專利名稱：新mhcⅱ相關(guān)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合人MHC II類HLA-DR分子的新腫瘤抗原肽的鑒別。本發(fā)明涉及樹突細胞對這樣的腫瘤抗原肽在與腫瘤細胞結(jié)合后的呈遞。而且，本發(fā)明還涉及這樣的腫瘤抗原肽用于疫苗接種抵抗腫瘤和用于診斷對腫瘤的免疫應(yīng)答的應(yīng)用。
通過表達腫瘤特異性蛋白可將腫瘤細胞與健康細胞區(qū)別開。這些在腫瘤中新表達的、突變的或異常表達的蛋白可以用作診斷標記或用于療法。
一類有效地用作診斷和治療工具的標記是結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的蛋白片段或肽。在人類中，MHC分子被定義為人白細胞抗原(HLA)。HLA相關(guān)肽較短，包含9-25個氨基酸(Kropshofer，H. & Vogt，A.B.，Immunol Today 18(1997)77-82)。它們對于起動適應(yīng)性免疫反應(yīng)是必不可少的，因為它們激活特異化的免疫細胞，即T淋巴細胞(簡稱T細胞)。如果T細胞不能識別出來自腫瘤特異性抗原的肽，則會造成免疫逃避和腫瘤的漸進性生長(Boon，T.等，Ann Rev Immunol.12(1994)337-265)。
關(guān)于它們的功能，可以區(qū)別開兩類MHC-肽復(fù)合體(Germain，R.，Cell76(1994)287-299)(i)MHC I類-肽復(fù)合體可以由幾乎所有的有核細胞表達，以吸引CD8+細胞毒性T細胞，它會溶解腫瘤細胞和受感染細胞，(ii)MHC II類-肽復(fù)合體僅在所謂的抗原呈遞細胞(APC)上組成型表達，例如B淋巴細胞、巨嗜細胞或樹突細胞(DC)。具體地，DC具有準備CD4+T輔助細胞的能力(Banchereau，J.和Steinman，R.M.，Nature 392(1998)245-254)。而且，DC會被允許最佳地激活細胞毒性CD8+T細胞這是通過它們的MHC II類-肽復(fù)合體與CD4+T輔助細胞的預(yù)先相互作用來完成的(Ridge，T.等，Nature 393(1998)474-478)。這樣，MHC II類分子呈遞到DC上的肽在涉及T細胞驅(qū)動的免疫反應(yīng)的疾病的發(fā)病機理中、從而也在誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫中起主導(dǎo)作用。
DC在啟動免疫反應(yīng)中的明顯作用已經(jīng)促使人們嘗試將DC開發(fā)作為疫苗，特別是抗癌癥的疫苗(Dallal，R.M.和Lotze，M.T.，Curr OpinionImmunol 12(2000)583-588)。一項重要的進展是發(fā)明了用于體外分化不同來源(包括外周血，例如粘附的單核細胞或來自骨髓的CD34+干細胞前體)的DC的技術(shù)。體外分化和活化的DC在與來自腫瘤細胞的抗原共培養(yǎng)或者采用類似技術(shù)以后，可以用于癌癥患者的疫苗接種。實驗性的樹突細胞疫苗接種研究已經(jīng)成功地誘導(dǎo)了特異性的抗癌反應(yīng)，包括臨床反應(yīng)(Timmermann，J.M.和Levy，R.，Ann Rev Medicine 50(1999)507-529；Nestle，F(xiàn).O.，等，Nature Medicine 7(2001)761-765)。
基于鑒別腫瘤抗原的疫苗包括用裸DNA準備的DC、重組的腺病毒或痘苗病毒、從各腫瘤細胞純化出的天然或重組蛋白或合成的腫瘤肽類似物。用抗原性腫瘤肽而不是遺傳的或蛋白前體來刺激DC的優(yōu)點是，肽可以直接裝載在DC的MHC分子上，而無需其它加工。
在過去的十年中，已經(jīng)鑒別出了許多源自腫瘤標記蛋白且被MHC I類分子限制的肽。它們被分成4類睪丸癌抗原，黑素瘤-黑素細胞分化抗原，在腫瘤上過表達的突變的抗原和未突變的共有抗原。在幾個臨床實驗性的疫苗接種研究中，用黑素瘤肽的混合物刺激來自黑素瘤患者的DC，該肽至今仍然受到HLA I類的排他性的限制(Nestle，F(xiàn).O.等，NatureMedicine 4(1998)328-332；Thurner，B.等，J Exp Med 190(1999)1669-1678)。但是，越來越多的證據(jù)表明，通過補充MHC II類限制的協(xié)助T細胞可以增加抗腫瘤的細胞毒性T細胞反應(yīng)的功效和壽命。因此，預(yù)計一種改良的疫苗接種方法是組合使用除MHC I類抗原之外的MHC II類相關(guān)的腫瘤肽。
對CD4+T輔助細胞識別的MHC II類-限制的癌癥抗原的知識落后于對I類-限制的抗原的鑒別(Wang，R.-F.，Trends in Immunol 22(2001)269-276)。一個原因是，將來自腫瘤細胞的cDNA庫轉(zhuǎn)染進靶細胞后使用抗腫瘤T細胞鑒別合適的轉(zhuǎn)染子和抗原性的表位(一種成功地應(yīng)用于MHCI類分子的方法)是無效的，因為編碼的蛋白不能運送到APC中的MHC II類途徑。
一種創(chuàng)新的替代方案是使用腫瘤細胞刺激的自體DC或特別的腫瘤標記蛋白，并對DC上的與MHC相關(guān)的肽進行測序。但是，該方案僅僅已經(jīng)用于抗自體腫瘤的疫苗接種，迄今為止仍然沒有用于鑒別候選的腫瘤抗原，因為DC是在體外不分裂的細胞，且僅僅能從外周血或骨髓得到非常小的量。而且，肽的純化和測序技術(shù)到目前為止仍不太敏感，通過該方法或任何其它的將注意力放在人體產(chǎn)生的肽的方法都不能直接地鑒別出與疾病相關(guān)的肽。
因此，通過提供新的天然加工的與MHC II類相關(guān)的候選腫瘤抗原肽能夠解決因為缺乏MHC II類限制的腫瘤抗原肽所導(dǎo)致的問題。
本發(fā)明提供了新的天然加工的抗原性肽，它們是黑素瘤和其它腫瘤中的候選的腫瘤抗原。這些抗原性肽由人MHC II類HLA-DR分子呈遞。它們源自翻譯因子eIF-4A、IFN-γ-可誘導(dǎo)的蛋白p78、細胞骨架蛋白波形蛋白和結(jié)合鐵的表面蛋白黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(melanotransferrin)。本發(fā)明的抗原性肽可以用作各腫瘤診斷中的標記和治療中的抗腫瘤疫苗。


圖1是說明使用的技術(shù)的簡圖在抗原攝入和抗原加工的最佳條件下，使最特異化抗原呈遞細胞(APC)的樹突細胞(DC)與抗原源(例如壞死的黑素瘤細胞)接觸。作為對照，在沒有黑素瘤細胞抗原的情況下，在相同的條件下培養(yǎng)DC。在成熟后，純化加載有DC抗原的MHC II類分子，分離并鑒別各MHC II類相關(guān)抗原性肽。
圖2A含有從成熟的樹突細胞分離出的HLA-DR結(jié)合肽的所有組成成分的代表性的MALDI-質(zhì)譜分析，所述的樹突細胞已經(jīng)用壞死的黑素瘤細胞系UKRV-Mel-15a模擬處理(上區(qū))或刺激(下區(qū))。標記的是肽峰(M+H+)＝1820.6，它在與黑素瘤細胞接觸的圖譜中很明顯。
圖2B顯示了具有實驗譜(M+H+)＝1820.6的肽的對應(yīng)的MALDI-PSD斷裂譜。該肽由壞死的黑素瘤細胞誘導(dǎo)(圖2A)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索鑒別出了波形蛋白表位波形蛋白(202-217)(參見表1)。
圖2C顯示了具有實驗譜(M+H+)＝1820.6的肽的離子阱MS-MS圖譜。該肽由壞死的黑素瘤細胞誘導(dǎo)(圖2A)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索鑒別出了波形蛋白表位波形蛋白(202-217)(參見表1)。
圖3A-C顯示了在各種HLA-DR等位產(chǎn)物的情況下來自波形蛋白和黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的候選腫瘤抗原的不同結(jié)合力。體外的肽結(jié)合實驗分析指示的肽，其中純化的HLA-DR分子和生物素化的HA(307-319)肽作為報道物。作為親和力測量，檢測了通過競爭使生物素化的流感病毒血凝素HA(307-319)肽結(jié)合減少50％所需的肽濃度(IC50)。得到的倒數(shù)1/IC50直接與肽親和力相關(guān)。為了進行對比，已經(jīng)包括了來自流感病毒血凝素的HA(307-319)、已知能混雜地結(jié)合幾種HLA-DR等位基因的腫瘤抗原NY-ESO(115-132)(Zarour HM等，Cancer Research 2002；62，213-218)和CDC-27(768-782)(參見表2)。在HLA-DR1(圖3A)、HLA-DR4(圖3B)和HLA-DR5(圖3C)的情況下，檢測了IC50值。
圖4顯示了產(chǎn)生的T細胞系對鑒別出的源自黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的表位的特異性反應(yīng)。用LPS(1μg/ml)活化并用20uM源自不變鏈(LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM；SEQ ID NO17)的對照肽或黑轉(zhuǎn)鐵蛋白肽(MTF；SEQ ID NO13)刺激自體樹突細胞24小時，或者不進行刺激。通過夾心免疫測定法檢測對INF-γ(TH1反應(yīng))或IL-4(TH2反應(yīng))的T-細胞反應(yīng)。
圖5顯示了黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在一組黑素瘤細胞(UKRV-Mel-15a，Ma-Mel-18a，UKRV-Mel-17(Eichmuller，Usener D，Jochim A，Schadendorf D.，Exp Dermatol.2002 Aug；11(4)292-301))以及未成熟的(IM DC)和成熟的樹突細胞(Mat DC)(用1μg/ml LPS活化的)的細胞表面的表達。用黑轉(zhuǎn)鐵蛋白mAb L235(5μg/ml)對細胞染色。細胞表面表達的強度指定為特異性的熒光指數(shù)(SFI)i.d.特異信號的geo mean/同種型的geo mean。
圖6顯示了黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在不同癌癥和正常組織中的單一靶表達模型(STEP)。表達水平以任意單位給出，其基于黑轉(zhuǎn)鐵蛋白mRNA相對于一組8個持家基因的相對表達。點劃線顯示了黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在所有測試的正常組織中的平均表達。
迄今為止只記載了少數(shù)由MHC II類分子呈遞的人腫瘤抗原，它們幾乎全部與惡性黑素瘤相關(guān)。發(fā)現(xiàn)的第一個黑素瘤抗原性肽源自黑素細胞-特異性的酶酪氨酸酶，且受到HLA-DR4的限制(Topalian SL等，PNAS 1994；91，9461-9465)。還發(fā)現(xiàn)了其它3種黑素瘤表位源自MAGE家族蛋白，且由HLA-DR11和HLA-DR13呈遞(Manici S等，J Exp Med 1999；189，871-876)。已知另一組黑素瘤抗原還含有MHC I類腫瘤抗原，它們包含Melan-A/MART-1(Zarour HM等，PNAS 2000；97，400-405)、gp100和膜聯(lián)蛋白II(Li K等Cancer Immunol Immunother 1998；47，32-38)。已經(jīng)證實它們都能以HLA-DR4-限制的方式激活源自黑素瘤患者的CD4+T細胞。
只有3種MHC II類相關(guān)黑素瘤抗原依賴突變來自糖酵解酶磷酸丙糖異構(gòu)酶的HLA-DR1-限制的肽(Pieper R等，J Exp Med 1999；189，757-765)、來自細胞周期調(diào)節(jié)劑CDC-27的HLA-DR4-限制的表位(WangR-F等J Exp Med 1999；183，1131-1140)和依賴于染色體地重排的融合蛋白(由LDL受體和fucosal轉(zhuǎn)移酶組成)的黑素瘤表位(Wang R-F等，J Exp Med 1999；189，1659-1667)。
術(shù)語黑素瘤包括但不限于黑素瘤，轉(zhuǎn)移性的黑素瘤，來自黑素細胞或與黑素細胞有關(guān)的色素痣細胞的黑素瘤，黑素癌，黑素上皮癌，黑素肉瘤，原位黑素瘤，表面散布的黑素瘤，結(jié)節(jié)性黑素瘤，惡性痣性黑素瘤，肢端著色斑性黑素瘤，入侵性黑素瘤或家族性的非典型胎塊和黑素瘤(FAM-M)綜合征。哺乳動物中的這種黑素瘤可能是由染色體異常、退化性生長和進行性疾病、促有絲分裂劑、紫外線輻射(UV)、病毒感染、不合適的基因的組織表達、基因表達的改變、和在細胞上的呈遞或致癌劑造成的。
本發(fā)明的抗原性肽是與MHC分子相關(guān)且由其呈遞的肽，因此具有激活或耐受(tolerize)T細胞的潛力。因此，由MHC II類分子呈遞的抗原性肽是與MHC II類相關(guān)或MHC II類抗原性肽，而由MHC I類分子呈遞的抗原性肽是與MHC I類相關(guān)或MHC I類抗原性肽。
將源自由機體基因組編碼的蛋白或APC的肽指定為“自身肽”。認為外周淋巴器官中的DC所呈遞的自身肽的主要功能是誘導(dǎo)T細胞對自身蛋白的耐受。
源自細菌、病毒或其它外來入侵者的基因組編碼的蛋白的肽且與自身蛋白不同的肽被稱作“外源抗原性的”或“外源性的”肽。它們能引起T細胞對抗它們所來源的外源蛋白的反應(yīng)。
腫瘤抗原是由腫瘤細胞表達的蛋白，該腫瘤細胞會導(dǎo)致T細胞的抗腫瘤反應(yīng)性。腫瘤抗原肽源自這樣的腫瘤抗原，并因此具有激活腫瘤反應(yīng)性T細胞的潛力。
本發(fā)明提供了分離的與MHC II類相關(guān)的抗原性肽，其包含選自由SEQID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列。優(yōu)選地，抗原性肽具有小于26個氨基酸的長度，更優(yōu)選地是11-25個氨基酸的長度。更優(yōu)選地是，本發(fā)明的抗原性肽具有14-18個氨基酸的長度。最優(yōu)選地是，本發(fā)明的抗原性肽具有15-17個氨基酸的長度。
本發(fā)明的與MHC II類相關(guān)的新型抗原性肽源自細胞骨架蛋白波形蛋白(SEQ ID NO.1-6)、翻譯因子eIF-4A1(SEQ ID NO.7-9)、IFN-γ可誘導(dǎo)的蛋白p78(SEQ ID NO.10和11)和結(jié)合鐵的表面蛋白黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(SEQ IDNO.12和13)和由T-細胞1識別的黑素瘤抗原(MART-1，Melan-A蛋白；SEQID NO21)。
MHC II類分子的單肽結(jié)合溝是約25長，但是與MHC I類分子不同的是，其兩側(cè)都是開放的(Stern LJ等，Nature 1994；368，215-221)。因此，從人MHC II類分子洗脫的天然加工的抗原性肽具有約11個殘基的最小長度，且達到約25個殘基的最大長度(Chicz RM等，J Exp Med 1993；178，27-47)。
MHC-肽的相互作用的穩(wěn)定性由多余一打的氫鍵決定，該氫鍵涉及肽主鏈和結(jié)合溝的特異性袋與合適地定位的肽氨基酸側(cè)鏈之間的互補性。與各袋配合的肽氨基酸稱作“錨”殘基。關(guān)于大多數(shù)HLA-DR等位基因，這些錨位于相對位置P1、P4、P6和P9。在這4個錨位置的氨基酸的組合賦予了結(jié)合到各HLA-DR等位基因產(chǎn)物的高穩(wěn)定性，并且隨各等位基因而異。在本文中將肽結(jié)合基序定義為包含4個錨氨基酸的9個氨基酸的序列。本發(fā)明的MHC II類抗原性肽的肽結(jié)合基序在SEQ ID NO.18中表示，它是SEQ ID NO.1至4的抗原性肽的序列，或如SEQ ID NO.19所示，它是SEQID NO.5和6的源自波形蛋白的抗原性肽的序列，和如SEQ ID NO.20所示，它是SEQ ID NO.12和13的源自黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗原性肽的序列。
其它的結(jié)合能由氫鍵提供，所述的氫鍵涉及P1錨前面和P9錨后面的殘基。與此相符合，在大多數(shù)天然加工的肽中，九聚物核心區(qū)(P1-P9)在N-和C-末端連接有3-4個殘基。因此，大多數(shù)肽是15-17聚體。更長的肽會從溝中伸出，因此允許外肽酶(它們會修飾兩端)的接近。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗原性肽包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列，其可以在氨基或羧基端具有氨基酸缺失并且維持它們的結(jié)合力。通過檢測將標記的報道肽的結(jié)合減少50％所需的濃度來測量肽的相對結(jié)合力。該值稱作IC50。以合理親和力與相關(guān)的HLA II類分子相結(jié)合的肽所得到的IC50值不超過用參考肽建立起來的IC50的10倍。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗原性肽由包含4個錨氨基酸的肽結(jié)合基序組成。
波形蛋白已知波形蛋白是多種良性和惡性腫瘤的標記蛋白。與melanA/MART-1、酪氨酸酶和S100一起，常規(guī)地用波形蛋白來跟蹤來自黑素瘤患者的臨床標本中的黑素瘤細胞。有趣地，有較低入侵潛力的黑素瘤克隆具有較高的波形蛋白表達，而波形蛋白在較高入侵性的黑素瘤細胞克隆則受到下調(diào)(Gutgemann A等，Arch Dermatol Research 2001；293，283-290)。相反地，在分化較差的和轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中觀察到表達增加的波形蛋白(Lang SH等，Prostate 2002；52，253-263)。而且，與正常腎組織相比，波形蛋白在人腎細胞癌中過量表達(Stassar MJ等Br.J.Cancer2001；85，1372-1382)。同樣地，典型何杰金淋巴瘤中有超過95％的腫瘤細胞是波形蛋白陽性的，而富含T-細胞的B-細胞淋巴瘤則是波形蛋白陰性的(Rudiger T等，Am J Surg Path 1998，22，1184-91)。
eIF-4A1近年來，許多研究中已經(jīng)報道了翻譯起始因子與惡性細胞轉(zhuǎn)化之間的密切聯(lián)系，包括乳腺癌、成神經(jīng)細胞瘤和黑素瘤(Kerekatte V等，Int.J.Cancer 1995；64，27-31)。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了對一組新的翻譯癌基因的定義。與正常的人黑素細胞相比，翻譯起始因子eIF-4A1持續(xù)在黑素瘤細胞系中過量表達。eIF-4A1的過量表達似乎是黑素瘤細胞的一個重要特征，并且為它們的惡性轉(zhuǎn)化負責(zé)(Eberle J等，Int.J.Cancer 1997；71，396-401)。
IFN-可誘導(dǎo)的p78
前列腺癌從激素依賴性狀態(tài)向非激素依賴性狀態(tài)的演變包括了一系列遺傳改變，該遺傳改變由癌基因的活化和/或腫瘤抑制基因的失活導(dǎo)致。鑒別出了幾種在不依賴于雄激素的癌細胞系中高度過量表達的基因。在其它基因中，鑒別出了干擾素可誘導(dǎo)的編碼p78的基因(Markku H等，LabInyest.2000；80，1259-1268.)。
黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(p97)黑轉(zhuǎn)鐵蛋白是與人黑素瘤相關(guān)的首選表面標記之一(Hellstrm等，Int.J Cancer 1983；31，553-555)。與上述的腫瘤標記蛋白波形蛋白、eIF-4A1或IFN-可誘導(dǎo)的p78不同，黑轉(zhuǎn)鐵蛋白只在少數(shù)的細胞類型中表達至顯著程度肝和腦中的內(nèi)皮細胞，汗腺導(dǎo)管和贅生性細胞(RichardsonDR，Eur J Biochem 2000；267，1290-1298)。除了酪氨酸酶、MUC 18和Melan A/MART-1以外，常規(guī)地將黑轉(zhuǎn)鐵蛋白用作RT-PCR實驗中的基因標記，并且發(fā)現(xiàn)其在大多數(shù)人黑素瘤中表達(Slingluff等，Curr OpinImmunol 1994；6，733-740)。此外，證實了黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在成膠質(zhì)細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤和少突膠質(zhì)瘤中受到上調(diào)(Chi DD，等，Am.J.Pathol.1997；150，2143-2152)。經(jīng)常在黑素瘤患者的肝、肺和腎轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)它。重要的是，黑轉(zhuǎn)鐵蛋白是GPI-錨定的表面蛋白，因此可以被抗體接近。
T-細胞識別的黑素瘤抗原T-細胞識別的黑素瘤抗原(Melan A；MART-1)是已知的腫瘤抗原(Kawakami Y.，Eliyahu S.，Delgado C.H.，Robbins P.F.，RiVoltiniL.，Topalian S.L.，Miki T.，Rosenberg S.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515-3519(1994)；Coulie P.G.，Brichard V.，van PelA.，Woelfel T.，Schneider J.，Traversari C.，Mattei S.，de Plaen E.，Lurquin C.，Szikora J.-P.，Renauld J.-C.，BoonT.，J.Exp.Med.18035-42(1994))。
本發(fā)明的“分離的”肽是不具有天然產(chǎn)生的對應(yīng)物(例如突變的肽抗原)、或已經(jīng)被從其天然伴隨組分中分離出或純化出的肽，例如在組織(例如胰腺、肝、脾、卵巢、睪丸、肌肉、關(guān)節(jié)組織、神經(jīng)組織、胃腸組織)或體液如血液、血清或尿。典型地，當它是至少70干重％且不含有蛋白和天然生成的與其天然有關(guān)的有機分子時，認為肽是“分離的”。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽制品由至少80干重％、更優(yōu)選地至少90干重％、最優(yōu)選地至少99干重％的本發(fā)明的肽組成。由于化學(xué)合成的肽被根據(jù)其性質(zhì)從天然伴隨它的組分中分離出來，合成的肽是“分離的”。免疫原性的肽包括但不限于能造成或刺激細胞免疫反應(yīng)或體液免疫反應(yīng)的抗原性肽。這樣的肽還可以是抗體反應(yīng)性的。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗原性肽的類似物。術(shù)語“類似物”包括顯示出這些抗原性肽的功能特征的任何肽。術(shù)語“類似物”還包括肽的保守取代物或化學(xué)衍生物。
術(shù)語“類似物”包括具有與這里所述的序列實質(zhì)上相同的氨基酸殘基序列的任何多肽，其中一個或多個殘基已經(jīng)被功能類似的殘基保守地取代，且其能表現(xiàn)出這里所述的肽的功能特征。保守取代的實例包括將一個非極性(疏水性)殘基例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代為另一個；將一個極性(親水性)殘基取代為另一個，例如在精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、蘇氨酸和絲氨酸之間；將一個堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代為另一個；或?qū)⒁粋€酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸取代為另一個。
短語“保守取代”也包括使用化學(xué)衍生的氨基酸替代非衍生的氨基酸?！盎瘜W(xué)衍生物”是指通過側(cè)官能團的反應(yīng)化學(xué)衍生出的具有一個或多個氨基酸的主題多肽。這樣衍生的分子的實例包括，例如其中的游離氨基已經(jīng)被衍生形成胺氫氯化物、對甲苯磺?；⑵S酯基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、乙酰基或甲?；哪切┓肿?。游離的羧基可以衍生形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離的羥基可以衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-im-芐基組氨酸?；瘜W(xué)衍生物還包括含有20個標準氨基酸的一個或多個天然存在的氨基酸衍生物的那些蛋白或肽。例如，4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸，5-羥基賴氨酸可以取代賴氨酸，3-甲基組氨酸可以取代組氨酸，高絲氨酸可以取代絲氨酸，和鳥氨酸或瓜氨酸可以取代賴氨酸。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，分離的與MHC II類相關(guān)的抗原性肽具有小于26個氨基酸的長度，其包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列，以及在氨基或羧基端有缺失且能維持它們的結(jié)合力的這些肽，在它們的序列中含有至少一個氨基酸修飾來增強該肽與MHC II類分子的結(jié)合。該氨基酸修飾可以是如上所述的保守氨基酸取代?？梢詫⒔Y(jié)合檢測為與參考抗原性肽相比的結(jié)合力。本發(fā)明的MHC II類抗原性肽的肽結(jié)合基序還可以包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個氨基酸序列修飾，同時仍然維持未修飾的肽結(jié)合基序的結(jié)合力。優(yōu)選地，修飾的肽結(jié)合基序包含未修飾的肽結(jié)合基序的四個錨氨基酸中的至少3個。氨基酸修飾可以是如上所述的保守的氨基酸取代。
本發(fā)明的分離的肽可以如下得到例如通過從天然源(例如從MHC II分子洗脫)中提取；通過表達編碼該肽的重組核酸；或通過化學(xué)合成。在與其天然起源不同的細胞系統(tǒng)中生成的肽是“分離的”，因為它將從天然伴隨它的組分中分離出。由宿主生物表達的重組肽可以作為粗裂解物得到，或者可以通過本領(lǐng)域已知的標準蛋白純化方法純化，這樣的方法可以包括示差沉淀、大小排阻色譜、離子交換層析、等電聚焦、凝膠電泳、親合層析和免疫親合層析等。分離或純化的程度可以通過任何合適的方法檢測，例如質(zhì)譜或HPLC分析。通過Merrifield，(1986)Science 232341-347，Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer，編(N.Y.，Academic Press)，第1-284頁(1979)所述的方法，可以合成地制備出該肽。合成可以在溶液中、或在固相中或用自動合成儀進行(Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，RockfordIll.，PierceChemical Co.(1984))。
在另一個實施方案中，提供的本發(fā)明的抗原性肽包含選自由SEQ IDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列，這些肽在氨基或羧基端有缺失且維持它們的結(jié)合力，其與MHC II類分子相連。
如果連有可檢測的標記(例如熒光基團、放射性核素或能催化反應(yīng)產(chǎn)生能吸收或發(fā)射特定波長的光的酶)，則含有共價地或非共價地結(jié)合的本發(fā)明的方法定義的肽的II類MHC分子的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、或寡聚體)可以用于對來自對象(例如人患者)的T細胞進行定量，所述的T細胞具有對這樣的復(fù)合體特異性的并且因此能與之結(jié)合的細胞表面受體。相對較多的這樣的T細胞很可能是相關(guān)疾病的診斷，或者表明該T細胞參與了對疾病的免疫。另外，連續(xù)監(jiān)視結(jié)合多聚體的T細胞的相對數(shù)量可有助于確立疾病的進程或治療功效。已經(jīng)使用I類MHC分子的四聚體(含有來自HIV-1或來自流感病毒-15的肽)開發(fā)了這樣的實驗(Altman等(1996)，Science 27494-96；Ogg等(1998)，Science 2792103-21061)，預(yù)期相應(yīng)的II類MHC多聚體也具有相似用途。這樣的復(fù)合體可以通過純化的II類MHC分子(在存在目標肽的情況下裝配好)的化學(xué)交聯(lián)生成，或者通過改進已經(jīng)建立的生成含有單一定義肽的II類MHC分子的重組技術(shù)來生成(Kazono等(1994)，Nature 369151-154；Gauthier等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9511828-118331)。這樣多聚體的II類MHC分子單體可以是天然分子，其由全長的α和β鏈組成。或者，它們可以是含有α和β鏈的胞外域或形成肽結(jié)合裂縫的“壁”和“墻”的α和β鏈域的分子。
因此，本發(fā)明還涉及指向上述肽且能與其反應(yīng)的抗體、片段或其衍生物。生產(chǎn)抗體的一般方法學(xué)是熟知的，并且作為實施例公開在Kohler和Milstein，1975，Nature 256，494或在J.G.R.Hurrel，MonoclonalHybridoma AntibodiesTechnique and Application，CRC Press Inc.，Boco Raron，F(xiàn)L(1982)中?？贵w可以是多克隆的，或優(yōu)選地單克隆的，或抗體片段，例如是F(ab’)2、Fab、Fv或scFv。本發(fā)明的抗體還可以是人源化的(Merluzzi S.等，(2000)，Adv.Clin.Path.，4(2)77-85)或人抗體(Aujame L.等，Hum.Antibodies，(1997)，8(4)155-168)。
本發(fā)明還提供了分離的編碼MHC II類抗原性肽的核酸分子，所述的肽包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的序列，以及編碼在氨基或羧基端有缺失且維持其結(jié)合力的抗原性肽的核酸分子，和編碼這樣的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一個氨基酸修飾來增強肽與MHC II類分子的結(jié)合。優(yōu)選地，分離的核酸分子是DNA分子。
而且，提供的分離的核酸分子編碼與MHC II類分子相連的本發(fā)明的抗原性肽，其中抗原性肽包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了重組核酸構(gòu)建體，其包含全部或部分的編碼抗原性肽的核酸序列，所述的肽包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的序列，或者包含編碼在氨基或羧基端有缺失且維持其結(jié)合力的抗原性肽的核酸分子，或者包含編碼這樣的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一個氨基酸修飾來增強該肽與MHC II類分子的結(jié)合，所述的核酸可操作地連接到表達載體上。適合于在本發(fā)明中使用的表達載體包含至少一個表達調(diào)控元件，它可操作地連接到編碼該抗原性肽的核酸序列上。重組表達構(gòu)建體可以是DNA構(gòu)建體。
表達調(diào)控元件插入在載體中，以控制和調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明的抗原性肽的核酸序列的表達。表達調(diào)控元件的實例包括但不限于lac系統(tǒng)，噬菌體λ的操縱子和啟動子區(qū)域，酵母啟動子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或SV40的啟動子。其它優(yōu)選的或需要的操縱元件包括但不限于前導(dǎo)序列、終止密碼子、多腺苷酸化信號和在宿主系統(tǒng)中合適地轉(zhuǎn)錄并隨后翻譯核酸序列所必須或優(yōu)選的任何其它序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白，表達調(diào)控元件所需要或優(yōu)選的正確組合取決于選擇的宿主系統(tǒng)。還能明白，表達載體應(yīng)當含有在宿主系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移并隨后復(fù)制含有核酸序列的表達載體所必需的其它元件。這樣的元件的實例包括但不限于復(fù)制起始點和選擇性標記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還能夠明白，這樣的載體能使用常規(guī)方法容易地構(gòu)建(www.cellbio.com/protocols.html)或可以商業(yè)獲得。
本發(fā)明的另一方面涉及宿主生物或宿主細胞，已經(jīng)插入在其中的重組核酸構(gòu)建體包含全部或部分的編碼抗原性肽的核酸序列，所述的肽選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組，或者包含編碼在氨基或羧基端有缺失且維持其結(jié)合力的抗原性肽的核酸分子，或者包含編碼這樣的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一個氨基酸修飾來增強該肽與MHC II類分子的結(jié)合，所述的核酸可操作地連接到表達載體上。用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細胞包括真核細胞(例如動物、植物、昆蟲和酵母細胞)和原核細胞(例如大腸桿菌)?？梢詫y帶核酸序列的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細胞中的方法包括但不限于顯微注射、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)或使用DEAE-葡聚糖、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法(Sambrook等(1989)in″MolecularCloning.A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Pres，Plainview，New York)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了能在真核細胞中起作用的真核表達載體。這樣的載體的實例包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、禽痘病毒載體、質(zhì)?；驐U狀病毒轉(zhuǎn)移載體。優(yōu)選的真核細胞系包括但不限于COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、293細胞(ATCC# CRL15731)、T2細胞、樹突細胞、單核細胞或Epstein-15 Barr病毒轉(zhuǎn)染的B細胞。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)MHC II類抗原性肽的方法，所述的抗原性肽包含選自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21組成的組的氨基酸序列，或者所述的抗原性肽在氨基或羧基端有缺失且維持其結(jié)合力，或者所述的抗原性肽的氨基酸序列中含有至少一個氨基酸修飾來增強該肽與MHC II類分子的結(jié)合，該方法包括下述步驟在能表達所述肽的條件下培養(yǎng)含有上述的重組核酸構(gòu)建體的宿主細胞，并從細胞或培養(yǎng)基中回收該肽。
分離和鑒別出的本發(fā)明的抗原性肽的序列可以通過MHC結(jié)合基序、MHC結(jié)合力和T細胞識別來驗證。
MHC結(jié)合基序與特定MHC分子(等位變體)相關(guān)的肽具有常見的結(jié)構(gòu)特征，定義為結(jié)合基序，這是與MHC分子形成穩(wěn)定復(fù)合體所必須的。從MHC I類分子洗脫下來的肽配體相對較短，有8-11個氨基酸。而且，該肽的2或3個側(cè)鏈與結(jié)合有關(guān)。各氨基酸側(cè)鏈的位置隨HLA等位基因而變化，這些所謂的“錨”殘基中的兩個在大多數(shù)情況下是位于位點2和9。關(guān)于特殊的錨位置，僅有1或2個氨基酸正常起錨氨基酸的作用，例如在HLA-A2中位點2處的亮氨酸或纈氨酸V。
關(guān)于MHC II類分子，其肽長度從11至25個氨基酸，更長的肽也可以結(jié)合，因為肽結(jié)合溝的兩端是開放的。大多數(shù)HLA II類分子具有至多4個錨殘基，位于九聚物核心區(qū)的相對位點P1、P4、P6和P9中。但是，該核心區(qū)到肽N-端的距離是可變的。在大多數(shù)情況下，有2-4個N-端殘基在核心區(qū)前面。因此，在大多數(shù)HLA II類相關(guān)肽中P1錨殘基位于位點3、4或5處。從HLA-DR II類分子洗脫的肽具有較大的疏水P1錨，代表性的是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。
錨殘基的位點和準確類型構(gòu)成了肽結(jié)合基序，它對于大多數(shù)常見的HLA II類等位基因產(chǎn)物是已知的。能夠在肽序列中進行基序驗證的計算機算法是“Tepitope”，可以從vaccinome獲得(www.vaccinome.com)。
MHC結(jié)合力通過本領(lǐng)域已知的方法，例如使用分離的MHC II類分子和合成的肽(其氨基酸序列與通過本發(fā)明的方法鑒別出的那些相同)，可以測試通過本發(fā)明的方法鑒別出的肽結(jié)合到合適的MHC II類分子的能力(KropshoferH等，J.Exp.Med.1992；175，1799-1803；Vogt AB等，J.Immunol.1994；153，1665-1673；Sloan VS等，Nature 1995；375，802-806)?；蛘?，可以使用細胞結(jié)合實驗(使用MHC II類表達細胞系和生物素化的肽)來檢驗鑒別出的表位(Arndt SO等，EMBO J.，2000；19，1241-1251)。
在兩種實驗中，通過檢測將標記的報道肽的結(jié)合減少50％所需的濃度來測量肽的相對結(jié)合力。該值稱作IC50。以合理親和力與相關(guān)的HLA II類分子相結(jié)合的肽所得到的IC50值不超過用參考肽建立起來的IC50的10倍。
同樣的結(jié)合實驗還可以用于測試肽結(jié)合備選的II類MHC分子(即，使用本發(fā)明的方法它們被洗脫的那些之外的II類MHC分子)的能力。可以將本發(fā)明的診斷方法(使用這樣的肽)和本發(fā)明的治療方法(使用這樣的肽或源自它們的肽)應(yīng)用到能表達這樣的備選的II類MHC分子的受試者。
T細胞識別表位的檢驗方法可以涉及檢測通過本發(fā)明的方法鑒別出的肽激活CD4+T細胞群的能力。合成了其氨基酸序列與在本發(fā)明中鑒別出的那些相同的或與核心序列(源自在本發(fā)明中鑒別出的嵌套組肽)相對應(yīng)的肽。然后測試了合成肽激活CD4+T細胞的能力，所述CD4+T細胞來自(a)測試受試者，能表達目標MHC II類分子，且具有至少一種疾病癥狀；和(b)對照受試者，能表達目標MHC II類分子，且沒有疾病癥狀。其它的對照受試者可以是具有疾病癥狀且不表達目標MHC II類分子的那些。
在有些疾病(例如具有自身免疫組分的那些)中，測試受試者的CD4+T細胞中有反應(yīng)性，而(b)所述的對照受試者的CD4+T細胞中則沒有，這提供了確實的證據(jù)證明相關(guān)肽是能激活CD4+T細胞的表位，所述細胞能啟動、促進或加劇相關(guān)疾病。在其它疾病(例如沒有自身免疫組分的癌癥或感染性疾病)中，與前述類似的反應(yīng)性和無反應(yīng)性模式表明，相關(guān)肽是能激活CD4+T細胞的表位，所述細胞介導(dǎo)對疾病的免疫，或者至少減輕疾病的癥狀。
可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法體外地檢測CD4+T細胞反應(yīng)。例如，可以將全外周血單核細胞(PBMC)在有或沒有備選的合成肽的情況下培養(yǎng)，并通過例如將[3H]-胸腺嘧啶整合它們的DNA來檢測它們的增殖反應(yīng)。增殖的T細胞是CD4+T細胞，這可以通過在實驗前從PBMC中排除CD4+T細胞來檢測，或者通過添加能結(jié)合到T細胞上的CD4+分子的抑制性抗體、從而抑制后者增殖來檢測。在兩種情況下，只有當CD4+T細胞是增殖細胞時，增殖反應(yīng)才會被抑制?；蛘?，可以從PBMC中純化CD4+T細胞，并在存在能表達合適的MHC II類分子的APC的情況下測試對肽的增殖反應(yīng)。這樣的APC可以是B-淋巴細胞、單核細胞、巨嗜細胞或樹突細胞或全PBMC。APC還可以是源自B-淋巴細胞、單核細胞、巨嗜細胞或樹突細胞的無限增殖化細胞系。APC可以內(nèi)源地表達目標MHC II類分子，或者它們可以表達轉(zhuǎn)染的編碼這樣的分子的多核苷酸。在所有情況下，在試驗之前，可以通過例如電離輻射或絲裂霉素-C處理來使APC無增殖性。
作為檢測細胞增殖的備選方案，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測CD4+T細胞生成的細胞因子。細胞因子包括但不限于白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、TNF-α、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-12(IL-12)或TGF-β。測試它們的實驗包括但不限于ELISA和其中在存在測試樣品的情況下測試細胞對相關(guān)細胞因子的反應(yīng)性(例如增殖)的生物測定。
備選地，通過細胞內(nèi)的免疫熒光染色和流式細胞計數(shù)可以直接看見CD4+淋巴細胞生成的細胞因子。
而且，前述的分離的抗原性肽可以用于診斷、預(yù)防和治療疾病，優(yōu)選癌癥。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷、預(yù)防和治療疾病(優(yōu)選癌癥)的本發(fā)明的抗原性肽。
本發(fā)明的一個方面是治療目的，其中一種或多種鑒別出的黑素瘤肽用于給患者疫苗接種以抵抗癌癥，優(yōu)選黑素瘤。為此目的，可以將相關(guān)肽以足以使肽結(jié)合到MHC分子的量直接地給患者施用，激活T細胞，隨后T細胞介導(dǎo)受感染的細胞或癌細胞的裂解。
備選地，黑素瘤肽可以用于生成基于DC的疫苗。在該情況下，可以用相關(guān)肽或含有相關(guān)肽序列的重組蛋白刺激源自患者的單核細胞的自體DC。更具體地，在疫苗接種抵抗黑素瘤時，與或不與本領(lǐng)域已知的MHC I類相關(guān)的腫瘤抗原肽組合的本發(fā)明的MHC II類相關(guān)肽可以用于刺激黑素瘤患者的自體的或異源的DC。類似地，可以將能編碼相關(guān)肽的核酸分子整合進載體中，以轉(zhuǎn)染腫瘤細胞。這些轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞可以與DC融合。在任何這些情況下，都會給腫瘤患者施用在合適的MHC分子情況下呈遞相關(guān)肽的DC，以觸發(fā)抗腫瘤的細胞介導(dǎo)的和/或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的II類限制的黑素瘤抗原或其類似物可以預(yù)防性地或治療性地用作疫苗。當預(yù)防性地使用時，該疫苗在出現(xiàn)任何黑素瘤之前就使用。II類限制的黑素瘤抗原疫苗的預(yù)防性施用應(yīng)當用于防止或減少哺乳動物的黑素瘤。在一個優(yōu)選的實施方案中，用本發(fā)明的疫苗預(yù)防性地處理對黑素瘤高危的哺乳動物(優(yōu)選人)。這樣的哺乳動物的實例包括但不限于具有黑素瘤家族史的人、具有非典型痣史的人、具有FAM-M綜合征史的人或患過黑素瘤(已經(jīng)切除)并因此具有再次發(fā)作的危險的人。當治療性地使用時，該疫苗用于增強患者自身對黑素瘤或轉(zhuǎn)移性的黑素瘤呈遞的腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。當用作免疫原時，該疫苗可以是細胞、用重組表達載體轉(zhuǎn)染的細胞的細胞裂解物、用編碼II類限制的黑素瘤抗原的重組表達載體轉(zhuǎn)染的細胞的細胞裂解物、或含有表達的蛋白的培養(yǎng)上清液。備選地，免疫原是部分地或基本上純的為II類限制的黑素瘤抗原編碼的重組蛋白、肽或其類似物。使用常規(guī)方法，可以將蛋白或肽與脂蛋白連接，或者以脂質(zhì)體形式或與佐劑一起施用。
因此，本發(fā)明提供了一種含有有效量的抗原性肽的藥物組合物，所述抗原性肽包含在SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21中描述的序列，以及這些肽在氨基或羧基端具有缺失并且維持它們的結(jié)合力，和可接受的賦形劑、稀釋劑或載體?！坝行Я俊痹谶@里是指足以激活特異性的淋巴細胞并誘導(dǎo)抗腫瘤的有效反應(yīng)的量。該量取決于使用的肽、給藥方式、要治療的疾病的嚴重程度和患者的總體狀況，通常為1-50mg/ml，例如在肽加載到樹突細胞上的情況下。
可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可以是用于體外研究的磷酸鹽緩沖鹽水和體內(nèi)使用的生理鹽溶液。
在一個實施方案中，這樣的組合物是用于給容易長瘤的患者進行預(yù)防性的疫苗接種，或用于給長瘤患者進行治療性的疫苗接種?！耙呙缃臃N”在這里是指主動免疫法，即，作為常規(guī)的疫苗接種方法，體內(nèi)地施用該肽來直接地在患者中引起體內(nèi)免疫反應(yīng)，例如抗病原體，和被動免疫法，即，使用該肽來體外地激活抗腫瘤的CD4+細胞或自身的或異源的樹突細胞，隨后將它們重新接種到患者體內(nèi)。
制備和使用疫苗的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，記載在(作為實例)Paul，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York(1989)或Cryz，S.J.，Immunotherapy and Vaccine，VCH Verlagsgesellschaft(1991)中。疫苗常規(guī)地制成注射劑、混懸液或溶液形式，但是它們也可以以固體制劑或脂質(zhì)體的形式使用。免疫原成分可以與藥用賦形劑混合，例如乳化劑、緩沖劑和能提高疫苗功效的佐劑。后者可以根據(jù)單或多劑量方案施用。多次給藥包括1-10次分開的給藥，每一次含有一定量的抗原，從1Hg至1000joug，隨后在后續(xù)的時間間隔(必須能維持或加強免疫反應(yīng))再次給藥，如果受試者需要，還可以在幾個月后再次給藥。在任何情況下，治療方案都取決于在治療的患者中引起的反應(yīng)、總體狀況和腫瘤的發(fā)展。
本發(fā)明的獸用和人用的藥物組合物或制劑包括如上所述的抗原性肽、一種或多種藥用載體和任選的其它治療性成分。載體必須是“可接受的”，其含義是與制劑的其它成分相容且對其受體無害。制劑可以常規(guī)地制成單位劑量形式，且可以通過制藥領(lǐng)域熟知的任何方法制備。
所有方法包括將活性成分與載體(其包括一種或多種輔助成分)相組合的步驟。通常，通過使活性成分與液體載體或細碎的固體載體或者兩者均勻地和緊密地組合來制備制劑，然后如果需要將產(chǎn)品制成需要的制劑。
適合于靜脈內(nèi)地、肌肉內(nèi)地、皮下地或腹膜內(nèi)地施用的制劑常規(guī)地包含活性成分的無菌水溶液和優(yōu)選地與受體血液等滲的溶液。這樣的制劑可以方便地如下制備將固體活性成分溶解到水中形成水溶液，所述的水含有生理上可相容的物質(zhì)，例如氯化鈉(例如0.1-2.0M)、甘氨酸等，且具有緩沖的可與生理條件相容的pH，并對所述的溶液滅菌。它們可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。
本發(fā)明的制劑可以包含穩(wěn)定劑。示例性的穩(wěn)定劑是聚乙二醇、蛋白、糖、氨基酸、無機酸和有機酸，它們可以單獨使用或者混合使用。這些穩(wěn)定劑的優(yōu)選用量是約0.11～約10,000重量份/重量份免疫原。如果使用兩種或多種穩(wěn)定劑，它們的總量優(yōu)選地在上述范圍內(nèi)。這些穩(wěn)定劑以合適的濃度和pH用在水溶液中。這樣的水溶液的特定滲透壓通常為約0.1至約3.0滲透壓摩爾，優(yōu)選地為約0.8至約1.2。水溶液的pH調(diào)至約5.0至約9.0，優(yōu)選地為6-8。在制備本發(fā)明的免疫原時，可以使用抗吸附劑。
本發(fā)明還提供了包含在SEQ ID NO.1-13和21中描述的序列的抗原性肽和在其氨基或羧基端具有缺失并且保留它們的結(jié)合力的那些肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于刺激哺乳動物中的保護性抗體或具有抗腫瘤反應(yīng)性的免疫細胞(例如細胞毒性T細胞或自然殺傷細胞)的生成。
在另一個實施方案中，提供了包含SEQ ID NO.1-13和21中描述的序列的抗原性肽和在其氨基或羧基端具有缺失并且保留它們的結(jié)合力的那些肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于通過刺激保護性抗體或免疫陽性的CD4+T細胞的生成來預(yù)防或治療黑素瘤。
在另一個實施方案中，提供了包含選自由SEQ ID NO.12和13組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于通過刺激保護性抗體或免疫陽性的CD4+T細胞的生成來預(yù)防或治療肺癌。
此外，本發(fā)明的方法可以用作診斷目的。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗原性肽可以用作跟蹤治療方案功效的反應(yīng)標記。實質(zhì)上，可以測定抗原性肽的基準值，然后施用特定的治療劑，隨后監(jiān)視抗原性肽的水平，抗原性肽水平的變化指示著治療性處理的功效。
而且，僅僅在疾病(優(yōu)選癌癥)的特定階段或時期發(fā)現(xiàn)的抗原性肽可以用作階段特異性的標記。實質(zhì)上，例行地監(jiān)視已經(jīng)與特定疾病階段關(guān)聯(lián)的抗原性肽的水平，由此提供關(guān)于疾病的階段和其進程的信息。
因此，提供了作為癌癥診斷標記的包含選自由SEQ ID NO.1-13和21組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽。優(yōu)選地，提供了本發(fā)明的MHC II類抗原性肽作為黑素瘤的診斷標記的應(yīng)用。實質(zhì)上優(yōu)選地是，包含選自由SEQ ID NO.12和13組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽作為黑素瘤診斷標記的應(yīng)用。
另外，提供了包含選自由SEQ ID NO.12和13組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽的作為肺癌診斷標記的應(yīng)用。
本發(fā)明還包括源自黑轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽的抗原性肽的作為肺癌診斷和監(jiān)視標記的應(yīng)用。各蛋白的應(yīng)用原理是，CD存在于大多數(shù)組織中，它們在那里通過特異性受體和通過特異化的內(nèi)吞機制(例如巨胞飲作用)捕獲外源性抗原，隨后在MHC II類分子上將加工后的抗原作為肽呈遞。以前的研究已經(jīng)證實了在MHC II類分子的情況下發(fā)現(xiàn)的肽表位的頻率，這在多數(shù)情況下反應(yīng)了蛋白(特定肽源自它們)的豐富。因此，不僅僅抗原性肽，其相應(yīng)的蛋白也可以用作肺癌標記。
因此，本發(fā)明另一個實施方案提供了黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(SEQ ID NO22)用作肺癌標記的應(yīng)用。
通過多種方法，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白印跡、免疫沉淀和免疫熒光，通過檢測疾病(優(yōu)選癌癥)的多肽或肽標記的表達和/或組成，可以診斷疾病(優(yōu)選癌癥)。對來自個體的測試樣品檢測是否存在本發(fā)明的多肽或肽的表達變化和/或組成變化。多肽或肽表達的變化可以是例如定量多肽表達(即生成的多肽的量)的變化；多肽組成的變化可以是例如定性多肽表達(如多肽突變體或不同的拼接變體的表達)的變化。
這兩種變化(定量的和定性的)還可以都存在。如這里所使用的，多肽表達或組成的“變化”是指測試樣品中的表達或組成與對照樣品中的肽或多肽的表達或組成相比時的變化。對照樣品是與測試樣品相對應(yīng)的(例如來自相同種類的細胞)且來自不患有疾病(優(yōu)選癌癥)的個體。測試樣品中的肽或多肽的表達或組成與對照樣品相比時的變化指示著疾病(優(yōu)選癌癥)，或者對疾病(優(yōu)選癌癥)的易感性?？梢允褂枚喾N方法檢查本發(fā)明的肽或多肽的表達或組成，包括光譜法、比色法、電泳、等電聚焦和免疫試驗(例如，David等，美國專利號4,376,110)，例如免疫印跡(還參見Current Protocols in Molecular Biology，具體地第10章)。例如，在一個實施方案中，可以使用能結(jié)合到多肽(例如如上所述)上的抗體，優(yōu)選具有可檢測標記的抗體?？贵w可以是多克隆的，或更優(yōu)選地是單克隆的?？梢允褂猛暾目贵w或其片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab’)2)。與探針或抗體相關(guān)的術(shù)語“標記的”意在包括通過將可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)到該探針或抗體上來直接標記該探針或抗體，和通過與直接標記的另一種試劑反應(yīng)來間接標記該探針或抗體。間接標記的實例包括使用熒光標記的次級抗體和末端用生物素標記的DNA探針(這樣可以用熒光標記的鏈霉抗生物素檢測它)檢測初級抗體。
蛋白印跡分析使用如上所述的能特異性地結(jié)合到本發(fā)明的肽或多肽上的抗體，它可以用來檢測測試樣品的肽或多肽的水平或量，并將其與對照樣品的肽或多肽的水平或量進行對比。優(yōu)選地，測試樣品的肽或多肽是在同源的或異源的免疫測定中檢測。測試樣品的多肽的水平或量高于或低于對照樣品的多肽的水平或量，該差異是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，指示著多肽表達的變化，診斷疾病(優(yōu)選癌癥)或?qū)膊?優(yōu)選癌癥)的易感性。
因此，本發(fā)明還涉及包含抗體的診斷性組合物，所述抗體能與本發(fā)明的MHC II類抗原性肽反應(yīng)。
現(xiàn)在已經(jīng)總體上描述了本發(fā)明，參考具體實施例并結(jié)合附圖能更好地理解本發(fā)明，除非另有說明，這些實施例在這里僅僅是用作解釋目的而無意進行限制。
實施例下面的實施例與上面所述的附圖有關(guān)，并且是基于圖1所示的和下面詳細描述的技術(shù)。除非另有說明，在實施例中提到的商業(yè)獲得的試劑是根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用。
發(fā)明方法細胞系和培養(yǎng)本研究用人樹突細胞進行，其從單核細胞分化出，如下所述。單核細胞是從人外周血純化出。另外，使用了黑素瘤細胞系UKRV-Mel-15a、UKRV-Mel-20c和Ma-Mel-18a(Eichmueller S等，Exp Dermatol 2002；11，292-31)。
所有細胞都在補充有1mM Pyruvat、2mM谷氨酰胺和10％熱滅活的胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，MD)的RPMI 1640培養(yǎng)基(簡稱RPMI)中培養(yǎng)。
外周血單核細胞(PBMC)的分離外周血從當?shù)匮獛飓@取，其是從健康供體得到的標準白細胞層(buffycoat)制品。用肝素(200國際單位/毫升血，Liquemine，Roche)防止凝結(jié)。在LSM(1.077-1.080g/ml；ICN，Aurora，OH)中以800g(室溫)離心30分鐘，分離外周血單核細胞(PBMC)。從中間相收集PBMC，用含有20mMHepes的RPMI洗滌2次(在500g進行15分鐘，在300g進行5分鐘)。為了除去紅細胞，在37℃用ALT緩沖液(140mM氯化銨，20mM Tris，pH 7.2)處理PBMC 3分鐘。用含有20mM Hepes的RPMI洗滌PBMC 2次(在200g進行5分鐘)。
從外周血單核細胞生成樹突細胞根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用抗-CD14磁珠(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)進行陽性篩選，從PBMC分離出單核細胞。將單核細胞在RPMI中培養(yǎng)，所述的RPMI中添加了1％非必需氨基酸(Gibco，BRL，Rockville，MD)、50ng/ml重組人粒細胞巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF；S.A.1.1×107U/mg)(Leucomax；Novarti，Basel Switzerland)和3ng/ml重組人IL-4(S.A.2.9×104U/μg)(R&D Systems，Minneapoli，MN)。以0.3×106/ml，將單核細胞接種到6孔平板(Costar)中，培養(yǎng)5天，得到未成熟的樹突細胞。
通過流式細胞儀分析確認下述表型來例行監(jiān)視來自單核細胞的未成熟的樹突細胞的質(zhì)量CDla(高)，CD3(負的)，CD14(低)，CD19(負的)，CD56(負的)，CD80(低)，CD83(負的)，CD86(低)和HLA-DR(高)。相反，成熟的樹突細胞(參見下面)表現(xiàn)出下述表型CDla(低)，CD80(高)，CD83(高)，CD86(高)和HLA-DR(高)?？笴Dla、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86以及各同種型對照的單克隆抗體購自Pharmingen(SanDiego，CA)。
樹突細胞暴露于壞死的黑素瘤細胞通過在液氮中冷凍并隨后在室溫解凍，循環(huán)4次使黑素瘤細胞系壞死。通過光學(xué)顯微鏡監(jiān)視死亡細胞的百分比。為了給樹突細胞飼喂來自黑素瘤細胞的抗原，將6×106未成熟的樹突細胞暴露于1.8×107死亡細胞(3∶1比例)。同時，通過加入10ng/ml重組人腫瘤壞死因子(TNFα；S.A.1.1×105U/μg)來誘導(dǎo)樹突細胞的成熟。作為對照，單獨用TNFα孵育6×106樹突細胞。
共培養(yǎng)24-48小時后，通過在300g離心10分鐘收獲成熟的樹突細胞。用含有10％FCS的RPMI洗滌細胞，并轉(zhuǎn)移到eppendorf管中。在400g離心3分鐘后，完全除去上清液，在-70℃冷凍細胞。
抗-HLA II類珠的生成通過培養(yǎng)各小鼠雜交瘤細胞系，生成抗-HLA-DR單克隆抗體(mAb)L243(ATCC，Manassa，VA)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用Protein A瓊脂糖凝膠(Pharmacia，Uppsala，Sweden)純化mAb L243，并以2.5mg/ml的終濃度固定化到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)上。將L243珠保藏在含有0.1％ Zwittergent 3-12(Calbiochem，La Jolla，CA)的PBS中。
HLA-DR-肽復(fù)合體的納米級純化將冷凍的樹突細胞團重新懸浮到10倍體積的冰冷卻的裂解緩沖液(1％Triton-X-100，20mM Tris，pH 7.8，5mM MgCl2，含有蛋白酶抑制劑胰凝乳蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑、PMSF和亮抑蛋白酶肽(Roche，Mannheim，Germany))中，并于1000rpm、4℃在水平搖床中裂解1小時。通過在2000g、4℃離心10分鐘，將細胞裂解物從細胞碎片和核中分離出。將裂解物與L243珠(5-10μl L243珠/100μl細胞裂解物)于1000rpm、4℃在水平搖床中共孵育2小時。通過在2000g、4℃離心5分鐘，使結(jié)合到L243珠上的免疫沉淀的HLA-DR-肽復(fù)合體沉積下來，并用300μl0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem)的PBS洗滌3次。
通過分析免疫沉淀前后的各細胞裂解物，監(jiān)視耗盡HLA-DR-肽復(fù)合體的功效。平行地，通過使用抗-HLA-DRα-特異性的mAb 1B5(Adams，T.E.等，Immunology 50(1983)613-624)的蛋白印跡分析等分試樣的珠。
HLA-DR相關(guān)肽的洗脫將結(jié)合到L243珠上的HLA-DR-肽復(fù)合體重新懸浮到400μl H2O(HPLC-級；Merck，Darmstadt，Germany)中，轉(zhuǎn)入超濾管，Ultrafree MC，30kD截留(Millipore，Bedford，MA)，通過在14000rpm、4℃離心2-4分鐘，用400μl H2O(HPLC-級)洗滌10次。為了洗脫結(jié)合的肽，加入50μl在H2O(HPLC-級)中的0.1％三氟醋酸(Fluka，Buch，Switzerland)，在37℃孵育30分鐘。通過在14000rpm、室溫Ultrafree unit離心3分鐘，將洗脫的肽收集到一個新的eppendorf管中，并立即在Speed-VacTM真空離心機中凍干。
通過納米-HPLC對肽分級將凍干的從HLA-DR分子洗脫的肽再溶解到在H2O(HPLC-級)中的0.05％三氟醋酸、5％乙腈(Merck，Darmstadt，Germany)中，在連接到FAMOSTM自動取樣器和ULTIMATETM納米流HPLC(Dionex，Olten，Switzerland)上的75μm×15cm C18 PepMap毛細管(C18；3μm；100)(LC-Packings，Amsterdam，Netherland)上分離。使用恒定流速為200nl/分鐘的下述非線性梯度0-40分鐘，5-50％，系統(tǒng)B；40-50分鐘，50-90％，系統(tǒng)B。系統(tǒng)A是0.05％三氟醋酸，5％乙腈/H2O，系統(tǒng)B是0.04％三氟醋酸，80％乙腈/H2O。通過在214nm和280nm的雙紫外吸收監(jiān)視分離。使用級分收集器PROBOTTM(BAI，Weiterstadt，Germany)收集級分(400nl)，并且點樣到AnchorChip 600/384MALDI-MS靶(Bruker，Bremen，Germany)上。
通過質(zhì)譜分析肽序列MALDI-TOF質(zhì)譜將點樣到AnchorChip板上的肽與基質(zhì)(10mg/ml；α-氰-4-羥基-肉桂酸(Merck，Darmstadt，Germany)，50％乙腈，0.1％三氟醋酸)共結(jié)晶。為了定性分析整體的肽所有組成成分，根據(jù)生產(chǎn)商的說明在UltraflexTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀(Bruker，Bremen，Germany)上分析樣品。
離子阱MS/MS質(zhì)譜為了對復(fù)合體肽混合物進行高通量測序，使用了基于液體色譜級分的MudPIT(多維蛋白鑒別技術(shù))(Washburn MP等，Nat Biotechnol 19(2001)，242-247)，隨后進行質(zhì)譜測序。
為此目的，將凍于的從HLA分子洗脫的肽重新懸浮到含有下述試劑的緩沖液中5％(v/v)乙腈，0.5％(v/v)醋酸，0.012％(v/v)七氟丁酸(HFBA)和5％(v/v)甲酸。在通過Model P-2000激光拉出器(Sutter InstrumentCo.，Novato，CA)生成的熔融石英(fused-silica)微毛細管柱(100μm內(nèi)徑×365μm)上分離樣品。微柱裝填有3μm/C18反相物質(zhì)(C18-ACE 3μm[ProntoSIL 120-3-C18ACE-EPS，Leonberg，Germany])，隨后裝入3cm長的5μm陽離子交換物質(zhì)(Partisphere SCX；Whatman，Clifton，NJ)。
在Agilent 1100系列的HPLC(Agilent Technologie，Waldbronn，Germany)上進行全自動的8步梯度分離，使用下述緩沖液5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(緩沖液A)，80％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(緩沖液B)，250mM醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(緩沖液C)，和1.5M醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(緩沖液D)。第一步106分鐘包括，從0至80％梯度緩沖液B 100分鐘，在80％緩沖液B保持6分鐘。接下來的6步(每步106分鐘)的特征在于下述特征在100％緩沖液A5分鐘，在x％緩沖液C2分鐘，在100％緩沖液A5分鐘，從0至10％梯度緩沖液B 3分鐘，從10至35％梯度緩沖液B 55分鐘，從35至50％梯度緩沖液B 20分鐘，從50至80％梯度緩沖液B 16分鐘。步驟2-7中的2分鐘緩沖液C百分比(x)如下10、20、30、40、70、90和100％。步驟8有下述特征組成用100％緩沖液A洗滌5分鐘，用100％緩沖液D鹽洗20分鐘和0-80％梯度緩沖液B 100分鐘。
HPLC柱直接連接到裝配有納米-LC電噴射離子化源的Finnigan LCQ離子阱質(zhì)譜儀(Finnigan，Bremen，Germany)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行MS-MS模式的質(zhì)譜。通過對swiss.fasta數(shù)據(jù)庫的sequest算法鑒別肽。
MALDI-PSD質(zhì)譜作為如上所述通過離子阱MS/MS進行序列分析的備選方案，使用軟件FLEXControl 1.1α在Bruker Ultraflex TOF/TOF質(zhì)譜儀(Bruker，Bremen，Germany)上進行MALDI-PSD分析，獲得數(shù)據(jù)。使用胰蛋白酶消化的人血清白蛋白(Merck，Darmstadt，Germany)進行校正。首先在reflectron模式掃描肽混合物。然后對于lift模式(MALDI-PSD分析)選擇目標肽。使用Xmas 5.1.2和Biotools 2.1軟件(Bruker)自動驗證得到的肽斷裂譜，并使用MASCOT算法(http//www.matrixxcience.com)用于不豐富蛋白數(shù)據(jù)庫的序列鑒別。
肽結(jié)合試驗肽合成使用F-moc化學(xué)合成肽，并通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化。一些肽通過在F-moc合成的過程中在N-端偶聯(lián)生物素基-氨基-己酸來生物素化。通過MALDI-MS例行地檢查肽的純度。
HLA-DR分子的純化如(Kropshofer H.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995；92，8313-8317)所述，通過使用抗-DR mAb L243的親合層析，從1010EBV-轉(zhuǎn)化的B細胞系或T2-轉(zhuǎn)染子純化HLA-DR分子。
體外肽結(jié)合試驗HA(307-319)(PKYVKQNTLKLAT)是來自流感病毒血凝素的免疫顯性的表位，它能良好地結(jié)合HLA-DR1、DR4和DR5，并且用作報道肽。
將純化的洗滌劑增溶的HLA-DR1、HLA-DR4或HLA-DR5分子(200nM)與生物素化的HA(307-319)肽(200nM)和分級量的競爭肽(100nM-10uM)于37℃在總體積為50μl的結(jié)合緩沖液(50mM磷酸鈉，50mM檸檬酸鈉，pH5.0，0.1％ Zwittergent 3-12)中共同孵育24小時。
將3×10μl在含有0.05％ Tween-20和1％BSA的PBS中稀釋10倍，在微量滴定板(Nunc)中孵育3小時，所述滴定板包被有抗-DR mAb L243。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，用0.1μg/ml鏈霉抗生物素-銪(Wallay Oy)孵育45分鐘，使平板顯影。使用時間分辨的銪熒光和VICTOR多標記計數(shù)器(Wallac Oy)對生物素化的HA(307-319)肽向HLA-DR分子的結(jié)合進行定量(Arndt SO等，EMBO J.2000；19，1241-1251)。
T細胞識別T細胞的分離使用由半抗原抗體混合物和連接到磁珠上的抗-半抗原抗體組成的CD4+T細胞分離試劑盒(Milteny Biotech)，通過負選擇從PBMC中分離出CD4+T細胞。在添加有下述試劑的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)T細胞1％自體人血清、1％非必需氨基酸(Gibco，BRL)、1％丙酮酸鈉(Gibco，BRL)、1％卡那霉素(Gibco，BRL)和1％谷氨酸(Gibco，BRL)。通過流式細胞分析對分離的CD4+T細胞進行定性控制，顯示出下述表型CD3(高)，TcR(高)，CD4(高)，CD8(負的)，CD19(負的)，CD45RO/RA(高)。
腫瘤抗原特異性的T細胞系的生成最初用2×105自體樹突細胞刺激1×106T細胞，所述的樹突細胞已經(jīng)用脂多糖(LPS來自Salmonella abortus equi，Sigma)和20μM黑轉(zhuǎn)鐵蛋白肽刺激。5天后，加入IL-2(1250U/ml)。每10-14天，用20μM黑轉(zhuǎn)鐵蛋白肽(SEQ ID NO13)刺激的自體樹突細胞再次刺激響應(yīng)的T細胞，并且在含有IL-2的培養(yǎng)基中生長。每個再刺激循環(huán)后，通過夾心免疫測定檢測生長的T細胞對IFN-γ和IL-4的特異性。
STEP分析在含有不同來源(睪丸、腦、脾、肌肉、淋巴(lymph)、脂肪、肺、肺癌、黑素瘤、結(jié)腸、結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、前列腺、前列腺癌)的癌和正常組織平板上進行單靶表達譜(Single target expressionprofiling，STEP)用Ultraspec RNA分離試劑盒(Biotecx，BL10100)從快速冷凍的人組織中提取總RNA，并使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen)進一步純化。使用T7-T24引物(5’-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACTATA GGG AGG CGG(dT24))，通過反轉(zhuǎn)錄(GIBCO BRL Life Technologies，Grand Island，NY)將15μg總RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，使用鎖相凝膠(phaselock gel)(5Prime-3Prime Inc.)通過苯酚/氯仿/異戊基萃取提純。使用已知的方法，生成含有5ng/μl的源自總RNA的雙鏈cDNA的主384-孔平板。手工地或通過機器人技術(shù)生成子板(最終cDNA濃度40pg/μl(200pg/孔))。使用TaqMan技術(shù)，在384-孔光學(xué)板上進行雙重實時PCR(靶基因和GAPDH作為參考基因)，并在ABI PrismPE7900序列檢測系統(tǒng)(Perkin-Elmer Applied Biosystems(PE)，Lincoln，CA)上分析，該系統(tǒng)使用TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性產(chǎn)生實時定量DNA分析試驗。每孔中的PCR混合物(25μl)有下述物質(zhì)組成商業(yè)獲得的預(yù)先混合的GAPDH TaqMan引物/探針(PE)，來自每個靶基因的5’和3’引物各900nM和200nM TaqMan探針，200pg cDNA和TaqMan通用PCR主混合物(PE)。使用下述的PCR條件在50℃進行2分鐘，然后在95℃進行10分鐘，隨后在95℃ 15秒，和在62℃1分鐘進行40個的循環(huán)。
生成了下述引物對，來特異性地從黑轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的外顯子9中挑出序列，因此受到黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(抗原性表位源自它)的限制5’-MtfCAGTGCGTGTCAGCCAAGTC(SEQ ID NO14)；3’-MtfTTCCCCGCCGTGTAAATGT(SEQ ID NO15)用下面的帶有熒光報道染料和熒光猝滅染料的位點特異性的探針序列進行檢測
P-MtfAGCGTCGACCTGCTCAGCCTGG(SEQ ID NO16)用式2ΔcT計算目標基因的相對表達。ΔcT是當熒光信號超過閾值時的GAPDH基因相對目標基因的熱循環(huán)差異。將GAPDH在每種組織中的表達調(diào)整到8個持家基因塊的表達水平。
抗體小鼠單克隆抗體L235是黑轉(zhuǎn)鐵蛋白特異性的IgG1同種型的抗體。能生成該抗體的雜交瘤細胞系購自ATCC(HB-8446)。
結(jié)果鑒別出的黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的表位能被T-細胞識別(圖4)。用自體樹突細胞(其已經(jīng)用鑒別出的黑轉(zhuǎn)鐵蛋白表位和LPS刺激)重復(fù)地再刺激來自HLA-DR4陽性供體的T細胞，會產(chǎn)生特異性地識別該表位的T-細胞系。誘導(dǎo)的T-細胞系能排它地分泌IFN-γ，而不是IL-4。根據(jù)抗原的劑量，T-細胞反應(yīng)是可滴定的。從而鑒別出的黑轉(zhuǎn)鐵蛋白表位是免疫原性的，且因此是肽疫苗的備選品。
而且，還可以從黑素瘤細胞系UKRV-Mel-17(它強烈表達黑轉(zhuǎn)鐵蛋白且是HLA-DR4陽性的)的HLA-DR分子洗脫鑒別出的表位。而且，已經(jīng)從該細胞系的HLA-DR分子洗脫并鑒別出新的MART-1抗原性肽(SEQ ID NO21)(表4)。已經(jīng)知道MART-1是腫瘤抗原(Kawakami Y.，Eliyahu S.，Delgado C.H.，Robbins P.F.，Rivoltini L.，Topalian S.L.，MikiT.，Rosenberg S.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515-3519(1994)；Coulie P.G.，Brichard V.，van Pel A.，Woelfel T.，Schneider J.，Traversari C.，Mattei S.，de Plaen E.，Lurquin C.，Szikora J.-P.，Renauld J.-C.，Boon T.，J.Exp.Med.18035-42(1994))。
黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在大多數(shù)黑素瘤細胞系上表達，其中的一些表現(xiàn)出非常強烈的表達(圖5)。用于鑒別取自死亡的Ma-Mel 18a細胞的新型抗原的樹突細胞自身不能表達黑轉(zhuǎn)鐵蛋白。
使用一組正常的對癌癥的組織的mRNA表達方案表明，黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在所有觀察的正常組織中都非常缺乏，但是在幾種肺癌中強烈表達，還在結(jié)腸癌細胞中較少程度地表達(圖6)。
關(guān)于黑轉(zhuǎn)鐵蛋白在某些腫瘤組織中的特異性表達、其在黑素瘤細胞中的廣泛表達和鑒別出的表位特異性地激活T-細胞的能力，新鑒別出的黑轉(zhuǎn)鐵蛋白表位能滿足可以用于肽疫苗接種的新型腫瘤抗原的要求。
實施例1用上述的方法學(xué)(圖1)鑒別源自黑素瘤細胞系UKRV-Mel-15a(或從其誘導(dǎo)的)新的與HLA-DR-相關(guān)的腫瘤肽。該黑素瘤細胞系UKRV-Mel-15a自身不能表達HLA-DR分子。
將3×106樹突細胞與9×106黑素瘤系UKRV-Mel-15a的死亡細胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)24小時。作為對照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)3×106樹突細胞。
在洗滌劑TX-100中裂解兩組樹突細胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脫與HLA-DR相關(guān)的肽，通過MALDI-MS分析(圖2A)在該實施例中，通過MALDI-MS光譜測定法對比來自兩種DC培養(yǎng)物的HLA-DR相關(guān)肽，通過連續(xù)測序只用包含在用黑素瘤細胞刺激的DC的圖譜中的肽信號來鑒別新的表位。
MALDI-MS分析揭示了一個在與未刺激的DC相比的刺激過的DC譜中的觀察到的質(zhì)譜為m/z＝1820.6的顯著信號(圖2A)。
通過MALDI-PSD片段測序產(chǎn)生了源自腫瘤抗原波形蛋白(登記號P08670；swissprot)——具有氨基酸序列TLQSFRQDVDNASLAR(圖2B；表1，SEQ ID NO.1)的波形蛋白(202-217)的新型表位。離子阱MS-MS序列分析確認了該序列(圖2C)。
分析全肽所有組成成分的高通量離子阱MS/MS測序的結(jié)果，揭示了該波形蛋白表位的3種其它長度的變體(表1)15-mer波形蛋白(203-217)(SEQ ID NO.2)、14-mer波形蛋白(203-216)(SEQ ID NO.3)和14-mer波形蛋白(202-215)(SEQ ID NO.4)。波形蛋白表位的4種長度的變體與黑素瘤抗原Melan A(51-65)、CDC27(768-782)、酪氨酸酶(448-462)和gp100(44-59)具有適合于結(jié)合到HLA-DR4的共同的序列基序(DRB1*0401)(表2)?？梢酝ㄟ^涉及合成的波形蛋白(202-217)肽和純化的HLA-DR4分子的體外結(jié)合試驗證實向HLA-DR4的結(jié)合(圖3)根據(jù)其對報道肽HA(307-319)的IC50值，波形蛋白(202-217)能高親和力地結(jié)合到HLA-DR4(圖3B)，這類似于CDC-27(768-782)，但是較差地結(jié)合到DR1(圖3A)或DR5(圖3C)。
通過本發(fā)明的方法鑒別出的波形蛋白(202-217)肽是迄今為止記載的第一種源自HLA II類限制的表位的波形蛋白。
實施例2該方法學(xué)還用于鑒別結(jié)合到用TNFα-誘導(dǎo)成熟且暴露于壞死的黑素瘤細胞系UKRV-Mel-20c后的樹突細胞(DC)的HLA-DR分子的肽。黑素瘤細胞系UKRV-Mel-20c自身不能表達HLA-DR分子。通過高通量離子阱MS/MS技術(shù)進行測序。
這樣，將5×106樹突細胞與1.5×107黑素瘤系UKRV-Mel-20c的死亡細胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)24小時。作為對照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)5×106樹突細胞。
在洗滌劑TX-100中裂解兩組樹突細胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脫與HLA-DR相關(guān)的肽，通過LC-高通量離子阱MS/MS技術(shù)分析。
對比從未刺激的DC(對照)鑒別出的肽序列和從用壞死的黑素瘤細胞刺激的DC鑒別出的肽序列在不存在黑素瘤細胞的情況下鑒別出了35種來自DC的HLA-DR分子的肽序列，在存在UKRV-Mel20c黑素瘤細胞的情況下鑒別出了40種肽序列。對比肽序列發(fā)現(xiàn)，21種肽是相同的，14種序列(11種表位)對未刺激的DC是特異性的，17種序列(9種表位)僅僅在黑素瘤細胞刺激后呈遞。
重要的是，9種黑素瘤細胞誘導(dǎo)的表位中的3種是源自已知的腫瘤標記蛋白，即翻譯因子eIF-4A1(登記號P04765；swissprot)，干擾素-γ(IFNγ)-可誘導(dǎo)的P78(登記號AAD43063；基因座AF135187)和細胞骨架蛋白波形蛋白(登記號P08670；swissprot)(表1)。
從下述事實強調(diào)波形蛋白關(guān)于作為黑素瘤抗原的重要性使用黑素瘤細胞系UKRV-Mel20c可以鑒別出第二種波形蛋白表位。在該情況下，發(fā)現(xiàn)了兩種長度的變體波形蛋白(166-183)(SEQ ID NO.5)和波形蛋白(167-183)(SEQ ID NO.6)。與前述波形蛋白表位不同，波形蛋白(167-183)不僅攜帶HLA-DR4的結(jié)合基序(參見表2)，而且似乎是混雜的HLA-DR結(jié)合劑，因為它能中等至較好程度地結(jié)合到HLA-DR1(圖3A)、HLA-DR4(圖3B)和HLA-DR5(圖3C)。
死亡的UKRV-Mel-20c黑素瘤細胞還產(chǎn)生了源自翻譯起始因子eIF-4A1(表1)的3種肽由2種長度的變體eIF4A1(172-187)(SEQ ID NO.7)和eIF4A1(172-186)(SEQ ID NO.8)所代表的一種表位，同時發(fā)現(xiàn)其它的是肽eIF4A1(321-338)(SEQ ID NO.9)。
而且，還鑒別出了兩種源自干擾素-可誘導(dǎo)的蛋白p78的肽(表1)，為相同表位的長度變體p78(503-516)(SEQ ID NO.10)和p78(503-515)(SEQ ID NO.11)。迄今，p78蛋白仍然指示著前列腺癌。
因而，通過本發(fā)明的方法鑒別出的源自翻譯因子eIF-4A1、IFNγ-可誘導(dǎo)的p78和波形蛋白的肽是可以用作治療方案中的診斷標記或疫苗的新的候選腫瘤抗原。
實施例3用第三種黑素瘤細胞系Ma-Mel-18a來鑒別新的與HLA-DR相關(guān)的腫瘤肽。黑素瘤細胞系Ma-Mel-18a自身不能表達HLA-DR分子。
這樣，將4×106樹突細胞與1.2×107黑素瘤系Ma-Mel-18a的死亡細胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)24小時。作為對照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情況下培養(yǎng)4×106樹突細胞。
在洗滌劑TX-100中裂解兩組樹突細胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脫與HLA-DR相關(guān)的肽，通過LC-高通量離子阱MS/MS技術(shù)分析。
對比從對照組(未刺激的DC)鑒別出的肽序列和從用死亡的Ma-Mel-18a刺激的DC鑒別出的肽序列(表3)在不存在Ma-Mel-18a細胞的情況下，發(fā)現(xiàn)了155種源自75種自身蛋白的自身肽序列。這些自身肽中的22種在遇到死亡的Ma-Mel-18a細胞后消失；但是在對照組中沒有發(fā)現(xiàn)165種自身肽中的26種。這26種自身肽顯然是由Ma-Mel-18a黑素瘤細胞誘導(dǎo)的，它們源自19種蛋白。19種蛋白中的18種是僅由DC表達或者由黑素瘤細胞和DC二者表達。尚未有關(guān)于18種蛋白在黑素瘤或其它腫瘤中的記載。
DC不能表達但是Ma-Mel-18a細胞能表達的唯一蛋白是黑轉(zhuǎn)鐵蛋白(登記號P08582；swissprot)鑒別出了相同p97表位的兩個長度的變體(表1)p97(688-684)(SEQ ID NO.12)和p97(688-683)(SEQ ID NO.13)。
p97是熟知的黑素瘤標記蛋白，但是至今仍沒有定義出源自p97的腫瘤抗原肽。
與上述的兩種波形蛋白表位(表1，2)類似，p97表位含有HLA-DR4的肽結(jié)合基序，所述的HLA-DR4帶有分別作為P1、P4、P6和P9的錨的L-672、D-675、T-677和A-680(表2)。與此相一致地，p97(668-683)能高親和力地結(jié)合到HLA-DR4上(圖3B)。而且，它以中等親和力地結(jié)合到HLA-DR1(圖3A)和HLA-DR5(圖3C)。
再根據(jù)這些結(jié)果，能產(chǎn)生p97鑒別結(jié)果的DC和能產(chǎn)生p97肽的鑒別的DC會表達HLA-DR4和HLA-DR1。因此，這里所述的p97表位可以用于多種HLA-DR等位基因。
關(guān)于黑轉(zhuǎn)鐵蛋白黑素瘤組織中的廣泛表達(Palmieri G等，J.Clin.Oncol.1999；17，304-311)，黑轉(zhuǎn)鐵蛋白表位可以用作候選的腫瘤抗原。
這樣，以能導(dǎo)致MHC II類-和CD4+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的黑轉(zhuǎn)鐵蛋白為基礎(chǔ)的肽疫苗將最適合于對表達黑轉(zhuǎn)鐵蛋白的腫瘤的治療。
表1黑素瘤細胞誘導(dǎo)的與HLA-DR相關(guān)的肽抗原
a用于刺激樹突細胞的壞死后的黑素瘤細胞的名字b源自黑素瘤細胞的肽的單字母序列c表位在蛋白序列中的位置表2共有HLA-DR4的結(jié)合基序(DRB1*0401)的源自黑素瘤細胞的肽抗原
a以單字母表示的肽序列，并且根據(jù)HLA-DR4(DRB1*0401)的肽結(jié)合基序?qū)Ρ萈1錨W，Y，F(xiàn)，I，L，V；P4錨D，E；P6錨T，S，A；P9錨A，S，G；包含P1-P9的核心表位區(qū)域標有下劃線
bR.-F.Wang，Trends in Immunol 22，269-276(2001)cN.Renkvist等，Cancer Immunol.Immunother.50，3-15(2001).
表3.在缺乏和存在壞死的Ma-Mel-18a情況下DC的與HLA-DR相關(guān)的肽所有組成成分(DRB1*0101/DRB1*0401)
a產(chǎn)生鑒別出的肽的蛋白的數(shù)目b在缺乏或單獨存在Ma-Mel-18a細胞的情況下唯一發(fā)現(xiàn)的肽或蛋白的數(shù)目表4從HLA-DR4陽性的黑素瘤細胞系UKRV-Mel-17的MHC II類分子洗脫的與黑素瘤的MHC II類限制的表位相關(guān)的蛋白
序列表序列表<110> 霍夫曼-拉羅奇有限公司<120> 新MHC II類相關(guān)候選腫瘤抗原的鑒定<130> Case 21412<160> 22<170> PatentIn vetsion 3.2<210> 1<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 1Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg1 5 10 15<210> 2<211> 15<212> PRT<213> 人<400> 2Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg1 5 10 15<210> 3<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 3Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala1 5 10<210> 4<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 4Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu1 5 10<210> 5<211> 18<212> PRT<213> 人<400> 5Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp1 5 10 15Ile Met<210> 6<211> 17<212> PRT<213> 人
<400> 6Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp Ile1 5 10 15Met<210> 7<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 7Ser Pro Lys Tyr Ile Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met1 5 10 15<210> 8<211> 15<212> PRT<213> 人<400> 8Ser Pro Lys Tyr Ile Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu1 5 10 15<210> 9<211> 18<212> PRT<213> 人<400> 9Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Thr Thr Asp Leu Leu Ala Arg Gly Ile1 5 10 15Asp Val<210> 10<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 10Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Glu Arg Glu1 5 10<210> 11<211> 13<212> PRT<213> 人<400> 11Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Glu Arg1 5 10<210> 12<211> 17<212> PRT<213> 人<400> 12Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val
1 5 10 15Gly<2l0> 13<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 13Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val1 5 10 15<210> 14<211> 20<212> PRT<213> 人<400> 14Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala1 5 10 15Ala Gly Thr Cys20<210> 15<211> 19<212> PRT<213> 人<400> 15Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala1 510 15Thr Gly Thr<210> 16<211> 22<212> PRT<213> 人<400> 16Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Cys Cys Thr Gly Gly20<210> 17<211> 24<212> PRT<213> 人<400> 17Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro1 5 10 15Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met20
<210> 18<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 18Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser1 5<210> 19<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 19Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala1 5<210> 20<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 20Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala1 5<210> 21<211> 17<212> PRT<213> 人<400> 21Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser Pro Pro Pro1 5 10 15Tyr<210> 22<211> 738<212> PRT<213> 人<300>
<308> swissprot/P08582<309> 2001-10-16<313> (1)..(738)<400> 22Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr1 5 10 15Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu20 25 30Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile35 40 45Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val50 55 60
Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly65 70 75 80Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly85 90 95Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val100 105 110Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys115 120 125Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val130 135 140Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val145 150 155 160Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala165 170 175Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp180 185 190Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr195 200 205Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val210 215 220Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr225 230 235 240Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu245 250 255Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His260 265 270Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp275 280 285Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser290 295 300His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln305 310 315 320Lys Asp Leu Leu Phe Lyg Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala325 330 335Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met340 345 350Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp355 360 365Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val
370 375 380Ala Phe Arg Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala385 390 395 400Lys Ser Pro Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp405 410 415Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Lys Tyr420 425 430Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp ser Ser435 440 445Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala450 455 460Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe465 470 475 480Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg485 490 495Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu500 505 510Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro515 520 525Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys530 535 540Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe545 550 555 560Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr565 570 575Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala580 585 590Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg595 600 605Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro610 615 620His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly625 630 635 640Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn645 650 655Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu660 665 670Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr675 680 685
Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met690 695 700Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro705 710 715 720Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro725 730 735Ala Leu
權(quán)利要求
1.一種分離的MHC II類抗原性肽，其包含選自由SEQ ID NO.1-13和21組成的組氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原性肽，其中所述的肽在羧基或氨基端有氨基酸缺失且保持結(jié)合能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的抗原性肽，其中所述的肽序列含有至少一個氨基酸修飾以增強所述肽與MHC II類分子的結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的抗原性肽，其與MHC II類分子相連。
5.抗體，其與權(quán)利要求1-3的抗原性肽反應(yīng)。
6.一種分離的核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的肽或多肽。
7.一種重組核酸構(gòu)建體，其包含可操作地連接表達載體的權(quán)利要求6的核酸分子。
8.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體。
9.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的MHC II類抗原性肽的方法，其包括下述步驟在允許表達所述肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細胞，并從所述細胞或培養(yǎng)基中回收該肽。
10.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-4中任一項的抗原性肽和可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
11.權(quán)利要求1-4中任一項的分離的抗原性肽，用于診斷、預(yù)防和治療疾病，優(yōu)選癌癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的MHC II類抗原性肽作為癌癥診斷標記的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述的MHC II類抗原性肽是黑素瘤的診斷標記。
14.包含選自由SEQ ID NO.12和13組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽的作為肺癌診斷標記的應(yīng)用。
15.SEQ ID NO22的多肽作為肺癌診斷標記的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求1-4中任一項的抗原性肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于刺激哺乳動物中的保護性抗體或免疫細胞的生成。
17.權(quán)利要求1-4中任一項的抗原性肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于通過刺激保護性抗體或免疫陽性的CD4+T細胞的生成來預(yù)防或治療黑素瘤。
18.包含選自由SEQ ID NO.12和13組成的組的氨基酸序列的MHC II類抗原性肽在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于通過刺激保護性抗體或免疫陽性的CD4+T細胞的生成來預(yù)防或治療肺癌。
19.實質(zhì)上如前面所述，更具體地參考前面的實施例的抗原性肽、核酸、宿主、方法和應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的天然加工的抗原性肽，它們是黑素瘤和其它腫瘤的備選腫瘤抗原。這些抗原性肽由人MHC II類HLA－DR分子呈遞。它們源自翻譯因子eIF－4A、IFN－γ－可誘導(dǎo)的蛋白p78、細胞骨架蛋白波形蛋白和結(jié)合鐵的表面蛋白黑轉(zhuǎn)鐵蛋白。本發(fā)明的抗原性肽可以用作診斷各種腫瘤的標記和在治療中用作抗腫瘤疫苗。
文檔編號C07K14/74GK1688602SQ03823680
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月2日
發(fā)明者哈拉爾·克羅普紹夫爾, 蒂爾·亞歷山大·勒恩, 安妮·沃格特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司