專利名稱：在腫瘤細胞中選擇性增殖的腫瘤溶解病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過在腫瘤細胞中增殖來顯示抗腫瘤作用的病毒、該病毒含有的多核苷酸、含該病毒的抗癌劑和使用該病毒治療癌癥的方法。
背景技術：
現在，進行基因治療是癌癥的治療方法之一。但是，在基因治療中，由于使用非增殖性的病毒載體，在患病組織等部位導入基因，考慮人體的安全，只能在靶細胞周圍使用。另外，在現在的基因治療中，由于基因的導入效率低，不能得到令人滿意的治療效果。
在癌化細胞或永生化細胞株中，大多數情況下端粒末端轉移酶的活性增大，另一方面，已知除生殖類細胞、血球類細胞、上皮類干細胞等以外的正常體細胞，幾乎不能檢出端粒末端轉移酶的活性。
因此，本發(fā)明的主要目的是通過利用腫瘤細胞中活化的端粒末端轉移酶在腫瘤細胞中增殖病毒，以有效地殺滅腫瘤細胞。


圖1示出在腫瘤細胞中選擇性增殖的腫瘤溶解病毒的構造模式圖。在非增殖性病毒載體中缺失E1基因的區(qū)域插入由hTERT啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因構成的復制盒。
圖2示出在人癌細胞和正常細胞中的端粒末端轉移酶活性的比較。
圖3示出在人癌細胞和正常細胞在TRAD感染后表達的的E1A和E1B的mRNA和蛋白質。
圖4顯示了人癌細胞和正常細胞在TRAD感染后在細胞內的增殖。
圖5示出通過考馬斯亮藍染色在人癌細胞和正常細胞中由TRAD引起的細胞毒活性后的照片。
圖6示出在人癌細胞和正常細胞中由TRAD引起的細胞毒活性的顯微鏡照片。
圖7示出在人癌細胞和正常細胞由TRAD引起的細胞阻礙活性根據XTT測定法的圖。
圖8示出使用裸鼠和人肺癌細胞H358的非增殖性p53基因表達腺病毒載體的腫瘤內局部給藥的抗腫瘤效果的圖表。
圖9示出使用裸鼠和人大腸癌細胞SW620的TRAD的腫瘤內局部給藥的抗腫瘤效果的圖表。

發(fā)明內容
本發(fā)明人首先發(fā)現，通過使具有端粒末端轉移酶的啟動子和增殖能力的病毒感染癌細胞，使病毒在癌細胞中增殖，能夠殺滅癌細胞，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以下的1～10項。
1.一種多核苷酸，含人端粒末端轉移酶的啟動子和至少一種E1基因。
2.如上述第1項記載的多核苷酸，其中的E1基因是來自腺病毒的E1基因。
3.如上述第1或第2項記載的多核苷酸，其中的人端粒末端轉移酶的啟動子是hTERT。
4.如上述第1～3中任一項記載的多核苷酸，其中的E1基因按以下順序按序含有以下基因E1A基因、IRES序列和E1B基因。
5.一種病毒，其含有如上述第1～4中的任一項記載的多核苷酸。
6.如上述第5項記載的病毒，其病毒是腺病毒。
7.一種抗癌劑，含上述第5或第6項記載的病毒作為有效成分、及藥用可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
8.一種癌癥的治療方法，其使用上述第5或第6項記載的病毒或前述第7項記載的抗癌劑進行治療。
9.如上述第8項記載的治療方法，其中的癌癥至少包含下列部位中的一種癌癥胃、大腸、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、膽囊·膽管、乳房、子宮、甲狀腺和卵巢。
10.如上述第9項記載的治療方法，其中的癌癥至少包含骨肉瘤和腦瘤中的一種。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征在于，基于許多種類的癌細胞具有端粒末端轉移酶活性這一發(fā)現，使用具有端粒末端轉移酶的啟動子和增殖能力的病毒感染癌細胞，通過在癌細胞中增殖該病毒而殺滅癌細胞。
本發(fā)明中所用的病毒沒有特別限制，但是，從安全性等考慮，優(yōu)選使用腺病毒。另外，在腺病毒中，從使用簡便等方面考慮，特別優(yōu)選使用5型腺病毒。
所謂含病毒的多核苷酸的E1基因，是指病毒具有的DNA復制的早期基因(早期E)和晚期基因(晚期L)中的早期基因之一，E1基因編碼有關控制病毒·染色體轉錄的蛋白質。
本發(fā)明中所用的E1基因，可使用來自任何病毒的E1基因，但是，優(yōu)選使用來自腺病毒的E1基因。
另外，E1基因，已知由E1A、E1B等構成。通過E1A基因編碼的E1A蛋白質，可以活化在病毒產生感染能力時使必需的基因群(E1B、E2、E4等)的轉錄。
由E1B基因編碼的E1B蛋白質，可幫助晚期基因(L基因)的mRNA在感染的宿主細胞的細胞質中累積，阻礙宿主細胞蛋白質的合成，促進病毒的復制。腺病毒的E1A基因和E1B基因的序列，分別用以下的序列1和2表示。
在本發(fā)明中，E1基因也可以直接使用公知的基因，但優(yōu)選使用以E1A基因、IRES序列和E1B基因的順序具有的基因，即，將IRES序列插入E1A基因和E1B基因之間的基因。因為這可以使病毒感染宿主細胞時增殖能力提高。
只要可以達到本發(fā)明的效果，也可以將至少一個核苷酸插入選自下列位置中的至少一處IRES序列和E1A基因之間、IRES序列和E1B基因之間、E1A基因的上游和E1B基因的下游。另外，只要可以達到本發(fā)明的效果，在E1A基因、IRES序列、E1B基因或E1基因中，至少一個，優(yōu)選多個核苷酸被置換、缺失、插入或添加也是可以的。
IRES序列，是在小核糖核酸病毒科的病毒中特異性的蛋白質合成開始信號，因具有與18S核糖體RNA的3’末端互補的序列而被認為具有作為核糖體結合部位的效果。已知來自小核糖核酸病毒科的病毒的mRNA通過該序列翻譯。
IRES序列的翻譯效率高，在mRNA的中間也可進行非依賴帽結構的蛋白質合成。因此，在該病毒中，通過人端粒末端轉移酶的啟動子對E1A基因、和IRES序列下游的E1B基因兩者各自進行獨立的翻譯。IRES序列如下述的序列3所示。
再者，在本發(fā)明中，E1基因優(yōu)選在其上游具有人端粒末端轉移酶的啟動子。因為在具有端粒末端轉移酶活性的癌細胞內，可促進本發(fā)明病毒的增殖。人端粒末端轉移酶的啟動子，只要來自人啟動子，其種類等就沒有限定，但其中優(yōu)選hTERT。
hTERT是編碼人端粒末端轉移酶逆轉錄酶的基因，確認在其5’末端的上游1.4kbp的區(qū)域有許多轉錄因子結合序列?？烧J為該區(qū)域是hTERT啟動子，但是，其中翻譯開始部位的上游181bp的序列是下游基因表達的重要的核心區(qū)域。
在本發(fā)明中，人端粒末端轉移酶的啟動子，如果是包含該核心區(qū)域的啟動子，那么可以沒有限制地使用，但是，優(yōu)選使用完全包含該核心區(qū)域的上游的約378bp的序列作為hTERT啟動子。對于該約378bp的序列，確認其基因表達效率與單獨181bp的核心區(qū)域的情況等同。hTERT的序列如下述序列4所示。
具有本發(fā)明的端粒末端轉移酶的啟動子和E1基因(含E1A基因、IRES基因和E1B基因的基因)的基因，可通過常規(guī)基因工程方法得到。
作為E1基因，可以使用含有其的公知病毒的E1基因，其中，優(yōu)選腺病毒的E1基因。
例如，可在表達E1基因的細胞中，優(yōu)選在表達E1基因的293細胞等中，使用E1A-S、E1A-AS、E1B-S，E1B-AS等引物，通過進行RT-PCR和/或DNA-PCR，可以擴增E1A基因和E1B基因。根據需要，使用TA克隆之類的公知方法確認序列后，使用EcoRI之類的限制酶，可切割E1A和E1B的DNA片斷。
通過常規(guī)基因工程學手段，可將E1B和E1B插入pIRES之類公知的載體中，在該載體中制成E1A-IRES-E1B序列。然后，可將用M1uI、Bg1II等限制酶切割的hTERT啟動子序列，插入到位于E1A上游的XhoI等部位。
根據需要，可使用用MfeI、NheI等限制酶切割去除pShuttle等公知的載體中含有的巨細胞病毒(CMV)啟動子，在該部位可插入通過用限制酶NheI和NotI切割phTERT-E1A-IERS-E1B得到的序列(得到的序列稱為“pSh-hAIB”)。
使用I-CeuI、Pl-SceI等限制酶從pSh-hAIB切割出必要部分的(含hTERT啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因)序列，使用Adeno-X Expression System(CLONTECH)等市售的試劑盒，可插入到Adeno-X病毒DNA等病毒的DNA中(得到的序列稱為“AdenoX-hAIB”。)。
含上述hTERT啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的序列，只要能達到本發(fā)明的效果，可插入到病毒基因的任何部分，但是，例如，在基因治療用的腺病毒中，由于E1基因缺失，因此優(yōu)選插入到其缺失部分。
通過PacI等公知的限制酶使AdenoX-hAIB線性化后，轉染293細胞等培養(yǎng)細胞，可制作具有感染性的重組腺病毒(得到的病毒，稱為“本發(fā)明的病毒”或“TRAD”)。轉染方法沒有限制，從效率考慮，優(yōu)選使用磷酸鈣法、電穿孔法等。
如上所述得到的本發(fā)明的病毒，可使用常規(guī)增殖病毒方法，例如感染293細胞等宿主細胞等進行增殖。
本發(fā)明的病毒，可作為抗癌劑使用。例如，不僅可用于癌癥的治療，而且也可用于手術后癌癥復發(fā)的預防，轉移的防止和/或預防等。
本發(fā)明的抗癌劑適用的癌癥的種類沒有限制，可用于所有種類的癌癥。例如，對胃、大腸、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、膽囊·膽管、乳房、子宮、甲狀腺、卵巢等的癌癥，以及腦瘤、骨肉瘤等有效，其中對實體瘤尤為有效。
本發(fā)明的抗癌劑，可以直接使用于患病部位，或以公知的方法，例如，通過靜脈、肌肉、腹腔內或皮下注射；通過從鼻腔、口腔或肺吸入；經口服、栓劑、外用劑等導入人體(靶細胞或臟器)。
另外，本發(fā)明的病毒，例如，通過冷凍干燥等方法處理便于操作后，以其原狀或與賦形劑、增重劑、粘合劑、潤滑劑等公知的藥用可接受的載體、公知的添加劑(包括緩沖劑、等滲化劑、螯合劑、著色劑、保存劑、香料、調味劑、甜味劑等)等相混合，可制備醫(yī)藥組合物。
本發(fā)明的抗癌劑，根據片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、水劑、糖漿等口服劑；注射劑、外用劑、栓劑、滴眼劑等非口服劑等形態(tài)，可經口服或不經口服給藥。優(yōu)選例如經肌肉、腹腔等局部注射、經靜脈注射等。
給藥量，根據有效成分的種類、給藥路徑、給藥對象、患者的年齡、體重、性別、癥狀等其它條件適當選擇，但是，一日給藥量，通常作為有效成分的本發(fā)明病毒量為106-1011PFU左右，優(yōu)選為109-1011PFU左右，可以每日給藥一次，也可以每日給藥多次。
另外，在使用本發(fā)明的病毒時，通過使用公知的免疫抑制劑等抑制生物體的免疫功能，可以使該病毒易于感染。
而且，本發(fā)明的病毒，可與在現有基因治療中使用的、例如包含p53基因之類的非增殖性病毒、公知的抗癌劑和放射線組成的組中選出的至少一種的抗癌劑組合使用。
感染生物體(癌細胞和癌組織)的本發(fā)明的病毒，可在該細胞內增殖，并殺滅該細胞。通過殺滅這樣的癌細胞，可治療癌癥、抑制癌細胞增殖、防止癌細胞轉移等。
由于下述理由，本發(fā)明的抗癌劑產生副作用的可能性極小，被認為是非常安全的制劑。
(1)在正常體細胞中，幾乎沒有端粒末端轉移酶活性，而且，由于腺病毒自身難以感染造血細胞等浮游細胞，因此使用本發(fā)明的腺病毒時，對腫瘤種類的選擇性很高。
(2)由于本發(fā)明的病毒具有增殖能力，所以可以比常規(guī)基因治療用非增殖性病毒更低的濃度進行使用。
(3)即使在本發(fā)明的病毒過量給藥的情況下，也可通過生物體內常規(guī)免疫作用起到抵抗病毒的作用。
實施例以下，列舉實施例以更詳細地說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于此。
實施例1
<TRAD的制備>
使用特異性的引物(E1A-S序列5，E1A-AS序列6)對由293細胞提取的RNA進行RT-PCR，擴增899bp的E1A基因。使用引物(E1B-S序列7，E1B-AS序列8)對由293細胞提取的DNA進行DNA-PCR，擴增1823bp的E1B基因。
對各自的PCR產物進行TA克隆(TA克隆試劑盒雙啟動子；Invitrogen)，確認序列后，通過限制酶EcoRI，分別切割出899bp(E1A)、1823bp(E1B)的DNA片斷。
在pIRES載體(CLONTECH)的M1uI切斷部位、及Sa1I部位，各自正向插入E1A和E1B(E1A-IRES-E1B)。
將用限制酶M1uI和BglII切割的455bp的hTERT啟動子序列，正向插入在E1A-IRES-E1B的E1A上游的XhoI部位(phTERT-E1A-IRES-E1B)。
通過限制酶MfeI和NheI處理，除去pShuttle載體含有的巨細胞病毒(CMV)的啟動子，在其部位插入用限制酶NheI和NotI切割phTERT-E1A-IRES-E1B得到的3828bp的序列(pSh-hAIB)。
通過限制酶I-CeuI和P1-SceI從pSh-hAIB切割出4381bp的序列，并插入到Adeno-X Expression System(CLONTECH)的腺-X病毒DNA中(腺X-hAIB)。用限制酶PacI對腺X-hAIB進行線性化處理后，使用磷酸鈣法轉染293細胞，制作具有感染性的重組腺病毒(TRAD)。該TRAD的模式圖如圖1所示。
實施例2<人癌細胞和正常細胞的端粒末端轉移酶活性的比較>
從人肺癌細胞(A549、H226Br、H1299)、人大腸癌細胞(SW620、DLD-1、LoVo)、人胎兒腎臟細胞293、SV40基因導入的永生化人血管內皮細胞HUVEC、人正常纖維母細胞(W138、NHLF)的10種細胞中，使用RNAzol(Cinna/Biotecx)提取RNA，使用LightCycler和LightCycler DNA TeloTAGGG 試劑盒(Roche MolecularBiochemicals)，進行實時定量的逆轉錄(RT)-PCR，比較各個細胞的hTERT基因的表達水平。結果如圖2所示。
將表達水平最高的A549細胞作為1.0進行比較，確認A549、H226Br、H1299、SW620、DLD-1、LoVo等癌細胞和293細胞中為0.18～1.00的hTERT基因表達，但是，在永生化的HuVEC細胞和WI38、NHLF等正常細胞中沒有檢出其表達。
實施例3<在人癌細胞和正常細胞中，TRAD感染后的E1A和E1B的mRNA和蛋白質的表達>
在體外培養(yǎng)人大腸癌細胞SW620和人正常纖維母細胞WI38，用0.1和1 MOI(感染復數)的濃度感染TRAD后，在36小時后回收RNA。使用293細胞作為陽性對照。
使用GeneAmp RNA PCR核心試劑盒進行逆轉錄(RT)，使用針對E1A和E1B基因的引物，通過GeneAmp PCR system 9700thermal cycler(PE Applied Biosystems)進行30次循環(huán)的擴增。PCR產物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠染色可視化(圖3A上的2處)。在凝膠影像分析儀上測定帶強度，將GAPDH作為內標物進行定量并制圖(圖3A下面)。
在體外培養(yǎng)人大腸癌細胞SW620和人正常纖維母細胞WI38，用0.1和1 MOI的濃度感染TRAD的48小時后回收吸附的細胞，在溶解液中反應30分鐘之后進行離心，測定上清液的蛋白質濃度。在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉移至膜上后，用抗腺病毒5型E1A抗體(PharMingen International)進行蛋白質印跡分析。結果示于圖3B。
在癌細胞SW620中，發(fā)現通過TRAD感染后E1A基因(502bp)、E1B基因(543bp)的表達明顯增強，但是，在正常細胞WI38中，僅發(fā)現其微弱的表達(圖3A)。在陽性對照的293細胞中，確認其表達水平適中。
通過蛋白質印跡分析，E1A蛋白質的表達隨SW620中的0.1MOI、1 MOI和TRAD的濃度而增強(圖3B)。另一方面，在WI38中，即使采用1 MOI的TRAD，也幾乎檢出不到E1A蛋白質的表達。
實施例4<人癌細胞和正常細胞在TRAD感染后的細胞內增殖的研究>
在人癌細胞(SW620和H1299)和人正常細胞(WI38和NHLF)中用1 MOI TRAD于37℃感染2小時，棄去含TRAD的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)液洗滌一次，再加入新鮮培養(yǎng)液。此后立即在第0天用刮刀回收細胞，反復凍融后，懸浮在1毫升的培養(yǎng)液中。而且，用同樣的方法回收第1天、第2天、第3天、第5天、第7天的病毒，進行病毒滴度測定。結果在圖4示出。
在為正常細胞的WI38或NHLF中，測出102PFU的TRAD在第3天增殖至105PFU左右，其增殖了100-1000倍，但是，在癌細胞SW620和H1299中，確認為107-108PFU，其增殖了105-106倍，確認為癌細胞特異性病毒增殖。
實施例5<TRAD對于人癌細胞和正常細胞的細胞毒活性>
將5種人癌細胞(SW620、H1299、A549、DLD-1、H226Br)以6～8×104個/孔和2種人正常細胞(WI38、NHLF)以2～4×104個/孔分別接種在24孔板中，在24小時后，用0.01、0.1、1、2、5 MOI的TRAD感染。從感染開始96小時后，在顯微鏡下觀察SW620、DLD-1、NHLF細胞的形態(tài)學變化。并且棄去全部細胞的培養(yǎng)液，活細胞用考馬斯亮藍染色，用掃描儀讀取放大的影像。
將SW620、H1299以104個/孔、NHLF以5×103個/孔接種在96孔板中，用0(非感染細胞)、0.01、0.1、1 MOI的TRAD進行感染，用XTT測定法，測定第1天、第2天、第3天、第5天、第7天的活細胞數。按每4孔依次測定，將非感染細胞作為1.0，作平均值+/-SD圖。其結果分別示于圖5、6和7。
在SW620、H1299、A549、DLD-1、H226Br等癌細胞中，確認細胞數隨TRAD的濃度依賴性地減少，藍色染色區(qū)域減少。另一方面，在WI38、NHLF等正常細胞中，沒有發(fā)現蘭色染色活細胞數顯著減少(圖5)。
在顯微鏡觀察中，SW620、DLD-1細胞從板的底面剝離并變圓，細胞密度也減少，但是，在NHLF中，幾乎沒有發(fā)生形態(tài)學的變化，細胞數也沒有減少(圖6)。
在SW620和H1299中，通過1 MOI的TRAD感染后的第3天，確認幾乎100％的細胞死亡，而0.1 MOI組也有80％以上的細胞數減少。相反，在NHLF中觀察到，即使第3天幾乎沒有細胞數的減少，第7天用1 MOI的TRAD的組表達細胞數降低了約60％，但是用0.01MOI的組則完全沒有病毒的影響(圖7)。
實施例6<使用動物模型的TRAD抗腫瘤活性的研究>
在5-6周齡裸鼠的背部皮下移植5×106個人肺癌細胞H358，在直徑約為5-6毫米時，在連續(xù)2天在腫瘤內局部處注入表達p53基因的非增殖性腺病毒載體(Ad-p53)1×108PFU、3×108PFU、1×109PFU。此后，定期測定正交的腫瘤直徑，按(長徑)×(短徑)2/2算出推定腫瘤重量。使用沒有插入基因的非增殖性腺病毒載體-dl312作為空白對照。
在5-6周齡裸鼠的背部皮下移植5×106個人大腸癌細胞SW620，在直徑為約5-6毫米時，連續(xù)3天在腫瘤內局部處注入2×107PFU的dl312和4×103PFU的TRAD。同樣方法測定腫瘤直徑，算出推定腫瘤重量。結果如圖8和圖9所示。(圖中，Mock表示對照，以PBS(磷酸緩沖液)進行給藥)。
通過以3×108PFU、1×109PFU的Ad-p53進行給藥，有效地抑制了H358腫瘤的增殖(p＜0.05)。但是，在以1×108PFU的Ad-p53的給藥，被認為未能有效地抑制腫瘤的增殖(圖8)。另外，在對照的dl312給藥中，腫瘤增殖完全沒有受到影響。
通過以相比具有抗腫瘤效果的Ad-p53低很多的、4×103PFU濃度的TRAD對腫瘤內部進行給藥，能夠顯著性差異地抑制SW620腫瘤的增殖(p＜0.05)。在對照的dl312給藥中，腫瘤增殖完全沒有受到影響。
綜上所述，可以表明本發(fā)明的病毒可在癌細胞中有效地增殖，并殺滅癌細胞。另外，由于本發(fā)明的癌細胞具有增殖能力，所以即使低濃度下也能發(fā)揮強大的抗癌作用，通過降低給藥病毒的濃度，可抑制副作用。
序列表<110>關西TLO株式會社，藤原俊義，田中紀章，京哲<120>利用具有腫瘤特異復制能力的病毒進行的腫瘤細胞溶解<130>P03-75<150>JP2002-198941<151>2002-07-08<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>899<212>DNA<213>293細胞<400>1acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct120agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa180gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag240gaagggattg acttactcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt300tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt360gtaccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag420gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg480tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat540atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag600ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga660cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt720
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1.一種多核苷酸，其含有人端粒末端轉移酶的啟動子和至少一種E1基因。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其E1基因是來自腺病毒的E1基因。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其人端粒末端轉移酶的啟動子為hTERT。
4.如權利要求1～3任一項所述的多核苷酸，其E1基因依次含有E1A基因、IRES序列和E1B基因。
5.一種病毒，其含有權利要求1～4任一項所述的多核苷酸。
6.如權利要求5所述的病毒，所述病毒為腺病毒。
7.一種抗癌劑，其含有權利要求5或6所述的病毒作為有效成分、藥用可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
8.一種治療癌癥的方法，其使用權利要求5或6所述的病毒或者權利要求7所述的抗癌劑進行治療。
9.如權利要求8所述的治療方法，其中，癌癥選自胃、大腸、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、膽囊·膽管、乳房、子宮、甲狀腺和卵巢中的至少一種。
10.如權利要求9所述的治療方法，其中，癌癥是選自骨肉瘤和腦瘤中的至少一種。
全文摘要
通過使用具有某種基因序列的病毒以及使用該病毒的抗癌劑，并使所述病毒在腫瘤細胞中增殖，可顯示有效的抗癌作用；其中，所述基因序列含有端粒末端轉移酶的啟動子，與含有E1基因、優(yōu)選E1A基因、IRES序列和E1B基因的序列。
文檔編號C07K14/075GK1665927SQ0381606
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月7日 優(yōu)先權日2002年7月8日
發(fā)明者藤原俊義, 田中紀章, 京哲, 白木屋佳子, 川島健 申請人:關西Tlo株式會社, 藤原俊義, 田中紀章, 京哲