專利名稱：pH偏移的等電位捕集離析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請(qǐng)的領(lǐng)域是兩性化合物的分離和濃縮。更具體地說，本發(fā)明申請(qǐng)涉及使用pH偏移捕集技術(shù)改變包含至少一種兩性樣品組份的樣品組成的方法。
背景技術(shù)：
電泳技術(shù)和等電點(diǎn)聚焦(IEF)技術(shù)特別仍然是用于分離小的和大的、簡(jiǎn)單的和復(fù)雜的等兩性組份的關(guān)鍵技術(shù)。IEF用于許多領(lǐng)域和工業(yè)中，可在分析和制備規(guī)模上進(jìn)行。例如，IEF用于臨床診斷、生物工藝學(xué)、藥品和食品工業(yè)等，可以單獨(dú)或者與其它的分析或者制備技術(shù)結(jié)合使用。
在IEF中，在pH梯度中借助于電場(chǎng)分離兩性組份，其中pH從陽極處較低的pH值增加到陰極處較高的pH值。(關(guān)于IEF的專題論文見例如，P.G.Righetti，Isoelectric focusingtheory，methodology andapplications，Elsevier Biomedical，Amsterdam，1983，在此引入作為參考。)因?yàn)閮尚越M份的凈電荷在等電狀態(tài)下為零，每當(dāng)它的環(huán)境pH變成等于它的等電點(diǎn)(pl)值時(shí)，兩性組份的電泳遷移速度就變成零。因此，具有不同pl值的兩性組份在pH梯度下在不同的點(diǎn)停止遷移。
相對(duì)穩(wěn)定的連續(xù)pH梯度可以由幾種手段產(chǎn)生。例如，可使用載體兩性電解質(zhì)(在它們pl值鄰近處具有足夠緩沖能力和電導(dǎo)率的化合物)的混合物。此外，適當(dāng)數(shù)量的適當(dāng)?shù)娜跛岷腿鯄A或者弱酸和強(qiáng)堿或者強(qiáng)酸和弱堿可以體積控制方式結(jié)合為一種離子可滲透的基質(zhì)，比如一種交聯(lián)的聚丙烯酰胺凝膠，以形成并穩(wěn)定pH梯度，其然后被用作固定不動(dòng)的pH梯度IEF(IPGIEF)。(關(guān)于IPGIEF的專題論文見例如，P.G.Righetti，Immobilized pH gradientstheory and methodology，Elsevier，Amsterdam，1990，在此引入作為參考。)。
做為選擇，兩性樣品組份還可以使用基于等電位膜的多隔室電解槽(例如，F(xiàn)aupel et al，U.S.5,082,548，在此引入作為參考)通過等電位捕集(IET)彼此進(jìn)行分離，其中在IET分離過程結(jié)束時(shí)，得到了處于它們等電狀態(tài)的兩性樣品組份。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明申請(qǐng)的實(shí)施方式，使用pH偏移的等電位捕集(IET)方法，通過加入一種或多種適當(dāng)?shù)脑谄鋚l值鄰近具有足夠緩沖量、滴定容量和電導(dǎo)率的等電位緩沖劑電泳改變包含至少一種兩性組份樣品的初始成分，以在IET過程結(jié)束時(shí)得到其非等電狀態(tài)的兩性樣品組份。
簡(jiǎn)要地，根據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的一種實(shí)施方法提供選擇具有至少一個(gè)離子可滲透的等電位阻擋層的電泳分離體系，提供選擇具有比兩性樣品組份pl值較低的pH值的陽極電解液，提供選擇具有比兩性樣品組份pl值較高pH值的陰極電解液，提供具有比陽極電解液較高的和比陰極電解液pH值較低的pl值，而且與兩性樣品組份pl值不同的等電位緩沖液，將樣品和等電位的緩沖液引入電泳體系，通過進(jìn)行電泳分離捕集非等電狀態(tài)的兩性樣品組份。
一個(gè)方面提供選擇具有一種或多種分離隔室的電泳分離系統(tǒng)。另外的方面提供選擇兩個(gè)或更多離子可滲透等電位的阻擋層，所述的阻擋層的pl值不同于兩性樣品組份和等電位緩沖液的pl值。
另外的方面提供選擇第二等電位的緩沖液，所述的緩沖液的pl值不同于兩性樣品組份、第一等電位緩沖液和等電位阻擋層的pl值。另外的方面提供通過進(jìn)行電泳分離捕集第一兩性樣品組份和第二兩性樣品組份，所述的兩性樣品組份在非等電阻擋層的在兩個(gè)邊上都處于非等電狀態(tài)。
在第一方面，本發(fā)明提供一種關(guān)于利用電泳分離兩性組份的方法，該方法包括在電泳分離系統(tǒng)中安置含具有一定pl值兩性組份的樣品，所述的系統(tǒng)包括具有一定pH的陽極電解液和具有一定pH的陰極電解液，該陰極電解液的pH比陽極電解液pH高，布置于該陽極電解液和陰極電解液之間的一種或多種離子可滲透阻擋層，其中至少一個(gè)阻擋層是具有一定pl值的非等電阻擋層，所述的pl值比陽極電解液pH高但比陰極電解液pH低；提供一種具有一定pl值的等電位的緩沖液，所述的pl值比該陽極電解液的pH高，但比該陰極電解液的pH低，而且不同于兩性樣品組份的pl值，不同于離子可滲透的等電位阻擋層的pl值；及使樣品置于電位下以在電泳系統(tǒng)中在等電緩沖液存在下收集非等電狀態(tài)的兩性樣品組份。
優(yōu)選，該電泳分離系統(tǒng)包括含陽極和適合于容納該陽極電解液的陽極室，含陰極和適應(yīng)于容納陰極電解液的陰極室，布置于陽極室和陰極室之間以具有一定pl值的離子可滲透的等電位阻擋層形式的一個(gè)離子可滲透阻擋層。
優(yōu)選，該電泳分離系統(tǒng)進(jìn)一步包括布置于該陽極室和該陰極室之間的第一和第二離子可滲透阻擋層，在陽極室和陰極室之間形成第一分離隔室。
在優(yōu)選的形式中，第一和第二離子可滲透阻擋層是等電位的阻擋層，每一個(gè)具有確定的但是不同的pl。
將樣品提供到樣品隔室、陽極室或者陰極室的至少一個(gè)中。在一個(gè)優(yōu)選的形式中，將樣品提供到樣品隔室，在樣品隔室中在非等電狀態(tài)下分離兩性組份。做為選擇，在樣品隔室、陰極室或者陽極室中得到非等電狀態(tài)的兩性組份。
預(yù)期樣品包含兩個(gè)或更多的兩性組份，所述的組份在樣品隔室、陰極室、陽極室、兩個(gè)或更多的樣品隔室、陽極室或者陰極室中以非等電狀態(tài)得到。
該電泳分離系統(tǒng)可進(jìn)一步包含布置于陽極室和陰極室之間的第三離子可滲透阻擋層，形成鄰近第一分離隔室的第二分離隔室，該系統(tǒng)具有第一pl值的第一離子可滲透等電位阻擋層和第二pl值的第二離子可滲透等電位阻擋層，第二pl值不同于第一離子可滲透等電位阻擋層的第一pl值。
優(yōu)選，所有的離子可滲透阻擋層是等電位的阻擋層，每一個(gè)具有確定的但是不同的pl。預(yù)期任一或更多的阻擋層可以是等電位的阻擋層。
在該形式中，樣品可以被提供到第一樣品隔室、第二樣品隔室、第一和第二樣品隔室、陽極室或者陰極室。在第一樣品隔室、第二樣品隔室、陰極室或者陽極室中得到非等電狀態(tài)的兩性組份。
樣品包含兩個(gè)或更多的兩性組份，所述的兩性組份在第一樣品隔室、第二樣品隔室、陰極室、陽極室或者第一樣品隔室和第二樣品隔室的每一個(gè)中以非等電狀態(tài)得到。
在另外的優(yōu)選形式中，該電泳分離系統(tǒng)包括多個(gè)布置于陽極室和陰極室之間的離子可滲透阻擋層，形成布置于陽極陰極室之間的多個(gè)分離隔室， 其中，兩個(gè)或更多的離子可滲透阻擋層是離子可滲透等電位阻擋層，每一個(gè)具有不同的pl值。三個(gè)或更多的離子可滲透阻擋層可以是離子可滲透等電位阻擋層，每一個(gè)具有不同的pl值。預(yù)期所有的離子可滲透阻擋層可以是離子可滲透等電位阻擋層，每一個(gè)具有pl值。
該方法可以包括將每一個(gè)具有不同的pl值的第一等電位的緩沖液和第二等電位的緩沖液，提供到樣品隔室、陽極室或者陰極室的至少兩個(gè)中。
該離子可滲透阻擋層可選自任何適當(dāng)?shù)牟牧匣蛘呶镔|(zhì)，比如不溶混液體、多孔質(zhì)固體、非離子膜、膜、等電位的膜、水凝膠膜、凝膠和水凝膠。
本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水凝膠膜優(yōu)選基于聚醚砜、基于聚(乙烯基)醇或者基于聚丙烯酰胺。預(yù)期任何其它類型的水凝膠膜可用于本發(fā)明。
優(yōu)選，該非離子的膜是支撐膜比如負(fù)載在玻璃纖維、濾紙、聚合物網(wǎng)狀物和紙上的交聯(lián)聚丙烯酰胺和聚(乙烯基)醇。該離子可滲透阻擋層可以是多孔玻璃料比如玻璃粉、陶瓷的玻璃料和聚合的玻璃料。
在一個(gè)優(yōu)選的形式中，該離子可滲透阻擋層可基本上限制尺寸或者水合離子半徑大于預(yù)定尺寸的分子通過。
該離子可滲透等電位阻擋層優(yōu)選是等電位的多孔質(zhì)固體、等電位的膜和等電位的凝膠。更優(yōu)選，該離子可滲透等電位阻擋層是等電位的膜。
該離子可滲透阻擋層優(yōu)選防止阻擋層之間溶解物大量的對(duì)流混合。在應(yīng)用中，優(yōu)選隔室之間基本上沒有對(duì)流混合。
將該等電位的緩沖液提供到樣品隔室、陽極室和陰極室的至少一個(gè)中。優(yōu)選，等電位的緩沖液的pl值與兩性樣品組份的pl值相差至少約0.001pH單位。pl值和與等電位的緩沖液pl值最接近的pKa值之間差的絕對(duì)值優(yōu)選小于約1.5。
等電位的緩沖液是任何適當(dāng)?shù)木彌_液，其可使兩性組份基本上以非等電狀態(tài)獲得。適當(dāng)?shù)木彌_劑包括然而并非限于亞氨基二乙酸、N-甲基亞氨基乙酰乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、間氨基苯甲酸、組氨酰-甘氨酸、組氨酰-組氨酸、組氨酸、1，2-二氨基丙酸、鳥氨酸、賴氨酸、lysil-賴氨酸和精氨酸。優(yōu)選，該等電位的緩沖液是谷氨酸或者賴氨酸。當(dāng)使用兩種等電位的緩沖劑時(shí)，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)谷氨酸和賴氨酸是特別適當(dāng)?shù)?。該方法可進(jìn)一步包括提供非離子的增溶劑。
優(yōu)選，該增溶劑是離子型去垢劑。例子包括然而并非限于吐溫TM20、BrijTM30、TRITONTMX-100或NDSB-195。
該方法特別適于分離兩性樣品組份比如蛋白質(zhì)、多肽、低聚肽、對(duì)氨基酚、氨基膦酸和氨基酸。優(yōu)選，該兩性樣品組份是蛋白質(zhì)。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)等電分離需要組份在它的等電狀態(tài)進(jìn)行分離的問題，因?yàn)殡娪痉蛛x更快，而且?guī)缀鯖]有組份溶解性的問題。
本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是它可以在任何可適于等電分離的電泳分離系統(tǒng)中進(jìn)行。該方法不需要特殊設(shè)備，導(dǎo)致已知的電泳分離系統(tǒng)更有效的利用。
在整個(gè)說明書中，除非上下文要求，否則該單詞“包含〔comprise〕”或者變化比如“包括〔comprises〕”或者“包括〔comprising〕”應(yīng)理解為包含聲稱的要素、整體或者步驟或者要素、整體或者步驟的組的內(nèi)含物，然而并非排除任何其它的要素、整體或者步驟，或者要素、整體或者步驟的組。
任何討論的已經(jīng)包括在說明書中的文獻(xiàn)、證書、材料、方法、論文等等僅為了為本發(fā)明提供背景的目的。不能作為一種承認(rèn)，因?yàn)樗谠撋暾?qǐng)每一個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日以前存在于澳大利亞，任何或者所有的這些文件形成與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)或者是普通常識(shí)。
為使本發(fā)明被更清楚地理解，參考以下附圖和實(shí)施例描述優(yōu)選的形式。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是可用來實(shí)施本發(fā)明申請(qǐng)實(shí)施方式的一種等電位捕集(IET)裝置(現(xiàn)有技術(shù))(Gradipore，澳大利亞)的示意圖。
圖2是表明在本發(fā)明申請(qǐng)分離過程開始時(shí)，顯示于圖1中IET裝置隔室中代表性溶液的特征的示意圖。
圖3是利用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦分析的雞蛋白樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄；圖4是在IET分離結(jié)束時(shí)，從顯示于圖1的IET裝置的陰極和陽極分離隔室中除去的等分樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄，所述的裝置如實(shí)施例2描述進(jìn)行操作，并用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)行分析；圖5是在IET分離結(jié)束時(shí)，從顯示于圖1的IET裝置的陰極和陽極分離隔室中除去的等分樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄，所述的裝置如實(shí)施例3描述進(jìn)行操作，并用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)行分析；圖6是在從實(shí)施例3陽極分離隔室得到樣品的IET分離結(jié)束時(shí)，從顯示于圖1的IET裝置的陰極和陽極分離隔室中除去的等分樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄，所述的裝置如實(shí)施例4描述進(jìn)行操作，并用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)行分析；
圖7是在IET分離結(jié)束時(shí)，從顯示于圖1的IET裝置的陰極和陽極分離隔室中除去的等分樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄，所述的裝置如實(shí)施例5描述進(jìn)行操作，并用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)行分析；圖8是在壓力調(diào)節(jié)的毛細(xì)管電泳分離過程中，在IET分離開始和結(jié)束時(shí)，從如實(shí)施例6描述操作的IET裝置的分離隔室中除去的等分樣品的紫外線吸光率檢測(cè)器記錄。
圖9是在壓力調(diào)節(jié)的毛細(xì)管電泳分離過程中，在IET分離開始和結(jié)束時(shí)，從如實(shí)施例7描述操作的IET裝置的分離隔室中除去的等分樣品的紫外線吸光率檢測(cè)器記錄。
圖10是在八次穿過后IET分離結(jié)束時(shí)，從顯示于圖1的IET裝置的陰極和陽極分離隔室中除去的等分樣品的全列成像紫外線吸光率檢測(cè)器記錄，所述的裝置如實(shí)施例8描述進(jìn)行操作，并用如實(shí)施例1描述的毛細(xì)管等電聚焦進(jìn)行分析；實(shí)施本發(fā)明的模式以下以非限制性詳述方式描述本發(fā)明申請(qǐng)的改變具有兩性樣品組份的樣品混合物的初始組成的實(shí)施方式。
圖1指可用于實(shí)施本發(fā)明描述的實(shí)施方式的本領(lǐng)域已知的非等電捕集(IET)裝置。在該IET分離裝置(Gradipore，澳大利亞)中，陽極10位于陽極室15。陽極電解液20充滿陽極室15。陽極電解液20是一種酸性溶液，例如，它是一種磷酸的水溶液(H3PO4)。當(dāng)然，此外本領(lǐng)域已知的其它適當(dāng)?shù)乃嵝匀芤阂部墒褂谩ｊ枠O離子可滲透阻擋層30將陽極室15和鄰近的陽極分離隔室40分開。離子可滲透阻擋層30允許離子通過，但是基本上阻止陽極室15和陽極分離隔室40中內(nèi)容物的對(duì)流混合。此外，離子可滲透阻擋層30通常稱為離子可滲透、防對(duì)流的阻擋層或者限制膜。盡管在該實(shí)施例中陽極離子可滲透阻擋層30是一種離子可滲透、防對(duì)流的非等電位阻擋層，但它也可一種離子可滲透的、防對(duì)流的等電位的阻擋層，或者任何其它的可允許離子通過但可阻止陽極分離隔室40和陽極室15中內(nèi)容物對(duì)流混合的阻擋層。離子可滲透的等電分離阻擋層50在其pl值時(shí)具有足夠的緩沖和滴定容量，將陽極分離隔室40和陰極分離隔室60分開，基本上阻止隔室40和60內(nèi)容物的對(duì)流混合。等電分離阻擋層50可以是一種等電位的膜、固定的等電位的凝膠、等電位的通路或者任何其它的本領(lǐng)域已知的在其pl值具有足夠緩沖和滴定容量的等電位的阻擋層。
陰極的離子可滲透阻擋層70將陰極分離隔室60和包含陰極電解液80的陰極室85分開。陰極的離子可滲透阻擋層70允許離子通過，但是基本上阻止陰極分離隔室60和陰極室85中內(nèi)容物的對(duì)流混合。此外，陰極的離子可滲透阻擋層70通常稱為離子可滲透、防對(duì)流的阻擋層或者限制膜。盡管在該實(shí)施例中陰極離子可滲透阻擋層70是一種離子可滲透、防對(duì)流的非等電位阻擋層，但它也可一種離子可滲透的、防對(duì)流的等電位的阻擋層，或者任何其它的可允許離子通過但可阻止陰極分離隔室60和陰極室85中內(nèi)容物對(duì)流混合的阻擋層。陰極電解液80是堿溶液，例如，它是氫氧化鈉的水溶液(NaOH)。其它適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域已知的堿溶液也可使用。陰極室85包含陰極90。
盡管圖1僅僅是適當(dāng)?shù)腎ET分離裝置的一個(gè)實(shí)施例，但也也可使用其它的IET分離裝置構(gòu)造。根據(jù)基本的IET原則選擇適當(dāng)?shù)腎ET裝置要素的標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域熟知的(例如，F(xiàn)aupel et al.，U.S.5,082,548，在此引入作為參考)。例如，可以在陽極離子可滲透阻擋層30和陰極的離子可滲透阻擋層70之間僅使用一個(gè)分離隔室，或陽極離子可滲透阻擋層30和陰極的離子可滲透阻擋層70之間使用多于兩個(gè)分離隔室。而且，陽極離子可滲透阻擋層30和陰極的離子可滲透阻擋層70可以具有相似的結(jié)構(gòu)或者不同的結(jié)構(gòu)。例如，它們可以是離子可滲透的、防對(duì)流的、非等電位的阻擋層，或者離子可滲透的、防對(duì)流的、等電位的阻擋層，或者任何其它的本領(lǐng)域已知的阻擋層，以使阻擋層30和70是離子可滲透的，但基本上防止它們分開的鄰近隔室內(nèi)容物的對(duì)流混合。
盡管圖1顯示出一種具有三種離子可滲透阻擋層的電泳裝置或者系統(tǒng)，但本發(fā)明可以在僅具有一個(gè)分離陽極室和陰極室的等電位阻擋層的系統(tǒng)中進(jìn)行。在該形式中，將樣品和等電位的緩沖液提供到一個(gè)或多個(gè)陽極和陰極室，而且該組份在陽極和陰極室的任何一個(gè)中在非等電狀態(tài)下分離。
圖2是表明在本發(fā)明申請(qǐng)分離過程開始時(shí)，顯示于圖1中IET裝置隔室中代表性溶液的特征的示意圖。一個(gè)特征是在IET裝置分離隔室中利用等電位的緩沖液，其中該等電位的緩沖液在其pl值時(shí)具有足夠的緩沖和滴定容量及電導(dǎo)率。例如，陽極分離隔室40包含兩性樣品組份100和110的混合物和第一等電位的緩沖液120，其中第一等電位的緩沖液在其pl值處具有足夠的緩沖和滴定容量及電導(dǎo)率，及陰極分離隔室60包含兩性樣品組份100和110的混合物和第二等電位的緩沖液130，其中第二等電位的緩沖液130在其pl值處也具有足夠的緩沖和滴定容量及電導(dǎo)率。選擇的該等電分離阻擋層50的pl值不同于第一兩性樣品組份100和第二兩性樣品組份110的pl值。例如，在圖2中，選擇的等電分離阻擋層50的pl值介于兩性樣品組份100和110的pl值之間。
選擇第一和第二等電位的緩沖劑120和130的pl值不同的第一和第二兩性樣品組份100和110的pl值、等電分離阻擋層50的pl值，及陽極電解液20和陰極電解液80的pH值，以使在IET分離過程結(jié)束時(shí)，第一和第二兩性樣品組份以它們的非等電狀態(tài)存在。在圖2中，兩性樣品組份100是例如pl＝4的蛋白質(zhì)，而兩性樣品組份110是例如pl＝6的蛋白質(zhì)。等電分離阻擋層50的pl值為5，第一等電位的緩沖液120的pl值為約3.3，第二等電位的緩沖液130的pl值約為10，和陽極電解液20的pH值約為2及陰極電解液80的pl值約為12。在該實(shí)施例中，等電位的緩沖液120是20mM的谷氨酸溶液，等電位的緩沖液130是20mM的賴氨酸溶液，陽極電解液20是磷酸水溶液和陰極電解液80是氫氧化鈉的水溶液。
根據(jù)眾所周知的IET方案，在陽極10和陰極90之間施加電勢(shì)以迫使所有的兩性組份遷移進(jìn)入IET裝置各自的隔室中。在IET分離過程結(jié)束時(shí)，在陽極分離隔室40(即，第一兩性樣品組份100和等電位的緩沖液120收集在陽極分離隔室40)中收集pl值高于陽極電解液20的pH值，但低于等電分離阻擋層50的pl值的所有的兩性組份，在陰極分離隔室60(即，第二兩性樣品組份110和等電位的緩沖液130收集在陰極分離隔室60中)收集PL值低于陰極電解液80的pH值但高于等電分離阻擋層50Pl值的所有的兩性組份。然而，由于在陽極分離隔室40中存在等電位的緩沖液120，因此在IET過程結(jié)束時(shí)以其非等電狀態(tài)得到第一兩性樣品組份100。此外，由于在陽極分離隔室60中存在等電位的緩沖液130，因此在IET過程結(jié)束時(shí)以其非等電狀態(tài)得到第二兩性樣品組份110。
本領(lǐng)域?qū)嵤┱哳A(yù)期在任一時(shí)刻多于兩個(gè)兩性樣品組份可存在于樣品中。本領(lǐng)域?qū)嵤┱咭差A(yù)期可將第一等電位的緩沖液120和第二等電位的緩沖液130引入隔室40和/或60，彼此不同(例如，等電位的緩沖液120可以被引入陽極分離隔室40，等電位的緩沖液130可以被引入陰極的分離隔室60)，單獨(dú)與樣品混合(例如，等電位的緩沖液120和兩性樣品組份100和110的混合物被引入陽極分離隔室40，和等電位的緩沖液130和兩性樣品組份100和110的混合物被引入陰極的分離隔室60)，互相混合(例如，等電位的緩沖液120和130被引入陽極分離隔室40和/或60)，及彼此和樣品混合(例如，等電位的緩沖液120、等電位的緩沖液130和兩性樣品組份100和110的被引入隔室40和/或60)。本領(lǐng)域的實(shí)施者進(jìn)一步預(yù)期在任一時(shí)刻可能有超過兩種兩性樣品組份、超過兩種分離隔室、超過兩種等電緩沖劑及超過一種等電分離阻擋層。
進(jìn)一步，本領(lǐng)域?qū)嵤┱哳A(yù)期樣品和等電位的緩沖液引入分離裝置中的次序或者順序可改變，也就是說，樣品或者緩沖劑可以一起引入到該分離裝置或者以任何次序。
作為非限制性實(shí)施例，具有不同pl值的幾種兩性樣品組份的混合物可以分開進(jìn)入兩個(gè)部件。在該實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用在IET分離過程結(jié)束時(shí)，第一兩性樣品組份100可包含pl值低于等電分離阻擋層50pl值的兩性樣品組份的混合物，同時(shí)第二兩性樣品組份110可包含pl值高于等電分離阻擋層50pl值的兩性樣品組份的混合物。兩性樣品組份100和110可以是任何可根據(jù)等電點(diǎn)聚焦或者等電位捕集原理進(jìn)行分離的兩性樣品組份。
在圖2中，這樣選擇等電分離阻擋層50以使其pl值高于第一兩性樣品組份100的pl值。選擇第一等電位的緩沖液120以使其pl值低于等電分離阻擋層50的pl值。盡管第一等電位的緩沖液120的pl值低于等電分離阻擋層50的pl值，但第一等電位的緩沖液120的pl值可以高于或者低于第一兩性樣品組份100的pl值，因?yàn)樵贗ET分離結(jié)束時(shí)，兩者將迫使第一兩性樣品組份100進(jìn)入非等電狀態(tài)。例如，在圖2中，等電位的緩沖液120的pl值低于第一兩性樣品100的pl值。然而，等電位的緩沖液120的pl值也可高于第一兩性樣品組份100的pl值。
類似的，在圖2中，這樣選擇等電分離阻擋層50以使其pl值低于第二兩性樣品組份100的pl值。選擇第二等電位的緩沖液130以使其pl值高于等電分離阻擋層50的pl值。盡管第二等電位的緩沖液1 30的pl值高于等電分離阻擋層50的pl值，但第二等電位的緩沖液130的pl值可高于或者低于第二兩性樣品組份110的pl值，因?yàn)樵贗ET分離結(jié)束時(shí)，兩者將迫使第二兩性樣品組份110進(jìn)入非等電狀態(tài)。例如，在圖2中，第二等電位的緩沖液130的pl值高于第二兩性樣品組份110的pl值。然而，等電位的緩沖液130的pl值也可低于第二兩性樣品組份110的pl值。
在另外的實(shí)施方式中，等電位的緩沖液120的pl值高于等電位的阻擋層50的pl值，等電位的緩沖液130的pl值低于等電位的阻擋層50的pl值。盡管等電位的緩沖液120的pl值高于等電位的阻擋層50的pl值，等電位的緩沖液120的pl值低于第二兩性樣品組份110的pl值。類似的，盡管等電位的緩沖液130的pl值低于等電位的阻擋層50的pl值，等電位的緩沖液130的pl值高于第一兩性樣品組份100的pl值。在另外的實(shí)施方式中，等電位的緩沖液120的pl值高于等電位的阻擋層50的pl值，而且高于第二兩性樣品組份110的pl值，等電位的緩沖液130的pl值低于等電分離阻擋層50的pl值，而且低于第一兩性樣品組份100的pl值。
而圖2使用兩種等電位的緩沖劑，僅使用一個(gè)等電位的緩沖液也可實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式。例如，可以使用等電位的緩沖液120而不使用等電位的緩沖液130。類似的，可以使用等電位的緩沖液130而不使用等電位的緩沖液120。例如，當(dāng)樣品包含幾種不同pl值的兩性組份時(shí)，使用單一等電位的緩沖液是有利的。
作為僅使用一個(gè)等電位緩沖液原理的非限制性實(shí)施例，選擇等電位的緩沖液120以使其具有這樣的pl值要確保在IET分離結(jié)束時(shí)，等電位的緩沖液120存在于同一分離隔室中作為選擇的兩性樣品組份(例如，第一兩性樣品組份100)，并使所述的樣品組份處于非等電位。例如，當(dāng)?shù)谝粌尚詷悠方M份100的pl值高于等電分離阻擋層50的pl值時(shí)，也選擇等電位的緩沖液120以所其pl值高于等電分離阻擋層50的pl值。類似的，當(dāng)?shù)谝粌尚詷悠方M份100的pl值低于等電分離阻擋層50的pl值時(shí)，選擇等電位的緩沖液120以所其pl值低于等電分離阻擋層50的pl值。盡管等電位的緩沖液120的pl值不同于第一兩性樣品組份100的pl值，但等電位的緩沖液120的pl值可高于或者低于第一兩性樣品組份100的pl值。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇等電位的緩沖液120以使其pl值高于第一兩性樣品組份100的pl值。在另外的實(shí)施方式中，選擇等電位的緩沖液120以使其pl值低于第一兩性樣品組份100的pl值。
在另外的非限制性實(shí)施方式中，選擇等電位的緩沖液120以使具有這樣的pl值要確保在IET分離結(jié)束時(shí)，等電位的緩沖液120存在于不同于第一和第二兩性樣品組份100和110的分離隔室中。在該方式中，可以在等電分離阻擋層50的一側(cè)得到兩性樣品組份，同時(shí)非電解液樣品組份仍然在等電分離阻擋層50的另一側(cè)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品溶液包含具有不同pl值的兩性樣品組份100和110及非電解液樣品組份115。這樣選擇等電分離阻擋層50的pl值以使兩性樣品組份100和110在IET分離過程結(jié)束時(shí)位于等電分離阻擋層的同一側(cè)。例如，在該實(shí)施方式中，這樣選擇等電位阻擋層50的pl值以使其低于兩性樣品組份100和110兩者的pl值。這樣選擇等電位的緩沖液120的pl值以在IET分離過程結(jié)束時(shí)，使等電位的緩沖液120位于等電分離阻擋層50的另一側(cè)，而不是兩性樣品組份100和110。例如，在該實(shí)施方式中，這樣選擇等電位的緩沖液120的pl值以使其低于兩性樣品組份100和110和等電分離阻擋層50的pl值。陰極分離隔室60充滿等電位的緩沖液120，而陽極分離隔室40可單獨(dú)用樣品溶液充滿，或者充滿樣品溶液和等電位的緩沖液120的混合物。在IET分離過程結(jié)束時(shí)，陽極分離隔室包含非電解液樣品組份115和等電位的緩沖液120，后者在陽極分離隔室40中提供足夠的電導(dǎo)率。在IET分離過程結(jié)束時(shí)，陰極分離隔室60包含兩性樣品組份100和110的混合物，其在陰極分離隔室60中可提供足夠的電導(dǎo)率。
當(dāng)樣品僅放入IET裝置的分離隔室的其中之一時(shí)，雖然不必要，但有利的是用等電位的緩沖液120而非水裝滿另一個(gè)分離隔室，因?yàn)榈入娢坏木彌_液120改進(jìn)在整個(gè)IET裝置中的電位分布，導(dǎo)致很快的IET分離。
適當(dāng)?shù)牡入娢痪彌_劑120和130在其pl值鄰近處具有足夠的緩沖和滴定容量和電導(dǎo)率。為了使非等電緩沖液在其pl值處具有足夠的緩沖量和足夠的電導(dǎo)率，優(yōu)選它的pl值和它的最接近的pKa值差小于l，優(yōu)選小于0.75，更優(yōu)選小于0.5。例如，適當(dāng)?shù)牡入娢痪彌_劑包括N-甲基亞氨基乙酰乙酸、亞氨基二乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、間-氨基苯甲酸、組氨酰-甘氨酸、組氨酰-組氨酸、組氨酸、1，2-二氨基丙酸、鳥氨酸、賴氨酸、lysil-賴氨酸和精氨酸。本領(lǐng)域?qū)嵤┱哳A(yù)期其它適當(dāng)?shù)木哂凶銐蚓彌_和滴定容量和電導(dǎo)率的等電位緩沖劑也可使用。
盡管圖2說明了單一的二元分離，但其它的實(shí)施方式可實(shí)施連續(xù)的二元分離。對(duì)于每一連續(xù)的IET分離選擇的等電位的緩沖劑可以相同或者不同。例如，在第一連續(xù)IET分離結(jié)束時(shí)，等電位的緩沖液120可包含第一兩性樣品組份100和110。如果第二連續(xù)IET分離希望的目標(biāo)是第一等電位樣品組份100，那么希望在等電位的緩沖液135溶液中得到，這樣選擇第二連續(xù)分離的等電分離阻擋層50以使其pl值處于第一和第二等電位的樣品組份100和110的pl值之間，這樣選擇等電位的緩沖液120以使其pl值大于等電位的樣品組份100和110和等電分離阻擋層50的pl值。在一個(gè)實(shí)施方式中，陽極和陰極的分離隔室40和60可以充滿等電位的樣品組份100和110和等電位的緩沖劑120和135的混合物。在另外的實(shí)施方式中，陽極分離隔室40可以充滿等電位的緩沖液135，陰極的分離隔室60可以充滿等電位的樣品組份100和110和等電位的緩沖劑120和135的混合物。在另外的實(shí)施方式中，陽極分離隔室40可以充滿等電位的緩沖液135，陰極的分離隔室60可以充滿等電位的樣品組份100和110和等電位的緩沖劑120的混合物。在另外的實(shí)施方式中，陽極分離隔室40可以充滿等電位的緩沖液135，陰極的分離隔室60可以充滿等電位的樣品組份100和110和等電位的緩沖劑120和135的混合物。
在其它的實(shí)施方式，新鮮的等電位的緩沖液可以加入在任何連續(xù)的分離步驟中，或者等電位的緩沖液可以從早先的分離步驟繼續(xù)下去。其它的實(shí)施方式在多等電位的緩沖劑存在的情況下，可同時(shí)實(shí)施多餾分分離(例如，在IsoPrimeTM裝置(Amersham-PHarmacia)上進(jìn)行)。
盡管等電位緩沖液的存在通常通過使其處于非等電位可提高兩性樣品組份的溶解性，但用于IEF系統(tǒng)的適當(dāng)?shù)脑鋈軇┮部捎糜诒景l(fā)明中。例如，本領(lǐng)域已知的非離子的和兩性離子增溶劑也可用于增加樣品組份的溶解性。例如，吐溫TM20、玻雷吉TM30、TRITONTMX-100(Aldrich)或者任何其它適當(dāng)?shù)姆请x子增溶劑也可使用。類似的，NDSB-195TM(Toronto Research Chemicals，North York，ON，Canada)或者本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)膬尚噪x子增溶劑可以使用。
為有助于理解本發(fā)明，本發(fā)明包括以下實(shí)施例并描述了一系列試驗(yàn)的結(jié)果。以下關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施例不應(yīng)解釋為特別地限制本發(fā)明，或者本發(fā)明現(xiàn)在已知的或者隨后開發(fā)的這樣的變化，都在本發(fā)明描述和要求的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管等電聚焦分離雞蛋白樣品。
雞蛋白，在去離子水中以1～25的比率烯釋，用作包含兩性組份的樣品。使用在iCE280儀器上的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管等電聚焦(Convergent Bioscience、Toronto、Canada)分析該雞蛋白樣品。該熔融石英分離毛細(xì)管長(zhǎng)5厘米，它的內(nèi)徑為75微米。
該聚焦介質(zhì)包含8％載體兩性電解質(zhì)(Pharmalyte 3-10，Amersham-PHarmacia)，涵蓋pH3-10的范圍，處于0.28％的甲基纖維素水溶液中(avg.m.w.＝80,000，Aldrich)。要分析的75微升樣品與150微升的聚焦介質(zhì)混合。該溶液的等分試樣加入到該分離毛細(xì)管中，在3,000V聚焦5分鐘。1-二甲胺基萘-5-磺酰苯基丙氨酸(大約pl＝3.52)和間羥異丁腎上腺素(大約pl＝9.61)用作pl標(biāo)識(shí)物。圖3顯示出該雞蛋白樣品的該全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF電泳圖。在毛細(xì)管區(qū)域聚焦的卵清蛋白對(duì)應(yīng)于像素450～650。在毛細(xì)管區(qū)域聚焦的卵鐵傳遞蛋白對(duì)應(yīng)于像素1050～1150。
實(shí)施例2利用已知的IET方法(現(xiàn)有技術(shù))制備規(guī)模分離雞蛋白樣品。
為了比較本發(fā)明與已知的IET方法，使用已知的IET方法在如下所述條件下進(jìn)行制備規(guī)模分離包含兩性組份的樣品。
在由Gradipore，Australia生產(chǎn)的IET裝置上實(shí)現(xiàn)代表現(xiàn)有技術(shù)的分離。該IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D標(biāo)稱取舍點(diǎn)的聚醚砜膜(Gelman)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，陽極分離隔室40，Pl＝4.7的等電分離阻擋層50(Gradipore)從固定化TM電解質(zhì)化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陰極的分離隔室60，及由5,000D標(biāo)稱取舍點(diǎn)的聚醚砜膜(格爾曼)制造的陰極離子可滲透阻擋層70。80mL的50mM磷酸溶液(大約pH＝1.8)以2L/min的流動(dòng)速率循環(huán)通過陽極室15。80mL的50mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝12.4)以2L/min的流動(dòng)速率循環(huán)通過陰極室85。40mL的每一個(gè)過濾的雞蛋白溶液(含以1～25的比率用去離子水烯釋的蛋白)以20mL/min的流速分別循環(huán)通過陽極和陰極的分離隔室40和60。將陽極10置于陽極室15中，將陰極90置于陰極室85中。起始的外加電勢(shì)是250V，產(chǎn)生的電流為400mA。在雞蛋白溶液10次流通通過該分離隔室之后，電流下降到37mA。然后將電勢(shì)增加到500V，產(chǎn)生的電流為74mA。該分離實(shí)際在7次以上流通之后完成，完成時(shí)的電流穩(wěn)定在25mA，總的分離時(shí)間為40分鐘。在雞蛋白溶液每一次流過之后，從陽極陰極的分離隔室40和60中取出等分樣品，利用如實(shí)施例1描述的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF儀器進(jìn)行分析。
作為IET分離的結(jié)果，pl值低于4.7的蛋白質(zhì)，比如卵清蛋白(大約pl＝4.6)，聚集在pl＝4.7等電分離阻擋層50陽極側(cè)的陽極分離隔室40中(圖4中的底框，注記為“下游”)。Pl值大于4.7的蛋白質(zhì)，比如卵鐵傳遞蛋白(大約pl＝6.1)聚集在等電分離阻擋層50陰極側(cè)的陰極分離隔室60中(圖4中的頂框，注記為“上游”)。實(shí)際所有的卵清蛋白和該較低的pl蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入陽極分離隔室40。在IET分離結(jié)束時(shí)肉眼觀察分離盒內(nèi)部顯示在陽極分離隔室40中存在有沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3利用IET分離方法制備規(guī)模分離雞蛋白樣品。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的兩種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模分離包含兩性組份的樣品。
在實(shí)施例2使用的IET裝置上進(jìn)行本發(fā)明的IET分離。該IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚醚砜膜(格爾曼)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，陽極分離隔室40，Pl＝4.8的等電分離阻擋層50(Gradipore)，由lmmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陰極分離隔室60，和由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚醚砜膜(格爾曼)制造的陰極離子可滲透阻擋層70。80mL的50mM磷酸溶液(大約pH＝1.8)以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。80mL的50mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝12.4)以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。40mL的每一個(gè)過濾的雞蛋白溶液(含以1～25的稀釋率，分別溶解在20mM谷氨酸和20mM賴氨酸的雞蛋白)以20mL/min的流速分別循環(huán)通過陽極和陰極的分離隔室40和60。將陽極10置于陽極室15中，將陰極90置于陰極室85中。起始的外加電勢(shì)是250V，產(chǎn)生的電流為480mA。該分離實(shí)際在雞蛋白溶液10次流通過分離隔室之后完成，特征在于完成時(shí)的電流穩(wěn)定在53mA，總的分離時(shí)間為25分鐘。在〔雞蛋白溶液〕每一次流過之后，從陽極陰極的分離隔室40和60中取出等分樣品，利用如實(shí)施例1描述的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF儀器進(jìn)行分析。
作為本發(fā)明IET分離的結(jié)果，pl值低于4.8的蛋白質(zhì)，比如卵清蛋白(大約pl＝4.6)，聚集在pl＝4.8等電分離阻擋層50陽極側(cè)的陽極分離隔室40中(圖5中的底框，注記為“下游”)。pl值大于4.8的蛋白質(zhì)，比如卵鐵傳遞蛋白(大約pl＝6.1)聚集在等電分離阻擋層50陰極側(cè)的陰極分離隔室60中(圖5中的頂框，注記為“上游”)。實(shí)際所有的卵清蛋白和該較低的pl蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入陽極分離隔室40。在IET分離結(jié)束時(shí)肉眼觀察分離盒的內(nèi)部表明，在陽極分離隔室40或者陰極分離隔室60中都沒有發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀。
因此，如同在實(shí)施例2中，在實(shí)施例3中可實(shí)現(xiàn)同樣有效的分離，但是分離需要較短的時(shí)間，需要較少量的溶液通過IET盒，盡管事實(shí)上在整個(gè)分離過程中施加的電勢(shì)較低。另外，已知的IET分離的一個(gè)主要的限制，即，在它們的等電狀態(tài)回收的兩性樣品組份的低溶解度引起它們的沉淀，被減少了。
實(shí)施例4利用IET分離方法制備規(guī)模連續(xù)二元分離雞蛋白樣品。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的兩種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模連續(xù)二元分離包含兩性組份的樣品，以從pl值間隔小的兩性組份中得到餾分。
在該實(shí)施例中，從實(shí)施例3中陽極分離隔室40回收的樣品使用IET盒(U.S.6,328,869)再一次經(jīng)IET分離，所述的盒包含由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)的聚醚砜膜(Gelman)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，陽極分離隔室40，Pl＝4.5的等電分離阻擋層50(Gradipore)，由lmmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陰極分離隔室60，和由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚醚砜膜(格爾曼)制造的陰極離子可滲透阻擋層70。80mL的50mM磷酸溶液(大約pH＝1.8)以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。80mL的50mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝12.4)以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。38mL從使用pl值為4.8的等電分離阻擋層50的實(shí)施例3 IET分離之后的陽極分離隔室40中回收的流體以20mL/min的流速循環(huán)通過陽極分離隔室40。因此，初始在實(shí)施例3中加入的pl＜4.8的蛋白質(zhì)和谷氨酸存在于該物流中。40mL的20mM賴氨酸溶液以20mL/min的流速循環(huán)通過陰極分離隔室60。陽極10置于陽極室15中，陰極90置于陰極室85中。外加電勢(shì)是250V，產(chǎn)生初始電流為87mA。在初步分餾的雞蛋白溶液6次流通之后，電流穩(wěn)定在68mA。在〔雞蛋白溶液〕每一次流過之后，從陽極和陰極的分離隔室40和60中取出等分樣品，利用如實(shí)施例1描述的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF儀器進(jìn)行分析。
作為連續(xù)施加第二IET分離的結(jié)果，pl值低于4.5的蛋白質(zhì)殘存在pl＝4.5等電分離阻擋層50的陽極側(cè)上的陽極分離隔室40(在圖6中的底框，注記為“下游的”)。pl值大于4.5的蛋白質(zhì)，比如卵清蛋白(大約pl＝4.6)聚集在等電分離阻擋層50陰極側(cè)的陰極分離隔室60中(圖6中的頂框，注記為“上游”)。在陽極分離隔室40的谷氨酸和陰極分離隔室60的賴氨酸存在的輔助下，在6次流通之后卵清蛋白的移轉(zhuǎn)完成約90％。值得注意的是，陰極分離隔室60不包含任何pl＜4.5的蛋白質(zhì)；這些殘留在陽極分離隔室40中。陽極分離隔室40包含一些殘留的pl＞4.5的蛋白質(zhì)。再一次，在本發(fā)明IET分離結(jié)束時(shí)，肉眼觀察IET盒的內(nèi)部顯示在陽極分離隔室40或者陰極分離隔室60中沒有蛋白質(zhì)沉淀。
實(shí)施例5
利用IET分離方法制備規(guī)模分離包含兩性組份的雞蛋白樣品。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的一種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模分離包含兩性組份的樣品。
在實(shí)施例3和4中使用的IET裝置上實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的分離，該IET盒(U.S.6,328,869)包含由1,000D標(biāo)稱取舍點(diǎn)的聚丙烯酰胺膜(Gelman)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，陽極分離隔室40，pl＝5.0的等電分離阻擋層50(Gradipore)，由lmmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陰極分離隔室60，和由1,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚丙烯酰胺膜(格爾曼)制造的陰極離子可滲透阻擋層70。60mL的2mM乙酸溶液(大約pH＝3.9)以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。60mL的15mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝10.5)以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。30mL過濾的雞蛋白溶液(含以1～25的比率用去離子水烯釋的雞蛋白)以20mL/min的流速循環(huán)通過陽極分離隔室40。30mL過濾的雞蛋白溶液(含以1～25的比率在5mM賴氨酸溶液中烯釋的雞蛋白)以20mL/min的流速循環(huán)通過陰極分離隔室60。陽極10置于陽極室15中，陰極90置于陰極室85中。外加電勢(shì)是250V，產(chǎn)生的初始電流為280mA。在〔雞蛋白溶液〕每一次流過之后，從陽極和陰極的分離隔室40和60中取出等分樣品，利用如實(shí)施例1描述的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF儀器進(jìn)行分析。在雞蛋白溶液3次流通之后，IET分離幾乎完成，如圖7所示，需要總的分離時(shí)間為6分鐘。
作為IET分離的結(jié)果，pl值低于5.0的蛋白質(zhì)，比如卵清蛋白(大約pl＝4.6)，聚集在pl＝5.0等電分離阻擋層50陽極側(cè)的陽極分離隔室40中(圖7中的底框，注記為“下游”)。Pl值大于5.0的蛋白質(zhì)，比如卵鐵傳遞蛋白(大約pl＝6.1)聚集在等電分離阻擋層50陰極側(cè)的陰極分離隔室60中(圖7中的頂框，注記為“上游”)。實(shí)際所有的卵清蛋白和該較低的pl蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入陽極分離隔室40。
實(shí)施例6通過IET分離方法制備規(guī)模使兩性樣品混合物脫鹽。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的一種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模使包含兩性組份的樣品脫鹽。
在實(shí)施例2使用的IET裝置上進(jìn)行本發(fā)明的除鹽過程。該IET盒(U.S.6,328,869)包含由交聯(lián)的聚(乙烯醇)膜(Gradipore)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，和由交聯(lián)的聚(乙烯醇)(Gradipore)膜制造的陰極離子可滲透阻擋層70。200mL的80mM磷酸溶液(大約pH＝1.6)以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。200mL的400mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝13.2)以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。30mL的樣品溶液(初始含30mM酪胺作為兩性樣品組份，30mM間-氨基苯甲酸作為等電位的緩沖液，和30mM苯甲基三甲基銨對(duì)-甲苯磺酸鹽作為強(qiáng)電解質(zhì)鹽)以20mL/min流速循環(huán)通過該分離隔室。陽極10置于陽極室15中，陰極90置于陰極室85中。初始，外加電勢(shì)是5V，產(chǎn)生的電流為500mA。該循環(huán)溶液被電泳450分鐘表明，兩性樣品組份酪胺可以非等電狀態(tài)被收集在IET裝置中(與等電位的緩沖液間氨基苯甲酸混合)，時(shí)間很長(zhǎng)(7.5小時(shí))。在450分鐘時(shí)，外加電勢(shì)為80V，產(chǎn)生的電泳電流為300mA。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中取自分離隔室的等分樣品利用壓力調(diào)節(jié)的毛細(xì)管電泳(PreMCE)進(jìn)行分析，所述的方法如描述于W.A.Williams和G.Vigh的“A Fast，Accurate Mobility Determination Methodfor capillary electrophoresis capillary electrophoresis”，AnalyticalChemistry，68(1996)1174。初始樣品的PreMCE紫外線吸光率檢測(cè)器記錄顯示于圖8的頂框(注記為T0min)，最后的aliquot顯示于圖8的底框(注記為T450min)。在該檢測(cè)器記錄中，注記BTA表示相當(dāng)于苯甲基三甲基銨離子的峰，注記PTSA表示相當(dāng)于對(duì)-甲苯磺酸鹽離子的峰，注記mABA表示相當(dāng)于間-氨基苯甲酸的峰，而注記NM1、NM2和NM3表明硝基甲烷的峰，在PreMCE分析中的內(nèi)標(biāo)物。
作為本發(fā)明IET分離結(jié)果，從包含兩性組份酪胺的樣品中除去強(qiáng)電解質(zhì)鹽苯甲基三甲基銨對(duì)甲苯磺酸鹽。酪胺與間-氨基苯甲酸一起收集在分離隔室，處于非等電狀態(tài)。因此，樣品的初始成分已經(jīng)被成功改變，處于非等電狀態(tài)的兩性樣品組份被收集在IET裝置中。
實(shí)施例7利用IET分離方法制備規(guī)模使雞蛋白樣品脫鹽。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的兩種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模使包含兩性組份的樣品脫鹽。
在實(shí)施例2使用的IET裝置上進(jìn)行本發(fā)明的除鹽過程。該IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚醚砜膜(格爾曼)制造的陽極離子可滲透阻擋層30，和由5,000D標(biāo)稱的取舍點(diǎn)聚醚砜膜(Gelman)制造的陰極離子可滲透阻擋層70。200mL的50mM磷酸溶液(大約pH＝1.8)以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。200mL的50mM氫氧化鈉溶液(大約pH＝12.4)以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。80mL過濾的雞蛋白溶液(含雞蛋白用作兩性樣品組份，按1～25的比率溶解在包含20mM谷氨酸作為第一等電位的緩沖液、20mM賴氨酸作為第二等電位的緩沖液和25mM苯甲基三甲基銨對(duì)甲苯磺酸鹽作為強(qiáng)電解質(zhì)鹽的溶液中)以40mL/min的流速循環(huán)通過該分離隔室。陽極10置于陽極室15中，陰極90置于陰極室85中。初始外加電勢(shì)是35V，產(chǎn)生的電流為500mA。如完成時(shí)電流穩(wěn)定在24mA所表示，在少到55分鐘，從再循環(huán)雞蛋白溶液中除去大量的苯甲基三甲基銨對(duì)-甲苯磺酸鹽。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中取自分離隔室的等分樣品利用壓力調(diào)節(jié)的毛細(xì)管電泳(PreMCE)進(jìn)行分析，所述的方法如描述于W.A.Williams和G.Vigh的“A Fast，Accurate Mobility Determination Method for capillaryelectrophoresis capillary electrophoresis”，Analytical Chemistry，68(1996)1174。初始樣品的PreMCE紫外線吸光率檢測(cè)器記錄顯示于圖9的頂框(注記為T0min)，最后的等分試樣顯示于圖9的底框(注記為T55min)。在該檢測(cè)器記錄中，注記BTA表示相當(dāng)于苯甲基三甲基銨離子的峰，注記PTSA表示相當(dāng)于對(duì)-甲苯磺酸鹽離子的峰，而注記NMl、NM2和NM3表明硝基甲烷的峰，在PreMCE分析中的內(nèi)標(biāo)物。
作為本發(fā)明IET分離結(jié)果，從樣品中除去強(qiáng)電解質(zhì)鹽苯甲基三甲基銨對(duì)甲苯磺酸鹽，而兩性樣品組份，該雞蛋白蛋白質(zhì)在它們的非等電狀態(tài)被收集在分離隔室中，與賴氨酸和谷氨酸混合。因此，樣品的初始成分已經(jīng)被成功改變，處于非等電狀態(tài)的兩性樣品組份被收集在IET裝置中。
實(shí)施例8利用IET分離方法制備規(guī)模分離雞蛋白樣品。
在如下所述條件及根據(jù)本發(fā)明的兩種等電位的緩沖劑存在下，制備規(guī)模分離包含兩性組份的樣品。
在實(shí)施例2使用的IET裝置上進(jìn)行本發(fā)明的IET分離。該IET盒(U.S.6,328,869)包含陽極離子可滲透阻擋層30，由pl＝3.0等電位的阻擋層(Gradipore)制造，所述的阻擋層(Gradipore)由ImmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陽極分離隔室40，pl＝5.0的等電分離阻擋層50(Gradipore)，由lmmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備，陰極分離隔室60，和陰極離子可滲透阻擋層70，由Pl＝8.2的等電分離阻擋層(Gradipore)制造，所述的阻擋層(Gradipore)由lmmobilineTM化學(xué)品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亞甲基雙-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制備。80mL的10mM磷酸溶液以2L/min的流速循環(huán)通過陽極室15。80mL的10mM三乙醇胺溶液以2L/min的流速循環(huán)通過陰極室85。30mL的每一個(gè)過濾的雞蛋白溶液(含以1～25的稀釋率，分別溶解在20mM谷氨酸和20mM組氨酸的雞蛋白)以20mL/min的流速分別循環(huán)通過陽極和陰極的分離隔室40和60。將陽極10置于陽極室15中，將陰極90置于陰極室85中。初始的電泳電流設(shè)定為250mA。該分離實(shí)際在雞蛋白溶液8次流通過分離隔室之后完成，總的分離時(shí)間為16分鐘。在〔雞蛋白溶液〕每一次流過之后，從陽極和陰極的分離隔室40和60中取出等分樣品，利用如實(shí)施例1描述的全列紫外線吸光率成像毛細(xì)管IEF儀器進(jìn)行分析。
作為本發(fā)明IET分離的結(jié)果，pl值低于5.0的蛋白質(zhì)，比如卵清蛋白(大約pl＝4.6)，聚集在pl＝5.0等電分離阻擋層50陽極側(cè)的陽極分離隔室40中(圖10中的底框，注記為“下游”)。pl值大于5.0的蛋白質(zhì)，比如卵鐵傳遞蛋白(大約pl＝6.1)聚集在等電分離阻擋層50陰極側(cè)的陰極分離隔室60中(圖10中的頂框，注記為“上游”)。實(shí)際所有的卵清蛋白和該較低的pl蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入陽極分離隔室40。在IET分離結(jié)束時(shí)肉眼觀察分離盒的內(nèi)部表明，在陽極分離隔室40或者陰極分離隔室60中都沒有發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員預(yù)期在不背離本發(fā)明精神或者范圍寬的描述前提下，如特定的實(shí)施方式所示，本發(fā)明可有許多的變化和/或改變。因此，本發(fā)明實(shí)施方式被認(rèn)為是在各方面作為說明性而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種利用電泳分離兩性組份的方法，該方法包括將含pl值的兩性組份的樣品置于電泳分離系統(tǒng)中，所述的系統(tǒng)包括具有pH的陽極電解液和具有pH的陰極電解液，陰極電解液的pH高于陽極電解液的pH，一種或多種離子可滲透阻擋層布置于陽極電解液和陰極電解液之間，其中至少一個(gè)阻擋層是等電位的阻擋層，其pl值高于陽極電解液的pH，但低于陰極電解液的pH；提供等電位的緩沖液，其pl值高于陽極電解液的pH，但低于陰極電解液的pH，而且不同于兩性樣品組分的pl值和離子可滲透等電位阻擋層的pl值；和在該電泳系統(tǒng)中，在等電位的緩沖液存在下，將樣品置于電勢(shì)下以收集非等電狀態(tài)的兩性樣品組份。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中該電泳分離系統(tǒng)包括含陽極并適合于容納陽極電解液的陽極室，含陰極和適合于容納陰極電解液的陰極室，及布置于陽極室和陰極室之間的具有pl值的離子可滲透等電位阻擋層形式的一個(gè)離子可滲透阻擋層。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中該電泳分離系統(tǒng)進(jìn)一步包括布置于該陽極室和該陰極室之間的第一和第二離子可滲透阻擋層，在陽極室和陰極室之間形成第一分離隔室。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中第一和第二離子可滲透阻擋層是每一個(gè)具有確定但不同pl的離子可滲透等電位阻擋層。
5.如權(quán)利要求3或者4的方法，其中將樣品提供到樣品隔室、陽極室或者陰極室的至少一個(gè)中。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中將樣品提供到樣品隔室，在樣品隔室中以非等電狀態(tài)分離兩性組份。
7.如權(quán)利要求5的方法，其中在樣品隔室或者陰極室或者陽極室中以非等電狀態(tài)得到兩性組份。
8.如權(quán)利要求3或者4的方法，其中樣品包含兩個(gè)或更多的兩性組份，所述的組份在樣品隔室、陰極室、陽極室、兩個(gè)或更多的樣品隔室、陽極室或者陰極室中以非等電狀態(tài)得到。
9.如權(quán)利要求3的方法，其中該電泳分離系統(tǒng)可進(jìn)一步包含布置于陽極室和陰極室之間的另外的離子可滲透阻擋層，形成鄰近第一分離隔室的第二分離隔室，該系統(tǒng)具有第一pl值的第一離子可滲透等電位阻擋層和具有第二pl值的第二離子可滲透等電位阻擋層，所述的第二pl值不同于第一離子可滲透等電位阻擋層的第一pl值。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中離子可滲透阻擋層都是每一個(gè)具有確定但不同pl的等電位阻擋層。
11.如權(quán)利要求9或者10的方法，其中樣品被提供到第一樣品隔室、第二樣品隔室、陽極室、陰極室或者第一和第二樣品隔室中。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中在第一樣品隔室、第二樣品隔室、陽極室或者陰極室中以非等電狀態(tài)得到兩性組份。
13.如權(quán)利要求9或者10的方法，其中樣品包含兩個(gè)或更多的兩性組份，所述的兩性組份在第一樣品隔室、第二樣品隔室、或者第一樣品隔室和第二樣品隔室的每一個(gè)中以非等電狀態(tài)得到。
14.如權(quán)利要求2的方法，其中該電泳分離系統(tǒng)進(jìn)一步包括多個(gè)布置于陽極室和陰極室之間的離子可滲透阻擋層，形成置于陽極和陰極室之間的多個(gè)分離隔室，其中兩個(gè)或更多離子可滲透阻擋層是每一個(gè)具有不同pl值的離子可滲透等電位阻擋層。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中三種或更多的離子可滲透阻擋層的每一個(gè)是具有不同pl值的離子可滲透等電位阻擋層。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中所有的離子可滲透阻擋層每一個(gè)都是具有不同pl值的離子可滲透等電位阻擋層。
17.如權(quán)利要求9～16任一權(quán)利要求的方法，其中第一等電位的緩沖液和第二等電位的緩沖液每一個(gè)具有不同的pl值，提供到樣品隔室、陽極室或者陰極室的至少兩個(gè)中。
18.如權(quán)利要求1～17任一權(quán)利要求的方法，其中該離子可滲透阻擋層選自不溶混液體、多孔質(zhì)固體、非離子膜、膜、等電位膜、水凝膠膜、凝膠和水凝膠。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中該水凝膠膜是基于聚醚砜、基于聚(乙烯基)醇或者基于聚丙烯酰胺的膜。
20.如權(quán)利要求18的方法，其中非離子膜是支撐膜，選自負(fù)載于玻璃纖維、濾紙、聚合的網(wǎng)狀物和紙上的交聯(lián)的聚丙烯酰胺和聚(乙烯基)醇。
21.如權(quán)利要求18的方法，其中該離子可滲透阻擋層是多孔玻璃料，選自玻璃粉、陶瓷玻璃料和聚合玻璃料。
22.如權(quán)利要求18～21任一權(quán)利要求的方法，其中該離子可滲透阻擋層基本上限制尺寸或者水合離子半徑大于預(yù)定尺寸的分子通過。
23.如權(quán)利要求1～17任一權(quán)利要求的方法，其中該離子可滲透等電位阻擋層選自等電位多孔質(zhì)固體、等電位膜和等電位凝膠。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中該離子可滲透等電位阻擋層是等電位的膜。
25.如權(quán)利要求1～24任一權(quán)利要求的方法，其中隔室之間基本上沒有對(duì)流混合。
26.如權(quán)利要求1～25任一權(quán)利要求的方法，其中將等電位的緩沖液提供到樣品隔室、陽極室和陰極室的至少一個(gè)中。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中等電位緩沖液的pl值與兩性樣品組份pl值相差至少0.001pH單位。
28.如權(quán)利要求1～27任一權(quán)利要求的方法，其中pl值和與等電位緩沖液pl值最接近的pKa值差的絕對(duì)值小于約1.5。
29.如權(quán)利要求1～28任一權(quán)利要求的方法，其中該等電位緩沖液選自亞氨基二乙酸、N-甲基亞氨基乙酰乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、間-氨基苯甲酸、組氨酰-甘氨酸、組氨酰-組氨酸、組氨酸、1，2-二氨基丙酸、鳥氨酸、賴氨酸、lysil-賴氨酸和精氨酸。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中該等電位的緩沖液是谷氨酸或者賴氨酸。
31.如權(quán)利要求17方法，其中第一等電位的緩沖液是谷氨酸，第二等電位的緩沖液是賴氨酸。
32.如權(quán)利要求1～31任一權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括提供非離子的增溶劑。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中該增溶劑是非離子型去垢劑。
34.如權(quán)利要求1～33任一權(quán)利要求的方法，其中兩性樣品組份選自蛋白質(zhì)、多肽、低聚肽、氨基酚、氨基膦酸和氨基酸。
35.如權(quán)利要求35的方法，其中該兩性樣品組份是蛋白質(zhì)。
全文摘要
提供一種利用電泳分離兩性組分的方法，該方法包括將含pl值的兩性組分的樣品置于電泳分離系統(tǒng)中，所述的系統(tǒng)包括具有pH的陽極電解液、具有pH的陰極電解液，陰極電解液的pH高于陽極電解液的pH，布置于陽極電解液和陰極電解液之間的一種或多種離子可滲透阻擋層，其中至少一個(gè)阻擋層是等電位的阻擋層，其pl值高于陽極電解液pH，但低于陰極電解液pH；提供等電位的緩沖液，其pl值高于陽極電解液的pH，但低于陰極電解液pH，不同于兩性樣品組分的pl值，也不同于離子可滲透等電位阻擋層的pl值；和在該電泳系統(tǒng)中，在等電位的緩沖液存在下，將樣品置于電勢(shì)下以收集非等電狀態(tài)的兩性樣品組分。
文檔編號(hào)C07K1/26GK1668367SQ03816652
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者久洛·維格 申請(qǐng)人:得克薩斯A&M大學(xué)體系