專利名稱：紅褐肉座菌cbh1纖維素酶的新變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變體纖維二糖水解酶、以及分離的編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸序列。本發(fā)明還涉及包括該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于生產(chǎn)重組變體CBH多肽的方法。
參考文獻1.Sheehan和Himmel Biotechnology Progress 15，pp 817-827(1999)2.Matti Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposiumon Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9-11(1993)
3.Tuula T.Teeri Trends in Biotechnology 15，pp 160-167(1997)4.T.T.Teeri等，Spec.Publ.-R.Soc.Chem.，246(RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering)，pp 302-308.(1999)5.PDB reference 20VWSulzenbacher，G.，Schulein，M.，Davies，G.J.Biochemistry 36 pp.5902(1997)6.PDB reference1A39Davies，G.J.，Ducros，V.，Lewis，R.J.，Borchert，T.V.，Schulein，M.Journal of Biotechnology 57pp.91(1997)7.PDB reference 6CELDivne，C.，Stahlberg，J.，Teeri，T.T.，Jones，T.A.Journal of Molecular Biology 275 pp.309(1998)8.PDB reference 1 EG1Kleywegt，G.J.，Zou，J.Y.，Divne，C.，Davies，G.J.，Sinning，I.，Stahlberg，J.，Reinikainen，T.，Srisodsuk，M.，Teeri，T.T.，Jones，T.A.Journal of MolecularBiology 272 pp.383(1997)9.PDB reference 1 DY4(8CEL)J.Stahlberg，H.Henriksson，C.Divne，R.Isaksson，G.Pettersson，G.Johansson，T.A.Jones發(fā)明背景
纖維素和半纖維素是通過光合作用產(chǎn)生的最為豐富的植物原料。他們可以被大量微生物降解并作為其能量來源，這些微生物包括產(chǎn)生能夠?qū)⒕酆象w底物水解為單糖的細胞外酶的細菌、酵母和真菌(Aro等，J.Biol.Chem.，vol.276，no.26，pp.24309-24314，June 29，2001)。由于不可再生資源途徑的限制，纖維素成為主要的可再生能量來源的潛力是巨大的(Krishna等，Bioresource Tech.77193-196，2001)。纖維素通過生物途徑的有效利用，是克服食物、飼料和燃料缺乏的途徑(Ohmiyaet等，Biotechnol.Gen.Engineer.Rev.vol.14，pp.365-414，1997)。纖維素酶水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或βD-葡萄糖苷聯(lián)接)從而形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等。纖維素酶通常分為三大類內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡萄糖苷酶(β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，TIBTECH 5，255-261，1987；Shulein，Methodes Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的無定形部分，而纖維二糖水解酶也可以降解晶體纖維素(Nevalainen和Penttila，Mycota，303-319，1995)。因此，在纖維素酶系統(tǒng)中存在纖維二糖水解酶對于晶體纖維素的有效溶解是必需的(Suurnakki等，Cellulose 7189-209，2000)。β-葡萄糖苷酶起到從纖維二糖、纖維寡糖和其他糖苷釋放D-葡萄糖單元的作用(Freer，J.Biol.Chem.vol.268，no.13，pp.9337-9342，1993)。已知纖維素酶由許多細菌、酵母和真菌產(chǎn)生。某種真菌產(chǎn)生能夠降解纖維素晶體形式的完整的纖維素酶系統(tǒng)，所以纖維素酶易于經(jīng)發(fā)酵大量產(chǎn)生。由于許多酵母(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))缺乏水解纖維素的能力，絲狀真菌扮演了特殊的角色。見例如Aro等，2001；Aubert等，1988；Wood等，Methods in Enzymology，vol.160，no.9，pp.87-116，1988，以及Coughlan等，“ComparativeBiochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems”Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp.11-30，1988。CBH、EG和BG的真菌纖維素酶分類可以進一步擴展為每個分類內(nèi)包括多種成分。例如，從多種真菌來源分離出多種CBH、EG和BG，這些真菌來源包括瑞氏木霉(Trichoderma reesei)這樣含有兩個CBH(即CBH I和CBH II)、至少八個EG(即EG I、EG II、EG III、EG IV、EG V、EG VI、EG VII和EG VIII)，以及至少五個BG(即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5)的已知基因。為了將晶體纖維素有效的轉(zhuǎn)化為葡萄糖，完整的纖維素酶系統(tǒng)是必需的，該系統(tǒng)包括來自CBH、EG和BG每個分類的成分，具有的單獨成分在水解晶體纖維素中效率較低(Filho等，Can.J.Microbiol.421-5，1996)。在來自不同分類的纖維素酶成分之間，可以觀察到協(xié)同關(guān)系。特別是EG型纖維素酶和CBH型纖維素酶協(xié)同相互作用，更有效的降解纖維素酶。見例如Wood，Biochemical Society Transactions，611thMeeting，Galway，vol.13，pp.407-410，1985。在紡織品處理中，對于加強去垢劑組合物清潔能力的目的、作為軟化劑、用于改善棉織品的觸感和外觀等，纖維素酶是有幫助的，此點為本領(lǐng)域所公知(Kumar等，Textile Chemist and Colorist，2937-42，1997)。含有纖維素酶、具有改善的清潔性能(美國專利No.4,435,307；GB App.Nos.2,095,275和2,094,826)、用于棉織品處理以改善紡織品觸感和外觀的清潔劑成分已得到描述(美國專利Nos.5,648,263，5,691,178，以及5,776,757；GB App.No.1,358,599；The ShizuokaPrefectural Hammamatsu Textile Industrial Research InstituteReport，Vol.24，pp.54-61，1986)。因此，在真菌和細菌中產(chǎn)生的纖維素酶得到顯著的關(guān)注。特別是，木霉屬物種(例如長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或瑞氏木霉)的發(fā)酵顯示產(chǎn)生完整的纖維素酶系統(tǒng)，能夠降解纖維素的晶體形式。盡管纖維素酶組合物先前已有描述，仍然需要新的以及改進的纖維素酶組合物，用于家用清潔劑、石洗組合物或洗衣用清潔劑等。展示出改善性能的纖維素酶是特別的目的。
發(fā)明概述[13]本發(fā)明提供一種分離的、此處鑒定為CHB I變體的纖維素酶蛋白質(zhì)，以及編碼CBH I變體的核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種CBH I纖維素酶變體，其中所述變體包括對應于紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)CBH I(SEQ IDNO2)的S8、Q17、G22、T41、N49、S57、N64、A68、A77、N89、S92、N103、A112、S113、E193、S196、M213、L225、T226、P227、T246、D249、R251、Y252、T255、D257、D259、S278、S279、K286、L288、E295、T296、S297、A299、N301、E325、T332、F338、S342、F352、T356、Y371、T380、Y381、V393、R394、S398、V403、S411、G430、G440、T445、T462、T484、Q487和P491中之一或更多殘基的位點的置換或缺失。在第一方面，本發(fā)明包括分離的編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，該多肽是家族7的糖基水解酶的變體，并且其中所述核酸編碼由此核酸編碼的多肽中對溫度應激(stress)敏感的殘基的置換，其中所述纖維二糖水解酶衍生自紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。在第二方面，本發(fā)明包括分離的編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，該多肽是家族7的糖基水解酶的變體，其中所述核酸在由所述核酸編碼的多肽中實現(xiàn)酶加工的殘基處編碼置換，其中所述纖維二糖水解酶衍生自紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。在第三方面，本發(fā)明包括分離的編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，該多肽是家族7的糖基水解酶的變體，其中在由所述核酸編碼的多肽中實現(xiàn)產(chǎn)物抑制的殘基處所述核酸編碼在此殘基的置換，其中所述纖維二糖水解酶衍生自紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及一種CBH I纖維素酶變體，包括對應于紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的S8P、Q17L、G22D、T41I、N49S、S57N、N64D、A68T、A77D、N89D、S92T、N103I、A112E、S113(T/N/D)、E193V、S196T、M213I、L225F、T226A、P227(L/T/A)、T246(C/A)、D249K、R251A、Y252(A/Q)、T255P、D257E、D259W、S278P、S279N、K286M、L288F、E295K、T296P、S297T、A299E、N301(R/K)、E325K、T332(K/Y/H)、F338Y、S342Y、F352L、T356L、Y371C、T380G、Y381D、V393G、R394A、S398T、V403D、S411F、G430F、G440R、T462I、T484S、Q487L和/或P491L中之一或更多殘基的位點的置換。在本實施方案的一個方面中，CBH I纖維素酶變體另外包括對應于來自紅褐肉座菌的CBH I(SEQ ID NO2)中T455的位點的缺失。在本實施方案的第二個方面，CBH I纖維素酶變體另外包括對應于紅褐肉座菌的CBH I(SEQ ID NO2)中殘基382-393的殘基缺失。在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及一種CBH I纖維素酶變體，其中所述變體包括殘基位點的置換，該位點對應于選自紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的S8P、N49S、A68T、A77D、N89D、S92T、S113(N/D)、L225F、P227(A/L/T)、D249K、T255P、D257E、S279N、L288F、E295K、S297T、A299E、N301K、T332(K/Y/H)、F338Y、T356L、V393G、G430F中的殘基。在第四個實施方案中，本發(fā)明涉及一種基本由突變體組成的CBH I變體，該突變體選自紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的i A112E/T226A；iiS196T/S411F；iii E295K/S398T；ivT246C/Y371C；v T41I加T445缺失；viA68T/G440R/P491L；vii G22D/S278P/T296P；viii T246A/R251A/Y252A；ixT380G/Y381D/R394A；x T380G/Y381D/R394A加382-393缺失；xiY252Q/D259W/S342Y；xii S113T/T255P/K286M；xiii P227L/E325K/Q487L；xiv P227T/T484S/F352L；xvQ17L/E193V/M213I/F352L；xvi S8P/N49S/A68T/S113N；xvii S8P/N49S/A68T/S113N/P227L；xviii T41I/A112E/P227L/S278P/T296P；
xix S8P/N49S/A68T/A112E/T226A；xx S8P/N49S/A68T/A112E/P227L；xxi S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L；xxii G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P；xxiiiS8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；xxiv G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；xxv G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P；xxvi G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P；xxviiS8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P；xxviii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R；xxix S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；xxx S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；xxxi S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；xxxiiS8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R；xxxiii S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；xxxivS8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；xxxv S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；xxxviS8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；xxxvii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F；
xxxviii S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；xxxix S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；[18]在第五個實施方案中，本發(fā)明涉及包括變體CBH I的編碼核酸的載體。在另一個方面涉及包括有效連接于調(diào)控序列的CBH I變體編碼核酸的構(gòu)建體。在第六個實施方案中，本發(fā)明涉及用包括CBH I變體的編碼核酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在第七個實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生CBH I變體的方法，包括步驟(a)在適宜的培養(yǎng)條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了包括編碼CBH I變體的核酸的載體的宿主細胞，產(chǎn)生CBH I變體；(b)獲得如上產(chǎn)生的CBH I變體。在第八個實施方案中，本發(fā)明涉及包括表面活性劑和CBH I變體的去垢劑組合物。在此實施方案的一個方面，該清潔劑是洗衣用清潔劑。在此實施方案的第二個方面，該清潔劑為餐具清潔劑。在本發(fā)明的第三個方面，此CBH I纖維素酶變體用于含纖維素紡織品、尤其是在石洗或靛青染色的粗斜紋棉布中的處理。在第九個實施方案中，本發(fā)明涉及包括CBH I變體的飼料添加劑。在第十個實施方案中，本發(fā)明涉及處理木質(zhì)紙漿的方法，該方法包括將所述木質(zhì)紙漿與CBH I變體接觸。在第十一個實施方案中，本發(fā)明涉及將生物物質(zhì)(biomass)轉(zhuǎn)化為糖的方法，該方法包括將所述植物材料、蔬菜或農(nóng)業(yè)廢棄物與CBH I變體接觸。在一個實施方案中，纖維素酶來源于真菌、細菌或放線菌類。在另一方面，纖維素酶來源于真菌。在最為優(yōu)選的實施方案中，該真菌為絲狀真菌。首選屬于真子囊菌(Euascomycete)、特別是曲霉屬物種、粘帚霉屬物種(Gliocladium spp.)、鐮孢菌屬物種(Fusarium spp.)、支頂孢屬物種(Acremonium spp.)、毀絲霉屬物種(Myceliophtoraspp).、輪枝孢屬物種(Verticillium spp.)、漆斑菌屬物種(Myrotheciumspp.)或青霉屬物種的絲狀真菌。在本實施方案的另一個方面，此纖維素酶為纖維二糖水解酶。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將在隨后的詳細描述中變得明晰。然而，應當理解，盡管指示了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，詳細描述和特定的實施例僅以說明形式給出，因為從此詳細的描述中，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在本發(fā)明范圍和精神之內(nèi)的多種改變和改良是顯而易見的。
附圖概述[27]

圖1是來自紅褐肉座菌的野生型Cel7A(CBH I)的核酸(下列；SEQ ID NO1)和氨基酸序列(上列；SEQ ID NO2)。圖2為紅褐肉座菌CBH I的三維結(jié)構(gòu)。圖3顯示了Cel7家族可獲得晶體結(jié)構(gòu)的成員的氨基酸比對。序列為20VW-尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)Cel7B、1A39-Humicolainsolens Cel7B、6CEL-紅褐肉座菌Cel7A、1EG1-紅褐肉座菌Cel7B。圖4闡明了如此處描述進行比對和覆蓋的四種Cel7同源物的催化域的晶體結(jié)構(gòu)。圖5A-M是八個單殘基突變和五個多重突變體的核酸序列以及推論得到的氨基酸序列。圖6A-D為pTrex2核酸序列。圖7A和B描述了表達質(zhì)粒pTEX的構(gòu)建。圖8A-J是Cel7家族全部42個成員的氨基酸比對。圖9A是野生型和八種單殘基變體的熱性能表示。圖9B是野生型和五種變體的熱性能表示。圖9B圖例Cel7A＝野生型紅褐肉座菌CBH I；N301K＝N301K變體；334＝P227L變體；340＝S8P/N49S/A68T/S113N變體；350＝S8P/N49S/A68T/S113N/P227L變體；以及363＝S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P變體。圖10為pRAX1載體。除了插入構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)基因組DNA片段AMA1序列的5259個堿基對的HindIII片段之外，該載體以pGAPT2質(zhì)粒為基礎(Molecular Microbiology，1996，19565-574)。堿基1至1134含有黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶基因啟動子。堿基3098至3356及4950至4971含有黑曲霉葡糖淀粉酶終止子。構(gòu)巢曲霉pyrG基因作為真菌轉(zhuǎn)化標志在3357至4949插入。具有可以插入基因的多克隆位點(MCS)。圖11是pRAXdes2載體骨架。該載體以質(zhì)粒載體pRAX1為基礎。一個Gateway盒插入pRAX1載體(由環(huán)形質(zhì)粒內(nèi)的箭頭指示)。該盒含有重組序列attR1和attR2以及選擇標志catH和ccdB。該載體根據(jù)GatewayTMCloning Technology中提供的指南制備譯本1中34-38頁，而且只能在來自Invitrogen的大腸桿菌DB3.1中復制；在其他大腸桿菌宿主中，ccdB基因是致死性的。首先，使用含有attB1/2重組序列的引物制備PCR片段。該片段與pDONR201(由Invitrogen商業(yè)供應)重組；該載體含有attP1/2重組序列，重組位點之間有catH和ccdB。使用由Invitrogen提供的BP克隆酶(clonase enzyme)將PCR片段重組入這個所謂的ENTRY載體內(nèi)，含有插入的PCR片段的克隆可以通過50μg/ml卡那霉素選擇，因為表達ccdB的克隆不能存活?，F(xiàn)在，att序列被改變，并被稱為attL1和attL2。第二步是將此克隆與pRAXdes2載體(含有attR1和attR2，catH和ccdB在重組位點之間)重組。使用Invitrogen的LR克隆酶將來自ENTRY載體的插入物重組入目的載體。使用100μg/ml氨芐青霉素，僅有pRAXCBH1載體被選擇，因為ccdB是致死性的，而ENTRY載體對氨芐青霉素敏感。使用這種方法，現(xiàn)在制備了表達載體，并可轉(zhuǎn)化黑曲霉。圖12提供pRAXdes2cbh1載體的圖解，使用該載體在曲霉內(nèi)表達編碼CBH1變體的核酸。通過att序列的同源重組，編碼CBH1酶的同系物或變體的核酸序列被克隆進入載體。
詳細描述[39]本發(fā)明將使用隨后的定義和實施例、僅僅通過參考得以詳細說明。此處提及的所有專利和出版物，包括所有在這些專利和出版物中公布的序列，被明確引用作為參考。除非在此另外定義，所有此處使用的技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，JohnWiley and Sons，New York(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了含有本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的通用詞典。盡管任何與此處所述類似或相當?shù)姆椒ê筒牧峡梢杂糜趯嵺`或檢測本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料得以描述。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另外指出，核酸按照從5′到3′的方向從左向右寫；氨基酸序列按照從氨基端到羧基端的方向從左向右寫。從業(yè)者對本領(lǐng)域定義和術(shù)語特別可參考Sambrook等，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MAMUAL(SecondEdition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989，以及Ausubel FM等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York，NY，1993。應當理解，由于本發(fā)明可能變化，因此不限定于所描述的特定的方法學、方案和試劑。此處提供的標題不是本發(fā)明多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨笐獏⒖颊麄€說明書而得到。因此，通過參考整個說明書，下面馬上要定義的術(shù)語將得到更加充分的定義。為了描述和公布可能使用的、與本發(fā)明有關(guān)的組合物和方法學，此處所有列出的出版物在此明確引用作為參考。
I定義[43]如此處所用的術(shù)語“多肽”，指由肽鍵連接的氨基酸殘基單鏈組成的化合物。如此處所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”，可以與術(shù)語“多肽”同義，或者額外指兩種或更多多肽的復合物。“變體”意味著通過向C和N末端之一或兩者增加一個或更多氨基酸、在氨基酸序列的一個或者許多不同位點置換一個或多個氨基酸、或者在蛋白質(zhì)末端之一或兩者、或在氨基酸序列的一個或更多位點刪除一個或多個氨基酸，得以由前體蛋白質(zhì)(例如天然蛋白)衍生的蛋白質(zhì)。酶變體的制備優(yōu)選通過如下步驟實現(xiàn)修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將此DNA序列轉(zhuǎn)化進入適宜的宿主，以及表達經(jīng)過修飾的DNA序列，以形成衍生酶。本發(fā)明的變體CBH I酶包括含有與前體酶氨基酸序列相比而言改變的氨基酸序列的肽，其中變體CBH酶保留了前體酶特有的分解纖維素的性質(zhì)，但是在某些特定的方面可能具有改變的特性。例如，變體CBH酶可能具有升高的最適pH或升高的溫度或氧化穩(wěn)定性，但是將保留其纖維素分解活性的性質(zhì)。預計根據(jù)本發(fā)明的變體可以得自編碼纖維素酶變體CBH酶的DNA片段，其表達的纖維素酶衍生物的功能活性得以保留。例如，編碼纖維素酶的DNA片段可以另外包括附加于纖維素酶DNA序列5′或3′末端、可以編碼鉸鏈或連接子的DNA片段或其部分，在此纖維素酶DNA序列中，編碼的纖維素酶結(jié)構(gòu)域的功能活性得以保留。“等價殘基(Equivalent residues)”也可以通過測定與前體纖維素酶在三級結(jié)構(gòu)水平的同源性得以定義，其中前體纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)X線晶體學測定。等價殘基定義為經(jīng)過比對后，纖維素酶和紅褐肉座菌CBH特定氨基酸殘基的兩個或兩個以上主鏈原子的原子坐標(N與N，CA與CA，C與C以及O與O)在0.13nm內(nèi)、優(yōu)選0.1nm內(nèi)的殘基。在最佳模式得到確定并定位，纖維素酶蛋白質(zhì)非氫原子與紅褐肉座菌CBH I的原子坐標具有最大交迭之后，比對得以實現(xiàn)。最佳模型是在可以得到最高分辨率時，實驗衍射數(shù)據(jù)具有最低R因子的晶體學模型。
[46]與紅褐肉座菌CBH I的特定殘基功能類似的等價殘基定義為如下的纖維素酶氨基酸他們采用某種構(gòu)象，從而它們以某種方式改變、修飾或形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化，其中所述方式由紅褐肉座菌CBHI的特定殘基定義或造成。另外，他們是占據(jù)相似位置的纖維素酶(其三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X射線晶體學獲得)殘基，就此意義而言，盡管給定殘基的主鏈原子可能不滿足在占據(jù)同源位點基礎上的等價的標準，該殘基的至少兩個側(cè)鏈原子的原子坐標位于紅褐肉座菌CBH相應側(cè)鏈原子的0.13nm范圍內(nèi)。紅褐肉座菌CBH I的晶體結(jié)構(gòu)展示于圖2中。術(shù)語“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。應當理解，由于遺傳密碼子的兼并性，可以產(chǎn)生編碼給定蛋白質(zhì)(例如CBH I)的多個核酸序列。本發(fā)明考慮到編碼CBH I的每個可能的核苷酸序列變體，基于遺傳密碼子的兼并性，所有這些變體都是可能的?！爱愒础焙怂針?gòu)建體或序列具有在其進行表達的細胞中為非天然的序列部分。關(guān)于調(diào)節(jié)序列，異源指不能天然行使調(diào)控相同基因的職責的調(diào)節(jié)序列(即啟動子或增強子)，而該基因的表達目前正由此調(diào)節(jié)序列調(diào)控。通常，異源核酸序列不是細胞內(nèi)生的，或不是其所存在的基因組的部分，而是通過傳染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等加入細胞。“異源”核酸構(gòu)建體可以含有調(diào)節(jié)序列/DNA編碼序列組合，該組合與天然細胞中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列/DNA編碼序列組合相同或不同。此處所使用的術(shù)語“載體”，指為了在不同宿主細胞之間轉(zhuǎn)移而設計的核酸構(gòu)建體?！氨磉_載體”指具有整合并在外源細胞表達異源DNA片段的能力的載體。許多原核和真核表達載體有商業(yè)供應。選擇合適的表達載體在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。因此，“表達盒”或“表達載體”是重組或合成產(chǎn)生的、含有一系列允許特定核酸在靶細胞轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件的核酸構(gòu)建體。重組表達盒可以整合到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA、病毒或核酸片段中。一般，除了其他序列，表達載體的重組表達盒部分還包括將要得到轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子。此處所使用的術(shù)語“質(zhì)?！?，指作為克隆載體使用的環(huán)形雙鏈DNA構(gòu)建體，在許多細菌和一些真核細胞中形成染色體外的自我復制基因元件。此處所使用的術(shù)語“選擇標志編碼核酸序列”，指能夠在細胞內(nèi)表達的核酸序列，此選擇標志的表達給予含有該表達基因的細胞在相應選擇試劑存在或在相應選擇條件下的生長能力。此處所使用的術(shù)語“啟動子”，指行使指導下游基因轉(zhuǎn)錄職責的核酸序列。啟動子通常適合于目的基因在其中表達的宿主細胞。啟動子及其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列(也稱為“調(diào)節(jié)序列”)對于表達給定基因是必要的?？偠灾?，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括但是不限于啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或激活序列。如此處定義的“嵌合基因”或“異源核酸構(gòu)建體”指可能由包括調(diào)節(jié)元件在內(nèi)的不同基因部分組成的非天然基因(即引入宿主的基因)。用于轉(zhuǎn)化宿主細胞的嵌合基因構(gòu)建體一般含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(增強子)，此轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有效連接于異源蛋白質(zhì)編碼序列，或者在選擇標志嵌合基因中，有效連接于編碼給予轉(zhuǎn)化細胞抗生素抗性的蛋白質(zhì)的選擇標志基因。本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化進入宿主細胞的一個典型嵌合基因，包括組成性的或可誘導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、蛋白質(zhì)編碼序列和終止序列。如果需要分泌目的蛋白，嵌合基因構(gòu)建體也可以包括編碼信號肽的第二DNA序列。當核酸被置于與其他核酸序列的功能關(guān)系當中時，就是“有效連接的”。例如，如果作為參與多肽分泌的蛋白質(zhì)原而表達，編碼分泌性前導序列的DNA有效連接到編碼多肽的DNA；如果影響序列轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子被認為有效連接到編碼序列；或者如果被定位以幫助翻譯，則核糖體結(jié)合位點被認為有效連接于編碼序列。通常，“有效連接的”意味連接的DNA序列是鄰近的，在分泌性前導序列的情況下，是鄰近的并且是按閱讀框連接的。然而，增強子不必是鄰近的。連接通過在便利的限制位點連接得以完成。如果這樣的位點不存在，合成的寡核苷酸接頭、連接子或PCR引物得以按照傳統(tǒng)實踐使用。如此處所使用的，術(shù)語“基因”意為參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA節(jié)段，可以或不可以包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或“前導區(qū)”序列和3′UTR或“尾區(qū)”序列，和編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)?？偠灾幋aCBH I變體的核酸分子將在中到高嚴緊性條件下與此處提供的野生型序列SEQ ID NO1雜交。然而，在某些情況下，持有顯著不同的密碼子利用的CBH I編碼核酸序列得以使用，由該CBH I編碼核酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相同或基本相同的氨基酸序列。例如，根據(jù)特定密碼子被宿主利用的頻率，編碼序列可以得到修飾以幫助CBH I在特定的原核或真核表達系統(tǒng)中更快的表達。例如，Te′o等人(FEMS Microbiology Letters 19013-19，2000)描述了用于在絲狀真菌中表達的基因的優(yōu)化。一個核酸序列可以認為與參考核酸序列是“可以選擇性雜交的”，如果這兩個序列在中到高嚴緊雜交和清洗條件下彼此特異性雜交。雜交條件以核酸結(jié)合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為基礎。例如，“最大嚴緊性”一般出現(xiàn)在約Tm-5℃(探針解鏈溫度Tm的5度以下)；“高嚴緊性”約在Tm之下5-10度；“中度”或“中間嚴緊性”約在探針解鏈溫度的10-20度之下；以及“低嚴緊性”約在解鏈溫度Tm的20-25度以下。功能上，最大嚴緊性條件可以用于鑒定與雜交探針具有嚴格一致性或接近嚴格一致性的序列；而高嚴緊性條件用于鑒定與探針具有80％以上的序列一致性的序列。中度和高度嚴密性雜交條件為本領(lǐng)域所周知(見，例如，Sambrook等人，1989，第九及第十一章，以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，1993，此處明確的引用作為參考)。高嚴緊性條件的一個例子包括在50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性載體DNA中，約42℃雜交，繼之在室溫下以2XSSC和0.5％SDS清洗兩次，以及在42℃以0.1XSSC和0.5％SDS附加清洗兩次。當涉及細胞或載體時，此處所使用的“重組體”包括通過引入異源核酸序列被修飾的細胞或載體，或者從這樣修飾的細胞中衍生的細胞。因此，例如，由于蓄意的人為干預的結(jié)果，重組體細胞表達與細胞的天然形式(非重組)中發(fā)現(xiàn)的不同形式的基因，或者表達天然細胞中異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。涉及細胞時，此處所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”，意為細胞具有整合到其基因組中、或作為游離質(zhì)粒而維持多代的非天然(異源的)核酸序列。此處所使用的術(shù)語“表達”，指以基因的核酸序列為基礎的多肽產(chǎn)生過程。此過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。在將核酸序列插入細胞的上下文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)入的”意為“轉(zhuǎn)染”、或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導”，包括核酸序列在真核或原核細胞中的整合，在這些細胞中，核酸序列可以整合到細胞基因組中(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)、轉(zhuǎn)化為自主復制子、或得到瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。隨后的術(shù)語“CBH I表達”指cbh I基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽及其衍生物，包括相關(guān)物種的CBH I，例如康寧木霉(Trichoderma koningii)、紅褐肉座菌(也已知為長枝木霉、瑞氏木霉或綠色木霉(Trichoderma viride))和Hypocrea schweinitzii。作為實例，CBH I表達的檢驗包括CBH I蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析、Northern印跡分析和CBH I mRNA的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢驗、以及內(nèi)切葡聚糖酶活性試驗，如ShoemakerS.P.和Brown R.D.Jr.(Biochim.Biophys.Acta，1978，523133-146)以及Schulen(Methods Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)中所說明。術(shù)語“可變剪接”指從單基因產(chǎn)生多種多肽同種型的過程，包括在加工一些但不是全部基因轉(zhuǎn)錄本的過程中將非連續(xù)外顯子剪接到一起。因此，一個特定的外顯子可以與任何一個或幾個可變的外顯子連接，形成信使RNA。可變剪接的mRNA產(chǎn)生部分相同而其他部分不同的多肽(“剪接變體”)。術(shù)語“信號序列”指位于蛋白質(zhì)N末端部分幫助成熟形式的蛋白質(zhì)分泌到細胞外的氨基酸序列。細胞外蛋白質(zhì)的成熟形式缺少在分泌過程中被剪切掉的信號序列。術(shù)語“宿主細胞”意指含有載體并支持該表達構(gòu)建體復制、和/或轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達)的細胞。用于本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母、植物、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞)。一般而言，宿主細胞是絲狀真菌。術(shù)語“絲狀真菌”指被本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員識別的任何和所有絲狀真菌。優(yōu)選的真菌選自曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬、金孢子菌屬(Chrysosporium)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、脈孢菌屬(Neurospora)或其選擇性的有性形式，例如裸孢殼屬(Emericella)、肉座菌屬(Hypocrea)。已經(jīng)證實，無性生殖的真菌瑞氏木霉是子囊菌紅褐肉座菌的無性繁殖系。見KuhIs等人，PNAS(1996)937755-7760。術(shù)語“纖維寡糖”指含有2-8個葡萄糖單元、并具有β-1，4聯(lián)接的寡糖族，例如纖維二糖。術(shù)語“纖維素酶”指能夠?qū)⒗w維素聚合體水解為較短的纖維寡糖低聚體、纖維二糖和/或葡萄糖的一類酶。許多纖維素酶的例子(例如外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡糖苷酶)已經(jīng)從分解纖維素的生物(尤其包括真菌、植物和細菌)中獲得。來自紅褐肉座菌的CBH I是糖基水解酶家族7成員(由此而來Cel7)，特別的，它是該家族在紅褐肉座菌中鑒定的第一個成員(由此而來Cel 7A)。糖基水解酶家族7含有內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH I為后者。因此，詞語CBH I、CBHI-型蛋白質(zhì)和Cel7纖維二糖水解酶在此可以互換使用。此處所用術(shù)語“纖維素結(jié)合域”指纖維素酶氨基酸序列中參與纖維素酶或其衍生物的纖維素結(jié)合活性的部分或該酶的一個區(qū)域。纖維素結(jié)合域通常通過將纖維素酶非共價結(jié)合于纖維素、纖維素衍生物或其他多糖等價物而行使其功能。纖維素結(jié)合域允許或幫助由結(jié)構(gòu)獨特的催化中心區(qū)域進行的纖維素纖維的水解，其功能一般不依賴于催化中心。因此，纖維素結(jié)合域不具有屬于催化中心的顯著的水解活性。換言之，纖維素結(jié)合域是纖維素酶蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件，與具有催化活性的結(jié)構(gòu)元件截然不同。纖維素結(jié)合域及纖維素結(jié)合模塊在此處可以互換使用。此處所用術(shù)語“表面活性劑”指被本領(lǐng)域公認的任何具有表面活性性質(zhì)的化合物。因此，例如，表面活性劑包括諸如那些通常發(fā)現(xiàn)于去垢劑中的陰離子、陽離子和非離子表面活性劑。陰離子表面活性劑包括線性或分支烷基苯磺酸鹽；具有直鏈或分支烷基或烯基的烷基或烯基醚硫酸鹽；烷基或烯基硫酸鹽；烯屬磺酸鹽；以及烷基磺酸鹽。兩性表面活性劑包括季銨磺酸鹽和內(nèi)銨鹽型兩性表面活性劑。這種兩性表面活性劑在同一個分子中帶有陽性和陰性電荷基團。非離子表面活性劑可能包括聚氧化亞烷基醚和高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或其氧化烯加合物、脂肪酸甘油單酯等。此處所用術(shù)語“含纖維素織物”指任何縫制的或未縫制的織物、紗、或纖維，它們使用含棉或不含棉纖維素制成，或用含棉或不含棉纖維素摻和物制成，包括天然和人造纖維素制品(例如黃麻、亞麻、苧麻、人造絲和lyocell)。此處所用術(shù)語“含棉織物”指由純棉或包括棉織物、棉線、棉粗斜紋布、棉紗、原棉等棉摻和物制成的、縫制或未縫制的織物、紗或纖維。此處所用術(shù)語“石洗組合物”指用于石洗含纖維素織物的制劑。石洗組合物用于在銷售之前、即制造過程中，修飾含纖維素織物。相反，去垢劑組合物意在清潔污染衣服，不用于制造過程。此處所用術(shù)語“去垢劑組合物”指意在用于污染的含纖維素織物的清洗介質(zhì)中的混合物。在本發(fā)明上下文中，除纖維素酶和表面活性劑之外，這種組合物可能還包括附加的水解酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑、和熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑、纖維素酶活化劑、抗氧化劑和增溶劑。此處所用術(shù)語“cbh1基因表達的減少或消除”意味著cbh1基因從基因組中缺失因此不能由重組宿主微生物表達；或cbh1基因經(jīng)過修飾以致宿主微生物不能產(chǎn)生有功能的CBH1酶。術(shù)語“變體cbh1基因”或“變體CBH1”分別指紅褐肉座菌cbh1基因的核酸序列經(jīng)過刪除、添加和/或操縱編碼序列而改變，或所表達蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過修飾，所作修飾與本發(fā)明在此描述的一致。此處所用術(shù)語“提純”通常指將含有轉(zhuǎn)基因核酸或蛋白質(zhì)的細胞進行生物化學純化和/或柱層析。此處所用術(shù)語“活性”和“生物學活性”，指與特定蛋白質(zhì)有關(guān)的生物學活性，并在此互換使用。例如，與蛋白酶有關(guān)的酶活性是蛋白質(zhì)水解，因此，活性蛋白酶具有水解活性。隨后，特定蛋白質(zhì)的生物學活性指一般由本領(lǐng)域技術(shù)人員歸因于該蛋白質(zhì)的任何生物學活性。此處所用術(shù)語“富集的”意為所發(fā)現(xiàn)的CBH濃度相對大于野生型或天然存在的真菌纖維素酶組合物中所發(fā)現(xiàn)的CBH濃度。野生型真菌纖維素酶組合物是由天然存在的真菌源產(chǎn)生、并包括一個或更多BGL、CBH和EG成分的組合物，其中每種成分以真菌源產(chǎn)生的比率存在。因此，富集的CBH組合物將含有比率改變的CBH，其中CBH對于其他纖維素酶成分(即EG、β-葡糖苷酶和其他內(nèi)切葡聚糖酶)的比率升高?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法增加CBH或降低(或消除)至少一種其他成分，從而提高該比率。因此，為了舉例，可以使用在文獻中充分發(fā)表的公認的分離技術(shù)，包括在合適pH的離子交換層析、親和層析、尺寸排阻等，將天然存在的纖維素酶系統(tǒng)提純?yōu)榛炯兊某煞?。例如，在離子交換層析(通常為陰離子交換層析)中，可以通過pH梯度、或鹽梯度、或pH梯度和鹽梯度兩者洗脫分離纖維素酶成分。純化的CBH于是可以加到酶溶液中，形成富集的CBH溶液。也可以使用分子遺傳學方法過表達CBH編碼基因，提高微生物的CBH I產(chǎn)生量，可以同時借助于缺失一個或更多編碼其他纖維素酶的基因。真菌纖維素酶可以含有一種以上CBH成分。不同成分通常具有不同的等電點，允許其通過離子交換層析等而分離。在酶溶液中，可以使用單獨的CBH成分或CBH成分的組合。用于酶溶液中時，一般以足夠容許從生物物質(zhì)釋放可溶性糖的最高速度的量，添加同系物或變體CBH 1成分。同系物或變體CBH 1成分的添加量依賴于將被糖化的生物物質(zhì)的類型，這是易于被熟練技術(shù)人員確定的。然而，使用時，同系物或變體CBH 1相對于存在于纖維素酶組合物當中的任何EG型成分的重量百分比為自優(yōu)選約1、優(yōu)選約5、優(yōu)選約10、優(yōu)選約15、或優(yōu)選約20重量百分比至優(yōu)選約25、優(yōu)選約30、優(yōu)選約35、優(yōu)選約40、優(yōu)選約45或優(yōu)選約50重量百分比。此外，優(yōu)選的范圍可以為約0.5至約15重量百分比、約0.5至約20重量百分比、從約1至約10重量百分比、從約1至約15重量百分比、從約1至約20重量百分比、從約1至約25重量百分比、從約5至約20重量百分比、從約5至約25重量百分比、從約5至約30重量百分比、從約5至約35重量百分比、從約5至約40重量百分比、從約5至約45重量百分比、從約5至約50重量百分比、從約10至約20重量百分比、從約10至約25重量百分比、從約10至約30重量百分比、從約10至約35重量百分比、從約10至約40重量百分比、從約10至約45重量百分比、從約10至約50重量百分比、從約15至約20重量百分比、從約15至約25重量百分比、從約15至約30重量百分比、從約15至約35重量百分比、從約15至約30重量百分比、從約15至約45重量百分比、從約15至約50重量百分比。
II宿主生物[87]絲狀真菌包括真菌門和卵菌門亞類的所有絲狀形式。絲狀真菌以營養(yǎng)菌絲體為特征，營養(yǎng)菌絲體具有包括幾丁質(zhì)、葡聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、甘露聚糖和其他復雜多糖的細胞壁，通過菌絲延長和專性需氧碳分解代謝進行營養(yǎng)生長。在本發(fā)明中，絲狀真菌母細胞可以是(但是不限于)下列物種之一木霉屬，例如長枝木霉、綠色木霉、康寧木霉、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉屬；腐質(zhì)霉屬(Humicola sp.)，包括Humicola insolens和灰色腐質(zhì)霉(Humicola grisea)；金孢子菌屬，包括C.lucknowense；粘帚霉屬；曲霉屬；鐮刀霉屬、脈孢菌、肉座菌屬，以及裸孢殼霉(Emericella sp.)。此處所用術(shù)語“木霉屬”或“木霉屬物種”指先前或目前分類為木霉屬的任何菌株。在一個優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌母細胞是黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、或構(gòu)巢曲霉細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌母細胞是瑞氏木霉細胞。
III纖維素酶[91]纖維素酶是本領(lǐng)域已知的水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或βD-葡糖苷連接)形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的酶。如前所述，纖維素酶通常分為三個主要類型內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，TIBTECH 5，255-261，1987；Schulen，1988)。某些真菌產(chǎn)生完整的纖維素酶系統(tǒng)，包括外切纖維二糖水解酶或CBH型纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶或EG型纖維素酶和β-葡糖苷酶或BG型纖維素酶(Schulein，1988)。然而，這些系統(tǒng)有時缺乏CBH型纖維素酶，細菌纖維素酶一般也含有很少或沒有CBH型纖維素酶。另外，已有顯示，EG成分和CBH成分協(xié)同作用進而更有效的降解纖維素。見例如Wood，1985。不同成分，即在多組分或完整的纖維素酶系統(tǒng)中的多種內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖水解酶，通常具有不同的特性，例如等電點、分子量、糖基化程度、底物特異性和酶作用模式。認為內(nèi)切葡聚糖酶型纖維素酶水解纖維素低結(jié)晶區(qū)域內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，外切纖維二糖水解酶型纖維素酶從纖維素的還原或非還原末端水解纖維二糖。內(nèi)切葡聚糖酶成分的作用可以產(chǎn)生新的可以被外切纖維二糖水解酶成分識別的鏈末端，而大大幫助外切纖維二糖水解酶的作用。另外，已顯示β-葡糖苷酶型纖維素酶催化烷基和/或芳基β-D-葡糖苷(例如甲基β-D葡萄糖苷和對硝基苯葡糖苷以及纖維二糖這類僅含有糖基的糖苷)的水解。這將葡萄糖作為單一產(chǎn)物而為微生物產(chǎn)生，減少或消除了抑制纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的纖維二糖。也發(fā)現(xiàn)纖維素在去垢劑組合物當中的許多用途，包括增強清潔能力、作為軟化劑和改善棉纖維觸感。(Hemmpel，ITBDyeing/Printing/Finishing 35-14，1991；Tyndall，Textile Chemistand Colorist 2423-26，1992；Kumar等，Textile Chemist and Colorist，2937-42，1997)。雖然此機制并非本發(fā)明的部分，纖維素酶的軟化和色彩保持特性(color restoration property)歸結(jié)于纖維素酶組合物中堿性內(nèi)切葡聚糖酶成分的作用，正如美國專利號5,648,263，5,691,178和5,776,757所示例，這些專利公布了含有纖維素酶組合物的去垢劑組合物，該纖維素酶組合物中富集了指定的堿性內(nèi)切葡聚糖酶成分，與沒有富集該成分的纖維素酶組合物相比，為服裝的處理賦予了色彩保持和改進的軟化性能。另外，在去垢劑組合物中使用這類堿性內(nèi)切葡聚糖酶成分，顯示彌補了去垢劑組合物的pH要求(例如，如美國專利號5,648,263，5,691,178和5,776,757中所說明，在7.5至10的堿性pH展現(xiàn)出最大活性)。也已顯示，纖維素酶組合物降解含棉纖維，引起纖維強度損失的降低(美國專利號4,822,516)，導致在商業(yè)清潔劑中纖維素酶組合物應用的不暢。已有提示，與包括完整纖維素酶系統(tǒng)的組合物相比，包括內(nèi)切葡聚糖酶成分的纖維素酶組合物顯示含棉纖維強度損失的降低。還有顯示纖維素酶在將纖維素生物物質(zhì)降解為乙醇(其中纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖，酵母或其他微生物另外將葡萄糖發(fā)酵為乙醇)、木漿處理(Pere等，1996)、作為飼料添加劑(WO 91/04673)和谷物濕磨中是有用的。多數(shù)CBH和EG具有由核心域組成的多域結(jié)構(gòu)，該核心域通過連接肽與纖維素結(jié)合域(CBD)分離(Suurnakki等人，2000)。核心域含有活性位點，CBD通過將酶與纖維素結(jié)合而與纖維素相互作用(vanTilbeurgh等，1986；Tomme等，Eur.J.Biochem.170575-581，1988)。CBD在晶體纖維素的水解中尤其重要。已經(jīng)顯示，當CBD缺失時，纖維二糖水解酶降解晶體纖維素的能力明顯降低(Linder和Teeri，J.Biotechnol.5715-28，1997)。然而，CBD的確切角色和作用機制仍然是假設。有提示說CBD僅僅是通過在纖維素表面增加效應酶濃度而增強了酶活性(Stahlberg等，Bio/Technol.9286-290，1991)，和/或通過從纖維素表面松弛單纖維素鏈而增強酶活性(Tormo等，EMBO J.vol.15，no.21，pp.5739-5751，1996)。由于其核心蛋白質(zhì)能夠通過使用木瓜蛋白酶限制性蛋白質(zhì)水解(Tomme等，1988)而輕松的產(chǎn)生，大部分關(guān)注纖維素酶結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌孜锏淖饔玫难芯恳呀?jīng)使用纖維二糖水解酶的核心蛋白質(zhì)進行。眾多纖維素酶已在科學文獻中加以說明，其示例包括瑞氏木霉的纖維素酶Shoemaker，S.等人，Bio/Technology，1691-696，1983，公布CBHI；Teeri，T.等，Gene，5143-52，1987，公布CBHII。來自木霉之外的種類的纖維素酶也得到說明，例如，Ooi等，Nucleic Acids Research，vol.18，no.19，1990公布了由棘孢曲霉產(chǎn)生的、編碼內(nèi)切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，Gene173(2)287-8，996，公布了來自棘孢曲霉的、編碼β-葡糖苷酶1的cDNA克隆和序列；Sakamoto等，Curr.Genet.27435-439，1995，公布了來自白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的、編碼內(nèi)切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；Saarilahti等，Gene 909-14，1990，公布了來自胡蘿卜歐文菌(Erwinia carotovara)的內(nèi)切葡聚糖酶；Spilliaert R等人，Eur J Biochem.224(3)923-30，1994，公布了來自Rhodothermus marinu的、編碼熱穩(wěn)定的β-葡聚糖酶的bgIA的克隆和測序；以及Halldorsdottir S等，Appl Microbiol Biotechnol.49(3)277-84，1998，公布一個來自糖基水解酶家族12的、編碼熱穩(wěn)定纖維素酶的Rhodothermus marinus基因的克隆、測序和過表達。然而，仍然需要對具有改善特征(例如在熱應激條件下或存在表面活性劑的條件下改善的性能、增加的特異性活性、改變的底物剪切模式、和/或體外高水平表達)的新纖維素酶進行鑒定和特征描述。包括不同量CBH型、EG型、和BG型纖維素酶的改進的新型纖維素酶組合物的發(fā)展，目的用于(1)在顯示出增強的清潔能力的去垢劑組合物中，作為軟化劑行使功能，和/或改善棉織物觸感(“石洗”或“生物磨光(biopolishing)”)；(2)用于將木質(zhì)紙漿或其他生物物質(zhì)降解為糖(例如，用于生物酒精生產(chǎn))；和/或(3)用于飼料組合物。
IV分子生物學[99]在一個實施方案中，本發(fā)明提供變體CBH I基因的表達，該表達處于在絲狀真菌中具有功能的啟動子的控制之下。因此，本發(fā)明依賴于重組基因?qū)W中的常規(guī)技術(shù)。公布本發(fā)明中使用的普通方法的基礎課本，包括Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；以及Ausubel等，eds.，Current Protocols in MolecularBiology(1994)。
A鑒定同源CBH1基因的方法[100]野生型紅褐肉座菌CBH1的核酸序列顯示于圖1中。本發(fā)明一個方面包括此處所述之編碼CBH 1同系物的核酸分子。該核酸分子可以是DNA分子?？梢杂糜诜蛛x編碼CBH I的DNA序列的技術(shù)廣為本領(lǐng)域所知，包括但是不限于使用同源DNA探針的cDNA和/或基因組文庫篩選、以及使用活性試驗或抗CBH I抗體的表達篩選。這些方法中的任何都可以發(fā)現(xiàn)于Sambrook等或在Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).Ausube等，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，紐約(1987)(“Ausubel”)。
B CBH I核酸序列的突變方法[102]本發(fā)明考慮任何本領(lǐng)域已知可以引入突變的方法。本發(fā)明涉及變體CBH 1的表達、純化和/或分離及應用。優(yōu)選通過利用來自紅褐肉座菌cbh基因的重組方法制備這些酶。分離和克隆來自紅褐肉座菌的cbh 1基因后，使用例如定點誘變等其他本領(lǐng)域已知的方法，造成與所表達的CBH 1變體中替代的氨基酸相對應的置換、添加或缺失。再次說明，定點誘變和其他在DNA水平引入氨基酸改變的方法可以在Sambrook等和Ausubel等的著作中找到。使用多種本領(lǐng)域已知的方法制備編碼紅褐肉座菌CBH1氨基酸序列變體的DNA。這些方法包括但是不限于定點誘變(或寡核苷酸介導的)、PCR誘變和早期制備的編碼紅褐肉座菌CBH1 DNA的盒式誘變。定點誘變是制備置換變體的首選方法。該技術(shù)廣為本領(lǐng)域所知(見，例如Carter等，Nucleic Acids Res.134431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488(1987))。簡而言之，在DNA定點誘變中，首先通過初始DNA單鏈與編碼所需突變的寡核苷酸雜交而改變初始DNA。雜交后，使用DNA聚合酶，以雜交的寡核苷酸為引物，以初始的單鏈DNA為模板，合成完整的第二條鏈。編碼所需突變的寡核苷酸由此整合入產(chǎn)生的雙鏈DNA中。PCR誘變也適于制造初始多肽(即紅褐肉座菌CBH1)的氨基酸序列變體。見Higuchi，PCR Protocols，pp.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette等，Nuc.Acids Res.17723-733(1989)。還有例如Cadwell等，PCR Methods and Applications，Vol 2，28-33(1992)。簡而言之，當在PCR中使用小量模板DNA作為初始材料時，可以使用與模板DNA相應區(qū)域有微小差異的引物來產(chǎn)生相對大量的特定DNA片段，該DNA片段僅在引物與模板具有差異的位點不同于模板。另一個制備變體的方法盒式誘變，以Wells等，Gene 34315-323(1985)中所描述的方法為基礎。初始材料是含有將被突變的初始多肽DNA的質(zhì)粒。確定初始DNA中將被突變的密碼子。在確定的突變位點的每一側(cè)，必須具有唯一的限制性核酸內(nèi)切酶位點。如果不存在這樣的限制性位點，可以通過上述寡核苷酸介導的突變方法將其引入到初始多肽DNA中合適的位點。在這些位點切割質(zhì)粒DNA使其線性化。使用標準程序合成編碼限制性位點之間、但是含有所需突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸，其中的寡核苷酸雙鏈為分別合成，并使用標準技術(shù)將其雜交在一起。該雙鏈即為所提到的盒。將該盒設計為具有與線性質(zhì)粒末端相容的5′和3′末端，以致其可以直接與質(zhì)粒連接。該質(zhì)?，F(xiàn)在含有突變的DNA序列。作為替代或補充，可以確定編碼變體CBH I所需的氨基酸序列，并可以合成產(chǎn)生編碼這樣的氨基酸序列變體的核酸序列。這樣制備的變體CBH I常?？梢砸蕾嚴w維素酶的使用目的進行更多修飾。這些修飾可以涉及氨基酸序列的更多變化、異源多肽的融合和/或共價修飾。
V cbh1核酸及CBH1多肽A變體cbh型核酸[111]野生型紅褐肉座菌CBH I核酸序列顯示于圖1中。本發(fā)明包括此處所描述之編碼變體纖維素酶的核酸分子。核酸可以是DNA分子。分離和克隆CBH I后，使用例如定點誘變等其他本領(lǐng)域已知的方法，造成與所表達的CBH I變體中替代的氨基酸相對應的置換、添加或缺失。再次說明，定點誘變和其他在DNA水平引入氨基酸改變的方法可以在Sambrook等人和Ausubel等人的著作中找到。將編碼CBH 1變體的DNA序列克隆到DNA構(gòu)建體當中后，使用該DNA轉(zhuǎn)化微生物。根據(jù)本發(fā)明，為了表達變體CBH 1的目的而被轉(zhuǎn)化的微生物，可以有利的包括得自木霉屬的菌株。因此，根據(jù)本發(fā)明，制備變體CBH 1纖維素酶的優(yōu)選模式包括使用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化木霉屬宿主細胞，該構(gòu)建體包括至少一個編碼部分或全部的變體CBH 1的DNA片段。DNA構(gòu)建體通常功能性附著于啟動子。轉(zhuǎn)化的宿主細胞于是在允許表達所需蛋白質(zhì)的條件下生長。隨后，將所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物純化為基本同質(zhì)。然而，事實上，編碼變體CBH 1的特定DNA的最佳表達媒介物可能不同于紅褐肉座菌。因此，也許在與變體CBH 1的來源生物具有系統(tǒng)發(fā)生相似性的轉(zhuǎn)化宿主中表達蛋白質(zhì)最為有利。在一個備選實施方案中，可以使用黑曲霉作為表達媒介。使用黑曲霉的轉(zhuǎn)化技術(shù)，參見WO98/31821，其中所公布的內(nèi)容在此完全引用作為參考。因此，僅出于說明目的提供關(guān)于木霉屬物種表達系統(tǒng)的說明，并作為本發(fā)明表達變體CBH 1的一個選擇。然而，如果合適，一個本領(lǐng)域技術(shù)人員可以傾向于在不同的宿主細胞中表達編碼CBH 1的DNA，而且應當理解，在確定最佳的表達宿主中，應當考慮變體CBH 1的來源。另外，本領(lǐng)域的熟練工人能夠利用本領(lǐng)域可利用的工具、通過常規(guī)技術(shù)為特定基因選擇最佳表達系統(tǒng)。
B變體CBH 1多肽[116]野生型紅褐肉座菌CBH I的氨基酸序列顯示于圖1。變體CBH I多肽包括某位點的置換或缺失，該位點對應于紅褐肉座菌CBH I的下列一個或多個殘基S8、Q17、G22、T41、N49、S57、N64、A68、A77、N89、S92、N103、A112、S113、E193、S196、M213、L225、T226、P227、T246、D249、R251、Y252、T255、D257、D259、S278、S279、K286、L288、E295、T296、S297、A299、N301、E325、T332、F338、S342、F352、T356、T371、T380、Y381、V393、R394、S398、V403、S411、G430、G440、T445、T462、T484、Q487和P491。此外，變體可以另外包括對應于紅褐肉座菌CBH I的殘基382-393的缺失。本發(fā)明中的變體CBH I具有衍生自前體CBH I氨基酸序列的氨基酸序列。CBH I變體的氨基酸序列通過前體氨基酸序列的一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而有別于前體CBH I氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，前體CBH I是紅褐肉座菌CBH I。紅褐肉座菌CBH I的成熟氨基酸序列顯示于圖1中。因此，本發(fā)明針對的CBH I變體，在位點上具有與紅褐肉座菌CBH I特別確定的殘基等價的氨基酸殘基。如果CBH I同系物的殘基(氨基酸)與紅褐肉座菌CBH I的特定殘基或殘基的一部分同源(即，與一級或三級結(jié)構(gòu)中的位置相對應)、或功能類似(即，具有相同或相似的化學或結(jié)構(gòu)結(jié)合、反應或相互作用的功能能力)，則該殘基等價于紅褐肉座菌CBHI的殘基。此處使用的編號方式意在與成熟CBH I的氨基酸序列的(如圖1所示)一致。除了在前體CBH I內(nèi)定位之外，此處還鑒定了對應于前體CBH I中造成前體CBH I在熱應激下不穩(wěn)定的氨基酸位點的特定殘基，用于置換或缺失。氨基酸位點號碼(例如+51)指為呈現(xiàn)在圖1中的成熟紅褐肉座菌CBH I指定的號碼。本發(fā)明中變體CBH1具有衍生自前體紅褐肉座菌CBH1氨基酸序列的氨基酸序列。CBH1變體的氨基酸序列通過前體氨基酸序列的一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而有別于前體CBH1氨基酸序列。紅褐肉座菌CBH1的成熟氨基酸序列示于圖1中。因此，本發(fā)明針對的CBH1變體，在位點上具有與紅褐肉座菌CBH1特別確定的殘基等價的氨基酸殘基。如果CBH1變體的殘基(氨基酸)與紅褐肉座菌CBH1的特定殘基或殘基的一部分同源(即，與一級或三級結(jié)構(gòu)中的位置相對應)、或功能類似(即，具有相同或相似的化學或結(jié)構(gòu)結(jié)合、反應或相互作用的功能能力)，則該殘基等價于紅褐肉座菌CBH1的殘基。此處使用的編號方式意在與成熟CBH1的氨基酸序列的(如圖1所示)一致。除了在前體CBH1內(nèi)定位之外，此處還鑒定了對應于前體CBH1中造成前體CBH1在熱應激下不穩(wěn)定的氨基酸位點的特定殘基，用于置換或缺失。氨基酸位點號碼(例如+51)指為呈現(xiàn)在圖1中的成熟紅褐肉座菌CBH1指定的號碼。測定同源性的氨基酸序列比對優(yōu)選使用“序列比較算法”測定?？梢酝ㄟ^例如局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981))、同源性比對算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970))、搜索相似性方法(Pearson和Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 852444(1988))、這些方法的計算機化執(zhí)行(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、視覺檢測或MOE(Chemical Computing Group，Montreal Canada)執(zhí)行用于比較的序列的最佳比對。一個適于確定序列相似性的算法的示例為BLAST算法，該算法在Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中有說明。可以通過國家生物技術(shù)信息中心(<www.ncbi.nlm.nih.gov>)公共獲得執(zhí)行BLAST分析的軟件。此算法包括，首先通過鑒定查詢序列中長度W的字串，當和數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的字串比對時，該字串匹配或滿足一些正值的閾分值T，從而確定高得分序列對(HSP)。這些最初的鄰近命中字串作為起始點去尋找含有這些命中字串的較長的HSP。命中字串沿著進行比較的兩個序列中的每個的方向延伸，只要累積比對分值能夠增加。當如下情況時，命中字串的延伸停止累積比對分值從達到的最大值降低數(shù)量X；累積分值達到或低于零；或到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認值為字串長度(W)11，BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))比對(B)50，期望值(E)10，M′5，N′-4，以及比較兩條鏈。BLAST算法然后對兩個序列的相似性進行統(tǒng)計學分析(見。例如Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST提供的一種相似性度量是最小總概率(the smallestsum probability)(P(N))，該度量表示兩個核苷酸或氨基酸序列隨機發(fā)生匹配的概率。例如，在測試氨基酸序列與蛋白酶氨基酸序列的比較中，如果最小總概率低于約0.1，更優(yōu)選低于約0.01，更優(yōu)選低于約0.001，則認為這個氨基酸序列與該蛋白酶相似。附加的修飾CBH1纖維素酶穩(wěn)定性的特定策略提供如下[123](1)降低主鏈去折疊的熵可以給酶引入穩(wěn)定性。例如，脯氨酸殘基的引入可以通過降低去折疊熵而顯著的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。(見，例如Watanabe等人，Eur.J.Biochem.226277-283(1994))。類似地，甘氨酸殘基沒有β-碳原子，從而比其他許多殘基具有大的多的骨架構(gòu)象自由度。置換甘氨酸，優(yōu)選用丙氨酸，可以降低去折疊熵并增加穩(wěn)定性(見，例如Matthews等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84；6663-6667(1987))。此外，縮短外部環(huán)部分可能增加穩(wěn)定性。已觀察到嗜高熱生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)比其他嗜溫同系物具有更短的外部環(huán)部分(見，例如Russel等人，Current Opinions in Biotechnology 6370-374(1995))。二硫鍵的引入也可以有效的穩(wěn)定不同的三級結(jié)構(gòu)彼此的穩(wěn)定性。因此，在可以接近現(xiàn)有半胱氨酸的位置引入半胱氨酸，或者引入可以形成二硫鍵的半胱氨酸對，可以改變CBH1變體的穩(wěn)定性。(2)通過增加側(cè)鏈疏水性降低內(nèi)部空穴，可以改變酶的穩(wěn)定性。減少內(nèi)部空穴的數(shù)量和體積，通過將疏水相互作用最大化和降低包裝缺陷而增加酶穩(wěn)定性(見，例如Matthews，Ann.Rev.Biochem.62；139-160(1993)；Burley等人，Science 22923-29(1985)；Zuber，Biophys.Chem.29171-179(1988)；Kellis等人，Nature 333784-786(1988))。已知來自嗜熱生物的多聚體蛋白質(zhì)往往比其嗜溫對等物具有更強的疏水性亞基界面，該界面具有更大的表面互補性(Russel等人，見上文)。本原理被認為可以應用于單體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域界面中。能夠通過增加疏水性而改善穩(wěn)定性的特定置換包括賴氨酸到精氨酸、絲氨酸到丙氨酸、以及蘇氨酸到丙氨酸(Russel等人，見上文)。置換為丙氨酸或脯氨酸的修飾可以增加側(cè)鏈尺寸以及由此產(chǎn)生空穴的減少、更佳的包裝和增加的疏水性。降低空穴大小、增加疏水性及改善CBH 1結(jié)構(gòu)域之間界面互補性的置換，可以增加酶的穩(wěn)定性。尤其是使用不同殘基在這些位點對特定殘基進行修飾，能夠改善性能，所使用的殘基選自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之中任何殘基。(3)平衡剛性二級結(jié)構(gòu)(即α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角)中的電荷，可以增加穩(wěn)定性。例如，以天冬氨酸上的負電荷中和螺旋N-末端的部分正電荷，可以增加該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(見，例如Eriksson等，Science 255178-183(1992))。類似的，以正電荷中和螺旋C-末端的部分負電荷可以增加穩(wěn)定性。去除正電荷與β-轉(zhuǎn)角肽鏈N-末端的相互作用，將有效的賦予三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。以非正電荷殘基置換，可以去除不受歡迎的正電荷同存在于轉(zhuǎn)角的酰氨氮的相互作用。(4)引入鹽橋和氫鍵來穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)可能是有效的。例如，離子對相互作用(比如在天冬氨酸或谷氨酸與賴氨酸、精氨酸或組氨酸之間)可以引入強大的穩(wěn)定效應，并且可以用于附著導致改善熱穩(wěn)定性的不同的三級結(jié)構(gòu)元件。另外，帶電殘基/不帶電殘基氫鍵的數(shù)量，以及氫鍵的數(shù)量，通常可以改善熱穩(wěn)定性(見，例如Tanner等，Biochemistry352597-2609(1996))。以天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺置換，可以通過骨架酰胺引入氫鍵。以精氨酸置換，可以改善鹽橋，并將氫鍵引入羰基骨架中。(5)消除不耐熱殘基一般能夠增加熱穩(wěn)定性。例如，在高溫下，天冬酰胺和谷氨酰胺對脫酰氨敏感，半胱氨酸則對氧化敏感。在敏感位點減少這些殘基可以產(chǎn)生增加的熱穩(wěn)定性(Russel等，見上文)。以谷氨酰胺或半胱氨酸之外的任何殘基置換或缺失，都可以通過消除不耐熱殘基而增加穩(wěn)定性。(6)配體結(jié)合的穩(wěn)定或去穩(wěn)定化賦予CBH1變體經(jīng)過修飾的穩(wěn)定性。例如，在應用本發(fā)明的基質(zhì)中，一種成分可以結(jié)合于表面活性劑/CBH1變體特定的熱敏感位點。通過置換修飾該位點，該成分對變體的結(jié)合可能加強或削弱。例如，可以使用苯丙氨酸或酪氨酸置換CBH1結(jié)合裂隙中的非芳香族殘基，從而引入芳香族側(cè)鏈的穩(wěn)定，增加CBH1變體的穩(wěn)定性；其中纖維素底物能夠順利地與芐基環(huán)相互作用。(7)增加任何表面活性劑/熱敏感配體的電負性，可以增加在表面活性劑或熱應激下的穩(wěn)定性。例如，使用苯丙氨酸或酪氨酸置換，可以通過增加對溶劑的屏蔽而增加D(天冬氨酸)殘基的電負性，從而增加穩(wěn)定性。
C抗-CBH抗體[130]本發(fā)明進一步提供抗CBH抗體。該抗體可以是單克隆、多克隆、人源化、雙特異性或異源綴合(heteroconjugate)抗體。制備多克隆抗體的方法是熟練技術(shù)人員已知的。免疫試劑可以是CBH多肽或其融合蛋白。將抗原與在待免疫動物體內(nèi)已知具有免疫原性的蛋白質(zhì)連接，是有用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在標準程序或常規(guī)實驗法的基礎上確定免疫程序。作為選擇，抗CBH抗體可以為單克隆抗體。單克隆抗體可以由動物體內(nèi)被免疫的細胞或者使用重組DNA方法產(chǎn)生。(見，例如Kohler等，Nature，vol.256，pp.495-499，August 7，1975；美國專利號4,816,567)。本發(fā)明的抗CBH抗體可以進一步包括人源化或者人類抗體。術(shù)語“人源化抗體”指非人類(例如鼠)抗體的人源化形式，是嵌合抗體，免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合部分序列)，含有源于非人類抗體的某些部分。非人類抗體的人源化方法廣為本領(lǐng)域所知，如進一步在下述文獻中所詳述Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，vol.332，pp.323-327，1988；及Verhoeyen等，Science，vol.239，pp.1534-1536，1988。產(chǎn)生人類抗體的方法也為本領(lǐng)域所知。見，例如，Jakobovits.A等，Annals New York Academy of Sciences，764525-535，1995及Jakobovits.A，Curr Opin Biotechnol 6(5)561-6，1995。
VI重組CBH1變體的表達[134]本發(fā)明依賴于使用細胞表達變體CBH I，CBH I的表達不要求特殊方法。本發(fā)明提供使用表達載體轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，該表達載體包括編碼變體CBH的核酸序列。培養(yǎng)條件(例如溫度、pH等)是在轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染之前應用于母本細胞、并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的那些條件。在一種方法中，使用表達載體轉(zhuǎn)染絲狀真菌細胞或酵母細胞，該表達載體具有啟動子或有生物學活性的啟動子片段，或者一個或多個(例如一系列)增強子，這些在宿主細胞系中有功能的元件有效連接于編碼CBH的DNA片段，從而使CBH在細胞系中得到表達。
A核酸構(gòu)建體/表達載體[137]天然或合成的編碼CBH I的多核苷酸片段(“CBH I編碼核酸序列”)可以整合到異源核酸構(gòu)建體或載體當中，該異源核酸構(gòu)建體或載體能夠引入絲狀真菌或酵母細胞、并在其內(nèi)復制。此處公布的載體和方法適合在用于CBH I表達的細胞中使用?？梢允褂萌魏屋d體，只要該載體在其轉(zhuǎn)導的細胞中能夠復制并存活。大量合適的載體和啟動子已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且有商業(yè)供應?？寺『捅磉_載體已在Sambrook等，1989；Ausubel FM等，1989；以及Strathern等，The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces，1981中加以說明，每一個都在此明確引用作為參考。對真菌適宜的表達載體在van den Hondel，C.A.M.J.J.等(1991)InBennett，J.W.和Lasure，L.L.(eds.)More GeneManipulations in Fungi.Academic Press，pp.396-428中得到說明。適當?shù)腄NA序列可以通過許多程序插入到質(zhì)?；蜉d體(此處全部稱為“載體”)中。通常，使用標準程序?qū)NA序列插入到適宜的限制內(nèi)切酶位點。這類程序以及有關(guān)的亞克隆程序被認為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)?？梢酝ㄟ^將包括變體CBH I編碼序列的異源核酸構(gòu)建體引入到所選的絲狀真菌菌株而產(chǎn)生包括變體CBH I編碼序列的重組絲狀真菌。一旦獲得所需的變體cbh核酸序列形式，可以通過多種方法對其進行修飾。在包括非編碼側(cè)翼區(qū)的序列處，側(cè)翼區(qū)可以發(fā)生切除、誘變等。因此，可以在自然發(fā)生序列上進行轉(zhuǎn)位(transition)、易位、缺失和插入。所選的變體cbh編碼序列可以根據(jù)廣為人知的重組技術(shù)插入到合適的載體中，并用于轉(zhuǎn)化能夠表達CBH I的絲狀真菌。由于遺傳密碼子的內(nèi)在簡并性，可以使用其他編碼基本相同或功能相當氨基酸序列的核酸序列，以克隆和表達變體CBH I。因此，將編碼區(qū)的這些置換理解為屬于本發(fā)明所涵蓋的序列變體之內(nèi)。任何以及所有這些序列可以按照與此處所述之用于母本CBH I編碼核酸序列的相同方法使用。本發(fā)明還包括含有一個或多個如上所述之編碼變體CBH I核酸序列的重組核酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括正向或反向插入本發(fā)明序列的載體，例如質(zhì)?；虿《据d體。異源核酸構(gòu)建體可以包括下述形式的變體cbh編碼序列(i)分離形式；(ii)與其它編碼序列組合，例如融合蛋白或信號肽編碼序列，其中cbh編碼序列為主要的編碼序列；(iii)與例如內(nèi)含子或控制元件的非編碼序列組合，例如對于編碼基因在合適宿主中的表達有效的啟動子和終止元件，或5′和/或3′非翻譯區(qū)；和/或(iv)在cbh編碼序列為異源基因的載體或宿主環(huán)境中。在本發(fā)明的一個方面，使用異源核酸構(gòu)建體將變體CBH I編碼核酸序列體外轉(zhuǎn)運到細胞中，優(yōu)選確定的絲狀真菌和酵母細胞系。對于長遠生產(chǎn)變體CBH I來說，穩(wěn)定表達是優(yōu)選的。由此得出，任何有效產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的方法都可以用于實踐本發(fā)明。合適的載體一般整合了選擇標志編碼核酸序列、插入位點和適宜的控制元件，例如啟動子和終止序列。載體可以包含對編碼序列在適宜的宿主內(nèi)(和/或在經(jīng)過修飾的可溶性蛋白質(zhì)抗原編碼序列通常不被表達的載體或宿主細胞中)表達有效的調(diào)控序列，例如，包括有效連接于編碼序列的非編碼序列(例如內(nèi)含子和控制元件，即啟動子和終止元件，或5′和/或3′非翻譯區(qū))。大量適宜的載體和啟動子廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，其中，許多有商品提供，和/或由Sambrook等描述(見上文)。示范啟動子包括組成性啟動子和可誘導啟動子，其例子包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、RSV啟動子、EF-1α啟動子、含有所述(ClonTech and BASF)tet-on或tet-off系統(tǒng)中tet反應元件(TRE)的啟動子、β肌動蛋白啟動子、以及可以通過增加某些金屬鹽而上調(diào)的金屬硫蛋白啟動子。啟動子序列是為了表達目的由特定絲狀真菌識別的DNA序列。它有效連接于編碼變體CBH I多肽的DNA序列。這些連接包括，在公布的表達載體中，啟動子相對于編碼變體CBH I多肽的DNA序列起始密碼子進行定位。啟動子序列含有轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，介導變體CBH I多肽的表達。實例包括來自黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶編碼基因；構(gòu)巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脈孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶編碼基因；紅褐肉座菌(瑞氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纖維素酶編碼基因的啟動子。選擇適宜的選擇標志依賴于宿主細胞，適合于不同宿主的標志廣為本領(lǐng)域所知。通常的選擇標志基因包括來自構(gòu)巢曲霉或瑞氏木霉的argB、來自構(gòu)巢曲霉的amdS、來自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)或瑞氏木霉的pyr4、以及來自黑曲霉或構(gòu)巢曲霉的pyrG。附加的示范選擇標志包括但是不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，他們包括在用于轉(zhuǎn)化諸如trp-，pyr-，leu-等突變株的異源核酸構(gòu)建體中。這些選擇標志賦予轉(zhuǎn)化子利用通常不被絲狀真菌所代謝的代謝物的能力。例如，來自紅褐肉座菌、編碼乙酰胺酶的amdS基因，允許轉(zhuǎn)化子細胞以乙酰胺為氮源并在其上生長。選擇標志可以恢復營養(yǎng)缺陷型突變株在選擇性基本培養(yǎng)基上生長的能力，或者該選擇標志可以賦予轉(zhuǎn)化子在抑制性藥物或抗生素上生長的能力。使用本領(lǐng)域通常使用的方法將選擇標志編碼序列克隆到任何適宜的質(zhì)粒中。示范質(zhì)粒包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX質(zhì)粒含有來自構(gòu)巢曲霉的AMA1序列，使其能夠在黑曲霉中復制。除非另外說明，本發(fā)明的實施將使用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的傳統(tǒng)的分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中得到充分解釋。例如，見Sambrook等，1989；Freshney，Animal CellCulture，1987；Ausubel等，1993；以及Coligan等，Current Protocolsin Immunology，1991。
B CBH1生產(chǎn)的宿主細胞和培養(yǎng)條件(i)絲狀真菌[150]本發(fā)明提供絲狀真菌，相對于相應的非轉(zhuǎn)化母本真菌而言，該絲狀真菌經(jīng)過修飾、選擇并以有效方式培養(yǎng)以導致變體CBH I的生產(chǎn)或表達。可以為變體CBH I表達而處理和/或修飾的母本絲狀真菌種類的例子包括但是不限于木霉屬，例如瑞氏木霉、長枝木霉、綠色木霉、康寧木霉；青霉屬、腐質(zhì)霉屬，包括Humicola insolens；曲霉屬、金孢子菌屬、鐮刀霉屬、肉座菌屬和裸孢殼霉屬。在通常用來培養(yǎng)母本真菌系的條件下培養(yǎng)CBH I表達細胞。一般而言，細胞在含有生理鹽分和營養(yǎng)素的標準培養(yǎng)基(例如在Pourquie，J.等，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.，Aubert，J.P.等，Academic Press，pp.71-86，1988和IImen，M.等，Appl.Environ.Microbiol.631298-1306，1997中所描述)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件也是標準的，例如，培養(yǎng)物在振蕩培養(yǎng)器或發(fā)酵罐中，于28℃培養(yǎng)直至達到所需的CBH I表達水平。給定絲狀真菌的優(yōu)選培養(yǎng)條件可以在科學文獻和/或從真菌來源(例如American Type Culture Collection，(ATCC；http://www.atcc.Org))中尋找到。真菌生長建立之后，細胞暴露于有效引起或允許變體CBH I表達的條件中。在CBH I編碼序列處于可誘導啟動子控制的情況下，將誘導試劑(例如糖、金屬鹽或抗生素)以誘導CBH I表達的有效濃度添加到培養(yǎng)基中。在一個實施方案中，菌株包括對于獲得過表達蛋白質(zhì)有用的黑曲霉。例如，已知黑曲霉泡盛變種(A.niger var.awamori)dgr246分泌提高量的分泌性纖維素酶(Goedegebuur等，Curr.Genet(2002)4189-98)。黑曲霉泡盛變種的其他菌株(例如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4)也是已知的。Ward等(Ward，M，Wilson，L.J.和Kodama，K.H.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743)。在其他實施方案中，菌株包括對于獲得過表達蛋白質(zhì)有用的瑞氏木霉。例如，由Sheir-Neiss等在Appl.Microbiol.Biotechnol.2046-53(1984)中描述的RL-P37，已知分泌提高量的纖維素酶。RL-P37的功能等價物包括瑞氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)?？梢灶A期，這些菌株也將在過表達變體CBH1中有用。當需要在沒有潛在危害的天然纖維素水解活性存在下獲得變體CBH I時，獲得木霉菌宿主細胞系是有用的，其中在引入含有編碼變體CBH I的DNA片段的DNA構(gòu)建體或質(zhì)粒之前，該細胞系的一個或多個纖維素酶基因被缺失。這些菌株可以通過在美國專利號5,246,853和WO92/06209中說明的方法制備，在此引用該專利的公開內(nèi)容作為參考。在缺少一個或多個纖維素酶基因的微生物中表達變體CBH I纖維素酶，簡化了鑒定及后續(xù)的純化程序。可以缺失任何來自木霉的克隆基因，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因，以及那些編碼EGIII和/或EGV蛋白質(zhì)的基因(分別見，例如美國專利號5,475,101和WO 94/28117)。可以使用本領(lǐng)域已知的方法，通過把將被缺失或斷裂的所需基因的一種形式插入到質(zhì)粒中，從而實現(xiàn)基因缺失。缺失質(zhì)粒于是在適宜的限制酶切位點被切割，該限制酶切位點在所需基因編碼區(qū)內(nèi)部，該基因編碼序列或其部分由選擇標志替代。來自將被缺失或斷裂的基因所在座位的側(cè)翼序列，優(yōu)選在約0.5至2.0kb之間，保持在選擇標志基因的兩側(cè)。適宜的缺失質(zhì)粒通常具有獨特的限制性酶位點，能夠使含有缺失基因的片段(包括側(cè)翼DNA序列)和選擇標志基因以單個線性片段被除去。必須對選擇標志進行選擇，從而可以檢測轉(zhuǎn)化微生物。在所選微生物中表達的任何選擇標志基因?qū)⑹呛线m的。例如，對于曲霉屬物種，對選擇標志進行選擇，以使選擇標志在轉(zhuǎn)化子中的存在不顯著影響其性質(zhì)。這樣的選擇標志可以是編碼可檢測產(chǎn)物的基因。例如，可以使用這樣的曲霉基因的功能拷貝，如果在宿主菌株中缺乏該拷貝會導致宿主菌株表現(xiàn)營養(yǎng)缺陷表型。類似的，存在用于木霉的選擇標志。在一個實施方案中，使用功能性pyrG基因轉(zhuǎn)化曲霉屬的pyrG-衍生菌株，該基因從而為轉(zhuǎn)化提供選擇標志。通過選擇具有氟乳清酸(FOA)抗性的曲霉屬菌株獲得pyr-衍生菌株。pyrG基因編碼乳清苷-5′-單磷酸脫羧酶，該酶是尿苷合成所需的。含有完整pyrG基因的菌株在缺乏尿苷的培養(yǎng)基上生長，但是對氟乳清酸敏感。通過選擇FOA抗性而選擇pyrG-衍生菌株是可能的，該pyrG-擴衍生菌株缺乏功能性乳清苷單磷酸脫羧酶，生長需要尿苷。使用FOA選擇技術(shù)，也可能獲得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、需要尿苷的菌株。使用編碼該酶基因的功能性拷貝轉(zhuǎn)化這些細胞是可能的(Berges和Barreau，Curr.Genet.19359-365(1991)，以及van Hartingsveldte等，(1986)Development ofa homologous transformation system for Aspergillus niger based onthe pyrG gene.Mol.Gen.Genet.20671-75)。使用上文中提及的FOA抗性技術(shù)，容易執(zhí)行衍生菌株的選擇，因此，優(yōu)選使用pyrG基因作為選擇標志。在另一個實施方案中，使用功能性pyr4基因轉(zhuǎn)化肉座菌(肉座菌物種(木霉屬))的pyr4-衍生株，該基因由此為轉(zhuǎn)化提供了選擇標志。pyr4-衍生株可以通過選擇具有氟乳清酸(FOA)抗性的肉座菌(木霉屬)菌株而獲得。pyr4基因編碼乳清苷-5′-單磷酸脫羧酶，該酶是尿苷的生物合成所需要的。具有完整pyr4基因的菌株在缺乏尿苷的培養(yǎng)基上生長，但是對氟乳清酸敏感。可以通過選擇FOA抗性而選擇缺乏功能性乳清苷單磷酸脫羧酶、生長需要尿苷的pyr4-衍生菌株。使用FOA選擇技術(shù)，也可以獲得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、需要尿苷的菌株。使用編碼該酶的基因的功能性拷貝轉(zhuǎn)化這些細胞也是可能的(Berges及Barreau，Curr.Genet.19359-365(1991))。衍生菌株的選擇很容易使用上文涉及的FOA抗性技術(shù)而進行，因此，作為選擇標志使用的基因優(yōu)選為pyr4基因。為了轉(zhuǎn)化pyrG-曲霉或pyr4-肉座菌(木霉)以缺失表達一種或多種纖維素酶基因的能力，包含斷裂或缺失的纖維素酶基因的單DNA片段于是從缺失質(zhì)粒中分離，并用于轉(zhuǎn)化適宜的pyr-曲霉或pyr-木霉宿主?；谵D(zhuǎn)化子分別表達pyrG或pyr4基因產(chǎn)物，從而彌補宿主菌株營養(yǎng)缺陷型的能力將其鑒定并選擇。在產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子上進行蛋白質(zhì)雜交分析，以識別并確認雙交換整合事件，該雙交換整合事件用適宜的pyr選擇標志替代了待缺失的基因的基因組拷貝編碼區(qū)的部分或全部。盡管上文描述的特定質(zhì)粒載體涉及pyr-轉(zhuǎn)化子的制備，本發(fā)明不限于這些載體。使用上述技術(shù)，可以在曲霉或肉座菌(木霉)菌株中缺失和取代多種基因。另外，可以使用前文所討論的任何可利用的選擇標志。實際上，任何被克隆并確定的宿主(例如曲霉或肉座菌)基因，可以使用前述策略從基因組中缺失。如前文所聲明，使用的宿主菌株可以從肉座菌(木霉)衍生，該宿主菌株缺乏或具有與選擇標志相應的非功能基因。例如，如果為曲霉選擇pyrG為選擇標志，則使用特定的pyrG-衍生株作為轉(zhuǎn)化程序中的受體。同樣，例如，如果為肉座菌選擇pyr4為選擇標志，則使用特定的pyr4-衍生株作為轉(zhuǎn)化程序中的受體。類似的，可以使用含有與構(gòu)巢曲霉amdS、argB、trpc、niaD基因相當?shù)娜庾?木霉)基因的選擇標志。相應的受體株因此必須分別為諸如argB-、trpC-、niaD-之類衍生株系。制備編碼CBH I變體的DNA，用于插入到合適的微生物中。根據(jù)本發(fā)明，編碼CBH I變體的DNA包括對于編碼具有功能性纖維素水解活性的蛋白質(zhì)所必需的DNA。編碼CBH I變體的DNA片段可以功能地附著于真菌啟動子序列，例如，曲霉glaA基因或木霉cbh1或egl 1基因的啟動子?？梢灶A見，不止一種編碼CBH I變體的DNA拷貝可以重組入菌株中幫助過表達。可以使用攜帶編碼變體的DNA的表達載體構(gòu)建體制備編碼CBH I變體的DNA。攜帶插入的CBH I變體編碼DNA片段的表達載體可以是能夠在給定宿主微生物中自主復制、或者是可以整合到宿主DNA中的任何載體，一般為質(zhì)粒。在優(yōu)選的實施方案中考慮兩類表達載體來實現(xiàn)基因表達。第一類含有的DNA序列中啟動子、基因編碼區(qū)以及終止序列均源于將要表達的基因。如果需要，可以缺失不需要的DNA序列(例如編碼不必要結(jié)構(gòu)域的)使基因截短，從而使待表達的結(jié)構(gòu)域處于它自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列控制下。載體上也可以含有選擇標志，從而允許對多拷貝新基因序列整合進入宿主的事件進行選擇。第二類表達載體經(jīng)過預裝配，并含有高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和選擇標志序列。預計基因或其部分的編碼區(qū)可以插入到此用于通用目的的表達載體中，所以處于表達盒啟動子和終止序列的控制下。例如，在曲霉中，pRAX就是這樣的通用目的表達載體?；蚧蚱洳糠挚梢圆迦氲綇奼laA啟動子的下游。例如，在肉座菌中，pTEX就是這樣的通用目的表達載體?；蚧蚱洳糠挚梢圆迦氲綇奵bh 1啟動子的下游。在此載體中，本發(fā)明的編碼CBH I變體的DNA序列應該與轉(zhuǎn)錄和翻譯序列(即按閱讀框與結(jié)構(gòu)基因連接的合適的啟動子序列和信號序列)有效連接。啟動子可以是在宿主細胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以得自編碼與宿主細胞同源或異源蛋白質(zhì)的基因。可選的信號肽為CBH I變體的細胞外生產(chǎn)作準備。信號序列的編碼DNA優(yōu)選與將表達的基因具有天然關(guān)聯(lián)，然而，本發(fā)明中考慮使用來自任何合適來源的信號序列，例如，來自木霉的外切纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶。用于將本發(fā)明的變體CBH I DNA編碼序列連接到啟動子、并且插入到合適載體的程序，廣為本領(lǐng)域所知。可以根據(jù)已知技術(shù)(例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、微注射、微穿孔、生物彈轟擊等)，將前文描述的DNA載體或構(gòu)建體導入宿主細胞。在優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)中，必須考慮到肉座菌(木霉)細胞壁對DNA的通透性非常低。因此，所需DNA序列、基因或基因片段的攝取充其量也是最小限度的。許多方法在轉(zhuǎn)化步驟之前在衍生菌株(即缺乏與所用的選擇標志相應的功能性基因)中增加肉座菌(木霉)細胞壁的通透性。本發(fā)明中制備用于轉(zhuǎn)化的曲霉或肉座菌(木霉)的優(yōu)選方法包括從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。見Campbell等，Improvedtransformation efficiency of A.niger using homologous niaD genefor nitrate reductase.Curr.Genet.1653-56；1989。菌絲體可以從萌發(fā)的、具有生長力的孢子獲得。使用消化細胞壁而產(chǎn)生原生質(zhì)體的酶處理菌絲體。原生質(zhì)體由于懸浮介質(zhì)中存在滲透穩(wěn)定劑而得到保護。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鈉、硫酸鎂等。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M至1.2M之間變化。在懸浮介質(zhì)中優(yōu)選使用約1.2M山梨醇溶液。宿主菌株(曲霉或肉座菌(木霉))對DNA的攝取，依賴于鈣離子濃度。在攝取溶液中通常使用約10mM CaCl2至50mM CaCl2。在攝取溶液中除了鈣離子之外，其他通常包括的是緩沖系統(tǒng)，例如TE緩沖液(10MmTris，pH 7.4；1mM EDTA)，或10mM嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)的pH 6.0緩沖液以及聚乙二醇(PEG)。確信聚乙二醇使細胞膜融合，從而允許介質(zhì)中的成分運送入宿主細胞(例如曲霉或肉座菌菌株)的細胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)運到核。該融合常常使多拷貝質(zhì)粒DNA溫和整合到宿主染色體中。在轉(zhuǎn)化中，通常使用含有密度為105至106/mL、優(yōu)選2×105/mL曲霉原生質(zhì)體或經(jīng)過通透性處理的細胞懸浮液。類似地，在轉(zhuǎn)化中，通常使用含有密度為108至109/mL、優(yōu)選2×108/mL肉座菌(木霉)原生質(zhì)體或經(jīng)過通透性處理的細胞懸浮液。將這種原生質(zhì)體或細胞的合適溶液(例如1.2M山梨醇；50mM CaCl2)100μl體積，與所需DNA混合。通常將高濃度PEG添加到攝取溶液中?？梢韵蛟|(zhì)體懸浮液中添加0.1至1體積的25％PEG 4000。然而，優(yōu)選向原生質(zhì)體懸浮液中添加0.25體積。也可以向攝取溶液中添加二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等添加劑以幫助轉(zhuǎn)化。通常，混合物在約0℃孵育10至30分鐘時間。然后向混合物中添加PEG進一步加強所需基因或DNA序列的攝取。通常以轉(zhuǎn)化混合物體積的5至15倍加入25％PEG 4000；然而，更多或更少的體積也可以是合適的。25％PEG 4000優(yōu)選為轉(zhuǎn)化混合物體積的10倍。添加PEG后，在添加山梨醇和CaCl2溶液之前，將轉(zhuǎn)化混合物在室溫或于冰上孵育。于是進一步將原生質(zhì)體懸浮液添加到熔化的分裝生長培養(yǎng)基中。該生長培養(yǎng)基只允許轉(zhuǎn)化子生長。在本發(fā)明中可以使用適合生長所需轉(zhuǎn)化子的任何生長培養(yǎng)基。然而，如果Pyr+轉(zhuǎn)化子得到選擇，優(yōu)選使用不含尿苷的生長培養(yǎng)基。接著菌落被轉(zhuǎn)移到去除尿苷的生長培養(yǎng)基，并在其上純化。在此階段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子可以通過其較快的生長速率、及其在缺乏尿苷的固體培養(yǎng)基上形成輪廓光滑而非粗糙的圓形菌落而與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子區(qū)分。另外，在有些情況下，在固體非選擇性培養(yǎng)基(即含有尿苷)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，從該培養(yǎng)基上收獲孢子，測定這些將隨后在缺乏尿苷的選擇性培養(yǎng)基上出芽并生長的孢子的百分率，從而實現(xiàn)進一步的穩(wěn)定性檢驗。在上述方法的一個特定的實施方案中，在液體培養(yǎng)基中生長之后，作為CBH I變體合適的翻譯后修飾的結(jié)果，CBH I變體以活性形式從宿主細胞中重新獲得。
(ii)酵母[180]本發(fā)明也考慮使用酵母作為生產(chǎn)CBH I的宿主細胞。其他幾個編碼水解酶的基因已在多個釀酒酵母菌株中表達。這些基因包括編碼兩種內(nèi)切葡聚糖酶(Penttila等，Yeast vol.3，pp 175-185，1987)、兩種纖維二糖水解酶(Penttila等，Gene，63103-112，1988)和一種瑞氏木霉β-葡糖苷酶(Cummings及Fowler，Curr.Genet.29227-233，1996)、出芽短柄霉(Aureobasidlium pullulans)木聚糖酶(Li及Ljungdahl，Appl.Environ.Microbiol.62，no.1，pp.209-213，1996)、小麥α-淀粉酶(Rothstein等，Gene 55353-356，1987)等的基因。另外，編碼溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶(ENDl)、白色腐壞真菌(Phanerochaetechrysosporium)纖維二糖水解酶(CBH1)、瘤胃纖維分解菌(Ruminococcus flavefaciens)纖維糊精酶(cellodextrinase)(CEL1)以及Endomyces flbrilizer纖維二糖酶(Bgl1)的纖維素酶基因盒在一個釀酒酵母實驗室菌株中成功地得到表達(Van Rensburg等，Yeast，vol.14，pp.67-76，1998)。
c將CBH I編碼核酸序列引入宿主細胞[181]本發(fā)明進一步提供經(jīng)過遺傳修飾而包括由外源提供的變體CBHI編碼核酸序列的細胞或細胞組合物。母細胞或細胞系可以使用克隆載體或表達載體進行遺傳修飾(即轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的)。如前文進一步的描述，載體可以是例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可以導致轉(zhuǎn)化載體向絲狀真菌基因組全部或部分的穩(wěn)定整合。然而，也考慮導致保持自我復制的染色體外轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)化。許多標準轉(zhuǎn)染方法可以用于產(chǎn)生表達大量異源蛋白質(zhì)的瑞氏木霉細胞系。一些已發(fā)表的將DNA構(gòu)建體引入產(chǎn)生纖維素酶的木霉菌株的方法，包括Lorito，Hayes，DiPietro及Harman，1993，Curr.Genet.24349-356；Goldman，VanMontagu及Herrera-Estrella，1990，Curr.Genet.17169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen及Knowles，1987，Gene 6155-164，對于曲霉參見Yelton，Hamer及Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474，對于鐮刀霉參見Bajar，Podila及Kolattukudy，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212，對于鏈霉參見Hopwood等，1985，The JohnInnes Foundation，Norwich，UK及對于芽孢桿菌參見Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi及Matteuzzi，1990，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.55135-138。其他用于將異源核酸構(gòu)建體(表達載體)引入絲狀真菌(例如紅褐肉座菌)的方法包括但是不限于使用粒子或基因槍、在轉(zhuǎn)化程序前的絲狀真菌細胞壁通透(例如，通過使用高濃度堿，譬如0.05M至0.4M CaCl2或醋酸鋰)、原生質(zhì)體融合或農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化。通過使用聚乙二醇和CaCl2處理原生質(zhì)體或原生質(zhì)球來轉(zhuǎn)化絲狀真菌的示范方法，在Campbell，E.I.等，Curr.Genet.1653-56，1989和Penttila，M.等，Gene，6311-22，1988中已有說明?？梢允褂萌魏问熘囊龑庠椿蜻M入宿主細胞的程序。這些程序包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、原生質(zhì)體融合、電穿孔、生物彈擊、脂質(zhì)體、微注射、等離子載體(plasma vectors)、病毒載體以及任何其他的廣為人知的用于引導克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遺傳物質(zhì)進入宿主細胞的方法(見，例如Sambrook等，如上文)。在美國專利號No.6,255,115中說明的農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)染也是有用的。唯一必要的是，使用的特定基因工程程序能夠成功引導至少一個基因進入可表達異源基因的宿主細胞。另外，含有變體CBH I編碼核酸序列的異源核酸構(gòu)建體可以在體外轉(zhuǎn)錄，通過廣為人知的方法(例如注射)引導產(chǎn)生的RNA進入宿主細胞。本發(fā)明進一步包括新的有用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，例如用于產(chǎn)生真菌纖維素酶組合物的紅褐肉座菌和黑曲霉。本發(fā)明包括絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，尤其是包括變體CBH I編碼序列或缺失內(nèi)源cbh編碼序列的真菌。在含有變體cbh 1編碼序列的異源核酸構(gòu)建體的引入之后，經(jīng)過遺傳修飾的細胞可以在經(jīng)改良適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或增強變體CBH I編碼核酸序列表達的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(例如溫度、pH等)是先前使用的用于所選細胞表達的條件，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。通常認為，此類異源核酸序列構(gòu)建體所引導進入的細胞的后裔，包含發(fā)現(xiàn)于外源核酸構(gòu)建體中的變體CBH I編碼核酸序列。本發(fā)明進一步包括新的有用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，例如用于產(chǎn)生真菌纖維素酶組合物的紅褐肉座菌。本發(fā)明包括絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，尤其是包括變體cbh 1編碼序列或缺失內(nèi)源cbh編碼序列的真菌。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子通?？梢酝ㄟ^其較快的生長速率、及其在固體培養(yǎng)基上形成輪廓光滑而非粗糙的圓形菌落而與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子區(qū)分。另外，在有些情況下，在固體非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，從該培養(yǎng)基上收獲孢子，測定這些將隨后在選擇培養(yǎng)基上出芽并生長的孢子的百分率，從而進行進一步的穩(wěn)定性檢驗。
VII CBH1核酸編碼序列和/或蛋白質(zhì)表達分析[192]為了評價變體CBH I由使用編碼變體CBH I核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞系的表達，可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平、或使用特異于纖維二糖水解酶活性和/或生產(chǎn)的功能性生物測定法進行試驗。此處所述之變體cbh 1核酸和蛋白質(zhì)序列的示范性申請中，設計經(jīng)過遺傳修飾的絲狀真菌菌株(例如瑞氏木霉)產(chǎn)生增加產(chǎn)量的CBH I。這類經(jīng)過遺傳修飾的絲狀真菌對于產(chǎn)生具有纖維素水解能力大大增加的纖維素酶產(chǎn)物是有用的。在一個方法中，這是通過將cbh1編碼序列引入適宜的宿主(例如，黑曲霉這類絲狀真菌)中而實現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括通過將含有變體CBH I編碼DNA序列的表達載體引入絲狀真菌或其它合適的宿主細胞、從而在絲狀真菌或其他合適的宿主中表達變體CBH I的方法。在另一個方面，本發(fā)明包括改良CBH I在絲狀真菌或其他合適的宿主中表達的方法。這類改良包括內(nèi)源性CBH表達的降低或消除。一般而言，分析變體CBH I表達所使用的檢測法包括Northern印跡雜交、斑點雜交(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應)，或使用適當標記探針的(以核酸編碼序列為基礎)原位雜交和傳統(tǒng)Southern印跡和放射自顯影。另外，變體CBH I的表達和/或生產(chǎn)可以通過例如檢測纖維二糖水解酶活性、表達和/或生產(chǎn)而在樣品中直接得到測定。這類檢測法在例如Becker等，Biochem J.(2001)35619-30和Mitsuishi等，F(xiàn)EBS(1990)275135-138得到說明，每個都在此明確引用作為參考。CBH I水解可溶性或不溶性底物的能力可以使用在Srisodsuk等，J.Biotech.(1997)5749-57及Nidetzky和Claeyssens Biotech.Bioeng.(1994)44961-966中說明的方法測定。對測定纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性有用的底物包括晶體纖維素、濾紙、磷酸溶脹纖維素、纖維寡糖、甲基 形基(umbelliferyl)乳糖苷、甲基 形基纖維二糖苷、正硝基苯基乳糖苷、對硝基苯基乳糖苷、正硝基苯基纖維二糖苷、對硝基苯基纖維二糖苷。另外，蛋白質(zhì)表達可以通過免疫學方法(例如細胞、組織切片的免疫組織化學染色，或免疫檢測組織培養(yǎng)基，如通過Western印跡或ELISA)評價。這類免疫測定可以用于CBH I變體表達的定性和定量評價。這類方法的細節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，許多實行這類方法的試劑有商品供應。純化形式的變體CBH I可以用于產(chǎn)生所表達蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體，以用于多種免疫測定。(見，例如Hu等，Mol Cell Biol.vol.11，no.11，pp.5792-5799，1991)。示范性檢測法包括ELISA、競爭性免疫測定、放射性免疫測定、蛋白質(zhì)印跡、間接免疫熒光測定等。通常，商品提供的抗體和/或試劑盒可以用于纖維二糖水解酶蛋白質(zhì)表達水平的定量免疫測定。
VIII重組CBH I蛋白質(zhì)的分離和純化。通常，細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的變體CBH I蛋白質(zhì)被分泌入培養(yǎng)基，并可得到純化和分離，例如，通過去除來自細胞培養(yǎng)基的不想要的成分。然而，在有些情況下，變體CBH I蛋白質(zhì)可以在促使從細胞裂解液重新獲得的細胞形式中產(chǎn)生。在這類情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)使用的技術(shù)將變體CBH I蛋白質(zhì)從其產(chǎn)生的細胞中純化。實例包括但是不限于親合層析(Tilbeurgh等，F(xiàn)EBS Lett.16215，1984)、離子交換層析(Goyal等，Bioresource Technol.3637-50，1991；Fliess等，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314-318，1983；Bhikhabhai等，J.Appl.Biochem.6336-345，1984；Ellouz等，J.Chromatography396307-317，1987)，包括使用高分辨能力物質(zhì)的離子交換(Medve等，J.Chromatography A 808153-165，1998)，疏水相互作用層析(Tomaz和Queiroz，J.Chromatography A 865123-128，1999)，以及兩相分配法(Brumbauer等，Bioseparation 7287-295，1999)。變體CBH I蛋白質(zhì)一般通過分級來分離具有所選擇的特性(例如，對抗體或受體等特定結(jié)合試劑的結(jié)合親和力)、或具有所選擇的分子量范圍或等電點范圍的蛋白質(zhì)。一旦實現(xiàn)給定的變體CBH I蛋白質(zhì)的表達，由此產(chǎn)生的CBH I蛋白質(zhì)從細胞或細胞培養(yǎng)物中純化。適于這類純化的示范程序包括如下抗體親合柱層析、離子交換層析、乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或諸如DEAE的陽離子交換樹脂層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；以及使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾。可以使用多種蛋白質(zhì)純化方法，這些方法是本領(lǐng)域已知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，vol.182，no.57，pp.779，1990；Scopes，Methods Enzymol.90479-91，1982中說明。所選的純化步驟依賴于，例如，所使用的生產(chǎn)過程及所產(chǎn)生的特定蛋白質(zhì)的特性。
IX cbh 1和CBH1的應用[203]可以理解，變體cbh核酸序列、變體CBH I蛋白質(zhì)和包括變體CBH I蛋白質(zhì)活性的組合物發(fā)現(xiàn)在多種廣泛應用中具有效用，其中一些說明如下。在表現(xiàn)出清潔能力增強的去垢劑組合物中，用于將木質(zhì)紙漿降解為糖的組合物(例如用于生物乙醇生產(chǎn))、和/或在飼料組合物中，新的改進的包括不同含量BG型、EG型和變體CBH型纖維素酶的纖維素酶組合物發(fā)現(xiàn)具有效用，其中，在去垢劑組合物中，起到軟化劑和/或改進棉纖維觸感(例如“石洗”或“生物磨光”)的功能。各型纖維素酶的分離和表征提供了控制這類組合物這些方面的能力。具有增強的熱穩(wěn)定性的變體(或突變體)CBH因其在升高溫度保持活性的能力，所以在任何上述領(lǐng)域具有作用。具有降低的熱穩(wěn)定性的變體(或突變體)CBH在例如需要酶活性在較低溫度壓制以使其他可能存在的酶不受影響的領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)用途。另外，該酶發(fā)現(xiàn)在纖維制品的有限轉(zhuǎn)化中有效，例如，在控制結(jié)晶程度或纖維素鏈長度中。達到需要的轉(zhuǎn)化程度后，糖化溫度可以升高至高于去穩(wěn)定的CBH I的存活溫度。由于CBH I活性對于水解晶體纖維素而言是必需的，所以晶體纖維素的轉(zhuǎn)化將在升高的溫度終止。具有增加的可逆性的變體(或突變體)CBH(即，再折疊或活性保持的增強)，也發(fā)現(xiàn)在類似領(lǐng)域具有效用。依賴于熱失活條件，可逆的變性能夠與不可逆過程競爭，或者比不可逆過程占優(yōu)勢。具有增加的可逆性的變體將在這些條件下顯示出對熱失活抗性的增加。在任何失活事件繼之以在非失活條件下的處理的過程中，增加的可逆性也將具有潛在的益處。例如，在用于生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的交錯水解和發(fā)酵(HybridHydrolysis and Fermentation，HHF)過程中，生物物質(zhì)首先在升高的溫度由纖維素酶不完全糖化(即50℃或更高)，然后溫度將下降(例如降至30℃)，以允許引入發(fā)酵微生物將糖轉(zhuǎn)化為乙醇。隨著處理溫度的降低，如果熱失活的纖維素酶可逆性折疊并重獲活性，則在低溫發(fā)酵過程中，糖化可以持續(xù)到更高的轉(zhuǎn)化水平。在一個方法中，在去垢劑組合物中、或在改進纖維觸感和外觀的織物處理中，本發(fā)明的纖維素酶發(fā)現(xiàn)具有效用。由于纖維制品的水解速度可以通過使用轉(zhuǎn)化子而增加，因此含有纖維素或雜多糖的產(chǎn)物可以以更快的速度降解至更高的程度，其中所述的轉(zhuǎn)化子具有至少一個額外的插入到基因組中的cbh基因拷貝。由纖維素制造的產(chǎn)物(例如紙、棉、含纖維尿布等)，可以在垃圾中得到更有效的降解。因此，能夠從轉(zhuǎn)化子獲得的發(fā)酵產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化子本身，可以用于幫助降解的組合物中，通過將多種添加到擁塞垃圾中的纖維素產(chǎn)物液化而幫助降解。分開的糖化和發(fā)酵過程為，將存在于生物物質(zhì)(如玉米秸稈)中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，繼而由酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。同步糖化和發(fā)酵的過程為，將存在于生物物質(zhì)(如玉米秸稈)中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時，在同一個反應器中，由酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。因此，在另一個方法中，本發(fā)明的變體CBH型纖維素酶在將生物物質(zhì)降解為乙醇中發(fā)現(xiàn)具有效用。來自來源容易獲得的纖維素的乙醇產(chǎn)物提供了穩(wěn)定并可再生的燃料來源。以纖維素為基礎的原料(feedstock)包括農(nóng)業(yè)垃圾、草、木以及城市垃圾(例如再生紙、園林修葺物等)之類的其他低價生物物質(zhì)。任何這些纖維原料的發(fā)酵可以產(chǎn)生乙醇。然而，纖維素在被轉(zhuǎn)化為乙醇之前，必須首先轉(zhuǎn)化為糖。許多原料可以通過本發(fā)明的變體CBH而得到使用，選作使用的原料依賴于進行轉(zhuǎn)化的地區(qū)。例如，在美國中西部，較多的是例如小麥稈、玉米秸稈和甘蔗渣之類的農(nóng)業(yè)垃圾；而在加利福尼亞較多的是稻稈。然而，應當理解，任何可獲得的纖維素生物物質(zhì)可以在任何地區(qū)使用。纖維二糖水解酶含量增加的纖維素酶組合物在乙醇生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)具有效用。來自此途徑的乙醇可以進一步用作辛烷增強物或直接作為替代汽油的燃料，這種燃料是有益的，因為乙醇是一種比石油來源產(chǎn)物更加環(huán)保的燃料來源。已知使用乙醇將改善空氣質(zhì)量并可能降低局部臭氧水平和煙霧。此外，使用乙醇替代汽油，在緩沖不可再生能源和石油化工的意外變化的沖擊中，具有戰(zhàn)略重要性。乙醇可以經(jīng)糖化和發(fā)酵從纖維素生物物質(zhì)(例如樹木、草本植物、城市固體垃圾和農(nóng)林業(yè)殘渣)中產(chǎn)生。然而，在由細菌產(chǎn)生的天然存在的纖維素酶混合物中，個體纖維素酶的比例對于生物物質(zhì)中纖維素向糖的快速轉(zhuǎn)化可能不是最有效率的。已知內(nèi)切葡聚糖酶的作用是產(chǎn)生新的纖維素鏈末端，這些末端本身是纖維二糖水解酶作用的底物，從而改進整個纖維素酶系統(tǒng)的水解效率。因此，使用增加或優(yōu)化的纖維二糖水解酶活性，可以大大增加乙醇的產(chǎn)生。這樣，該發(fā)明的纖維二糖水解酶在將纖維素水解為糖分中發(fā)現(xiàn)具有效用。在一個實施方案中，在加入發(fā)酵微生物之前，將變體纖維二糖水解酶添加到生物物質(zhì)中。在第二個實施方案中，在加入發(fā)酵微生物的同時，將變體纖維二糖水解酶添加到生物物質(zhì)中?？蛇x地，在任一實施方案中可以存在其他纖維素酶成分。在另一個實施方案中，纖維素原料可以進行預處理。預處理可以通過升高的溫度、以及稀釋酸或濃縮酸或稀釋堿溶液的加入而進行。加入預處理溶液至足夠至少部分水解半纖維素成分的時間，然后將其中和。CBH I作用于纖維素的主要產(chǎn)物是可以通過BG活性(例如真菌纖維素酶產(chǎn)物中)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的纖維二糖。無論通過預處理還是通過酶作用于生物物質(zhì)，除了葡萄糖和纖維二糖之外，可以從生物物質(zhì)制備可以利用的其它糖。生物物質(zhì)中的半纖維素成分可以轉(zhuǎn)化為(由半纖維素酶)諸如木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖等糖。因此，在生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，酶促糖化作用能夠產(chǎn)生糖，這些糖可以用于生物或化學轉(zhuǎn)化為中間或終產(chǎn)物。因此，從生物物質(zhì)產(chǎn)生的糖在除產(chǎn)生乙醇之外的許多過程中發(fā)現(xiàn)具有效用。這些轉(zhuǎn)化的實例為葡萄糖發(fā)酵為乙醇(如M.E.Himmel等，在“Fuels and Chemicals from Biomass”，pp2-45，ACSSymposium Series 666，ed B.C.Saha及J.Woodward，1997中所綜述)以及其他葡萄糖向2，5-二酮-D-葡萄糖酸(美國專利號6,599,722)、乳酸(R.Datta和S-P.Tsai pp 224-236，如上)、琥珀酸(R.R.Gokarn，M.A.Eiteman和J.Sridhar，pp237-263，同上)、1，3-丙二醇(A-P.Zheng，H.Biebl和W-D.Deckwer，pp264-279，同上)、2，3-丁二醇(C.S.Gong，N.Cao和G.T.Tsao，pp280-293，同上)的生物轉(zhuǎn)化，以及木糖向木糖醇的化學和生物轉(zhuǎn)化(B.C.Saha和R.J.Bothast，pp307-319，同上)。也見例如WO 98/21339。除了纖維素酶組合物(不考慮纖維二糖水解酶含量，即無纖維二糖水解酶、基本無纖維二糖水解酶或增強的纖維二糖水解酶)，本發(fā)明的去垢劑組合物還可以使用表面活性劑(包括陰離子、非離子和兩性表面活性劑)、水解酶、助洗劑、漂白劑、上藍劑和熒光染料、結(jié)塊抑制劑、增溶劑、陽離子表面活性劑等。所有這些成分為清潔劑領(lǐng)域所知。上文描述的纖維素酶混合物可以以液體稀釋液、顆粒、乳液、凝膠、糊等形式添加到去垢劑組合物中。這些形式為技術(shù)人員所熟知。當使用固體去垢劑組合物時，纖維素酶組合物優(yōu)選設計為顆粒。顆粒優(yōu)選配制為含有纖維素酶保護試劑。更完全的討論見美國專利號6,162,782，題目為“含有缺乏CBHI型成份的纖維素酶組合物的去垢劑組合物”，此處引用作為參考。使用的纖維素酶組合物優(yōu)選占總?cè)ス竸┙M合物質(zhì)量百分比的約0.00005至約5。使用的纖維素酶組合物更優(yōu)選占總?cè)ス竸┙M合物質(zhì)量百分比的約0.0002至約2。另外，變體cbh I核酸序列在相關(guān)核酸序列的鑒定和表征中發(fā)現(xiàn)具有效用。許多技術(shù)對于測定(預測或證實)相關(guān)基因或基因產(chǎn)物的功能是有用的，包括但是不限于(A)DNA/RNA分析，例如(1)過表達、異常表達、以及在其他物種表達；(2)基因敲除(反向遺傳學、靶向敲除、病毒介導的基因沉默(VIGS，見Baulcombe，100 Years of Virology，Calisher和Horzinek eds.，Springer-Verlag，New York，NY 15189-201，1999)；(3)基因甲基化狀態(tài)分析，尤其是側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)；和(4)原位雜交；(B)基因產(chǎn)物分析，例如(1)重組蛋白質(zhì)表達；(2)抗血清生產(chǎn)；(3)免疫定位；(4)催化或其他活性的生物化學檢測；(5)磷酸化狀態(tài)；和(6)通過酵母雙雜交分析與其他蛋白質(zhì)的相互作用；(C)通路分析，例如在特定生物化學或信號通路中安插一個基因或基因產(chǎn)物，基于其過表達表型或與相關(guān)基因的序列同源性；和(D)其它也可以得到執(zhí)行以測定或確認在特定代謝或信號通路中分離的基因及其產(chǎn)物的參與，并幫助測定基因功能。此處提及的所有專利、專利申請、論文和出版物，在此明確引用作為參考。
實施例[222]本發(fā)明在下面的實施例中得到進一步詳細說明，該實施例無意以任何方式限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。附圖意在被考慮為本發(fā)明詳述和說明的完整部分。所有引證的參考文獻在此明確引用其所有公開內(nèi)容作為參考。
實施例1已知的Cel7A纖維素酶比對[223]通過使用結(jié)構(gòu)信息和建模程序，首先將紅褐肉座菌Cel7A與其41個家族成員進行比對，從而確定幾種突變體的選擇。所有42個家族成員的一級氨基酸序列比對顯示于圖8中。先前已對該成員中的四個(即20VW.1，1A39，6CEL和1EG1.1)測定了晶體結(jié)構(gòu)。4個已公布結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的比對，鎖定了所有骨架原子在特定RMS偏差內(nèi)(RMS小于或等于2.0A)的氨基酸的比對。使用由Chemical Computing Group，Montreal Canada提供的MOE version2001.01執(zhí)行這四個序列的三級結(jié)構(gòu)比對。重疊的結(jié)構(gòu)元件用來凍結(jié)這四個序列的一級結(jié)構(gòu)。其余38個序列的一級結(jié)構(gòu)使用MOE與凍結(jié)的四個進行比對，MOE的二級結(jié)構(gòu)預測開放，其余參數(shù)設置為默認值。在比對的基礎上，通過定點誘變在蛋白質(zhì)中造成多種單氨基酸或多氨基酸突變。單氨基酸突變以下面的原理為基礎(也見表1)檢查同源體間氨基酸保守性后，在紅褐肉座菌序列中選取位點，在其他41個序列中，可從統(tǒng)計學上看到該位點偏愛另一個氨基酸(例如，在77位的Ala，僅僅出現(xiàn)在紅褐肉座菌和其他3個同源物中，而在其他22個當中變?yōu)锳sp)。
表1Cel7A變體及改變原理 多氨基酸突變建立在要求影響酶穩(wěn)定性、加工能力和產(chǎn)物抑制的基礎上。在紅褐肉座菌序列中構(gòu)建下述多位點改變1)Thr 246 Cys+Tyr 371 Cys2)Thr 246 Ala+Arg 251 Ala+Tyr 252 Ala3)Thr 380 Gly+Tyr 381 Asp+Arg 394 Ala+缺失殘基382 to393，4)Thr 380 Gly+Tyr 381 Asp+Arg 394 Ala5)Tyr 252 Gln+Asp 259 Trp+Ser 342 Tyr預測T246A/R251A/Y252A以及另一個三位點突變+缺失突變體都降低該酶的產(chǎn)物抑制。預測Thr246Cys+Tyr371 Cys增加酶穩(wěn)定性并增加其加工能力。預測D259W/Y252Q/S342Y變體影響該酶的產(chǎn)物抑制。使用本領(lǐng)域熟知的方法(參考文獻見上)構(gòu)建其他單突變和多突變體，并呈現(xiàn)于表2中。
表2紅褐肉座菌CBH I變體
實施例2CBH I變體在紅褐肉座菌中的克隆及表達
A紅褐肉座菌通用目的(general-purpose)表達質(zhì)粒-PTEX的構(gòu)建[230]質(zhì)粒pTEX按照前文Sambrook等(1989)的方法構(gòu)建，并在圖7中加以闡明。設計該質(zhì)粒用于絲狀真菌長枝木霉中的多目的表達載體。表達盒具有一些對該功能有用的獨特特征。使用長枝木霉強CBH I基因啟動子和終止子序列調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。在CBH I啟動子和終止子之間是獨特的PmeI和SstI限制性位點，該位點用于插入將要表達的基因。長枝木霉pyr4選擇標志基因插入CBH I終止子內(nèi)；利用獨特的Notl限制性位點或獨特的Notl和Nhel限制性位點，可以切割整個表達盒(CBH I啟動子-插入位點-CBH I終止子-pyr4基因-CBH I終止子)。本載體以細菌載體pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，N.J.)為基礎，該載體為具有延長的多克隆位點的PUC型載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)圖7中說明的流程圖構(gòu)建此載體。載體pTrex2L從pTrex2(pTEX的衍生物)構(gòu)建。pTrex2序列在圖6中給出。只要變體蛋白質(zhì)以有用的水平表達，使用的質(zhì)粒并不是那么重要。然而，通過在cbh 1位點強迫整合而將表達水平最大化，是有益的。
B克隆[234]技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域已知方法將所需的CBH I變體克隆到合適的載體中。如前所述，只要變體蛋白質(zhì)以有用的水平表達，使用的質(zhì)粒并不是那么重要。下面關(guān)于一種本發(fā)明的變體CBH I酶的制備的說明，可以用于制備任何在此說明的本發(fā)明的變體。變體cbh 1基因被克隆到pTrex2L載體中。質(zhì)粒pTrex2L的構(gòu)建如下使用合成的、含有BstE II和BamHI位點的連接子替換pTrex2中獨特的Sac II和Asc I位點之間的6個核苷酸，從而產(chǎn)生質(zhì)粒Trex2L。合成的互補連接子21聚體合成寡核苷酸CBHlink1+GGTTTGGATCCGGTCACCAGG
以及27聚體合成寡核苷酸CBHlink-CGCGCCTGGTGACCGGATCCAAACCGC被退火。使用Sac II和Asc I消化pTrex2。退火的連接子于是連接入pTrex2中產(chǎn)生pTrex2L。然后使用適當?shù)南拗菩悦赶撡|(zhì)粒，將野生型CBH I基因連接入該質(zhì)粒中。使用引物將所需突變引入野生型基因。應當理解，可以使用任何導致將所需改變或突變引入基因的方法。使用合成的DNA引物作為突變體構(gòu)建的PCR模板。在將被引入的所需突變基礎上設計引物，完全在熟練技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。使用合成的DNA寡核苷酸通過PCR將誘變模板進行延伸并形成雙鏈。經(jīng)過25個PCR循環(huán)后，終產(chǎn)物主要是含有所需突變的58bp雙鏈產(chǎn)物。隨后使用標準技術(shù)將誘變的片段附著于野生型CBH I片段并連接到質(zhì)粒中。
c轉(zhuǎn)化和表達[240]把為所需變體制備的載體轉(zhuǎn)化雙重或四重缺失的木霉菌株的尿苷營養(yǎng)缺陷型中(見表3；也見美國專利號5,861,271和5,650,322)，鑒別穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。
表3轉(zhuǎn)化/表達株
“雙重缺失”(ΔCBH I及ΔCBH II)以及“四重缺失”(ΔCBHI及A CBHII，ΔEGI及ΔEG II)瑞氏木霉宿主菌株[241]為了選擇表達變體CBH I的轉(zhuǎn)化子，在Vogels+1％葡萄糖上生長后，從菌株分離DNA，使用分離的僅含有變體CBH I的DNA片段進行Southern印跡實驗。分離變體CBH I表達盒的拷貝整合入宿主細胞基因組的的轉(zhuǎn)化子。在Vogels+1％乳糖上生長一天之后從菌株分離總mRNA。使用變體CBH I編碼區(qū)作為探針將mRNA進行Northern分析。鑒別表達變體CBH I的轉(zhuǎn)化子。使用上述方法可以獲得其他新的變體CBH I纖維素酶或其衍生物。
實施例3CBH1變體在黑曲霉中的表達[243]使用下面的引物及程序獲得PCR片段。構(gòu)建下列DNA引物，用于擴增多種微生物基因組DNA的同源CBH1基因。此處所有用于蛋白質(zhì)和DNA序列的符號與IUPAC IUBBiochemical Nomenclature Commission編碼相符合。在瑞氏木霉CBH1序列的基礎上發(fā)展同源5′(FRG192)和3′(FRG193)引物。兩個引物都在引物5′端含有Invitrogen的Gateway克隆序列。引物FRG192含有attB1序列，引物FRG193含有attB2序列。
不含attB1的FRG192序列ATGTATCGGAAGTTGGCCG(CBH1紅褐肉座菌信號序列)(SEQ ID NO3)不含attB2的FRG193序列TTACAGGCACTGAGAGTAG(CBH1紅褐肉座菌纖維素結(jié)合模塊)(SEQ IDNO4)[246]紅褐肉座菌CBH I cDNA克隆作為模板。PCR條件如下10μL 10X反應緩沖液(10X反應緩沖液包括100mM Tris HCl，pH 8-8.5；250mM KCl；50mM(NH4)2SO4；20mM MgSO4)；dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mM(終濃度)，1μL 100ng/μL基因組DNA，0.5uL PWO聚合酶(Boehringer Mannheim，Cat#1644-947)(1unit/μL)，引物FRG192和FRG193各0.2uM，(終濃度)，4μL DMSO，加水至100μL。紅褐肉座菌CBH1中的多個位點可能與變體的熱穩(wěn)定性有關(guān)，因此將紅褐肉座菌CBH1基因進行誘變。使用Qiagen Gel extraction KIT從瓊脂凝膠中純化編碼變體的片段。使用Invitrogen的GatewayTMTechnology操作手冊(versionC)，將純化的片段與InvitrogenpDONRTM201載體進行克隆酶反應，此處引用該手冊作為參考。然后基因從這個ENTRY載體轉(zhuǎn)入目標載體(pRAXdes2)，從而獲得表達載體pRAXCBH1。使用含有變體CBH I纖維素酶編碼核酸的表達載體轉(zhuǎn)化細胞。根據(jù)Cao等說明的方法(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，CunninghamA，Pai EF，Tu G-C和Hofmann T(2000)Penicillopepsin-JT2 arecombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contributionof a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9991-1001)，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到黑曲霉泡盛變種中。將轉(zhuǎn)化子在基本培養(yǎng)基平板上劃線(Ballance DJ，Buxton FP及Turner G(1983)Transformation of Aspergillus nidulans by theorotidine-5′-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassaBiochem Biophys Res Commun 112284-289)并于30℃生長4天。使用本領(lǐng)域熟知的方法收集孢子(見http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.Htm)。將構(gòu)巢曲霉分生孢子收獲于水中(使用消毒彎玻棒摩擦分生培養(yǎng)物表面以去除孢子)，可以在4℃保存數(shù)星期至數(shù)月而沒有嚴重的活力損失。然而，新鮮收獲的孢子出芽繁殖能力更強。為了長期保存，孢子可以于-20℃保存在50％甘油中，或者于-80℃保存在15-20％甘油中。甘油在8O％的水溶液中更易于吸量。800μL孢子水懸液(如同用于4℃保藏)加至200μL 80％甘油中，用于-80℃庫存；400μL懸液加至600μL 80％甘油中，用于-20℃庫存。冰凍前渦流振蕩。對于突變體收集，可以切下小塊孢子培養(yǎng)物，置于20％甘油中，渦流振蕩，冰凍于-80℃作為庫存。在我們的案例中，將其在-80℃保存與50％甘油中。在缺乏尿苷的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)黑曲霉泡盛變種(Ballance等，1983)。按照Cao等(2000)說明，將1cm2分生生長的瓊脂盤的孢子懸液接種到100ml搖瓶中，于37℃生長3天，從而篩選纖維素酶活性。CBHI活性檢驗建立在非熒光4-甲基 形基-β-乳糖苷水解的基礎上，水解產(chǎn)物為乳糖和7-羥基-4-甲基香豆素，后者是造成熒光信號的原因。吸量170μL 50mM NaAc溶液pH 4.5到適于熒光的96孔微量板(MTP)(Greiner，F(xiàn)luotrac 200，art.nr.655076)。添加10μL上清液，隨后添加10μL MUL(1mM 4-甲基 形基-β-乳糖苷(MUL)于milliQ水)，將MTP置于Fluostar Galaxy(BMG Labtechnologies；D-77656 Offenburg)中。在50℃，于λ320nm(激發(fā))和λ460nm(發(fā)射)測量動力學16分鐘(8個循環(huán)，每個循環(huán)120秒)。具有CBH活性的上清液進行疏水相互作用層析。
實施例4CBH 1變體的穩(wěn)定性按照上文克隆和表達CBH I纖維素酶變體(見實施例2和3)。使用柱層析將Cel7A野生型和變體從這些培養(yǎng)物的無細胞懸液中純化。使用疏水相互作用層析(HIC)純化蛋白質(zhì)。使用Poros20 HP2樹脂的柱子在BioCADR Sprint Perfusion Chroma tography System下運行，二者都由Applied Biosystems制造。HIC柱子使用5倍柱體積的0.020M磷酸鈉、0.5M硫酸銨(pH6.8)平衡。硫酸銨以終濃度約0.5M加入上清液中，pH調(diào)節(jié)至6.8。過濾后，將上清加于柱上。上樣后，使用10倍柱體積平衡緩沖液清洗柱，然后使用10倍柱體積溶于0.02M磷酸鈉、pH6.8的硫酸銨梯度洗脫，梯度從0.5M硫酸銨到0M硫酸銨。Cel7A約在中間梯度洗脫。收集級分，并以還原SDS-PAGE凝膠分析為基礎混和這些級分。根據(jù)Luo等，Biochemistry 3410669和Gloss等，Biochemistry365612的方法測定熔點。也見Sandgren等(2003)Protein Science12(4)pp848。在Aviv 215圓二色性分光光度計上收集數(shù)據(jù)。變體在210-260nm的自然光譜出現(xiàn)在25℃。緩沖條件為pH5.5的50mM Bis TrisPropane/50mM醋酸銨/冰乙酸。蛋白質(zhì)濃度保持在0.25至0.5mgs/mL。確定監(jiān)測去折疊的最佳波長后，在相同的緩沖條件下，將溫度從25℃升至75℃，使樣品熱變性。每2度收集數(shù)據(jù)5秒鐘。在0.1厘米路徑長度小室中，于230nm檢測部分可逆去折疊。在75℃，如上所述收集去折疊光譜。然后將樣品冷卻到25℃收集再折疊光譜。使用三個光譜在230nm的區(qū)別來評價變體可逆性。野生型CBH I和多種變體CBH I的熱變性特征顯示于圖9A和9B中。也見表4。
表4變體CBH I纖維素酶的熱穩(wěn)定性
不離開本發(fā)明的范圍和精神，所描述的本發(fā)明方法和體系的多種修改和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。盡管結(jié)合特定的優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行說明，仍然應當理解，本發(fā)明不應當被不適當?shù)叵拗朴谶@類特定的實施方案。事實上，所述的實施本發(fā)明的方法可以進行多種修改，這些修改對于分子生物學或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且落在權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.變體CBH I纖維素酶，其中所述變體包含在對應于紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的下列一個或多個殘基的位點上的置換或缺失S8、Q17、G22、T41、N49、S57、N64、A68、A77、N89、S92、N103、A112、S113、E193、S196、M213、L225、T226、P227、T246、D249、R251、Y252、T255、D257、D259、S278、S279、K286、L288、E295、T296、S297、A299、N301、E325、T332、F338、S342、F352、T356、Y371、T380、Y381、V393、R394、S398、V403、S411、G430、G440、T445、T462、T484、Q487和P491。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的變體CBH I纖維素酶，其中所述變體包含在某位點的置換，該置換對應于紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的下列一個或多個殘基S8P、Q17L、G22D、T41I、N49S、S57N、N64D、A68T、A77D、N89D、S92T、N103I、A112E、S113(T/N/D)、E193V、S196T、M213I、L225F、T226A、P227(L/T/A)、T246(C/A)、D249K、R251A、Y252(A/Q)、T255P、D257E、D259W、S278P、S279N、K286M、L288F、E295K、T296P、S297T、A299E、N301(R/K)、E325K、T332(K/Y/H)、F338Y、S342Y、F352L、T356L、Y371C、T380G、Y381D、V393G、R394A、S398T、V403D、S411F、G430F、G440R、T462I、T484S、Q487L和/或P491L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的變體CBH I纖維素酶，進一步包括在對應于紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)中T445的位點的缺失。
4.變體CBH I纖維素酶，其中所述變體包括在某位點的置換，該置換對應于選自紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)S8P、N49S、A68T、A77D、N89D、S92T、S113(N/D)、L225F、P227(A/L/T)、D249K、T255P、D257E、S279N、L288F、E295K、S297T、A299E、N301(R/K)、T332(K/Y/H)、F338Y、T356L、V393G、G430F的殘基。
5.變體CBH I纖維素酶，其中所述變體CBH I基本由選自紅褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO2)的下列突變體的突變體組成xl.A112E/T226A；xli.S196T/S411F；xlii.E295K/S398T；xliii.T246C/Y371C；xliv.V403D/T462I；xlv.T41I加T445缺失；xlvi.A68T/G440R/P491L；xlvii.G22D/S278P/T296P；xlviii.T246A/R251A/Y252A；xlix.T380G/Y381D/R394A；l.Y252Q/D259W/S342Y；li.S113T/T255P/K286M；lii.P227L/E325K/Q487L；liii.P227T/T484S/F352L；liv.Q17L/E193V/M213I/F352L；lv.S8P/N49S/A68T/S113N；lvi.S8P/N49S/A68T/S113N/P227L；lvii.T41I/A112E/P227L/S278P/T296P；lviii.S8P/N49S/A68T/A112E/T226A；lix.S8P/N49S/A68T/A112E/P227L；lx.S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L；lxi.G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P；lxii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；lxiii.G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；lxiv.G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P；lxv.G22D/N49S/N64D/A68T/N1031/S113N/S278P/T296P；lxvi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P；lxvii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R；lxviii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；lxix.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；lxx.S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；lxxi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R；lxxii.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；lxxiii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；lxxiv.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；lxxv.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；lxxvi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F；lxxvii.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；lxxviii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I
6.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的CBH I變體的核酸序列。
7.編碼根據(jù)權(quán)利要求4的CBH I變體的核酸序列。
8.編碼根據(jù)權(quán)利要求5的CBH I變體的核酸序列。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求6的編碼CBH I變體的核酸的載體。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求7的編碼CBH I變體的核酸的載體。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求8的編碼CBH I變體的核酸的載體。
12.用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
13.用權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
14.用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
15.生產(chǎn)CBH I變體的方法，該方法包括步驟(a)在適合生產(chǎn)CBH I變體的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細胞；(b)獲得由此產(chǎn)生的CBH I變體。
16.生產(chǎn)CBH I變體的方法，該方法包括步驟(a)在適合生產(chǎn)CBH I變體的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細胞；(b)獲得由此產(chǎn)生的CBH I變體。
17.生產(chǎn)CBH I變體的方法，該方法包括步驟(a)在適合生產(chǎn)CBH I變體的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細胞；(b)獲得由此產(chǎn)生的CBH I變體。
18.包含表面活性劑和CBH I變體的去垢劑組合物，其中所述CBH I變體包括根據(jù)權(quán)利要求1的CBH I變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的去垢劑，其中所述去垢劑為洗衣用去垢劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的去垢劑，其中所述去垢劑為餐具去垢劑。
21.包含根據(jù)權(quán)利要求1的CBH I變體的飼料添加劑。
22.處理木質(zhì)紙漿的方法，該方法包括將所述木質(zhì)紙漿與根據(jù)權(quán)利要求1的CBH I變體接觸。
23.將生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，該方法包括將所述生物物質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求1的CBH I變體接觸。
全文摘要
此處描述紅褐肉座菌(H.jecorina)的一種Cel7酶CBH I的變體。本發(fā)明提供了具有改善的熱穩(wěn)定性和可逆性的纖維二糖水解酶。
文檔編號C07H21/04GK101048500SQ03823928
公開日2007年10月3日 申請日期2003年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者A·G·戴, F·戈治格布爾, P·戈爾菲迪, C·米欽森, P·尼夫, M·桑德格蘭, A·肖, J·斯塔爾伯格 申請人:金克克國際有限公司