專利名稱：Mk2相互作用蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合MAPKAP激酶2(MK2)的蛋白的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及結(jié)合MK2、用于治療與炎癥相關(guān)的狀況的蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明可以用于治療狀況，例如克隆氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和由于創(chuàng)傷或損傷引起的炎癥。
背景技術(shù)：
許多人和動物狀況與炎癥相關(guān)。迄今為止，對這些狀況幾乎沒有可靠的或有效的治療方法。但是，通過給患有這些狀況的患者采用能夠減輕炎癥的治療方法，可以基本上減輕與這些狀況相關(guān)的可怕癥狀。盡管這些狀況尚未治愈，這樣的療法能顯著地提高這些患者的生活質(zhì)量，改善這些狀況的一些影響。這樣，本領(lǐng)域需要鑒別出新的有助于完全消除患有這些狀況的患者的炎癥的治療方法。
炎癥狀況經(jīng)常與不當(dāng)?shù)募?xì)胞因子調(diào)節(jié)相關(guān)(Han等，Nature CellBiol.，E39-E40(1999))。鑒于該原因，炎性細(xì)胞因子表達(dá)的選擇性抑制劑成為治療與炎癥相關(guān)的狀況的潛在藥物。
認(rèn)為MAPKAP激酶2(MK2)有助于調(diào)節(jié)幾種細(xì)胞因子，因此可以成為炎性反應(yīng)的基本組分。MK2無效突變的小鼠表現(xiàn)出增強的對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克的抗性(Kotlyrov等，Nature Cell Biol.，194-97(1999))。認(rèn)為這種應(yīng)激抗性的原因是幾種炎性細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IFN-γ)的生物合成的減少。因為MK2在調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子中的作用，能夠結(jié)合并抑制MK2活性的蛋白成為減少炎癥的潛在藥物。
已經(jīng)證實MK2與許多蛋白相關(guān)。作為對某些環(huán)境刺激或炎性細(xì)胞因子的反應(yīng)，MK2被p38 MAP激酶磷酸化(Kotlyarov等，Nature CellBiology，194-97(1999))，如圖7所示。MK2磷酸化血清反應(yīng)因子(SRF)(Heidenreich等，J.Biol.Chem.，27414434-14443(1999))、CREB和ER81(Janknecht，J.Biol.Chem.，27641856-41861(2001))小熱休克蛋白和淋巴細(xì)胞特異性蛋白1(綜述于，Neininger等，EMBO Reports，2703-708(2001))、E47(Neufeld等，J.Biol.Chem.，27520239-20242(2000))、Akt(Rane等，J.Biol.Chem.，2763517-3523(2001))、酪氨酸羥化酶和TTP(Mahtani等，Mol.Cell Biol.，216461-6469(2001))。另外，MK2與5-脂氧化酶相互作用，該酶能催化合成白三烯(它們是一組炎癥介質(zhì))的重要步驟(Janknecht，J.Biol.Chem.27641856-41861(2001))。但是，已經(jīng)證實蛋白hnRNP A0在MK2+/+和-/-細(xì)胞中受到不同的調(diào)節(jié)。
這樣，由于MK2參與炎性反應(yīng)，它可以成為治療性干預(yù)的理想的目標(biāo)。更具體地，能抑制MK2活性的治療劑可以用于治療人或動物的狀況，其中減輕炎癥是治療上有益的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及與MK2相互作用的蛋白。結(jié)合MK2的蛋白，包括這樣的蛋白的剪接變體、截短物、片段、取代、添加和缺失突變體、融合蛋白、改組突變體、基序序列和同源物，是潛在的新型抗炎藥物試劑。
本發(fā)明還涉及包含MK2和MK2相互作用蛋白(例如STS、HPH2和Shc以及它們的變體)的蛋白復(fù)合物。其它的MK2相互作用蛋白的實例包括SRF、CREB、ER81、酪氨酸羥化酶、TTP、小熱休克蛋白1、E47、Akt和5-脂氧化酶。這些蛋白中的一種或多種也可以存在于包括MK2的蛋白復(fù)合物中。本發(fā)明還提供了制備和使用這樣的蛋白復(fù)合物的方法，該方法用于鑒別潛在的用于治療其中需要調(diào)節(jié)炎癥的狀況和疾病的化合物。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)表達(dá)MK2的細(xì)胞中的炎性活性的方法。該方法包括施用有效量的結(jié)合MK2的蛋白。本發(fā)明還包括通過施用編碼至少一種結(jié)合MK2的蛋白的DNA分子在細(xì)胞中表達(dá)蛋白的方法。
本發(fā)明還包括鑒別抗炎藥物的藥物篩選方法。在一些實施方案中，抗炎藥物通過這樣的方法鑒別，它包括，例如，提供包含MK2和至少一種MK2相互作用蛋白的復(fù)合物，向復(fù)合物加入有效量的受檢化合物并確定受檢化合物是否抑制MK2與相互作用蛋白的相互作用。根據(jù)本發(fā)明的方法鑒別出的抗炎藥物包括能抑制MK2與MK2相互作用蛋白之間的相互作用的小分子、化學(xué)試劑、蛋白、肽和抗體。另外，本發(fā)明還提供了鑒別潛在的抗炎藥物的方法，該藥物允許MK2與至少一種MK2相互作用蛋白發(fā)生相互作用，但是會阻斷MK2活性?？寡姿幬锏膶嵗ㄐ》肿?、化學(xué)試劑、蛋白、肽和抗體。
根據(jù)本發(fā)明，為了治療或預(yù)防其中減少炎癥會是治療上有益的狀況，可以給患者施用治療有效劑量的與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用并調(diào)節(jié)MK2活性的化合物(例如蛋白、肽、抗體、化學(xué)試劑和小分子)。實施方案包括治療包括與炎癥增加有關(guān)的細(xì)胞和組織的狀況。
與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物可以包括在藥物制劑中。該藥物制劑可以含有其它的組分，例如輔助將化合物結(jié)合到MK2或MK2復(fù)合物的試劑。
另外，與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物可以用作定量地或定性地檢測MK2的診斷工具。例如，這些化合物可以是放射性標(biāo)記的，組織可以與這些標(biāo)記的蛋白一起孵育，多余的未結(jié)合的蛋白可以洗去。然后可以確定組織存在放射活性，這表明存在MK2。與至少一種MK2或MK2復(fù)合物相互作用的化合物可以用于檢測MK2在細(xì)胞、體液、組織或器官中是否存在或其量。檢測到的MK2存在或其量可以與一種或多種這里列出的醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明還包括能促進MK2與MK2相互作用蛋白之間的相互作用的化合物，其中MK2相互作用蛋白刺激導(dǎo)致炎性反應(yīng)的MK2活性。這樣的試劑在治療其中需要刺激MK2并且隨后增加TNF-α生成的狀況(例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染)中特別有用。
因此，本發(fā)明還包括用于檢測樣品中的MK2水平的試劑盒，它包含至少一種與MK2或MK2復(fù)合物相互作用的化合物，無論它是否被標(biāo)記，和至少一種結(jié)合該化合物的試劑，例如標(biāo)記的抗體。該試劑盒還可以包含適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)準(zhǔn)和對照樣品，它們可以用來比較實驗檢測的結(jié)果。它還可以包含緩沖液或洗滌液和關(guān)于使用試劑盒的說明書。還可以包括在其上面可以進行實驗的結(jié)構(gòu)部件，例如棒、珠、紙、柱、小瓶或凝膠。


圖1A至1B顯示了編碼“與smoothelin相似的”(STS)蛋白的cDNA序列，對應(yīng)SEQ ID NO1。
圖2A和2B顯示了編碼人多同源異形體(Polyhomeotic)2(HPH2)蛋白的cDNA序列，對應(yīng)SEQ ID NO2。
圖3A和3B顯示了編碼src同源性和膠原(Shc)蛋白的cDNA序列，對應(yīng)SEQ ID NO3。
圖4顯示了“與smoothelin相似的”(STS)蛋白的氨基酸序列，對應(yīng)SEQ ID NO4。
圖5顯示了人多同源異形體2(HPH2)蛋白的氨基酸序列，對應(yīng)SEQID NO5。
圖6顯示了src同源性和膠原(Shc)蛋白的氨基酸序列，對應(yīng)SEQID NO6。
圖7顯示了p38/MK2信號傳遞途徑的圖。某些環(huán)境刺激或促炎細(xì)胞因子會激活P38MAP激酶信號傳遞途徑。MKK3/6MAP激酶直接磷酸化P38。p38的底物包括轉(zhuǎn)錄因子和一些放大和多樣化p38信號傳遞的激酶。MK2激酶是一種p38底物，它可以磷酸化一些蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和RNA結(jié)合蛋白。MK2還在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TNF的生物合成。
圖8顯示了Shc A、HPH2和STS的結(jié)構(gòu)和MK2相互作用域。Shc的所有三種異構(gòu)體(46、52和66-kDa)都含有src同源性2(SH2)域、磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)域和膠原蛋白同源性域1(CH1)。66kDa的異構(gòu)體還含有膠原蛋白同源性域2(CH2)。人多同源異形體2具有不育α基序(SAM)蛋白相互作用域。STS含有肌動蛋白結(jié)合域(ABD)和鈣調(diào)理蛋白同源性域(CH)。
圖9A顯示了在檢測各種MK2相互作用蛋白與酵母中的突變MK2的相互作用的特異性測定中，酵母在選擇性培養(yǎng)基上的生長和顏色。MK2相互作用蛋白Shc、HPH2和STS能結(jié)合催化失活的MK2K93R突變體。MK2相互作用蛋白不結(jié)合空BD載體(V)或核纖層蛋白(L)。圖9B總結(jié)了從圖9A的測定得到的數(shù)據(jù)，其中Shc、HPH2和STS中的每一個都能以基本相同的親和力結(jié)合MK2和MK2 K93R。圖9C顯示了MK2中的域，它與Shc、HPH2和STS相互作用。顯示了MK2N-端富含脯氨酸的、催化的和C-端定位域。
圖10描述了在有或沒有茴香霉素存在的情況下使用Western印跡(WB)檢測的蛋白與293T細(xì)胞中的MK2的共免疫沉淀(IP)。如圖10A所示，使用針對V5或Myc的抗體的Western印跡表明，V5-標(biāo)記的Shc和Myc-標(biāo)記的MK2蛋白都在293T細(xì)胞中表達(dá)。使用抗-V5抗體的免疫共沉淀和隨后的使用抗-Myc抗體的免疫印跡表明，MK2能與Shc免疫共沉淀。圖10B表明，如Western印跡所檢測到的，HA-HPH2、HA-p38和Myc-MK2都有表達(dá)。使用抗-HA抗體的免疫共沉淀和隨后的使用抗-Myc抗體的免疫印跡表明，MK2能與HPH2和p38免疫共沉淀。
圖11說明了RAW264.7巨噬細(xì)胞中的TNF-α蛋白(pg/ml)的水平。如圖所示，與只含有載體、p38、MK2或Shc的細(xì)胞中的TNF-α水平相比，共同表達(dá)p38和Shc或MK2和Shc的茴香霉素刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中的TNF-α水平有所增高。這樣，Shc表現(xiàn)為促炎的，因為它能提高MK2活性。
圖12A描述了一個2D放射自顯影，它顯示了使用二維凝膠電泳分辨的來自MK2+/+和MK2-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的33P標(biāo)記的蛋白。顯示了不同地磷酸化的蛋白(箭頭)，它具有等電點5.4。圖12B顯示了相同凝膠的銀染色，描述了分辨的蛋白的相對豐度。
圖13A描述了在存在MK2或MK2和Shc的情況下，在有和沒有茴香霉素刺激的HeLa細(xì)胞中檢測磷酸化的Hsp 27(pHsp 27)的western印跡。如圖所示，V5-p66 Shc A和MK2都在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，與抗-pHsp 27的免疫印跡證實，在表達(dá)MK2或MK2和Shc的細(xì)胞中的基礎(chǔ)pHsp 27蛋白的水平有所升高。圖13B描述了在有和沒有茴香霉素刺激的HeLa細(xì)胞中，用單獨的載體(V)、單獨的MK2、單獨的Shc或MK2和Shc轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中的基礎(chǔ)磷酸化的Hsp 27蛋白的水平。磷酸化的Hsp 27蛋白的水平對單獨載體轉(zhuǎn)染的無刺激細(xì)胞中的水平進行標(biāo)準(zhǔn)化。圖13C描述了對MK2和載體(V)或MK2和Shc轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中的MK2水平標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)磷酸化的Hsp 27的水平。
圖14A描述的western印跡表明Shc和MK2都在RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)。用抗-肌動蛋白抗體證實了在每條帶上加載了等量的總蛋白。圖14B描述了通過ELISA測得的在用單獨的載體(V)、單獨的MK2、單獨的Shc或MK2和Shc轉(zhuǎn)染的有和沒有LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中分泌的TNF-α蛋白的水平。
圖15A描述了包含CH2域、PTB域、CH1域和SH2域的p66Shc A蛋白的略圖。還顯示了蛋白中的MK2相互作用域、CAM激酶2共有序列和GSK3序列。圖15B描述了在使用從轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞免疫沉淀出的重組MK2和V5-Shc A進行的體外激酶測定中的p66Shc A的磷酸化。如圖所示，只在表達(dá)Shc的細(xì)胞的免疫沉淀物中檢測出磷酸化的ShcA。用Coomassie染色和使用V5-抗體的western印跡確認(rèn)了在Shc A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)Shc A。
圖16的略圖說明了，作為對細(xì)胞應(yīng)激的反應(yīng)由MK2調(diào)節(jié)的應(yīng)激激活的途徑和作為對細(xì)胞應(yīng)激激活MK2的反應(yīng)的Shc磷酸化。
圖17描述的western印跡顯示了反應(yīng)于MK2-/-和MK2+/+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中的過氧化氫(H2O2)的磷酸化的AKT和FKHR-L1水平。如圖所示，與MK2+/+MEFs中的水平相比，MK2-/-MEFs中的磷酸化的AKT和磷酸化的FKHR-L1水平都有降低。
序列簡述下表提供了本申請中的序列信息。

定義術(shù)語“復(fù)合物”是指兩個或多個蛋白的締合。這樣的締合可以是共價的或非共價的，包括例如復(fù)合物中兩個蛋白之間的離子的、親水的和疏水的相互作用。典型地，能形成復(fù)合物的蛋白會彼此相互作用，所以只要鑒別或檢測出復(fù)合物中的第一種蛋白，就能鑒別或檢測出與第一種蛋白形成復(fù)合物的其它蛋白?？梢泽w內(nèi)(例如在形成復(fù)合物的細(xì)胞中)鑒別出蛋白復(fù)合物，其中兩個或多個蛋白天然地彼此締合?；蛘撸梢泽w外形成復(fù)合物，當(dāng)將這些蛋白加入到同一反應(yīng)混合物中時，會發(fā)生兩個或多個蛋白之間的相互作用。用于檢測復(fù)合物中的蛋白的方法包括但不限于共免疫沉淀、酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和斷開(pull-down)實驗。MK2復(fù)合物是含有MK2和至少一種其它蛋白的復(fù)合物。
術(shù)語“共免疫沉淀”是指一種檢測兩種蛋白之間的相互作用的方法。例如，通過共免疫沉淀可以檢測出在293T細(xì)胞中共表達(dá)的HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白(例如Shc)和MYC-標(biāo)記的MK2之間的相互作用。從共表達(dá)兩種蛋白的細(xì)胞制備出細(xì)胞裂解物，隨后用抗-HA抗體進行免疫沉淀。通過SDS PAGE分辨免疫沉淀物，并用抗-MYC抗體進行免疫印跡來檢測共免疫沉淀的MK2。
術(shù)語“HPH2”是指人多同源異形同源物2，它是多蜂房組(PcG)蛋白中的一種，其分子量為約51kDa。HPH2與MK2相互作用形成復(fù)合物，由此調(diào)節(jié)MK2活性。術(shù)語“HPH2”還包括HPH2的變體，包括能與MK2相互作用的剪接變體、同源物、包含HPH2的融合蛋白、截短和缺失突變體、片段、取代突變體、添加突變體、改組突變體和HPH2基序。這樣術(shù)語“HPH2”還指HPH2的功能變體，包括與MK2相互作用的HPH2片段。HPH2與果蠅PcG蛋白“多同源異形體”和小鼠Rae28/Mph1蛋白是同源的(Gunster等，Molec.Cell.Biol.，172326-2335(1997))。在果蠅中，PcG基因是細(xì)胞記憶系統(tǒng)的一部分，它負(fù)責(zé)基因活性的穩(wěn)定遺傳。PcG蛋白能形成較大的多聚的染色質(zhì)相關(guān)蛋白復(fù)合物，并且含有鋅指基序和兩個指定為同源性域I和II的區(qū)域。這些復(fù)合物在發(fā)育過程中維持轉(zhuǎn)錄沉默/激活，并且在細(xì)胞周期(特別是細(xì)胞分裂)中維持轉(zhuǎn)錄記憶。PcG基因的突變與造血細(xì)胞的增殖缺陷相關(guān)，表明這些蛋白能調(diào)節(jié)造血作用。圖2A和2B提供了HPH2的cDNA序列(對應(yīng)SEQ ID NO2)，圖5提供了該蛋白的氨基酸序列(對應(yīng)SEQID NO5)。圖8B顯示了HPH2的結(jié)構(gòu)和HPH2中的MK2相互作用域，圖9C說明了MK2中的HPH2相互作用域。HPH2具有保守的C端不育α基序(SAM)蛋白相互作用域，它在許多信號蛋白(包括激酶、支架(scaffolding)蛋白、接頭(adaptor)蛋白和GTPA酶以及轉(zhuǎn)錄因子的ETS家族成員)中都有發(fā)現(xiàn)。相信HPH2是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑。
術(shù)語“炎癥”是指一種基本病理過程，它由反應(yīng)于物理劑、化學(xué)劑或生物劑造成的損傷或異常刺激的在受影響的血管和周圍組織中發(fā)生的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)反應(yīng)的動態(tài)復(fù)合物組成。
術(shù)語“炎性狀況”只是其中以炎癥為癥狀的狀況。這樣的狀況包括但不限于克隆氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和由于創(chuàng)傷或卒中(例如缺血性腦損傷)引起的炎癥。
術(shù)語“MK2”和“MK2多肽”是指MAPKAP激酶2，一種在Stokoe等人(Biochem.J.296843-849(1993))中公開的蛋白。該蛋白是Ser/Thr激酶，最初鑒別為hsp25/27激酶。已經(jīng)證實該蛋白激酶在被p38有絲分離原激活的蛋白激酶(p38MAP激酶)磷酸化以后仍有活性。認(rèn)為MK2在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)TNF，并且在調(diào)節(jié)其它細(xì)胞因子中也是重要的。MK2的cDNA序列分析揭示了下述特征(按5′至3′的次序)含有2個推定的SH3-結(jié)合位點的富含脯氨酸的區(qū)域、激酶催化域、MAP激酶磷酸化的蘇氨酸殘基和核定位信號。MK2-/-敲除的小鼠是能存活的，但是LPS誘導(dǎo)的TNF-α生物合成有90％的減少，并且這些小鼠對LPS誘導(dǎo)的休克有抗性。術(shù)語“MK2”還包括MK2的變體，包括具有MK2活性的剪接變體、同源物、包含MK2的融合蛋白、截短和缺失突變體、片段、取代突變體、添加突變體、改組突變體和MK2基序。該術(shù)語還包括MK2的功能變體，其中MK2蛋白的變體或其片段具有MK2活性，如通過這里所述的一個或多個測定和本領(lǐng)域已知的測定所測得的。
術(shù)語“結(jié)合MK2的蛋白”和“MK2相互作用蛋白”是指能粘附MK2或與之締合的蛋白。該術(shù)語包括在含有MK2的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的蛋白。該術(shù)語還指具有一種或多種與天然蛋白相關(guān)的生物活性的這樣的蛋白的任何變體(包括剪接變體、截短、片段、取代、添加和缺失突變體、融合蛋白、改組序列、基序序列和同源物)。這些蛋白還包括已經(jīng)修飾過的氨基酸序列，其帶有對天然蛋白的保守或不保守改變。這些蛋白可以來自任何來源，天然的或合成的。蛋白可以是人源的或來自動物源的，包括牛、雞、小鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒和魚。能結(jié)合MK2的蛋白可以刺激MK2活性、抑制MK2活性或?qū)K2的活性無影響。
術(shù)語“Shc”是指同源性和膠原蛋白(Migliaccio等，Nature，402309-313(1999))。術(shù)語“Shc”還包括Shc變體，包括剪接變體、同源物、含有Shc的融合蛋白、截短和缺失突變體、片段、取代突變體、添加突變體、改組突變體和Shc的基序序列，它們與MK2相互作用。該術(shù)語包括Shc的功能變體，其中變體Shc蛋白與MK2相互作用從而調(diào)節(jié)MK2活性。圖3A和3B提供了Shc蛋白(Shc A)的cDNA序列(對應(yīng)SEQ ID NO3)，圖6提供了該蛋白的氨基酸序列(對應(yīng)SEQ IDNO6)。圖8A和16A顯示了Shc蛋白的不同域，包括CH2、PTB、CH1、SH2和MK2相互作用域。圖9C顯示了MK2中與Shc相互作用的域。Shc A蛋白的三種異構(gòu)體(46、52和66-kDa)在與細(xì)胞表面受體結(jié)合后被磷酸化。兩個小異構(gòu)體通過不同的翻譯起點生成，而具有獨特N端CH域(CH2)的66kDa異構(gòu)體則通過可變剪接生成。Src同源性2(SH2)和磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)域會結(jié)合被激活的細(xì)胞表面受體上的磷酸酪氨酸，導(dǎo)致CH 1域的酪氨酸磷酸化，這促進了Grb2和SOS的募集。許多被激活的細(xì)胞表面受體通過兩個較小的Shc A異構(gòu)體傳遞信號，以激活Ras MAP激酶途徑。相反，尚未發(fā)現(xiàn)結(jié)合到這些受體上的p66能激活該有絲分裂途徑。膠原蛋白同源性2(CH2)域是p66獨有的且含有絲氨酸36，它因氧化應(yīng)激而被磷酸化。Shc的哺乳動物異構(gòu)體調(diào)節(jié)如生長(p52/p46Shc)、細(xì)胞凋亡(p66Shc)和壽命(p66Shc)的多種功能(Luzi等，Curr.Opin.Genetics and Development，10668-674(2000))。
確信Shc A是信號轉(zhuǎn)換磷酸蛋白。Shc A蛋白的p46和p52異構(gòu)體在除了腦和神經(jīng)元(在這里受發(fā)育調(diào)節(jié))之外的地方普遍表達(dá)。p66在特定的細(xì)胞類型和組織中表達(dá)。因為p66不能激活Ras MAPK途徑，認(rèn)為它的結(jié)合(假定其與兩種更小的Shc A異構(gòu)體的結(jié)合競爭)會通過其差異表達(dá)來調(diào)節(jié)Ras MAPK途徑的激活。已經(jīng)在分離自p66-/-小鼠的細(xì)胞中證實，p66作用于p53的下游來介導(dǎo)對氧化應(yīng)激(包括細(xì)胞內(nèi)的ROS和細(xì)胞凋亡)的細(xì)胞反應(yīng)。該活性需要p66異構(gòu)體(S36)中的位點36處的絲氨酸殘基的磷酸化。已經(jīng)證實兩種MAP激酶(Erk和Jnk)參與該絲氨酸的磷酸化。
術(shù)語“與smoothelin相似的”或“STS”是指與smoothelin密切相關(guān)的特定蛋白。術(shù)語“STS”還包括STS的變體，包括剪接變體、同源物、STS的融合蛋白、截短和缺失突變體、片段、取代突變體、添加突變體、改組突變體和STS的基序序列，它們與MK2相互作用。該術(shù)語包括STS的功能變體，其中變體STS蛋白與MK2相互作用。尚未完全發(fā)現(xiàn)STS的特征，但是STS的預(yù)測cDNA記載在國家衛(wèi)生部的國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)數(shù)據(jù)庫中，其預(yù)測的分子量是100kDa。STS與smoothelin有94％的相同，兩種蛋白都有鈣調(diào)理蛋白同源性和肌動蛋白結(jié)合域，這基于與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白的序列同源性。這些蛋白含有肌動蛋白結(jié)合域(ABD)和鈣調(diào)理蛋白同源性域(CH)。van derLoop等，J.Cell Biol.，134401-411(1996)確認(rèn)，smoothelin與以下序列具有顯著的同源性，該序列與肌營養(yǎng)不良蛋白、utrophin、β-血影蛋白和α-輔肌動蛋白的肌動蛋白結(jié)合域側(cè)接。細(xì)胞分級研究提示了發(fā)明人，smoothelin是細(xì)胞骨架的一部分。Northern印跡分析表明，基因在幾種含有血管平滑肌的組織中表達(dá)，但不在腦、脂肪組織、心肌或骨骼肌中表達(dá)。但是STS的表達(dá)模式有待測定。圖1A-1B提供了編碼STS的cDNA序列(對應(yīng)SEQ ID NO1)，圖4提供了該蛋白的氨基酸序列(對應(yīng)SEQ ID NO4)。圖8C顯示了STS蛋白的結(jié)構(gòu)，包括MK2結(jié)合區(qū)。它具有C端肌動蛋白結(jié)合域(ABD)和鈣調(diào)理蛋白同源性域(CH)。圖9C顯示了MK2中與STS相互作用的域。確信STS是與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白。
術(shù)語“治療益處”是指狀況癥狀的改善、狀況進程的減緩或狀況進展的停止。治療益處是通過對比狀況的一個方面(例如施用至少一種能結(jié)合MK2的蛋白前后的炎癥程度)來確定的。治療益處還可以通過對比狀況的一個方面(例如施用至少一種能抑制MK2與蛋白的相互作用的試劑前后的炎癥程度，其中所述的相互作用會刺激MK2活性)來確定。因此，治療益處還可以通過對比狀況的一個方面(施用至少一種能促進MK2與蛋白的相互作用的試劑前后，其中所述的相互作用會抑制MK2活性)來確定。
但是對于某些狀況，例如某些細(xì)菌感染(例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染)，需要增強MK2活性。因此，治療益處還可以通過施用一種能增強MK2活性或促進MK2與蛋白的相互作用(其中所述的相互作用會增強MK2活性)的試劑前后對這種感染的抗性的增加來確定，例如導(dǎo)致對細(xì)菌感染的抗性的增加。
術(shù)語“治療”是指治療性的處理和預(yù)防性的處理。需要治療的對象可以包括已經(jīng)具有特定醫(yī)學(xué)狀況的個體和可能最終獲得所述狀況的個體(即那些對所述狀況敏感因而需要預(yù)防措施的)。例如，該術(shù)語包括會導(dǎo)致下述結(jié)果的任何處理減少疾病或狀況的嚴(yán)重程度，縮短病程的持續(xù)時間，改善一種或多種與疾病或狀況相關(guān)的癥狀，患有疾病或狀況的患者的有益效果，不再必須治愈該疾病或狀況，和預(yù)防一種或多種與疾病或狀況相關(guān)的癥狀。
如這里所使用的，術(shù)語“域”是指具有區(qū)別性的物理特征或作用(包括，例如獨立的結(jié)構(gòu)或功能)的多肽(包括蛋白)的區(qū)域。域所指的多肽部分對于該多肽可以是天然的或非天然的。域可以含有具有區(qū)別性的物理特征的氨基酸序列，或者它可以含有其序列片段。域可以與多肽或蛋白中的其它域相互作用。在本發(fā)明的一些實施方案中，MK2多肽和/或MK2相互作用蛋白包括選自親和力標(biāo)記、放射性核苷酸、酶和熒光團的域。這樣的域可以用于分離或純化包含MK2和相互作用蛋白的復(fù)合物，或用于分離包含該域的蛋白。域的實例包括但不限于聚組氨酸、FLAG、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
術(shù)語“融合蛋白”是指這樣的蛋白，其中來自第一來源的第一個氨基酸序列共價地或非共價地連接到來自第二來源的第二個氨基酸序列，其中第一個和第二個氨基酸序列不同。不同的第一來源和第二來源可以包括兩種不同的生物實體，或來自同一生物實體的兩種不同蛋白，或生物實體和非生物實體。融合蛋白可以包括例如來自至少2種不同生物來源的蛋白。生物來源可以包括任何非合成地生成的核酸或氨基酸序列(例如，基因組或cDNA序列、質(zhì)?；虿《据d體、天然毒?；蛲蛔凅w或類似物，如這里進一步描述的，如上任一種)。合成來源可以包括化學(xué)地且不是通過生物系統(tǒng)生成的蛋白或核酸序列(例如，氨基酸序列的固相合成)。融合蛋白還可以包括源自至少2種不同合成來源的蛋白或源自至少1種生物來源和至少1種合成來源的蛋白。
在提到蛋白或多肽時，術(shù)語“分離的”是指從其自然的或天然的環(huán)境或來源分離出的蛋白或多肽。這樣，從細(xì)胞分離出的蛋白或多肽在制備后基本上不含有細(xì)胞中的其它多肽和組分。
如這里所使用的，術(shù)語“重組的”是指多肽，其來源或操作與全部或部分多肽(與其在本質(zhì)上自然地相關(guān))無關(guān)，其中這樣的多肽在本質(zhì)上不是自然地產(chǎn)生的。
術(shù)語“Y2H”是指檢測兩種蛋白之間的相互作用的酵母雙雜交系統(tǒng)。該雙雜交使用酵母轉(zhuǎn)錄激活劑GAL4，它分成兩個功能上不同的域。DNA結(jié)合域在與異源蛋白X融合時保留其DNA結(jié)合活性，激活域在與異源蛋白Y融合時保留其轉(zhuǎn)錄激活性質(zhì)。兩種融合蛋白或雜交蛋白在酵母中共表達(dá)。如果蛋白X和蛋白Y之間有相互作用，該締合會使轉(zhuǎn)錄激活劑的激活域密切締合其結(jié)合域，由此重構(gòu)有功能的轉(zhuǎn)錄激活劑。重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄激活劑然后可以驅(qū)動許多整合進酵母基因組(它們含有DNA結(jié)合域的結(jié)合位點)中的報道基因的表達(dá)。報道基因的表達(dá)指示著蛋白X和蛋白Y之間的相互作用。
具體實施例方式
A.MK2相互作用蛋白本發(fā)明涉及與MK2相互作用的蛋白。已知與MK2相互作用的蛋白實例包括但不限于SRF、CREB、ER81、小熱休克蛋白、淋巴細(xì)胞特異性蛋白1、E47、Akt和5-脂氧化酶。
以前已經(jīng)通過Y2H系統(tǒng)測定證實HPH2能結(jié)合MK2(B.Neufield，Neue Interaktionspartner der MAPKAP-kinasen 3pK und MK2diePolvcomb-Proteine HPH2 und Bmil sowie der basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor E47(2000)(未發(fā)表的理學(xué)博士論文，University of Wurzburg)。本發(fā)明確認(rèn)了該發(fā)現(xiàn)(圖2A和2B，圖9B和實施例5)。另外，在本發(fā)明中使用Y2H系統(tǒng)證實了STS(圖1A至1B，圖9B和實施例5)和Shc(圖3A和3B，圖9B和實施例5)能結(jié)合MK2。
可以使用多種方法分離出結(jié)合MK2的蛋白。例如，可以使用實施例7所例示的共免疫沉淀。V-5或HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白和MYC-標(biāo)記的MK2在細(xì)胞中共表達(dá)。用抗-HA或抗-V5抗體制備并免疫沉淀細(xì)胞裂解物。通過SDS PAGE分辨免疫沉淀物，并用抗-MYC抗體進行免疫印跡來檢測共免疫沉淀的MK2。
還可以使用如實施例1-5所例示的酵母雙-雜交(Y2H)系統(tǒng)。該方法由Fields和Song首次正式記載(Nature，340245-246(1989))。該雙雜交系統(tǒng)使用酵母轉(zhuǎn)錄激活劑，例如分成兩個功能上不同域的GAL4。GAL4 DNA結(jié)合域在與異源蛋白X融合時保留其DNA結(jié)合活性。GAL4激活域在與異源蛋白Y融合時保留其轉(zhuǎn)錄激活性質(zhì)。兩種融合蛋白或雜交蛋白在酵母中共表達(dá)。如果蛋白X和蛋白Y之間有相互作用，該締合會使GAL4的激活域密切締合其結(jié)合域，由此重構(gòu)有功能的轉(zhuǎn)錄激活劑。重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄激活劑然后可以驅(qū)動許多整合進酵母基因組(它們含有DNA結(jié)合域的結(jié)合位點)中的報道基因的表達(dá)。報道基因的表達(dá)指示著蛋白X和蛋白Y之間的相互作用。
Y2H系統(tǒng)提供了幾個超過了許多研究蛋白-蛋白相互作用的傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(Luban等，Curr.Opin.Biotech.，659-64(1995))。首先，不再需要體外生化結(jié)合測定所必需的復(fù)雜的和費力的操作條件，因為相互作用發(fā)生在體內(nèi)。其次，Y2H系統(tǒng)是高度敏感的，可以檢測出其它方法不能發(fā)現(xiàn)的相互作用(Fields等，Trends in Genetics，10286-291(1994))。最后，當(dāng)用于為能與目標(biāo)蛋白相互作用的編碼蛋白篩選cDNA庫時，Y2H系統(tǒng)是非常有效的。
除了Y2H系統(tǒng)外，哺乳動物的2-雜交系統(tǒng)也可以用于研究MK2和其它蛋白之間的相互作用。例如，可以用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞含有結(jié)合報道基因(例如熒光素酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))上游的GAL4的DNA序列的質(zhì)粒；含有編碼融合到GAL4的DNA-結(jié)合域的MK2的cDNA的質(zhì)粒；和含有編碼與MK2相互作用的蛋白(如通過Y2H所鑒別的)或融合到VP16激活劑的推定的MK2相互作用蛋白的cDNA的質(zhì)粒。共表達(dá)MK2和相互作用蛋白后裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用裂解物進行報道基因活性測定，該活性只有在MK2與蛋白相互作用時才可檢測出。通過該測定，可以確定哺乳動物細(xì)胞中MK2和蛋白之間的相互作用。哺乳動物的雙雜交系統(tǒng)還可以用于驗證MK2和其它蛋白之間的相互作用，如通過Y2H所鑒別的。
除了使用共免疫沉淀或雙雜交系統(tǒng)外，還可以使用cDNA文庫的低嚴(yán)格性篩選，或使用簡并PCR技術(shù)，該PCR技術(shù)使用針對編碼能結(jié)合MK2的蛋白的MK2結(jié)合域的序列的探針。隨著更多的基因組數(shù)據(jù)變得可以獲得，可以通過使用許多序列繪制和分析程序(例如MotifSearch(Genetics Computer Group，Madison，WI)，ProfileSearch(GCG)和BLAST(NCBI))的相似性檢索來發(fā)現(xiàn)新的含有與能結(jié)合MK2的蛋白的MK2結(jié)合域具有顯著同源性的序列的蛋白。
還可以使用蛋白質(zhì)組方法鑒別MK2相互作用蛋白，如實施例11所示。用野生型(+/+)或MK2缺陷型(-/-)細(xì)胞鋪板，并用33P標(biāo)記。激活MK2 30分鐘，隨后制備全細(xì)胞裂解物，并用2維凝膠電泳進行分析。對比凝膠以鑒別出有差異地磷酸化的蛋白。圖12顯示了使用該方法的有差異地磷酸化的蛋白(箭頭)。還可以使用質(zhì)譜法鑒別出有差異地磷酸化的蛋白。
結(jié)合MK2的蛋白會刺激MK2活性、抑制MK2活性或?qū)K2活性無影響。有幾種方法可研究結(jié)合MK2的蛋白是否會抑制或刺激MK2從而具有生物活性。結(jié)合MK2的蛋白會改變MK2活性，特別是降低MK2活性，是可以用作治療劑和炎癥抑制劑的特別好的備選品。另外可以發(fā)現(xiàn)，能自然地刺激MK2的蛋白的片段或突變體會抑制MK2，這樣可以用作炎癥抑制劑的備選品。例如，一旦鑒別了出結(jié)合MK2的蛋白并且證實了它會刺激MK2，可以在蛋白中進行突變，這樣該蛋白仍然能與MK2相互作用，但是對MK2活性沒有抑制作用。在一個或多個這里提供的測定中，可以測試突變體形式的MK2相互作用蛋白對MK2活性的影響。結(jié)合MK2但是對其活性無影響的蛋白也可以用作治療劑。這樣的蛋白可以例如與通常能結(jié)合MK2以刺激MK2活性的內(nèi)源蛋白相競爭。
為了研究結(jié)合MK2的蛋白是否影響其活性，可以測定結(jié)合蛋白對MK2活性(例如MK2激酶活性)的影響。例如，HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白(例如Shc)和Myc-標(biāo)記的MK2可以在293T細(xì)胞中共表達(dá)。制備細(xì)胞裂解物，并通過SDS PAGE分辨。隨后用抗體進行免疫印跡，檢測激活的MK2(例如抗-磷酸MK2蘇氨酸334)，確定MK2的激活狀態(tài)?；蛘?，通過對磷酸化形式的已知MK2底物量進行定量，可以確定MK2結(jié)合對MK2激酶活性的影響。
另外，可以確定MK2相互作用蛋白對TNF-α生物合成的影響，如實施例9所例示?？梢詫A-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白(例如Shc)和MYC-標(biāo)記的MK2與TNF熒光素酶報道基因一起共轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞(例如RAW)中。用或未用茴香霉素刺激細(xì)胞。收集培養(yǎng)基分析TNF的生成，制備細(xì)胞裂解物以確定熒光素酶活性。將在有MK2結(jié)合蛋白存在的情況下的TNF生物合成與對照樣品進行對比。
如實施例10所例示，還可以確定MK2對MK2相互作用蛋白的磷酸化狀態(tài)的影響。HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白(例如Shc)在293T細(xì)胞中表達(dá)。制備裂解物，用抗-HA抗體進行免疫沉淀。免疫沉淀物用于重組MK2作激酶的體外激酶測定。用SDS PAGE隨后進行磷酸-成像檢測MK2相互作用蛋白的磷酸化。
B.核苷酸和蛋白序列雖然不總是必須的，如果需要，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定能結(jié)合MK2的新蛋白的氨基酸或核酸序列。例如，本發(fā)明提供了編碼STS、HPH2和Shc的cDNA序列(圖1A和1B；2A和2B；3A和3B；和SEQ ID NO1-3)。本發(fā)明還提供了這些蛋白的對應(yīng)的氨基酸序列(圖4-6；SEQ ID NO4-6)。
本發(fā)明還包括這樣的核酸和氨基酸序列的剪接變體、截短、片段、取代、添加或缺失突變、融合蛋白、改組突變體、基序序列和同源物。例如，核酸或氨基酸序列可以包含與天然蛋白的核酸或氨基酸序列有至少70％～79％相同、或至少80％～89％相同、或至少90％～95％、或至少96％～100％相同的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，結(jié)合MK2的區(qū)域能耐受比不參與結(jié)合的蛋白其它部分更少的序列變化。這樣，MK2相互作用蛋白的這些非結(jié)合區(qū)域可以含有未顯著地改變蛋白對MK2的結(jié)合的顯著變化。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還能夠認(rèn)識到，可以作出許多變化來特異性地增加該蛋白對其目標(biāo)的親和力。這樣的增加親和力的變化典型地典型是通過改變氨基酸序列(例如在MK2-結(jié)合區(qū)內(nèi))和測試該蛋白結(jié)合MK2的能力或通過測定該結(jié)合的強度來確定的。所有的這些改變(無論是在蛋白的MK2結(jié)合區(qū)之內(nèi)或之外)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，能結(jié)合MK2的蛋白可以含有任意數(shù)量的對它們的各氨基酸序列的保守變化，而不改變它們的生物學(xué)性質(zhì)。這樣的保守氨基酸修飾是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知具有這樣特征的示例性的保守取代，它們包括例如精氨酸至賴氨酸或賴氨酸至精氨酸；谷氨酸至天冬氨酸或天冬氨酸至谷氨酸；絲氨酸至蘇氨酸或蘇氨酸至絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺或天冬酰胺至谷氨酰胺；纈氨酸至亮氨酸或異亮氨酸，亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸，和異亮氨酸至纈氨酸或亮氨酸。而且，結(jié)合MK2的蛋白可以用于生成能結(jié)合和抑制MK2活性的功能片段。
使用序列分析軟件包(Sequence Analysis SoftwarePackageTM)(第10版；Genetics Computer Group，Inc.，Universityof Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序，可以確定相對的序列相似性或同一性?！癎ap”使用Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch，1970)的算法來發(fā)現(xiàn)兩個序列的比對，它使匹配的數(shù)目最大化且使空位的數(shù)目最小化?！癇estFit”執(zhí)行兩個序列之間相似性的最佳片段的最佳比對。使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，J TheorBiol.，91(2)379-80(1981))，通過插入空位使匹配的數(shù)目最大化發(fā)現(xiàn)最佳比對。
上述的序列分析軟件包含有許多其它的有用的鑒別這里公開的核苷酸和氨基酸序列的同源物的序列分析工具。例如，“BLAST”程序(Altschul等，J Mol Biol.，215(3)403-10(1990))能在指定的數(shù)據(jù)庫(例如，NCBI維護的序列數(shù)據(jù)庫)中搜索與查詢序列(肽或核酸)相似的序列；″FastA″(Lipman和Pearson，Science，227(4693)1435-41(1985)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(8)2444-8(1988))執(zhí)行關(guān)于查詢序列和一組相同類型序列(核酸或蛋白)之間的相似性的Pearson和Lipman搜索；″TfastA″執(zhí)行關(guān)于蛋白查詢序列和任一組核苷酸序列(在進行對比之前，它將該核苷酸序列翻譯成所有的6個閱讀框架)之間的相似性的Pearson和Lipman搜索；″FastX″執(zhí)行關(guān)于核苷酸查詢序列和一組蛋白序列之間的相似性的Pearson和Lipman搜索，考慮移碼；″TfastX″執(zhí)行關(guān)于蛋白查詢序列和任一組核苷酸序列之間的相似性的Pearson和Lipman搜索，考慮移碼(在進行對比之前，它翻譯兩條鏈的核酸序列)。
本發(fā)明包括結(jié)合MK2的蛋白的片段。這樣的片段很可能包括蛋白的MK2結(jié)合區(qū)的全部的或一部分。片段可以包括能結(jié)合MK2的區(qū)域和蛋白的N-端之間的序列和/或能結(jié)合MK2的區(qū)域和蛋白C-端之間的序列的全部、一部分或不包括所述序列。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解，蛋白中的某些氨基酸可以取代為其它氨基酸，而不負(fù)面地影響蛋白活性，例如結(jié)合MK2的蛋白的結(jié)合特征。發(fā)明人這樣預(yù)期，可以對結(jié)合MK2的蛋白的氨基酸序列或編碼該蛋白的DNA序列進行各種改變，而不引起它們的生物學(xué)用途或活性的顯著損失。這樣的改變可以包括剪接變體、截短、片段、取代、添加和缺失突變、改組突變、基序序列、融合蛋白、同源物等。
在作出這樣的改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域通常能理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白生物學(xué)功能中的重要性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-132(1982))。公認(rèn)的是，氨基酸的相對親水特征有助于得到的蛋白的二級結(jié)構(gòu)，這又決定了該蛋白與其它分子(例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等)的相互作用。
以每一種氨基酸的疏水性和電荷特征為基礎(chǔ)，為它指定一個親水指數(shù)；它們是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在作出這樣的改變時，取代的氨基酸的親水指數(shù)可以是在被替換的氨基酸±2之內(nèi)、在±1之內(nèi)和在±0.5之內(nèi)。
本領(lǐng)域還能理解，在親水性的基礎(chǔ)上可以有效地進行相似氨基酸的取代。美國專利4,554,101聲稱，蛋白的最大的局部平均親水性(受其臨近氨基酸的親水性的控制)與該蛋白的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。
如美國專利4,554,101所述，為氨基酸殘基指定了下述親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.01)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在作出這樣的改變時，取代的氨基酸的親水指數(shù)可以是在被替換的氨基酸±2之內(nèi)、在±1之內(nèi)和在±0.5之內(nèi)。
修飾可以是保守的，以便蛋白的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)功能不受改變的影響。這樣保守的氨基酸修飾是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知具有各種前述特征的示例性的保守取代，它們包括例如精氨酸至賴氨酸或賴氨酸至精氨酸；谷氨酸至天冬氨酸或天冬氨酸至谷氨酸；絲氨酸至蘇氨酸或蘇氨酸至絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺或天冬酰胺至谷氨酰胺；纈氨酸至亮氨酸或異亮氨酸，亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸，和異亮氨酸至纈氨酸或亮氨酸。能結(jié)合MK2的蛋白的氨基酸序列可以修飾成具有任何數(shù)量的保守改變，只要蛋白與MK2的結(jié)合不受負(fù)面影響即可。這樣的改變可以引入到結(jié)合目標(biāo)的蛋白部分之內(nèi)或之外。例如，引入到蛋白結(jié)合部分的改變可以設(shè)計成提高該蛋白與其目標(biāo)的親和力。
C.使修飾穩(wěn)定使修飾穩(wěn)定能使蛋白穩(wěn)定、提高蛋白的體外和/或體內(nèi)半衰期、提高蛋白的循環(huán)半衰期和/或減少蛋白的水解降解。這樣的使修飾穩(wěn)定包括但不限于融合蛋白、糖基化位點的修飾和糖類部分的修飾。如本領(lǐng)域所熟知的，融合蛋白是這樣制備的，將第二蛋白與第一蛋白框內(nèi)融合，使翻譯的蛋白包含第一蛋白和第二蛋白。例如，在本發(fā)明中，融合蛋白可以這樣制備，將能結(jié)合MK2的蛋白與第二蛋白(例如穩(wěn)定劑蛋白部分)融合。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能認(rèn)識到的，這樣的融合蛋白可以任選地含有位于結(jié)合MK2的蛋白和穩(wěn)定蛋白部分之間的連接蛋白。穩(wěn)定劑蛋白可以是能夠增強結(jié)合MK2的蛋白的總體穩(wěn)定性的任何蛋白。
可以糖基化結(jié)合MK2的蛋白或?qū)⑵溥B接到白蛋白或非蛋白聚合物上。例如，以美國專利號4,640,835、4,791,192或5,414,135所述的方式，可以將能結(jié)合MK2的蛋白連接到多種非蛋白聚合物中的一種上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。例如，通過共價連接到聚合物上來化學(xué)修飾蛋白以提高它們的循環(huán)半衰期。美國專利號4,766,106和4,609,546還說明了聚合物和將它們連接到肽上的方法。
通過制備包含結(jié)合MK2的蛋白和免疫球蛋白序列的融合蛋白，可以穩(wěn)定結(jié)合MK2的蛋白，如美國專利號5,864,020所例示。免疫球蛋白序列優(yōu)選地(但非必須地)是免疫球蛋白恒定區(qū)。在本發(fā)明的嵌合體中的免疫球蛋白部分可以來自IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型，IgA、IgE、IgD或IgM，但優(yōu)選來自IgG-1或IgG-3。在一個實施方案中，將IgG的Fc片段融合到了結(jié)合MK2的蛋白上。
可以聚乙二醇化結(jié)合MK2的蛋白。聚乙二醇化是一種將聚乙二醇(PEG)連接到蛋白上的方法，其目的是延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。聚乙二醇化結(jié)合MK2的蛋白可以減少為達(dá)到最佳的炎癥減少所需要的施用蛋白的劑量或頻率。該技術(shù)的綜述記載在Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)，和Harris等，Clin.Pharmacokinet.，40539-551(2001)。
可以將結(jié)合MK2的蛋白修飾成具有改變的糖基化方式(即從起始的或天然的糖基化方式改變來的)。如這里所使用的，“改變的”是指去除一個或多個糖類部分，和/或具有至少一個添加到起始蛋白上的糖基化位點。
蛋白的糖基化典型地是N-連接的或O-連接的?！癗-連接的”是指糖類部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-X--絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖類部分酶促地結(jié)合到天冬酰胺側(cè)鏈上的識別序列。這樣，多肽中存在這些三肽序列中的任何一個都會產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化是指糖N-乙?；肴樘前?、半乳糖或木糖中的一個連接到羥基氨基酸、最常見的絲氨酸或蘇氨酸，盡管5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸也可以使用。
能結(jié)合MK2的蛋白的糖基化位點的添加常規(guī)地是通過改變蛋白的氨基酸序列以使其含有一個或多個上述的三肽序列來完成的(對于N-連接的糖基化位點)。改變還可以通過在起始蛋白的序列中添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或者用它們?nèi)〈鷣硗瓿?對于O-連接的糖基化位點)。還可以通過在DNA水平引入變化來改變蛋白的氨基酸序列。
增加蛋白上的糖類部分?jǐn)?shù)量的另一種方法是將糖苷化學(xué)地或酶促地偶連到蛋白的氨基酸殘基上。根據(jù)使用的偶連模式，糖可以連接到(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，例如半胱氨酸中的那些，(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸中的那些，(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法記載在WO 87/05330，和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306(1981)。
在結(jié)合MK2的蛋白上的任何糖類部分的去除都可以化學(xué)地或酶促地完成?；瘜W(xué)地去糖基化需要將蛋白暴露于三氟甲磺酸或等同化合物中。該處理會切除鍵合的糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙?；肴樘前?以外的大多數(shù)或全部的糖類，并保持氨基酸序列的完整。
化學(xué)地去糖基化記載在Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)；和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)。酶促地切除蛋白上的糖類部分可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來完成，如Thotakura等，Meth.Enzymol.，138350(1987)所述。
可以將結(jié)合MK2的蛋白連接到蛋白白蛋白或白蛋白衍生物上。將蛋白和多肽連接到白蛋白或白蛋白衍生物的方法是本領(lǐng)域熟知的，見，例如美國專利號5,116,944。
D.篩選能調(diào)節(jié)MK2活性的化合物1.酵母-2雜交系統(tǒng)在藥物篩選中的應(yīng)用本發(fā)明還提供了篩選能調(diào)節(jié)MK2活性的化合物(包括但不限于抗體、化學(xué)試劑、小分子、蛋白和肽)的方法。在一些實施方案中，一旦通過Y2H檢測到MK2和其它蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用，就可以將Y2H中的蛋白-蛋白相互作用用于高通量的藥物篩選。例如，一旦檢測出蛋白-蛋白相互作用，就可以用藥物(包括抗體、化學(xué)試劑、肽、蛋白或小分子)處理含有兩種蛋白(例如MK2和相互作用蛋白)的陽性酵母菌落(通過顏色和生長鑒別，如所述)。在存在藥物的情況下的陽性酵母菌落的顏色或生長變化會指示對兩種蛋白之間的相互作用的影響。
在一些實施方案中，MK2相互作用蛋白會刺激MK2活性，它對宿主(包括細(xì)胞、組織或整個生物)具有促炎作用。因此，理想的是鑒別出能中斷該相互作用的藥物。因此，可以用Y2H系統(tǒng)鑒別能中斷MK2和能刺激MK2活性的蛋白之間的相互作用的藥物，由此導(dǎo)致該藥物在治療或預(yù)防炎癥中的應(yīng)用。
在其它實施方案中，MK2相互作用蛋白會抑制MK2活性，在宿主(包括細(xì)胞、組織或整個生物)中產(chǎn)生抗炎作用。在該情況下，可以用Y2H系統(tǒng)鑒別能增強該相互作用的藥物，這可以通過含有兩種蛋白的酵母細(xì)胞的顏色和生長的變化來監(jiān)視，如這里所述的。這樣的藥物隨后可以用于治療或預(yù)防炎癥。
如上所述，在某些狀況(例如某些細(xì)菌感染)的情況下，理想的是具有增強的MK2活性。因此，還可以用Y2H系統(tǒng)篩選能增強MK2和相互作用蛋白之間的相互作用、產(chǎn)生增強的MK2活性、從而增強對細(xì)菌感染的抗性的藥物。這樣的藥物可以用于治療或預(yù)防例如某些細(xì)菌感染，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌感染。
2.體外重構(gòu)系統(tǒng)在藥物篩選中的應(yīng)用還可以用體外重構(gòu)系統(tǒng)鑒別能調(diào)節(jié)MK2活性的藥物，包括但不限于小分子、抗體、肽和化學(xué)試劑。例如，通過這里提供的任何測定鑒別出蛋白-蛋白相互作用以后，可以用能抑制兩種蛋白之間的相互作用的藥物體外處理蛋白。如上所述，理想的是鑒別出能抑制MK2和其它蛋白之間的相互作用的藥物，其中所述的相互作用能刺激MK2活性。另外，還可以用體外重構(gòu)系統(tǒng)形成和分離包含MK2和至少一種MK2相互作用蛋白的蛋白復(fù)合物。這些復(fù)合物隨后可以用于鑒別能抑制或促進復(fù)合物的形成從而調(diào)節(jié)炎癥和/或抑制或刺激復(fù)合物中的MK2活性從而調(diào)節(jié)炎癥的化合物。
MK2和相互作用蛋白是在體外翻譯系統(tǒng)(例如Promega(Madison，WI)提供的兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物-偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng))中合成和35S-標(biāo)記的。按照所述，通過共免疫沉淀確認(rèn)MK2和蛋白之間的相互作用。或者，可以使用表達(dá)系統(tǒng)(例如大腸桿菌或桿狀病毒昆蟲細(xì)胞)制備重組MK2和相互作用蛋白。這兩種蛋白之間的相互作用可以通過與共免疫沉淀、ELISA或熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)相似的斷開測定來檢測。將受檢化合物加入到體外翻譯的蛋白的混合物中，按照所述進行共免疫沉淀。理想的化合物是能抑制MK2和蛋白之間的相互作用的化合物，如通過在重組產(chǎn)生的蛋白的免疫沉淀測定或斷開測定中的相互作用的缺失或減少所測定的。這樣的化合物隨后可以用于治療或預(yù)防炎癥。在本發(fā)明的實驗中可以測試其對炎癥的影響的化合物的實例包括化學(xué)試劑、小分子、肽、蛋白和抗體。
還可以用體外重構(gòu)系統(tǒng)鑒別能結(jié)合MK2和抑制MK2活性的化合物。例如體外翻譯的MK2或純化的MK2可以與化合物一起孵育，隨后測試其磷酸化已知底物(例如Hsp 27)或增加TNF-α生物合成的能力，如這里所述。但是，可以使用任何能測試MK2活性的測定。這樣，將能抑制MK2活性的那些化合物鑒別為能夠用于抑制或預(yù)防炎癥的藥物。但是，能提高MK2活性的化合物可以用于治療某些狀況(其中需要提高MK2活性)。
E.藥物組合物本發(fā)明提供了含有能結(jié)合MK2的蛋白的組合物。這樣的組合物適合用于制藥用途和施用給患者。該組合物典型地含有一種或多種能結(jié)合MK2的蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑。該組合物還包含蛋白復(fù)合物，它含有MK2和至少一種MK2相互作用蛋白。如這里所使用的，短語“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括任何和所有與藥物施用相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這樣的介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的。該組合物還可以含有其它的活性化合物，它們提供補充的、附加的或增加的治療功能。該藥物組合物還可以與施用說明書一起包括在容器、包裝袋或分配器中。
本發(fā)明的藥物組合物還包括含有化合物的組合物，所述的化合物包括通過一種或多種這里所述的方法鑒別出的小分子、抗體、化學(xué)試劑、蛋白和肽。施用這些化合物以治療或預(yù)防炎癥的合適劑量可以由醫(yī)生容易地確定。劑量的實例包括但不限于5mg至500mg，50mg至250mg，100mg至200mg，50mg至100mg，15mg至85mg，30mg至70mg，和40mg至60mg。
本發(fā)明的藥物組合物被制成能與其目的給藥途徑相容的劑型。完成給藥的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的。給藥可以是例如靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、直腸的或皮下的。
用于皮下用途的溶液或懸浮液典型包含一種或多種下述組分無菌稀釋劑例如注射用水，鹽水，固定油類，聚乙二醇，甘油，丙二醇，或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或堿調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。這樣的制劑可以包封在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量的小瓶中。
適合用于注射的藥物組合物包括無菌水溶液或分散液和用于與無菌注射水溶液或分散液臨時配制的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，且其流動程度為能容易地注射。它在生產(chǎn)和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須不受微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，它含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)和它們的合適的混合物?？梢跃S持適當(dāng)?shù)牧鲃有裕?，通過使用包衣(例如卵磷脂)，通過使用表面活性劑維持分散需要的粒徑。對微生物活動的預(yù)防可以通過多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來實現(xiàn)，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，組合物中可以包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉。通過在組合物中包括能延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)可以延長可注射組合物的吸收。
在一些實施方案中，能結(jié)合MK2的蛋白是與載體一起制備的，所述的載體能保護蛋白以免在體內(nèi)迅速消除，例如包括植入物和微膠囊化的輸送系統(tǒng)的控釋制劑?？梢允褂每缮锝到獾?、可生物利用的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白制備這樣的制劑的方法。這些物質(zhì)也可以商業(yè)地購自Alza Corporation(Mountain View，CA)和Nova Pharmaceuticals。含有能結(jié)合MK2的蛋白的脂質(zhì)體懸浮液也可以用作藥學(xué)上可接受的載體。它們可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，例如如美國專利號4,522,811所述。
對要治療的狀況有益的其它治療上有用的試劑可以任選地包括在其中，或者與能結(jié)合MK2的蛋白同時或先后施用。
為了施用容易和劑量均勻，將組合物特別有益地制成劑量單位形式。這里使用的“劑量單位形式”是指物理上分離的單位，它適合作為要治療的對象的單位劑量。每一個單位典型地含有預(yù)定量的活性化合物，其經(jīng)過計算與需要的藥物載體一起產(chǎn)生理想的治療效果。關(guān)于本發(fā)明的劑量單位形式的說明，遵從或直接地取決于活性化合物的獨特特征和要達(dá)到的特定治療效果以及本領(lǐng)域關(guān)于使用這樣的活性化合物治療個體時所固有的限制。
F.治療適應(yīng)癥能與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物可以用于預(yù)防、診斷或治療人或動物的多種醫(yī)學(xué)狀況。因此，本發(fā)明提供了一種治療與炎癥相關(guān)的狀況的方法，包括給對象施用足以改善狀況癥狀量的組合物，它包含至少一種能與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物(例如蛋白、肽、抗體、化學(xué)試劑和小分子)。這樣的狀況包括克隆氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和由于創(chuàng)傷或損傷或卒中引起的炎癥。
G.使用能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用的化合物的治療方法能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用、調(diào)節(jié)MK2活性的化合物可以用于抑制或減少一種或多種與炎癥相關(guān)的癥狀。在一個實施方案中，炎癥被抑制了至少50％，或至少60、62、64、66、68、70、72、72、76、78、80、82、84、86或88％、或至少90、91、92、93或94％、或至少95％～100％?；衔锟梢詥为毷褂没蚪M合使用。
如這里所述的，包含化合物的藥物制劑是以治療上的有效量施用。能調(diào)節(jié)MK2活性的化合物可以選自蛋白、肽、抗體、化學(xué)試劑或小分子。如這里所使用的，化合物的“有效量”是足以減少炎癥以達(dá)到理想的生物學(xué)結(jié)果的劑量。這樣的改善可以通過多種方法檢測出，包括檢測癥狀(例如疼痛、腫脹或發(fā)紅)的那些。例如，用美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)評分來檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的炎癥。ACR評分定義為觸痛關(guān)節(jié)和腫脹關(guān)節(jié)什數(shù)有≥20％、50％或70％改善，加上在下面的5項標(biāo)準(zhǔn)中的至少3項中有≥20％、50％或70％改善患者疼痛評價、醫(yī)生和患者的總體評價、患者自述殘疾、急性階段反應(yīng)物(紅細(xì)胞沉降速度和C-反應(yīng)性蛋白水平)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，醫(yī)生能診斷和檢測任何疾病中的炎癥，并確認(rèn)使用本發(fā)明的方法鑒別出的抗炎藥物是否減輕了炎癥。
通常，治療上的有效量會隨著對象的年齡、狀況、性別和對象的醫(yī)學(xué)狀況的嚴(yán)重性而變化。劑量可以由醫(yī)生決定，并且在必要時調(diào)整到適合觀察到的治療效果。施用至少一種能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的化合物的合適劑量可以是5mg至500mg、50mg至250mg、100mg至200mg、50mg至100mg、15mg至85mg、30mg至70mg和40mg至60mg。這些化合物可以在一次給藥中施用，或間隔地(例如每日一次、每周一次或每月一次)施用。劑量方案可以根據(jù)蛋白減輕炎癥的能力、蛋白的半衰期或患者狀況的嚴(yán)重性來進行調(diào)整。通常，組合物是作為團塊劑量(bolus dose)施用，使這些化合物的循環(huán)水平最大化，給藥后達(dá)到最大的時間長度。團塊給藥后還可以使用連續(xù)輸注。
通過標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)方法可以確定這樣的蛋白或化合物的毒性和治療效能?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)物中進行實驗，確定蛋白或化合物對細(xì)胞因子表達(dá)或活性的影響。還可以在實驗動物中進行實驗，例如確定LD50(使50％群體死亡的劑量)和ED50(對50％群體治療上有效的劑量)?；衔锏亩拘宰饔煤椭委熥饔弥g的劑量比是其治療指數(shù)，它可以表達(dá)為LD50/ED50。能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的表現(xiàn)出大治療指數(shù)的化合物(包括但不限于肽、蛋白、抗體、化學(xué)試劑和小分子)可以在本發(fā)明的治療方法中使用。
從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可以用于評價在人體使用時的劑量范圍。這樣的蛋白和化合物的劑量可以在包括ED50值且較少或無毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。根據(jù)采用的劑量形式和使用的給藥途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。對于能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用的任何化合物，可以按照所述從細(xì)胞培養(yǎng)測定初步地估計出治療上有效的劑量?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲苿┝縼磉_(dá)到包含在細(xì)胞培養(yǎng)物中測得的ID50(即受檢蛋白達(dá)到癥狀最大抑制一半時的濃度)值的循環(huán)血漿濃度范圍。可以測量在血漿中的水平，例如通過高壓液相色譜。通過合適的生物實驗可以監(jiān)視任何特定劑量的效果。
H.使用細(xì)胞的治療方法給宿主施用能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽或抗體的另一種方法是施用能表達(dá)這些化合物的細(xì)胞?？梢杂枚喾N方法將表達(dá)蛋白、肽或抗體的細(xì)胞輸送到用于調(diào)控炎癥的位置。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過靶向輸送來施用表達(dá)蛋白、肽或抗體的細(xì)胞，例如將這樣的細(xì)胞的樣品直接注射進炎癥組織的特定位點。細(xì)胞可以在介質(zhì)或基質(zhì)中輸送，所述的介質(zhì)或基質(zhì)能部分阻止它們的運動，將細(xì)胞定位在目標(biāo)位點。這樣的介質(zhì)或基質(zhì)可以是半固體的，例如糊狀或凝膠，包括凝膠狀聚合物?；蛘撸橘|(zhì)或基質(zhì)可以是固體、多孔固體的形式，它們允許細(xì)胞遷移進固體基質(zhì)并且將它們保留在那里，同時允許細(xì)胞的增殖。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼重組MK2多肽的第一核酸和編碼MK2相互作用蛋白(例如STS、HPH2和Shc)的第二核酸。隨后可以從宿主細(xì)胞中分離出含有MK2和至少一種其它蛋白的MK2復(fù)合物。
I.在細(xì)胞中表達(dá)DNA的方法可以將編碼能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽和抗體的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。該DNA編碼的蛋白、肽和抗體然后可以在這樣的細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的一些實施方案中，為了改變細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)量或活性，可以將編碼能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用從而調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽和抗體的DNA分子導(dǎo)入到細(xì)胞中。更具體地，可以將編碼蛋白、肽或抗體的DNA分子導(dǎo)入到細(xì)胞中，以減少或抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)量或活性。
使用重組表達(dá)載體(例如嵌合病毒或膠態(tài)分散系統(tǒng))可以輸送蛋白、肽或抗體的多核苷酸序列。靶脂質(zhì)體可以用于多核苷酸序列的治療性輸送?？梢杂脕韺NA導(dǎo)入到細(xì)胞中的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或RNA病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是鼠或鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物?？梢詫我煌庠椿虿迦氲狡渲械哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMuLV)、哈維小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)和勞氏肉瘤病毒(RSV)。許多其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能整合多個基因，例如能編碼多順反子信息的載體或包含多個啟動子的載體。所有的這些載體都能給基因轉(zhuǎn)移或整合一個可選擇的標(biāo)記，以便轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞能被鑒別和產(chǎn)生。
由于重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒是有缺陷的，它們需要含有質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系，所述的質(zhì)粒編碼受病毒長末端重復(fù)序列內(nèi)的調(diào)節(jié)序列控制的逆轉(zhuǎn)錄病毒的全部結(jié)構(gòu)序列。這些質(zhì)粒缺少啟動包裝機制以識別RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行殼體包裝的核苷酸序列。缺失包裝信號的輔助細(xì)胞系包括但不限于，例如PSI.2、PA317和PA12。這些細(xì)胞系生產(chǎn)空毒粒，因為沒有包裝基因組。如果將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到具有完整包裝信號但是結(jié)構(gòu)基因被替換為其它目標(biāo)基因的細(xì)胞中，則可以包裝載體且生成載體毒粒。
或者，通過常規(guī)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，可以用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染組織培養(yǎng)物中的第二種細(xì)胞。然后用含有目標(biāo)基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。得到的細(xì)胞將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體釋放到培養(yǎng)基中，隨后載體被導(dǎo)入到合適的細(xì)胞中。
編碼蛋白、肽或抗體的多核苷酸的另一種靶向輸送系統(tǒng)是膠態(tài)分散系統(tǒng)。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物、納米囊、微球、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳狀液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是用作輸送載體的人工膜囊泡?？梢詫NA、DNA和完整毒粒包封到水內(nèi)部并以生物活性形式輸送給細(xì)胞(參見，例如，F(xiàn)raley等，TrendsBiochem.Sci.，677(1981))。使用脂質(zhì)體載體將基因有效地轉(zhuǎn)移進細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Mannino等，Biotechnique s，6682(1988))。脂質(zhì)體組合物通常包括磷脂類的組合，典型地與類固醇(特別是膽固醇)組合。也可以使用其它的磷脂或脂類。脂質(zhì)體的物理特征依賴于pH、離子強度和二價陽離子的存在。
在脂質(zhì)體生產(chǎn)中有用的脂類的實例包括磷脂?；衔?，例如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
J.在組織、器官或生物體中表達(dá)DNA的方法可以將編碼能結(jié)合MK2(包括抗體)的蛋白的DNA和編碼能通過結(jié)合MK2復(fù)合物調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽和抗體的DNA導(dǎo)入組織、器官或生物體內(nèi)的細(xì)胞。DNA編碼的蛋白、肽或抗體然后可以在組織、器官或生物體的細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的一個實施方案中，為了改變細(xì)胞因子在組織、器官或生物體的細(xì)胞中的產(chǎn)量或活性，可以將編碼蛋白、肽或抗體的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。該方法可以用于減少組織、器官或生物體中的炎癥。本發(fā)明可以用于治療多種狀況，例如克隆氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和由于創(chuàng)傷或損傷引起的炎癥。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可以將編碼能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽或抗體的DNA導(dǎo)向到特定的目標(biāo)細(xì)胞類型中。該細(xì)胞類型可以是組織、器官或生物體的組分。通過將目標(biāo)序列與其它編碼特定靶細(xì)胞上的受體的配體的基因一起插入到病毒載體，例如該載體現(xiàn)在對某細(xì)胞類型是特異性的，這樣就可以對某組織、器官或生物體是特異性的。通過連接例如糖、糖脂或蛋白，可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體變?yōu)榘刑禺愋缘?。?dǎo)向可以通過使用抗體來完成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，可以將特異性的多核苷酸序列插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或連接到病毒包膜上，以目標(biāo)特異性地輸送含有蛋白、肽或抗體的多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。基于如本領(lǐng)域已知的細(xì)胞特異性，脂質(zhì)體的導(dǎo)向也是可行的。
在本發(fā)明的另外一個實施方案中，可以從組織、器官或生物體取出細(xì)胞，將編碼能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的蛋白、肽或抗體的DNA導(dǎo)入到該細(xì)胞中，再將該細(xì)胞重新導(dǎo)入到組織、器官或生物體中。當(dāng)輸送到目標(biāo)組織、器官或生物體中時，這些細(xì)胞然后會生產(chǎn)蛋白、肽或抗體。通過上述的方法，可以將細(xì)胞重新導(dǎo)入到組織、器官或生物體中。
K.檢測和分離MK2的方法與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物可以用于體內(nèi)地或體外地檢測MK2的存在或其量。這包括蛋白、肽、抗體、化學(xué)試劑和小分子。通過將MK2相互作用蛋白的存在或水平與醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)聯(lián)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以診斷相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況。在這里說明了通過這些化合物可以診斷出的醫(yī)學(xué)狀況。
這樣的檢測方法是本領(lǐng)域熟知的，包括ELISA、放射免疫測定、免疫印跡、Western印跡、免疫熒光法、免疫沉淀和其它可對比的技術(shù)。這些化合物還可以提供在診斷試劑盒中，它整合了這些技術(shù)中的一種或多種來檢測MK2。這樣的試劑盒可以含有其它組分、包裝、說明書或其它的輔助檢測MK2和使用試劑盒的物質(zhì)。
當(dāng)能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用和調(diào)節(jié)MK2活性的化合物要用于診斷目的時，理想的是修飾它們，例如用配體基團(例如生物素)或可檢測的標(biāo)記基團(例如熒光基團、放射性同位素或酶)。如果需要，可以使用常規(guī)技術(shù)標(biāo)記它們。合適的標(biāo)記物包括熒光團、發(fā)色團、放射活性的原子、高電子密度的試劑、酶和具有特異性結(jié)合配偶體的配體。典型地通過酶的活性來檢測它們。例如，辣根過氧化酶通常是通過它將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化成藍(lán)色色素的能力(用分光光度計可以定量)來檢測的。其它的合適的結(jié)合配偶體包括生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素、IgG和蛋白A，以及許多本領(lǐng)域已知的受體-配體對。其它的排列和可能性是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能容易地明白的，并且認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的等同物。
與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物還可以用于在純化工藝中分離MK2。在一種工藝中，可以將化合物固定化，例如通過整合進柱或樹脂。用化合物結(jié)合MK2，然后轉(zhuǎn)移到能導(dǎo)致釋放結(jié)合的MK2的條件。這樣的工藝可以用于商業(yè)化生產(chǎn)MK2。
下面的實施例提供了本發(fā)明的多個實施方案。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，可以進行許多改進和變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。相信這樣的改進和變化也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例不以任何方式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，說明書和權(quán)利要求書中的所有數(shù)字都被術(shù)語“約”修飾，例如作為劑量的微小改變，也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例實施例1cDNA文庫的制備進行酵母雙-雜交篩選的方法源自Clontech出版的Pretransformed Matchmaker Libraries User Manual(Palo Alto，California，USA；versions PT3183-1；PR1X299)。
預(yù)轉(zhuǎn)化的人骨髓cDNA文庫購自Clontech(#HY4053AH)。該cDNA文庫預(yù)轉(zhuǎn)化進釀酒酵母宿主株Y187(Clontech)中。酵母細(xì)胞在使用前處于冷凍狀態(tài)。
酵母報道株AH109(C1ontech)中的DNA-誘餌構(gòu)建體作為Y187酵母的交配配偶體。
實施例2MK2-誘鉺構(gòu)建體的制備為了制備含有結(jié)合域(BD)的MK2構(gòu)建體，通過定向克隆到DNA-BD載體pGBKT7(Clontech)中產(chǎn)生MK K93R-pGBKT7，生成了編碼全長激酶的MK2基因片段，該激酶的ATP結(jié)合袋中的氨基酸賴氨酸93已經(jīng)被誘變?yōu)榫彼?。將位點93處的賴氨酸轉(zhuǎn)換成精氨酸，以生成無催化活性的激酶形式。更具體地，用Nde-Xho消化pGBKT7載體，使用瓊脂糖凝膠電泳純化。使用T4DNA連接酶將MK2片段連接到pGBKT7載體中。通過限制分析鑒別含有插入物的質(zhì)粒。用MK2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化酵母，隨后在轉(zhuǎn)化的AH109酵母株中確認(rèn)了MK2的表達(dá)。
通過對比用MK2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用空載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長速度，研究了MK2構(gòu)建體編碼的蛋白對宿主細(xì)胞的毒性。確認(rèn)MK2構(gòu)建體無毒性。含有誘餌構(gòu)建體或空載體的細(xì)胞以基本相同的速度和細(xì)胞數(shù)量生長。
為了分析轉(zhuǎn)錄的激活，將MK2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于SD/-Trp/X-α-Gal(Clontech)、SD/-His/-Trp/X-α-Gal(Clontech)和SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基(Clontech)上。結(jié)果表明，MK2蛋白自身不能激活轉(zhuǎn)錄。但是，含有MK2誘餌構(gòu)建體的酵母生成了色氨酸，這些酵母不生成腺嘌呤或組氨酸。但是在SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長的克隆沒有顯藍(lán)色。克隆在SD/-His/-Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上不生長，這表明沒有通常的內(nèi)源報道基因的轉(zhuǎn)錄激活。
實施例3篩選酵母雙-雜交文庫在篩選文庫中使用的MK2是全長的和無催化活性的。使用該無活性的在MK2 ATP結(jié)合袋的保守賴氨酸處編碼丙氨酸取代、使MK2變?yōu)闊o活性形式的突變體(Kotlyarovetal.，Mol Cell Bio 22，4827-4835(2002))，因為已知無活性的激酶會更穩(wěn)定地結(jié)合相互作用蛋白，從而更強地轉(zhuǎn)錄激活雙雜交報道基因。
將MK2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的酵母菌落接種到SD/-Trp(Clontech)培養(yǎng)基中，在30℃過夜，以250-270rpm搖動。次日，測得OD600值＞0.8。1000×g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞，傾倒出上清液，通過渦旋將細(xì)胞沉淀重新懸浮到殘余的液體中。
在室溫水浴中解凍一份(約1.0ml)冷凍的文庫培養(yǎng)物。輕柔渦旋細(xì)胞。得到完整的MK2誘餌培養(yǎng)物和1ml文庫培養(yǎng)物。向培養(yǎng)物中加入45ml 2×YPDA/Kan(酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、腺嘌呤和卡那霉素的混合物；Clontech)，輕微旋動，用2×YPDA/Kan將體積調(diào)整到50ml。在30℃輕旋(30-50rpm)細(xì)胞孵育過夜。
將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌離心瓶中，通過在1000×g離心10分鐘進行沉淀。將沉淀重新懸浮到50ml 2×YPDA/Kan中，然后在1000×g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。重復(fù)該洗滌步驟。隨后將細(xì)胞重新懸浮到10ml0.5×YPDA/Kan培養(yǎng)基中。
將200μl交配混合物鋪于約50個大(150mm)SD/-His/-Leu/-Trp平板(Clontech)上。在30℃孵育平板，菌落側(cè)朝下，直到菌落出現(xiàn)在平板上。對在SD/-Leu(Clontech)、SD/-Trp和SD/-Leu/-Trp(Clontech)平板上生長的克隆評分。單倍體和二倍體細(xì)胞能在SD/-Leu或SD/-Trp培養(yǎng)基上生長。只有二倍體細(xì)胞能在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長。確定的交配效率為5.4％。
將在含有SD/-His/-Leu/-Trp X-α-Gal培養(yǎng)基的平板上生長的菌落在SD/-His/-Leu/-Trp X-α-Gal平板上重新劃線以檢驗表型。接著，在更嚴(yán)格的含有X-α-GAL的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板(Clontech)上篩選克隆。以柵格方式將陽性菌落在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(Clontech)上重新劃線，產(chǎn)生主平板。從這些主平板制備酵母的DNA預(yù)備品和甘油儲備品。
實施例4推定的陽性克隆的分析YEASTMAKERTM酵母質(zhì)粒分離試劑盒(Clontech；#K1611-1)提供了從酵母分離質(zhì)粒的試劑和工具。從已經(jīng)在主平板上劃線的各陽性菌落得到酵母，并重新懸浮到96孔平板中的50μl Tris EDTA。向每個孔中加入10μl裂解酶。在37℃孵育平板1小時，然后加入20μl 20％SDS。使用Qiagen turboprep(Qiagen，Valencia，California，USA)純化DNA。使用Advantage 2PCR酶(Clontech；#K1910-1)PCR擴增樣品。通過測序鑒別插入物。
實施例5陽性克隆的分析將獨立序列轉(zhuǎn)化到細(xì)菌(DH5α)中，隨后從其中分離DNA。接著，將DNA轉(zhuǎn)化到酵母株AH109中。將幾種誘餌(MK2、無催化活性的MK2K93R、空載體pGBKT7、TPL2、p53和核纖層蛋白(Clontech))轉(zhuǎn)化到酵母株Y187中。將AH109中的轉(zhuǎn)化的每一個獨立序列株與用三種誘餌中的每一種轉(zhuǎn)化的Y187酵母進行交配。獨立克隆能與MK2和MK2K93R、但不能與空載體pGBKT7、TPL2、p53或核纖層蛋白相互作用，通過它們在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp上的生長測定和在SD/-Leu/-Trp X-α-GAL上的藍(lán)色，將它們鑒別為包含編碼特異性的MK2相互作用蛋白的DNA插入物的克隆(圖9A)。MK2相互作用蛋白能以基本相同的親和力結(jié)合野生型MK2和MK2K93R，這表明MK2結(jié)合不是無活性的激酶突變體MK2 K93R的偽跡。獨立DNA序列編碼的蛋白的特征在于“與smoothelin相似”(STS)。編碼該蛋白的cDNA序列提供在圖1和SEQID NO1中，氨基酸序列提供在圖4和SEQ ID NO4中。
獨立克隆編碼的另一種蛋白是人多同源異形體2(HPH2)。編碼該蛋白的cDNA序列供在圖2和SEQ ID NO2中，氨基酸序列提供在圖5和SEQ ID NO5中。HPH2具有不育α基序(SAM)蛋白相互作用域。
分離的獨立DNA序列編碼的另一種蛋白是src同源性和膠原蛋白(Shc)。編碼該蛋白的cDNA序列供在圖3和SEQ ID NO3中，氨基酸序列提供在圖6和SEQ ID NO6中。Shc(p66Shc A)的最長異構(gòu)體具有N端CH2域，在蛋白C端是PTB、CH1和SH2域。
實施例6MK2相互作用域的描繪為了描繪與Shc A、HPH2和STS相互作用所需的MK2域，使用了幾種MK2缺失突變體。檢驗的MK2突變體包括MK2N(MK2氨基酸41-400)、MK2C(MK2氨基酸1-370)和MK2Cat(MK2催化域氨基酸41-338)。MK2N具有富含脯氨酸的N-端缺失，MK2C具有MK2核定位信號(NLS)和p38結(jié)合位點缺失，MK2Cat具有N端富含脯氨酸的域和C端自動抑制域、核輸出信號(NES)和NLS缺失。2-雜交分析表明，Shc A同樣好地與全長MK2、MK2C和MK2Cat相互作用。但是，與MK2N的相互作用幾乎不能檢測出。與Shc A的相互作用方法表明，Shc A與MK2催化域最低限度地相互作用，MK2N-端的缺失會誘導(dǎo)構(gòu)型變化，所以Shc A不再有效地結(jié)合MK2。
HPH2以基本相同的親和力結(jié)合全長MK2、MK2N和MK2C。但是，與MK2Cat的相互作用不那么明顯。因此，HPH2似乎需要結(jié)合在MK2的N-或C-端，而MK2催化域單獨表達(dá)時不能促進HPH2與MK2以可比較的水平結(jié)合。
類似地，smoothelin結(jié)合MK2的親和力比Shc A或HPH2更高，如在酵母的生長和顏色測定中所證實。另外，類似地，smoothelin以基本相同的親和力結(jié)合MK2、MK 2N、MK2C和MK2Cat中的每一個，這表明MK2中的多個位點與該蛋白相互作用。
實施例7MK2與哺乳動物細(xì)胞的Shc A和HPH2共免疫沉淀將V5-標(biāo)記的Shc和MYC-標(biāo)記的MK2在293T細(xì)胞中共表達(dá)，如圖10A所示。用或不用10μg/ml茴香霉素刺激細(xì)胞30分鐘。使用抗V5或Myc的抗體的細(xì)胞裂解物的Western印跡表明，V5-標(biāo)記的Shc和MYC-標(biāo)記的MK2蛋白都有表達(dá)。用抗-V5抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物。免疫沉淀物通過SDS PAGE分辨，并用抗-MYC抗體進行免疫印跡?？?MYC抗體能結(jié)合免疫印跡，這表明MYC-標(biāo)記的MK2與V5-標(biāo)記的Shc共免疫沉淀。這暗示著MK2和Shc之間的相互作用。
在類似的實驗中，使用抗-HA抗體的共免疫沉淀和隨后的抗-Myc抗體的免疫印跡表明，MK2與HPH2和p 38共免疫沉淀(圖10B)。HA-標(biāo)記的p38、HA-標(biāo)記的HPH2和Myc-標(biāo)記的MK2都在293T細(xì)胞中表達(dá)，如Western印跡所示。
共免疫沉淀可以用于檢測兩個蛋白的結(jié)合，或確定兩個蛋白之間的結(jié)合的結(jié)果，如在其它方法(例如Y2H系統(tǒng))中所發(fā)現(xiàn)的。
實施例8結(jié)合蛋白對MK2激活的影響將HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白(例如Shc)和MYC-標(biāo)記的MK2在293T細(xì)胞中共表達(dá)。制備細(xì)胞裂解物，并通過SDS PAGE分辨。隨后用Myc和HA抗體進行免疫印跡，檢測MYC-標(biāo)記的MK2和HA-相互作用蛋白，這會確認(rèn)這些蛋白的表達(dá)。由于MK2的激活包括MK2的磷酸化，抗體的免疫印跡會檢測出磷酸化的MK2(例如，抗-磷酸MK2蘇氨酸334(p 334))，這會決定MK2的激活狀態(tài)。與單獨表達(dá)MK2時的MK2 p334的量相比，當(dāng)與MK2激活劑共表達(dá)時的MK2 p334的量的差異會指示在存在MK2相互作用蛋白的情況下的改變的MK2活性。
實施例9MK2相互作用蛋白對TNF生物合成的影響將兩個空載體構(gòu)建體在RAW 264.7巨噬細(xì)胞中共表達(dá)，建立TNF-α生物合成的基礎(chǔ)水平，如通過ELISA檢測到的(圖11)。用或不用脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞，以刺激MK2的催化活性。檢測MK2、p38或Shc與空載體共表達(dá)的細(xì)胞中的TNF-α表達(dá)水平，并將水平與用單獨載體發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)水平作對比。當(dāng)細(xì)胞共表達(dá)p38和Shc時，TNF-α表達(dá)水平比對照組檢測到的更高。類似地，Shc和MK2的共表達(dá)也會導(dǎo)致TNF-α水平的升高。
實施例10MK2對MK2相互作用蛋白的磷酸化狀態(tài)的影響將HA-標(biāo)記的MK2相互作用蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)。制備細(xì)胞裂解物，并用抗-HA抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用于體外激酶實驗中，其中加入重組MK2作為激酶。依次用SDS PAGE和磷酸成像檢測MK2相互作用蛋白的磷酸化。MK2的結(jié)合或相互作用蛋白在存在MK2情況下的磷酸化和MK2相互作用蛋白在無MK2情況下的磷酸化的減少或無磷酸化會指示MK2對MK2相互作用蛋白的磷酸化。MK2相互作用蛋白可能是或不是MK2的底物。
實施例11使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測MK2相互作用蛋白可以用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒別MK2相互作用蛋白。將野生型(+/+)或MK2缺陷型(-/-)細(xì)胞鋪平板，并用33P標(biāo)記。激活MK230分鐘，然后制備全細(xì)胞裂解物，使用二維凝膠電泳分析。對比凝膠，鑒別有差別地磷酸化的蛋白。圖12A顯示了有差別地磷酸化的蛋白(箭頭)，其等電點為5.4。在MK2+/+細(xì)胞中沒有磷酸化，可能是由于蛋白遷移中的磷酸化依賴性的改變。圖12B顯示了同一區(qū)域的銀染色，它顯示了許多可分辨的蛋白。
實施例12當(dāng)在HeLa細(xì)胞中與Shc A共表達(dá)時激活MK2檢測了與Shc A共表達(dá)時MK2的激活狀態(tài)。Hsp 27是MK2的生理學(xué)底物。HeLa細(xì)胞中的內(nèi)源性的HSP 27的磷酸化是對MK2的反應(yīng)，因此，可以用來確定MK2活性。用單獨載體、或載體和V5-Shc A或Myc-MK2(作為對照)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。平行地，用V5-Shc A和Myc-MK2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表達(dá)后，不用或用茴香霉素刺激細(xì)胞30分鐘以激活MK2。隨后用針對磷酸化的Hsp 27(pHsp 27)的抗-磷酸肽特異性抗體進行的免疫印跡表明，刺激時增加了pHsp 27。隨著外源性Myc-MK2的表達(dá)，未刺激時的細(xì)胞中的基礎(chǔ)pHsp 27水平也有升高(圖13A)。在Shc A或載體對照表達(dá)細(xì)胞中沒有觀察到這樣的基礎(chǔ)磷酸化的增加。使用密度測定法對這些結(jié)果的定量表明，隨著Myc-MK2的表達(dá)觀察到的基礎(chǔ)pHsp 27的增加是空載體或V5-Shc A的1.5-2倍。當(dāng)Myc-MK2與V5-Shc A共表達(dá)時，基礎(chǔ)pHsp 27的水平有進一步的提高。定量表明該提高比單獨表達(dá)Myc-MK2時檢測到的水平超出3倍(圖13B)。如293T細(xì)胞所顯示的，MK2水平隨著Shc A的共表達(dá)而增加，這進一步說明了MK2和Shc A之間的相互作用。觀察到的基礎(chǔ)pHsp 27的增加很可能反映了升高的MK2活性和升高的MK2蛋白水平。當(dāng)用MK2水平標(biāo)準(zhǔn)化時，表明基礎(chǔ)pHsp 27增加了2至3倍(圖13C)。認(rèn)為該增加反映了Shc A的共表達(dá)對MK2的激活。
共表達(dá)p66 Shc A觀察到升高的MK2活性。HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性的Hsp 27的磷酸化是對MK2活性的反應(yīng)。與MK2-p66 Shc A共表達(dá)觀察到增加的pHsp 27，這表明p66 Shc A結(jié)合能激活MK2。在RAW 264.7細(xì)胞中共表達(dá)MK2-p66 Shc A時觀察到的TNF-水平的升高確認(rèn)了ShcA共表達(dá)能激活MK2。用p66 Shc A激活MK2會導(dǎo)致MK2通過與Shc A結(jié)合定位且保留在胞質(zhì)溶膠中。胞質(zhì)溶膠定位會接著促進MK2向細(xì)胞質(zhì)底物(例如Hsp 27和TNF-αmRNA)的接近?；蛘撸琈K2會結(jié)合促進MK2細(xì)胞質(zhì)定位的胞質(zhì)溶膠Shc，在此處它就變得更活化了。
實施例13在RAW264.7細(xì)胞中與Shc A共表達(dá)時激活MK2如HeLα細(xì)胞中的pHsp 27水平測定所證實的，當(dāng)與Shc A共表達(dá)時會激活MK2。為了進一步證實與Shc A的締合會激活MK2，針對有MK2和Shc A存在的情況，測定了從RAW264.7細(xì)胞分泌出的TNF蛋白。從來自缺失MK 2的小鼠的細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)表明，LPS會引起TNF-α生物合成的90％減少。后續(xù)的實驗已經(jīng)證實，需要催化活性的MK2來恢復(fù)這些細(xì)胞中的TNF生物合成，由此認(rèn)為MK2酶促活性對于TNF-α生物合成是必需的。用單獨載體轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，或者用載體和V5-ShcA或Myc-MK2共轉(zhuǎn)染作為對照。平行地，用V5-Shc A和Myc-MK2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表達(dá)后，不用或用LPS刺激細(xì)胞30分鐘激活MK2。定量的western印跡分析表明，Myc-MK2和V5-Shc A都在RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)。與在293T和HeLa細(xì)胞中共表達(dá)相反，當(dāng)在RAW264.7細(xì)胞中共表達(dá)時，MK2和Shc A的水平都降低。該降低不能反應(yīng)蛋白水平的總體降低，因為在每道上加載了等量的蛋白，如使用肌動蛋白特異性抗體所顯示的(圖14A)。
TNF的ELISA實驗表明，LPS刺激會使TNF-α的分泌增加8倍，Myc-MK2或V5-Shc A的單獨表達(dá)不能加強這些細(xì)胞中的TNF生物合成。相反，當(dāng)MK2和Shc A共表達(dá)時，刺激后的TNF-α生物合成增加1.5倍(圖14B)。認(rèn)為TNF生物合成的增加反映了MK2活性的增加，但是不能反映MK2的表達(dá)，因為當(dāng)與Shc A共表達(dá)時的MK2蛋白水平低于在單獨表達(dá)MK2的細(xì)胞中觀察到的。
實施例14MK2在體外磷酸化Shc A在氧化應(yīng)激下，P66 Shc在CH2域中的絲氨酸36處被磷酸化。N-端至S36，絲氨酸位于Cam激酶II共有序列RXXS中的位點17(S17)處。圖15A顯示了Shc A蛋白的略圖，它包括蛋白中的多個磷酸化位點。已經(jīng)證實RXXS基序是MK2的底物，盡管它不含有經(jīng)常在MK2共有基序的保守的精氨酸-2位置發(fā)現(xiàn)的疏水氨基酸。為了確定Shc A是否是MK2的底物，將V5-Shc A在293T細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)后，使用抗-V5抗體免疫沉淀Shc A。免疫沉淀物隨后用于體外激酶測定，其中外源地加入了激活的重組MK 2。用載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞在66-kDa表現(xiàn)出較低的磷酸化水平，很可能是由于抗-V5抗體免疫沉淀了293T細(xì)胞的內(nèi)源性蛋白(它是MK2的弱底物)。只有Shc A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在66-kDa表現(xiàn)出較強的磷酸化水平，這表明Shc A是MK2的體外底物。Coomassie染色和使用抗-V5抗體的免疫印跡表明Shc A在Shc A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有表達(dá)(圖16B)。
如圖15B所示，MK2能體外地磷酸化p66 Shc A。MK2可以在p66Shc A調(diào)節(jié)的應(yīng)激激活途徑中起作用。盡管Shc A的66kDa異構(gòu)體能結(jié)合被激活的細(xì)胞表面受體，它的結(jié)合也不能激活Ras MAPK途徑。由于p66 Shc A未被普遍表達(dá)，認(rèn)為其細(xì)胞類型和組織特異性的表達(dá)通過其選擇性的表達(dá)方式選擇性地調(diào)節(jié)Ras MAPK途徑的激活。另外，p66Shc A異構(gòu)體在p53的下游起作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(Trinei等，Oncogene 21(24)3872-8(2002))。氧化應(yīng)激會激活P38-MK2途徑，將小熱休克蛋白磷酸化，由此調(diào)節(jié)微絲對應(yīng)激的反應(yīng)(Huot等，Circ Res.80(3)383-92.1997))。p38和MK2參與由氧化應(yīng)激引起的p53磷酸化(She Q.B.等，Jbiol.Chem.7；275(27)20444-9(2000)；She Q.B.等，Oncogene 21(10)1580-9(2002))。JNK和ERK參與絲氨酸磷酸化p66。本申請中陳述的數(shù)據(jù)支持了MK2在應(yīng)激激活的p66磷酸化中的作用，如圖16所示。
實施例15在MK2-/-細(xì)胞中降低磷酸Akt和磷酸FKHR-L1的水平從敲除了p66Shc A的動物得到數(shù)據(jù)已經(jīng)證實，p66調(diào)節(jié)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，包括胞內(nèi)ROS的生成和細(xì)胞凋亡，這些反應(yīng)需要蛋白中S36處的磷酸化。來自p66Shc A-/-動物的細(xì)胞具有降低了水平的胞內(nèi)自由基，與野生型同窩幼仔相比對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的應(yīng)激有抗性。另外，p66Shc A-/-動物對paraquot(一種能產(chǎn)生氧化劑的化合物)也有抗性，還表現(xiàn)出延長的壽命。p66 Shc-/-MEF中的氧化應(yīng)激(例如紫外線或H2O2)引起的AKT和FKHR-L1的磷酸化有所減少。FKHR-L1磷酸化的減少與FKHR-L1活性的升高有關(guān)，因為該轉(zhuǎn)錄因子在其去磷酸化形式仍然有作用。具有激活的FKHR-L1的細(xì)胞對細(xì)胞凋亡有抗性，這與該轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)幾種抗氧化劑酶(包括超氧物歧化酶和過氧化氫酶)的表達(dá)中的作用相符。
MK2在細(xì)胞對應(yīng)激的反應(yīng)中磷酸化和調(diào)節(jié)p66 Shc A中的作用表明，與野生型細(xì)胞相比，缺失MK2的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出降低的氧化應(yīng)激引起的磷酸(p)-AKT和磷酸(p)-FKHR-L1水平。為了驗證該預(yù)則，在MK2-/-和+/+MEF中測定了H2O2誘導(dǎo)的p-AKT和p-FKHR-L1水平。定量的western印跡分析表明，在MK2-/-MEF中的p-AKT和p-FKHR-L1水平都比在+/+MEF中有所降低，這表明MK2-/-細(xì)胞中的胞內(nèi)ROS水平有所降低(圖17)。
實施例16篩選抗炎藥物1.用于篩選藥物的酵母2-雜交系統(tǒng)用能結(jié)合MK2的蛋白鑒別抗炎藥物，包括能用于治療或預(yù)防炎癥的小分子、肽、化學(xué)試劑和抗體。
使用這里所述的酵母2-雜交系統(tǒng)鑒別MK2-相互作用蛋白。然后通過一個或多個這里提供的測定或本領(lǐng)域已知的測定研究MK2-相互作用蛋白對MK2活性的影響。例如，MK2相互作用蛋白會提高MK2活性，例如，如通過MK2激酶活性或TNF-α生物合成所測定的；抑制MK2活性；或?qū)K2活性無影響。理想地用能提高MK2活性的MK2相互作用蛋白作為篩選抗炎藥物的備選品。
將顯示出MK2和MK2相互作用蛋白之間的相互作用(如上所述，它能提高MK2活性)的陽性酵母克隆在合適的選擇平板上劃線，其次數(shù)與藥物備選品或要測試的受檢化合物的數(shù)量相同。如預(yù)期的，每一個劃線的菌落對MK2和相互作用蛋白之間的相互作用都是陽性的，如通過顏色和生長測定所證實的。隨后使每一個菌落接觸不同的藥物備選品，測試對MK2和相互作用蛋白之間的相互作用的影響。將能抑制MK2和相互作用蛋白之間的相互作用(如通過合適培養(yǎng)基上的菌落的顏色和/或生長的減少所證實的)的藥物備選品鑒定為潛在的治療或預(yù)防炎癥的備選品。
可以用相同的測定，例如，用于鑒別能促進MK2和相互作用蛋白之間的相互作用的藥物備選品，其中相互作用蛋白抑制MK2活性。例如，可以將顯示出MK2和相互作用蛋白之間的相互作用(如一個或多個這里提供的測定所證實的，它至少部分地抑制MK2活性)的陽性酵母菌落在合適的培養(yǎng)基上劃線。隨后使每一個陽性克隆的菌落接觸潛在的藥物備選品或受檢化合物。能在酵母特異性測定中產(chǎn)生這里所述的較強生長和顏色的藥物備選品是促進MK2和MK2相互作用蛋白之間的相互作用(其中相互作用蛋白抑制MK2活性)的潛在備選品。
2.用于篩選藥物的體外重構(gòu)實驗體外重構(gòu)實驗可以用于鑒別能阻斷MK2活性或阻斷MK2和相互作用蛋白之間的相互作用(其中該蛋白增強MK2活性)的抗炎藥物。
因此，體外重構(gòu)系統(tǒng)還可以用于形成包含MK2和至少一種MK2相互作用蛋白的蛋白復(fù)合物，其中這樣的復(fù)合物隨后可以用于鑒別能調(diào)節(jié)炎癥的受檢化合物。受檢化合物對炎癥的影響可以通過確定該受檢化合物抑制或促進復(fù)合物的形成來驗證，或測試其對MK2活性的影響。例如，將蛋白復(fù)合物與受檢化合物接觸之前和之后，可以測量包含MK2和相互作用蛋白的蛋白復(fù)合物的量。能使蛋白復(fù)合物的量相對于沒有受檢化合物時的量有所減少的受檢化合物具有抗炎性。然而，能使蛋白復(fù)合物的量相對于沒有受檢化合物時的量有所增加的受檢化合物具有促炎性。
例如，使用體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)(例如Promega供應(yīng)的兔網(wǎng)狀細(xì)胞系統(tǒng))合成MK2。首先在一個或多個這里提供的測定中測試體外翻譯的MK2的活性。隨后在合適的條件下在合適的時間段內(nèi)將各種藥物備選品加入到翻譯的MK2中，測試與潛在的藥物備選品接觸后的MK2活性。將能抑制或減少MK2活性的備選品鑒別為潛在的抗炎藥物。還可以進一步在炎癥的細(xì)胞和動物模型中體外地驗證這些藥物對炎癥和參與炎癥的各種途徑的效果。
類似地，體外重構(gòu)系統(tǒng)還可以用于鑒別能抑制MK2和相互作用蛋白之間的相互作用的藥物，其中該相互作用蛋白刺激MK2活性。例如，將包含體外翻譯的MK2和相互作用蛋白(如通過Y2H系統(tǒng)或共免疫沉淀測定所鑒別的)組合物用潛在的藥物備選品處理。將能抑制MK2和相互作用蛋白之間的相互作用的備選品鑒別為潛在的抗炎藥物。隨后在細(xì)胞和動物模型中體內(nèi)地測試這些藥物。除了體外翻譯的蛋白外，純化的蛋白也可以用在鑒別抗炎藥物的體外重構(gòu)實驗中。
實施例17與炎癥相關(guān)的狀況的治療可以給患有與炎癥相關(guān)的狀況(如表1)的患者施用能與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物(例如蛋白、肽、抗體、化學(xué)試劑和小分子)。患者服用一次或間隔(例如每日一次)服用該組合物，他們的狀況有所改善。例如，炎癥有所減輕。這表明，本發(fā)明的組合物可以用于治療與炎癥相關(guān)的疾病。
表1能與MK2或MK2復(fù)合物相互作用的化合物的施用

根據(jù)在說明書中引用的在這里引作參考的參考文獻的教導(dǎo)，完全能徹底地理解說明書。說明書中的實施方案提供了對本發(fā)明的實施方案的解釋，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地認(rèn)識到，許多其它實施方案也被包括在本發(fā)明中。說明書中的所有引用的文獻、專利申請和專利以及由獲取號或數(shù)據(jù)庫參考編號鑒別的序列都整體引作參考。如果引作參考的材料與本說明書矛盾或不一致，則以本說明書為準(zhǔn)。這里對任何參考文獻的引用都不能表明該參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所明白的，可以作出本發(fā)明的許多改進和變化而不背離其精神和范圍。這里所述的特定實施方案只是作為例子來提供，而不是以任何方式進行限制。除非另有說明，在說明書(包括權(quán)利要求書)中使用的表達(dá)成分的量、細(xì)胞培養(yǎng)物、治療狀況等的所有數(shù)字在任何情況下都應(yīng)當(dāng)理解為被術(shù)語“約”修飾。因此，除非另有相反的說明，數(shù)字參數(shù)都是約數(shù)，且可以根據(jù)本發(fā)明想要得到的理想性質(zhì)而變化。除非另有說明，一系列元素前的術(shù)語“至少”應(yīng)當(dāng)理解為是指系列中的每一元素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認(rèn)識到或僅僅使用常規(guī)實驗就能確定許多與這里所述的本發(fā)明的特定實施方案等同的方案。這樣的等同物也應(yīng)當(dāng)包括在本申請的權(quán)利要求書中。
序列表<110>Lin，Lih-LingYannoni，Yvonne<120>MK2相互作用蛋白<130>08702-0097-00304<150>USSN 60/400,044<151>2002-08-02<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3312<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1cccacgcgtc cgggggacgg ttgctgagcg ggcctgggac agcgggtcgc ggcacctccc 60gcctgcgcgt gtctaatccg tctgtcgggt cccgaaagag ctaagccgag cctgcgccgg120acgggtgggc tggactgaga gaattctctg agctggtgac aggtgccaca ggcactgggg180atctcaccag aaaggaaccg acggagctag gggccagcga gatggcggac gaggccttag240ctgggctgga tgagggagcc cttcggaagc tgctggaggt cacagcagat ctggcagagc300ggcggcgcat ccgctcagcc atccgggaac tgcagcggca ggagctggag cgcgaggagg360aggccctggc atccaagcgt ttccgtgccg agcggcagga caacaaggag aactggctgc420actctcagca gcgggaagct gagcagcggg ctgccctggc acggctggca gggcagctgg480agtccatgaa cgatgtggag gaattgactg cactgttgcg aagcgctggt gagtatgagg540agcgcaagct gatccgagct gccatccgcc gtgtacgggc tcaggagatt gaggctgcca600ccttggctgg gaggttgtac agcgggcgtc ccaacagtgg ctcaagagag gacagcaagg660ggctagcggc acacaggctg gaacagtgtg aggtgccaga gcgagaggaa caggaacagc720aggcagaggt ttcaaagcca acccccaccc ctgaaggcac cagccaggat gtgaccacag780
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Ile Lys Asp Gly Arg Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Val Leu Leu Pro465 470 475 480Thr Gly Asn Gln Arg Ala Glu Leu Thr Leu Gly Leu Arg Ala Pro Pro485 490 495Thr Leu Leu Ser Thr Ser Ser Gly Gly Lys Ser Thr Ile Thr Arg Val500 505 510Asn Ser Pro Gly Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ser Val Thr His Val Thr515 520 525Ser Phe Ser His Ala Pro Pro Ser Ser Arg Gly Gly Cys Ser Ile Lys530 535 540Met Glu Pro Glu Pro Ala Glu Pro Leu Ala Ala Ala Val Glu Ala Ala545 550 555 560Asn Gly Ala Glu Gln Thr Arg Val Asn Lys Ala Pro Glu Gly Arg Ser565 570 575Pro Leu Ser Ala Glu Glu Leu Met Thr Ile Glu Asp Glu Gly Val Leu580 585 590Asp Lys Met Leu Asp Gln Ser Thr Asp Phe Glu Glu Arg Lys Leu Ile595 600 605Arg Ala Ala Leu Arg Glu Leu Arg Gln Arg Lys Arg Asp Gln Arg Asp610 615 620Lys Glu Arg Glu Arg Arg Leu Gln Glu Ala Arg Gly Arg Pro Gly Glu625 630 635 640Gly Arg Gly Asn Thr Ala Thr Glu Thr Thr Thr Arg His Ser Gln Arg645 650 655
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Ile Ile Ser Ala Gly Ser Glu Leu Cys Leu Gln Gln Pro Val Asp Arg565 570 575Lys Val
權(quán)利要求
1.一種分離的、純化的或重組的蛋白復(fù)合物，其包含(i)MK2多肽；和(ii)選自STS、HPH2和Shc的MK2相互作用蛋白。
2.如權(quán)利要求1的復(fù)合物，其包含MK2多肽和至少一種MK2相互作用蛋白。
3.如權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述的MK2相互作用蛋白選自STS、HPH2和Shc。
4.如權(quán)利要求1的復(fù)合物，其包含MK2多肽和至少兩種MK2相互作用蛋白。
5.如權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述的MK2相互作用蛋白選自STS、HPH2和Shc。
6.如權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述的MK2多肽包含融合蛋白。
7.如權(quán)利要求6的復(fù)合物，其中所述的融合蛋白包含用于純化、分離或檢測融合蛋白的域。
8.如權(quán)利要求6的復(fù)合物，其中所述的融合蛋白包含的域選自親和力標(biāo)記、放射性核苷酸、酶和熒光團。
9.如權(quán)利要求7的復(fù)合物，其中所述的域選自聚組氨酸、FLAG、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
10.包含第一核酸和第二核酸的宿主細(xì)胞，其中第一核酸編碼重組MK2多肽，第二核酸編碼選自STS、HPH2和Shc的MK2相互作用蛋白。
11.如權(quán)利要求10的細(xì)胞，還包含第三核酸，它編碼第二種選自STS、HPH2和Shc的MK2相互作用蛋白。
12.確定受檢化合物抑制或促進蛋白復(fù)合物形成的測定，其包括(a)形成反應(yīng)混合物，它包含MK2多肽、至少一種MK2相互作用蛋白和受檢化合物；和(b)檢測MK2和MK2相互作用蛋白之間的蛋白復(fù)合物的存在；其中在有受檢化合物存在的情況下的復(fù)合物的量相對于在沒有受檢化合物存在的情況下的復(fù)合物的量的差異指示受檢化合物抑制或促進復(fù)合物的形成。
13.如權(quán)利要求12的測定，其中在有受檢化合物存在的情況下的復(fù)合物的量的增加指示受檢化合物能促進復(fù)合物的形成。
14.如權(quán)利要求12的測定，其中在有受檢化合物存在的情況下的復(fù)合物的量的減少指示受檢化合物能抑制復(fù)合物的形成。
15.一種檢測受檢化合物是否影響MK2活性的方法，其包含(a)形成包含MK2多肽和MK2相互作用蛋白的蛋白復(fù)合物；(b)使蛋白復(fù)合物與受檢化合物接觸，和(c)確定受檢化合物對選自下組的一種或多種活性的影響MK2激酶活性，MK2在復(fù)合物中的量，TNF的生產(chǎn)和MK2底物的磷酸化形式的量。
16.鑒別能抑制或促進蛋白復(fù)合物的形成的篩選測定，其包括(i)提供雙-雜交測定系統(tǒng)，它包括包含MK2多肽的第一融合蛋白和包含選自STS、HPH2和Shc中的一種或多種的多肽的第二融合蛋白，在所處的條件下，兩種蛋白在雙-雜交測定系統(tǒng)中相互作用；(ii)測量融合蛋白間在有和沒有受檢化合物的條件下的相互作用水平；和(iii)對比融合蛋白的相互作用水平，其中相互作用水平的降低指示能抑制MK2多肽和選自STS、HPH2和Shc中的一種或多種的多肽之間的相互作用的化合物。
17.結(jié)合復(fù)合物中的一種或多種蛋白的抗體，所述的復(fù)合物包含MK2多肽和選自STS、HPH2和Shc的MK2相互作用蛋白。
18.如權(quán)利要求17的抗體，其中所述的抗體抑制MK2和MK2相互作用蛋白之間的相互作用。
19.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中的至少包含第一蛋白和第二蛋白的蛋白復(fù)合物的形成的方法，其中第一蛋白是MK2多肽，第二蛋白選自STS、HPH2和Shc中的一種或多種，其中該方法包括給細(xì)胞施用能調(diào)節(jié)復(fù)合物形成的化合物。
20.一種生產(chǎn)復(fù)合物的方法，包含用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述的多核苷酸編碼MK2多肽和選自STS、HPH2和Shc中的一種或多種的MK2相互作用蛋白，其中多肽形成復(fù)合物。
21.一種鑒別抗炎藥物的藥物篩選方法，包含a)提供MK2和至少一種MK2-相互作用蛋白；b)使MK2和蛋白相互作用，形成復(fù)合物；c)向復(fù)合物添加有效量的潛在藥物；和d)確定潛在藥物是否抑制復(fù)合物的形成。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的MK2和蛋白在酵母2-雜交系統(tǒng)中體內(nèi)地相互作用。
23.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的MK2和蛋白在哺乳動物2-雜交系統(tǒng)中體內(nèi)地相互作用。
24.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的MK2和蛋白體外地相互作用。
25.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的蛋白是STS。
26.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的蛋白是Shc。
27.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的蛋白是HPH2。
28.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的藥物是小分子。
29.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的藥物是肽或蛋白。
30.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的藥物是抗體。
31.如權(quán)利要求21的方法，藥物是化學(xué)試劑。
32.一種調(diào)節(jié)組織中的炎癥的方法，包含a)給組織施用核酸，其中所述的核酸編碼MK2相互作用蛋白；和b)使核酸表達(dá)MK2相互作用蛋白，由此調(diào)節(jié)組織中的炎癥。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中所述的核酸能表達(dá)選自STS、HPH2和Shc的蛋白。
34.治療或預(yù)防組織中的炎癥的方法，包括給所述的組織施用治療有效量的至少一種試劑，其中所述的試劑a)阻斷MK2和MK2相互作用蛋白之間的相互作用；或b)進行相互作用，但是阻斷MK2活性。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中所述的試劑是抗體。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中所述的抗體是多克隆抗體。
37.如權(quán)利要求35的方法，其中所述的抗體是單克隆抗體。
37.如權(quán)利要求35-37的方法，其中所述的抗體結(jié)合MK2。
38.如權(quán)利要求35-37的方法，其中所述的抗體結(jié)合MK2-相互作用蛋白。
39.如權(quán)利要求34的方法，其中所述的試劑是化學(xué)試劑。
40.如權(quán)利要求34的方法，其中所述的試劑是肽或蛋白。
41.如權(quán)利要求34的方法，其中所述的試劑是小分子。
42.一種調(diào)節(jié)組織中的炎癥的方法，包含a)使組織與至少一種結(jié)合MK2的蛋白接觸；和b)使蛋白調(diào)節(jié)組織中的炎癥。
43.一種治療患有至少一種炎癥狀況的患者的方法，包含a)施用治療有效劑量的至少一種化合物，它選自與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物，其中所述的化合物選自抗體、化學(xué)試劑、小分子、蛋白和肽；和b)使化合物結(jié)合到MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種，并調(diào)節(jié)炎癥。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中所述的蛋白或肽是刺激MK2活性的野生型蛋白或肽的突變體形式。
45.如權(quán)利要求43的方法，其中所述的蛋白選自STS、HPH2和Shc。
46.如權(quán)利要求43的方法，其中所述的狀況選自克隆氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和由于創(chuàng)傷或損傷引起的炎癥。
47.一種在細(xì)胞中表達(dá)核酸以抑制炎癥的方法，包含a)加入編碼化合物的至少一種核酸，所述的化合物選自能與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物，其中所述的化合物選自抗體、化學(xué)試劑、小分子、蛋白和肽；和b)使細(xì)胞表達(dá)化合物并抑制炎癥。
48.如權(quán)利要求47的方法，其中所述的核酸編碼選自STS、HPH2和Shc的蛋白。
49.檢測樣品中不存在MK2、存在MK2和MK2量中的至少一種的方法，包含a)施用至少一種化合物，它與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用，其中所述的化合物選自抗體、化學(xué)試劑、小分子、蛋白和肽；和b)將不存在、存在結(jié)合的蛋白或化合物或其量與樣品中不存在MK2、存在MK2或MK2的量相關(guān)聯(lián)。
50.如權(quán)利要求49的方法，其中所述的蛋白選自STS、HPH2和Shc。
51.一種試劑盒，其中所述的試劑盒能定量檢測MK2，該試劑盒包含與MK2或MK2復(fù)合物中的至少一種相互作用的化合物，其中所述的化合物選自抗體、化學(xué)試劑、小分子、蛋白和肽；和至少一種其它試劑盒組分，它選自a)緩沖劑和溶液中的至少一種；b)至少一種結(jié)構(gòu)組分。
52.如權(quán)利要求51的試劑盒，還包含結(jié)合蛋白或化合物的試劑。
53.如權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述的試劑是抗體。
54.如權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述的蛋白選自STS、HPH2和Shc。
55.一種藥物組合物，它包含a)至少一種結(jié)合MK2的蛋白，和b)至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
56.如權(quán)利要求55的組合物，其中所述的蛋白選自STS、HPH2和Shc。
全文摘要
本發(fā)明涉及能結(jié)合MK2以調(diào)節(jié)炎癥的蛋白的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及能結(jié)合MK2以治療與炎癥相關(guān)的狀況的蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明可以用于治療炎性狀況，更具體地，用于治療其中炎癥的減少是治療上有益的狀況。
文檔編號C07K1/00GK1735687SQ03823700
公開日2006年2月15日 申請日期2003年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者L·－L·林, Y·M·彥諾尼 申請人:惠氏公司