(xì)胞生成因子是選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21及其組合的白介素。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子
69.權(quán)利要求66的方法，其中所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾素。
70.權(quán)利要求66的方法，其中所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
71.權(quán)利要求64的疾病治療方法，其中所述抗體選自可與CD4，CD5，CD8，CD14，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD40L，CD46，CD52，CD54，CD80，CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、腱生蛋白和成熟HLA-DR二聚體反應(yīng)的mAb或其片段，所述mAb或其片段在藥學(xué)上可接受的載體中配制。
72.一種治療選自淋巴瘤、白血病、其它表達(dá)CD-74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病，自身免疫性疾病及其組合的疾病的方法，包括施以包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的治療組合物，其中通過化學(xué)綴合或基因融合將至少一種治療劑連接于mAb或其片段或其抗體融合蛋白的Fv或Fab′上。
73.權(quán)利要求72的疾病治療方法，其中所述治療劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、放射性標(biāo)記物、激素、酶或細(xì)胞毒害劑。
74.權(quán)利要求73的疾病治療方法，其中所述細(xì)胞毒害劑是藥物或毒素。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、血細(xì)胞生成因子、集落刺激因子、干擾素、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素或其組合。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述血細(xì)胞生成因子是選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21及其組合的白介素。
77.權(quán)利要求75的方法，其中所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子。
78.權(quán)利要求75的方法，其中所述干擾素選自α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾素。
79.權(quán)利要求75的方法，其中所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
80.一種疾病診斷方法，包括對已診斷為或疑為患有至少一種選自淋巴瘤、白血病、其它表達(dá)CD-74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病，自身免疫性疾病及其組合的疾病的個體施以包含藥學(xué)上可接受的載體和至少一種權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白的診斷組合物，其中通過化學(xué)結(jié)合將診斷劑連接于mAb或其片段或其抗體融合蛋白的Fv或Fab′上。
81.權(quán)利要求80的疾病診斷方法，其中所述診斷劑是放射性同位素，其中通過放射閃爍照相或PET檢測放射性同位素的光子。
82.權(quán)利要求80的疾病診斷方法，其中診斷劑是可通過MRI檢測的金屬。
83.權(quán)利要求80的疾病診斷方法，其中診斷劑是脂質(zhì)體或氣充的脂質(zhì)體，而其中脂質(zhì)體可通過超聲掃描裝置檢測。
84.一種包含權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的mAb或其片段共價連接于I類或II類MHC抗原肽而形成的抗體綴合物的疫苗，其中疫苗用于治療癌癥患者或感染性疾病患者。
85.權(quán)利要求84的疫苗，其中I類或II類抗原肽通過蛋白水解消化而通過抗原呈遞細(xì)胞從與所述mAb或其片段相連的較大肽或蛋白質(zhì)中釋放。
86.權(quán)利要求84或85的疫苗，其中通過融合編碼mAb或其片段的cDNA和編碼抗原肽或蛋白質(zhì)的cDNA，和在細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)抗體融合蛋白來制備抗體綴合物。
87.一種雙特異性或多特異性抗體，其中將權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的mAb或其片段或其抗體融合蛋白連接于特異性針對癌癥或炎性細(xì)胞標(biāo)記物、感染性疾病生物體表面上的表位或血液或其它體液中的有毒物質(zhì)的抗體或抗體片段上。
88.包含核酸的DNA序列，所述核酸編碼的mAb或其片段選自(a)權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的抗-CD74mAb或其片段；(b)權(quán)利要求31的免疫綴合物，(c)包含至少兩種權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的所述抗-CD74mAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段；(d)權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)的抗體融合蛋白或其片段；(e)權(quán)利要求84-86任一項(xiàng)的疫苗；和(f)權(quán)利要求87的雙特異性或多特異性抗體。
89.含有權(quán)利要求88的DNA序列的表達(dá)載體。
90.權(quán)利要求89的表達(dá)載體，其中載體是pdHL2或GS。
91.權(quán)利要求90的表達(dá)載體，其中所述pdHL2或GS載體，當(dāng)用于表達(dá)嵌合、人源化或人IgG時，編碼IgG1的重和輕鏈恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)。
92.含有權(quán)利要求88的DNA序列的宿主細(xì)胞。
93.權(quán)利要求92的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
94.權(quán)利要求93的宿主細(xì)胞，其中所述哺乳動物細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
95.權(quán)利要求94的宿主細(xì)胞，其中所述淋巴細(xì)胞是骨髓瘤細(xì)胞。
96.一種表達(dá)抗-CD74mAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的方法，包括(a)用權(quán)利要求88的DNA序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；和(b)培養(yǎng)分泌所述抗-CD74mAb或其片段或抗體融合蛋白或其片段的所述細(xì)胞。
97.權(quán)利要求96的方法，其中所述宿主細(xì)胞源自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
98.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的裸抗-CD74抗體或其片段或裸抗體融合蛋白或其片段用于治療選自表達(dá)CD74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病、自身免疫性疾病、器官移植排斥和移植物抗宿主病的病癥或疾病的用途。
99.包含權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段或免疫綴合物的治療性綴合物的用途，其中所述抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段或免疫綴合物與至少一種治療劑結(jié)合，所述用途是治療選自表達(dá)CD74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病、自身免疫性疾病、器官移植排斥和移植物抗宿主病的病癥或疾病。
100.包含權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段或免疫綴合物的診斷性綴合物的用途，其中所述抗-CD74抗體或其片段或抗體融合蛋白或其片段與至少一種治療劑結(jié)合，所述用途是診斷表達(dá)CD74的惡性腫瘤、免疫失調(diào)病、自身免疫性疾病、器官移植排斥、移植物抗宿主病或其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了人源化、嵌合和人抗－CD74抗體，CD74抗體融合蛋白，免疫綴合物，疫苗和與CD74，主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類恒定鏈，Ii結(jié)合的雙特異性抗體，其可用于診斷和治療B細(xì)胞病癥例如B細(xì)胞惡性腫瘤，其中細(xì)胞可與CD74反應(yīng)的其它惡性腫瘤和自身免疫性疾病，以及治療和診斷方法。
文檔編號C07K16/28GK1649902SQ03809863
公開日2005年8月3日 申請日期2003年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月1日
發(fā)明者H·漢森, S·-O·梁, Z·屈, D·M·戈登伯格 申請人:免疫醫(yī)療公司