專利名稱：水溶性聚合物鏈烷醛的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及水溶性聚合物的特定醛衍生物，和涉及制備該聚合物醛衍生物的方法和使用它的方法。
本發(fā)明的背景近年來，人類治療學(xué)已經(jīng)突破過去傳統(tǒng)的小分子藥物進(jìn)入到生物藥物領(lǐng)域中。新型蛋白質(zhì)和肽的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致了許多蛋白質(zhì)和多肽生物藥物的開發(fā)。不幸地，蛋白質(zhì)和多肽，當(dāng)用作治療劑時(shí)，常常顯示出一些性能使得它們極難配制或給藥，如短的循環(huán)半衰期，免疫原性，蛋白水解降解，和低溶解度。改進(jìn)生物藥物的代謝動(dòng)力學(xué)或藥物動(dòng)力學(xué)性能的一種途徑是接合到天然或合成聚合物如聚乙二醇(PEG)上。PEG以共價(jià)鍵連接于治療蛋白質(zhì)上能夠得到許多優(yōu)點(diǎn)，如(i)遮蔽蛋白質(zhì)的抗原性表位，因此減少它的網(wǎng)狀內(nèi)皮的清除和被免疫系統(tǒng)的識別，(ii)減少蛋白水解酶引起的降解，和(iii)減少腎臟過濾。
對于偶聯(lián)于生物藥物如肽上的聚合物衍生物的開發(fā)，尤其對于偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性氨基上的聚合物衍生物的開發(fā)已經(jīng)投入許多工作。此類聚合物衍生物稱為“親電活化的”，因?yàn)樗鼈償y帶適合與親核試劑如胺反應(yīng)的親電子基團(tuán)。此類PEG衍生物的例子包括PEG二氯三嗪，PEG tresylate，PEG琥珀酰亞胺基碳酸酯，PEG羰基咪唑，和PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯。不幸地，這些特定試劑的使用能夠?qū)е乱粋€(gè)或多個(gè)下列問題在進(jìn)行偶聯(lián)所需要的反應(yīng)條件下發(fā)生不希望有的副反應(yīng)，選擇性的缺乏，和/或在生物藥物與PEG之間形成弱(即不穩(wěn)定的)鍵。
為了克服這些問題中的一些，已經(jīng)開發(fā)了許多新的或“第二代”親電活化的PEG，如PEG丙醛和PEG乙醛(分別參見，例如，US專利5,252,714和5,990,237)。醛衍生物是用于偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和其它生物分子上的特別有吸引力的試劑，因?yàn)槿╊悆H僅與胺反應(yīng)(即，在它們的連接化學(xué)性質(zhì)上是有選擇的)。上述試劑提供許多優(yōu)點(diǎn)它們能夠在制備時(shí)避免PEG二醇污染的問題，不局限于低分子量mPEG，在偶聯(lián)時(shí)形成穩(wěn)定的胺鍵，并且是選擇性的。雖然以上指出的衍生物與第一代PEG試劑相比提供許多優(yōu)點(diǎn)，但是申請人已經(jīng)指出了這些醛試劑的一些特殊的缺陷，使得它們在某些情況下不太理想。
更具體地說，申請人已經(jīng)在針對這些試劑的大量工作中認(rèn)識到，PEG乙醛是非常不穩(wěn)定的，特別在堿性介質(zhì)中，并且由于反應(yīng)混合物的中和所引起的過多鹽形成而難以分離。尤其，PEG乙醛對于經(jīng)由醛醇縮合的二聚作用是非常敏感的。PEG丙醛，盡管就它的穩(wěn)定性而言是好得多的試劑，但仍具有一些缺點(diǎn)，由于在制備過程中發(fā)生的副反應(yīng)，使得它難于以高的純度獲得PEG丙醛產(chǎn)物。
更具體地說，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)從它的前體PEG醛水合物原位制備PEG丙醛時(shí)，產(chǎn)物收率一般是僅僅約50％，這歸因于消耗了較大部分的乙縮醛試劑的消除反應(yīng)。雖然能夠使用用于PEG丙醛的合成的改進(jìn)合成路線，即，利用3-羥基丙醛二乙基縮醛與PEG甲磺酸鹽的堿催化反應(yīng)，但是申請人已經(jīng)這些發(fā)現(xiàn)這一反應(yīng)路線也會導(dǎo)致產(chǎn)生較大量的不穩(wěn)定的PEG乙烯基醚和產(chǎn)生難以除去的母體二羥基PEG(也稱作PEG二醇)的消除副反應(yīng)。因此，這一反應(yīng)的產(chǎn)率一般低于約85至90％。另外，使用上述PEG丙醛合成中的任何一個(gè)將需要在極低pH下，例如在2或2以下的pH下的縮醛中間體的水解。在如此低的pH下的水解是不希望有的，這歸因于為了中和反應(yīng)混合物到適合于接合的pH所需要的大量堿。另外，PEG丙醛在堿性pH下偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上也會因?yàn)榇罅肯喈?dāng)難以除去丙烯醛(由逆Michael型副反應(yīng)產(chǎn)生)的形成而存在問題。這些所不希望有的副產(chǎn)物的形成需要徹底的提純以獲得藥物純等級產(chǎn)物。
因此，仍然需要接合到生物活性分子和表面上的改進(jìn)的親電活化聚合物衍生物，尤其符合下列條件的聚合物衍生物(i)在它們的偶聯(lián)化學(xué)性質(zhì)上是選擇性的，(ii)能夠以高產(chǎn)率和較少的反應(yīng)步驟制得，(iii)在寬的pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，(iv)能夠容易地分離，(iv)能夠以高純度制備(即，基本上不存在聚合物派生的雜質(zhì)和副產(chǎn)物)，和(v)克服了已知的聚合物衍生物例如如上所述的那些衍生物的缺陷當(dāng)中的至少一些。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供了獨(dú)特家族的聚合物鏈烷醛-即，包括至少一個(gè)由一個(gè)或多個(gè)中間碳原子聯(lián)接于聚合物鏈段上的醛官能團(tuán)的聚合物。
在很大程度上，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛比現(xiàn)有技術(shù)醛衍生物有更低的反應(yīng)活性，因此，更有選擇性。此外，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛是以高的產(chǎn)物制得，某些結(jié)構(gòu)能夠在簡單的單步驟方法中制備。在這里描述的某些聚合物醛在堿性pH下比現(xiàn)有技術(shù)的已知的醛衍生物有更高的穩(wěn)定性，并且在沒有顯著的或甚至沒有可檢測量的逆Michael型反應(yīng)副產(chǎn)物下形成。另外，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛是在溫和的酸性條件下，即在不如PEG乙醛或PEG丙醛所需要的苛刻的酸性條件下，由水解作用從相應(yīng)的縮醛前體形成的。這一溫和條件允許本發(fā)明的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)，肽，或其它分子靶物的直接原位接合，無需中間的分離步驟。本發(fā)明的聚合物鏈烷醛還以高的純度制得，使得它們特別有利地偶聯(lián)于藥物和生物藥物上而得到具有足以對哺乳動(dòng)物受試者給藥的純度的聚合物接合組合物。
更具體地說，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物 在以上結(jié)構(gòu)中，POLY表示水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分；z’是1-約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；和R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)。
在一些情況下，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛將具有某些特征。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)POLY是線形(a)在聚合物中存在的羰基的總數(shù)(排除/不計(jì)數(shù)該醛羰基碳)是0或2或2以上，而當(dāng)X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)或(-CH2CH2NH-)鏈段時(shí)則除外。當(dāng)X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)或(-CH2CH2NH-)鏈段時(shí)，則在聚合物中存在的羰基的總數(shù)是0，1，2，或更大。
在又一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)另外的實(shí)施方案，當(dāng)X’是氧或包括至少一個(gè)(-CH2CH2O-)鏈段和z’是2-12時(shí)，則在至少一種情況下R1或R2的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或聚合物是非同類雙官能化的，其中POLY包括在一端的不是羥基的反應(yīng)活性基團(tuán)。
在這里提供的聚合物鏈烷醛可以具有大量的將在這里更詳細(xì)地描述的總體幾何形狀或結(jié)構(gòu)當(dāng)中的任何一些。優(yōu)選，當(dāng)POLY是支化的時(shí)，則(i)在至少一種情況下R1或R2的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或(ii)對于POLY包括賴氨酸殘基的情況，X’包括-(CH2CH2O)b-，其中b是1-約20。另外地，當(dāng)POLY是支化的和具有兩個(gè)聚合物分支時(shí)，則對于其中POLY包括“C-H”作為分支點(diǎn)的情況，沒有聚合物分支包括氧作為唯一的雜原子。
一般而言，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛具有一種結(jié)構(gòu)，其中z’是在下列范圍中的一個(gè)范圍之內(nèi)z’是約2-21，約3-12，約3-8，或3-約6。
在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，聚合物具有以下結(jié)構(gòu) 其中POLY，X’，各R1，各R2和R3如上所定義。在前面的結(jié)構(gòu)中，C1表示醛羰基碳；C2表示與羰基碳或C1相鄰的或在其α位的碳；C3表示從羰基碳隔開一個(gè)的或處于β位的碳原子；和C4表示在γ位的碳原子。具有由I-A描述的總體結(jié)構(gòu)的聚合物鏈烷醛一般在這里稱作聚合物丁醛。在以上通式I-A的優(yōu)選變型中，連接于C2上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。優(yōu)選，連接于C2的R1是低級烷基。另外地，聚合物鏈烷醛對應(yīng)于以上結(jié)構(gòu)I-A，其中連接于C3的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物鏈烷醛由結(jié)構(gòu)I-A描述，其中連接于C4的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛對應(yīng)于通式I，和當(dāng)與結(jié)構(gòu)I-A對比時(shí)，在亞烷基鏈中具有另外的碳原子。在這一實(shí)施方案(在這里參見結(jié)構(gòu)I-B)中，z’是4，連接于C2的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H?；蛘?，連接于C3或C4的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
在屬于通式I的又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，z’是5，連接于C2的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H(在這里參見結(jié)構(gòu)I-C)?；蛘?，連接于C3或C4或C5上的R1變量中的一個(gè)是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
在某些實(shí)施方案中，根據(jù)通式I的聚合物鏈烷醛具有一般由下面結(jié)構(gòu)式描述的連接基結(jié)構(gòu)部分-(CH2)c-De-(CH2)f-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-，其中c是0到8；D是O，NH，或S；e是0或1；f是0到8；p是0到8；M是-NH或O；K是NH或O；q是0至8，以及r和s各獨(dú)立地是0或1。屬于這一通式的特定的連接基在下面更詳細(xì)地描述。
該連接基結(jié)構(gòu)部分可以任選包括對應(yīng)于結(jié)構(gòu)-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-的低聚鏈段，其中b和g各自獨(dú)立地是1-20。優(yōu)選，b和g各自獨(dú)立地是約1-10，和甚至更優(yōu)選是約1-約6。這些低聚連接基為本發(fā)明的鏈烷醛提供附加的穩(wěn)定性，并且還在制備聚合物的合成方法中提供一些優(yōu)點(diǎn)，下面將詳細(xì)描述。
更具體地說，在某些實(shí)施方案中，X’包括對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)部分-(CH2)c-De-(CH2)fP-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-，其中P和T各自獨(dú)立地是-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g；和b和g各獨(dú)立地是1-約20。在根據(jù)通式I的聚合物鏈烷醛的特定實(shí)例中，X’包括-C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-或-NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-。
優(yōu)選，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的水溶性聚合物鏈段是聚(烯化氧)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚噁唑啉，聚(丙烯?；鶈徇?，或聚(乙氧基化的多元醇)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物鏈段是聚(烯化氧)，優(yōu)選聚(乙二醇)。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該聚(乙二醇)鏈段包括下面結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)n-或Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n是約10-約4000和Z是包括下述官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)部分，該官能團(tuán)選自羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂，生物素，和熒光素。
或者，POLY可以被封端結(jié)構(gòu)部分如烷氧基，取代的烷氧基，鏈烯氧基，取代的鏈烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，和取代的芳氧基所封端。優(yōu)選的封端基團(tuán)包括甲氧基，乙氧基，和芐氧基。
一般，POLY具有屬于下列范圍中的一個(gè)范圍內(nèi)的標(biāo)稱平均分子量約100道爾頓到約100,000道爾頓，約1,000道爾頓到約50,000道爾頓，或約2,000道爾頓到約30,000道爾頓。POLY的優(yōu)選的分子量包括250道爾頓，500道爾頓，750道爾頓，1kDa，2kDa，5kDa，10kDa，15kDa，20kDa，30kDa，40kDa，和50kDa，或甚至更大。
在又一個(gè)特定的實(shí)例中，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛包括以下結(jié)構(gòu) 其中POLY，各X’，各(z’)，各R1，各R2，和各R3如前面所定義。在特定的實(shí)例中，POLY是線形的和聚合物是同類雙官能化的。
如上所述，在聚合物鏈烷醛內(nèi)的聚合物鏈段可以具有大量的幾何形狀中的任何一些，如線形，支化，分叉，多分支，或樹枝狀的，下面將更詳細(xì)描述。
本發(fā)明的特定實(shí)例包括對應(yīng)于下列結(jié)構(gòu)的聚合物鏈烷醛 在上述結(jié)構(gòu)中，PEG是聚(乙二醇)，以及b和g各自獨(dú)立地是0到20，a是0到6。對于在本節(jié)中提供的通用化結(jié)構(gòu)，變量對應(yīng)于前面提供的范圍/值，除非另作說明。
在特定的實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物鏈烷醛對應(yīng)于下面結(jié)構(gòu) 屬于通用化結(jié)構(gòu)III-D中的一種特別優(yōu)選的聚合物鏈烷醛具有下面結(jié)構(gòu) 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括具有下面結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物的組合物
VII其中組合物不含有可檢測量的含有碘的物質(zhì)或逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物。這是特別有利的，因?yàn)楹獾奈镔|(zhì)能夠?qū)е掠捎阪湐嗔训木?乙二醇)鏈的降解，得到具有高的多分散性數(shù)值，例如大于約1.2的聚合物產(chǎn)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛將具有低于約1.2，優(yōu)選低于約1.1，和甚至更優(yōu)選低于約1.05的多分散性數(shù)值。甚至更優(yōu)選的是聚合物鏈烷醛，如以1.04，1.03或更小的多分散性為特征的在這里描述的那些。
根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括具有下面結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物的組合物 其中POLY是線形、末端封閉的水溶性聚合物鏈段并且該組合物不存在可檢測量的二醛聚合物衍生物。
本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的另一個(gè)特征是它們與其它已知的聚合物醛組合物相比的穩(wěn)定性，例如，貯存穩(wěn)定性。例如，在這里提供的是當(dāng)在40℃下貯存15天時(shí)顯示聚合物醛基的10％或10％以下降解(由NMR測得)的聚合物鏈烷醛組合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括對應(yīng)于下列結(jié)構(gòu)的聚合物鏈烷醛 在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)結(jié)構(gòu)VII-A，POLY具有結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中X是O，n是約10-約4000，和Z包括官能團(tuán)，靶結(jié)構(gòu)部分，報(bào)道基團(tuán)，封端基團(tuán)，等等。
本發(fā)明的另一種組合物包括根據(jù)下面結(jié)構(gòu)的聚合物 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供的是上述聚合物鏈烷醛的水合物或縮醛形式。
本發(fā)明的縮醛包括二甲基縮醛，二乙基縮醛，二異丙基縮醛，二芐基縮醛，2，2，2-三氯乙基縮醛，雙(2-硝基芐基)縮醛，S，S’-二甲基縮醛，S，S’-二乙基縮醛，和二氧戊環(huán)。
更具體地說，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的縮醛或水合形式可以一般由下面結(jié)構(gòu)來描述 其中Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，以及R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。聚合物縮醛是本發(fā)明的鏈烷醛的有用前體，并能夠水解得到聚合物鏈烷醛。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，所提供的是具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物 在結(jié)構(gòu)IX-A中，鏈烷醛是有僅僅亞甲基或-(CH2)-碳將該分子的縮醛或醛水合物部分與該連接基X’分開的一種鏈烷醛。
此外，本發(fā)明涉及由生物活性劑與在這里描述的聚合物鏈烷醛的反應(yīng)所形成的接合物，它們的水合物和/或相應(yīng)鏈烷醛。
優(yōu)選地，該接合物對應(yīng)于下列結(jié)構(gòu) 其中“NH-生物活性劑”表示包括氨基的生物活性劑。
還構(gòu)成本發(fā)明的一部分的是由在這里描述的聚合物鏈烷醛或它們的前體形成的水凝膠。
根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了受保護(hù)的醛試劑。這些被保護(hù)的醛試劑特別可用于形成本發(fā)明的聚合物鏈烷醛，并且一般對應(yīng)于下列結(jié)構(gòu) 其中G是官能團(tuán)，和剩余變量具有以上所給出的值。
在結(jié)構(gòu)XI-A，B和C的優(yōu)選實(shí)例中，G是離去基團(tuán)如氯，溴，對-甲苯基磺酸酯，甲基磺酰酯，三氟磺酸酯，和三氟乙基磺酸酯。
或者，G是選自-OH，-NH2，-SH，和它們的被保護(hù)形式中的官能團(tuán)。
本發(fā)明的另一種方面涉及制備水溶性聚合物鏈烷醛(任選為受保護(hù)的形式)的方法。簡言之，該方法包括下述步驟在有效形成被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛的條件下，讓包含至少一個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)Y的水溶性聚合物與包括約2到20個(gè)碳原子和反應(yīng)活性基團(tuán)K(適合于被Y置換)的受保護(hù)的鏈烷醛試劑進(jìn)行反應(yīng)，或者與Y反應(yīng)。在這一方法中，活化的聚合物聯(lián)接于含有最終產(chǎn)品的鏈烷醛部分的試劑或它的前體上。
優(yōu)選，反應(yīng)是在惰性氣氛下進(jìn)行。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，POLY-Y通過直接聚合來制備的。
方法也可包括例如在酸性條件下，將已保護(hù)的水溶性聚合物鏈烷醛水解形成相應(yīng)水溶性聚合物鏈烷醛的附加步驟。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該水解步驟是在不低于約3的pH下進(jìn)行的。
用于進(jìn)行該方法的鏈烷醛試劑的被保護(hù)形式包括縮醛如二甲基縮醛，二乙基縮醛，二異丙基縮醛，二芐基縮醛，2，2，2-三氯乙基縮醛，雙(2-硝基芐基)縮醛，S，S’-二甲基縮醛，和S，S’-二乙基縮醛，環(huán)狀縮醛和環(huán)狀硫縮醛。
在又一個(gè)實(shí)例中，所生產(chǎn)的聚合物鏈烷醛通過將反應(yīng)混合物的pH提高到約6.0-7.5，將聚合物鏈烷醛萃取到有機(jī)溶劑中，和除去溶劑來回收。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶性聚合物對應(yīng)于結(jié)構(gòu)“POLY-Y”，并且受保護(hù)的鏈烷醛試劑對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu) 優(yōu)選，POLY包括可以封端或不封端的聚(乙二醇)。
在該方法的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，POLY-Y包括結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和Z選自-OCH3，-OCH2CH3和-OCH2(C6H5)。在另一實(shí)施方案中，POLY-Y包括結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O-M+，其中POLY-Y是通過環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合到封端的醇鹽Z-CH2CH2O-M+(用強(qiáng)堿使Z-CH2CH2OH的末端-OH基團(tuán)金屬取代而制得)上所制備的。M+表示金屬抗衡離子如Na+，K+，Li+，Cs+，Rb+。所制備的POLY-Y適合與如上所述的受保護(hù)的鏈烷醛試劑反應(yīng)。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，回收的鏈烷醛不存在可檢測量的未反應(yīng)的POLY-Y(例如，Z-(CH2CH2O)nH)和逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物。
在該方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，POLY-Y對應(yīng)于PEG-二醇，即POLY-Y具有結(jié)構(gòu)HO-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，K選自 和該方法導(dǎo)致具有以下結(jié)構(gòu)的受保護(hù)的聚合物鏈烷醛的形成 在該方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，POLY-Y包括結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和Z是保護(hù)的羥基。在這一情況下，該方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括在反應(yīng)步驟之后將受保護(hù)的羥基去保護(hù)，任選地接著將聚(乙二醇)的末端羥基轉(zhuǎn)化成除羥基之外的官能團(tuán)。
舉例的官能團(tuán)包括氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，和硅烷。優(yōu)選，該官能團(tuán)選自N-羥基琥珀酰亞胺基酯，苯并三唑基碳酸酯，胺，保護(hù)的胺，乙烯基砜，和馬來酰亞胺。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，在POLY-Y中的“Y”是可電離的基團(tuán)或是可電離的基團(tuán)如羧酸、活性酯或胺的衍生基團(tuán)。優(yōu)選，在用于反應(yīng)步驟中之前，POLY-Y已經(jīng)進(jìn)行色譜提純。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，POLY-Y在使用之前由離子交換色譜法提純。理想地，用于反應(yīng)步驟中的此類色譜提純的POLY-Y基本上不存在可檢測量的聚合物雜質(zhì)。在這一方法的一個(gè)此類實(shí)施方案中，POLY-Y是封端的，并且基本上不存在可檢測量的PEG-二醇或雙官能的PEG雜質(zhì)。
另外地，在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，該鏈烷醛試劑包括以下結(jié)構(gòu) 或 其中g(shù)和b各自獨(dú)立地是約1-約20。例如，優(yōu)選的鏈烷醛試劑對應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu) 和該反應(yīng)步驟的產(chǎn)物具有下面通式化的結(jié)構(gòu) 在制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的又一個(gè)途徑中，在這里所述的聚合物鏈烷醛是通過將聚合物鏈段直接構(gòu)造在縮醛前體上，例如，通過直接聚合來制備的。更具體地說，這一方法包括下面的步驟(i)提供包含適合于引發(fā)聚合反應(yīng)的至少一個(gè)活性陰離子部位的縮醛前體，(ii)讓縮醛前體與能夠聚合的反應(yīng)活性單體相接觸，由此引發(fā)該反應(yīng)活性單體聚合到縮醛前體之上，(iii)作為該接觸步驟的結(jié)果，將附加的反應(yīng)活性單體加成到該縮醛前體中以形成聚合物鏈，(iv)讓接觸繼續(xù)進(jìn)行，直至達(dá)到了聚合物鏈的所需長度為止，和(v)終止反應(yīng)獲得本發(fā)明的聚合物醛前體。
如果需要，所形成的聚合物醛前體能夠進(jìn)一步水解成如以上所述的相應(yīng)鏈烷醛。
在以上方法的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，反應(yīng)活性單體是環(huán)氧乙烷并且含在縮醛前體之內(nèi)的反應(yīng)活性陰離子部位是醇鹽陰離子(O-)，優(yōu)選伴有堿金屬或其它合適的抗衡離子。在縮醛前體中存在的醇鹽端基對于環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合形成本發(fā)明的聚合物鏈烷醛而言是有活性的。
該縮醛前體一般具有對應(yīng)于下式的結(jié)構(gòu) 其中變量具有如上所述的值，例外的是X’是以氧陰離子或O-終端(例如，在它的中性形式，X’典型地以羥基或-OH終端，和在強(qiáng)堿存在下，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)醇鹽)。合適的抗衡離子包括Na+，K+，Li+和Cs+。該終止步驟一般包括中和該反應(yīng)，例如，通過添加酸。任選地，聚合物鏈段可以通過烷基化試劑或適合提供非反應(yīng)活性末端的其它試劑的添加來封端。
當(dāng)結(jié)合下面的詳細(xì)說明進(jìn)行閱讀時(shí)，本發(fā)明的這些和其它的目的和特征將變得更加清楚。
附圖的簡述

圖1是由環(huán)氧乙烷(EO)的陰離子開環(huán)聚合到具有陰離子部位的縮醛前體上來制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的一般性反應(yīng)示意圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說明在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，需要理解的是，本發(fā)明不局限于特定的聚合物、合成技術(shù)、活化劑等等，這些可以變化。需要理解的是，這里所使用的術(shù)語是為了描述僅僅特定的實(shí)施方案和不希望是限制意義。
必須指出，正如在本說明書中所使用，單數(shù)形式“a”，“an”和“the”包括復(fù)數(shù)對象，除非該文本清楚地另外指定。因此，例如，“聚合物”的含義包括單種聚合物和兩種或多種相同或不同的聚合物，“接合物”的含義指單種接合物和兩種或多種相同或不同的接合物，“賦形劑”的含義包括單種賦形劑和兩種或多種相同或不同的賦形劑，等等。
在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時(shí)，下列術(shù)語將根據(jù)如下所述的定義來使用。
定義在這里使用的下面術(shù)語具有所指定的含義。
如在說明書和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另外清楚地指明。
在這里使用的“PEG”或“聚(乙二醇)”意指包括任何水溶性聚(環(huán)氧乙烷)。典型地，用于本發(fā)明的PEG包括下列結(jié)構(gòu)中的一種“-(CH2CH2O)n-”或“(CH2CH2O)n-1CH2CH2-”，這取決于末端氧是否被替代，例如在合成轉(zhuǎn)化過程中。該變量(n)是3-3000，并且整個(gè)PEG的端基和結(jié)構(gòu)可以變化。當(dāng)PEG進(jìn)一步包括連接基結(jié)構(gòu)部分(下面將更詳細(xì)描述)時(shí)，構(gòu)成該連接基(X’)的原子當(dāng)以共價(jià)鍵連接于PEG鏈段時(shí)，不會導(dǎo)致(i)氧-氧鍵(-O-O-，過氧鍵)，或(ii)氮-氧鍵(N-O，O-N)的形成。“PEG”指含有主要的，即大于50％的子單元-CH2CH2O-的聚合物。用于本發(fā)明中的PEG包括具有各種分子量、結(jié)構(gòu)或幾何形狀(例如，支化，線形，分叉的PEG，樹枝狀體，等等)的PEG，下面將更詳細(xì)描述。
在本發(fā)明的聚合物的范圍內(nèi)的“水溶性”或“水溶性聚合物鏈段”是在室溫下可溶于水中的任何鏈段或聚合物。典型地，水溶性聚合物或鏈段將透射由同一溶液在過濾之后所透射的光的至少約75％，更優(yōu)選至少約95％。按重量計(jì)，水溶性聚合物或它的鏈段優(yōu)選至少約35％(按重量)可溶于水，更優(yōu)選至少約50％(按重量)可溶于水，再更優(yōu)選約70％(按重量)可溶于水，和再更優(yōu)選約85％(按重量)可溶于水。然而，最優(yōu)選的是，水溶性聚合物或鏈段約95％(按重量)可溶于水或完全可溶于水。
“封端”基團(tuán)或“封端的”基團(tuán)是在聚合物如PEG的末端上存在的惰性基團(tuán)。封端基團(tuán)是在典型的合成反應(yīng)條件下不容易經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)變的基團(tuán)。封端基團(tuán)一般是烷氧基，-OR，其中R是1-20個(gè)碳組成的有機(jī)基團(tuán)和優(yōu)選是低級烷基(例如甲基，乙基)或芐基?！癛”可以是飽和或不飽和的，并且包括芳基，雜芳基，環(huán)狀基團(tuán)，雜環(huán)基團(tuán)，和任何上述基團(tuán)的取代形式。例如，封端的PEG將典型地包括結(jié)構(gòu)“RO-(CH2CH2O)n-”，其中R如上所定義。另外地，封端基團(tuán)也可以有利地包括可檢測到的標(biāo)記物(label)。當(dāng)聚合物具有包括可檢測到的標(biāo)記物的封端基團(tuán)時(shí)，聚合物和/或聚合物所偶聯(lián)到的結(jié)構(gòu)部分(例如活化劑)的量或位置能夠通過使用合適的檢測器來測定。此類標(biāo)記物包括，但不限于、熒光增白劑、化學(xué)發(fā)光劑、用于酶標(biāo)記中的結(jié)構(gòu)部分、比色(例如，染料)，金屬離子、放射性結(jié)構(gòu)部分，等等。
對于本發(fā)明的聚合物所說的“非天然”指聚合物在其實(shí)體上在自然界中是無法發(fā)現(xiàn)的。然而本發(fā)明的非天然聚合物可含有天然的一種或多種子單元或天然的子單元類的一種或多種鏈段，只要整個(gè)聚合物結(jié)構(gòu)在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)就行。
本發(fā)明的水溶性聚合物如PEG相關(guān)的“分子量”指聚合物的標(biāo)稱平均分子量，典型地由尺寸排阻色譜法，光散射技術(shù)，或在1，2，4-三氯苯中的特性速度測定法來測定。本發(fā)明的聚合物典型地是多分散的，具有低于約1.20的低多分散性數(shù)值。
術(shù)語“反應(yīng)活性”或“活化的”當(dāng)與特定的官能團(tuán)相結(jié)合使用時(shí)，指容易與典型地在另一個(gè)分子上存在的親電子或親核基團(tuán)反應(yīng)、發(fā)生轉(zhuǎn)化的官能團(tuán)。這與為了反應(yīng)需要強(qiáng)烈的催化劑或苛刻的反應(yīng)條件的那些基團(tuán)(即“非反應(yīng)活性”或“惰性”基團(tuán))不同。
術(shù)語“保護(hù)的”或“保護(hù)基團(tuán)”或“保護(hù)基”指在某些反應(yīng)條件下防止或阻斷特定的化學(xué)反應(yīng)活性官能團(tuán)的反應(yīng)的結(jié)構(gòu)部分(即，保護(hù)基團(tuán))的存在。該保護(hù)基團(tuán)將取決于被保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)以及所使用的反應(yīng)條件和另外的反應(yīng)活性或保護(hù)基團(tuán)(如果有的話)在分子中的存在來變化。在現(xiàn)有技術(shù)中已知的保護(hù)基團(tuán)能夠在Greene，T.W.等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，第三版，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY(1999)中見到。
在這里使用的術(shù)語“官能團(tuán)”或它的任何同義詞是指包括它們的被保護(hù)的形式。
術(shù)語“連接基結(jié)構(gòu)部分”在這里用于指任選地用于連接互聯(lián)結(jié)構(gòu)部分如聚合物鏈段和鏈烷醛的原子或多個(gè)原子。本發(fā)明的連接基結(jié)構(gòu)部分是對水解表現(xiàn)穩(wěn)定的或可以包括生理可水解的或酶促可降解的連接鍵。
“生理可斷裂的”或“可水解的”或“可降解的”鍵是在生理?xiàng)l件下與水反應(yīng)(即水解)的較弱鍵。鍵在水中水解的趨勢不僅取決于連接兩個(gè)中心原子的連接鍵的一般類型而且取決于附著于這兩個(gè)中心原子上的取代基。合適的水解不穩(wěn)定的或弱的鍵包括但不限于羧酸酯，磷酸酯，酸酐，縮醛，酮縮醇，酰氧基烷基醚，亞胺，原酸酯，肽和低聚核苷酸。
“酶促可降解的連接鍵”指由一種或多種酶發(fā)生降解的連接鍵。
“水解穩(wěn)定的”連接鍵或鍵意指化學(xué)鍵，典型地共價(jià)鍵，它在水中是充分穩(wěn)定的，即，在較長時(shí)間中在生理?xiàng)l件下不發(fā)生任何顯著程度的水解。水解穩(wěn)定的連接鍵的例子包括但不限于下列這些碳-碳鍵(例如，在脂族鏈中)，醚，酰胺，脲烷等。一般，水解穩(wěn)定的連接鍵是在生理?xiàng)l件下顯示出每天低于約1-2％的水解速率的一種連接鍵。代表性的化學(xué)鍵的水解速率能夠在大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的教科書中找到。
“鏈烷醛”指本發(fā)明的水溶性聚合物的醛部分(CHO)，其中包括羰基碳和任何另外的亞甲基或取代的亞甲基(-C(R1)(R2)-)，一直到將聚合物的鏈烷醛部分連接于聚合物鏈段上的那一連接基結(jié)構(gòu)部分為止。在命名鏈烷醛鏈段時(shí)，C1對應(yīng)于羰基碳。在這里使用的術(shù)語“鏈烷醛”意指包括醛基的水合和保護(hù)形式，以及硫?qū)僭?chalcogen)類似物。本發(fā)明的鏈烷醛的一個(gè)特別優(yōu)選的保護(hù)形式是縮醛。
在關(guān)系到本發(fā)明的某些聚合物鏈烷醛時(shí)的“羰基的總數(shù)”是包含在聚合物鏈烷醛中的羰基的總數(shù)，不計(jì)醛碳。
在關(guān)系到聚合物的幾何形狀或整體結(jié)構(gòu)時(shí)的“支化”指具有兩個(gè)或多個(gè)聚合物“分支”的聚合物。支化聚合物可以具有2個(gè)聚合物分支，3個(gè)聚合物分支，4個(gè)聚合物分支，6個(gè)聚合物分支，8個(gè)聚合物分支或更多。一個(gè)特殊類型的高度支化的聚合物是用于本發(fā)明的目的的樹枝狀聚合物或樹枝形聚合物，被認(rèn)為是具有與支化聚合物的結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。
“分支點(diǎn)”指包括一個(gè)或多個(gè)原子的分叉點(diǎn)，在該分叉點(diǎn)上聚合物從線形結(jié)構(gòu)分裂成或支化成一個(gè)或多個(gè)附加聚合物分支。
“樹枝形聚合物”是具有規(guī)則支化圖形和具有每個(gè)構(gòu)成分支點(diǎn)的許多個(gè)重復(fù)單元的球狀的、尺寸單分散聚合物，其中全部的鍵從中心的焦點(diǎn)或芯上徑向發(fā)散。樹枝形聚合物顯示出某些樹枝狀性能如芯的包圍，使得它們與其它類型聚合物表現(xiàn)不同。
“主要地”或“基本上”是指某給定量的幾乎總量或全部，例如95％或95％以上。
“逆Michael型產(chǎn)物”指從Michael型加成反應(yīng)的逆反應(yīng)得到的產(chǎn)物。Michael加成反應(yīng)(向前方向)指親核的碳物質(zhì)加成到吸電子雙鍵上。典型地，但不一定地，該親核試劑是烯醇鹽或烯胺，雖然親核試劑也能夠是醇鹽或胺或其它物質(zhì)。親電子試劑典型地是α，β-不飽和酮、酯、或腈，雖然其它吸電子基團(tuán)也能夠活化碳-碳雙鍵以便實(shí)施親核攻擊。從如上所述的Michael型加成反應(yīng)的逆反應(yīng)(或向后方向)，即，導(dǎo)致親核碳物質(zhì)(它可以但不一定是烯醇鹽或烯胺)的損失和如上所述的吸電子雙鍵如α，β不飽和酮等的形成的消去反應(yīng)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物被認(rèn)為是逆Michael型產(chǎn)物。例如，mPEG-丙醛的逆Michael型反應(yīng)導(dǎo)致得到逆Michael型產(chǎn)物，mPEG-OH和丙烯醛(CH2＝CH-CHO)。
“烷基”指烴鏈，典型地具有約1到20個(gè)原子的長度。此類烴鏈優(yōu)選是，但不一定地是飽和的并可以是支化或直鏈，雖然典型地直鏈?zhǔn)莾?yōu)選的。示例性的烷基包括甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，1-甲基丁基，1-乙基丙基，3-甲基戊基，等等。在這里使用的“烷基”當(dāng)談到三個(gè)或更多個(gè)碳原子時(shí)包括環(huán)烷基。
“低級烷基”指含有1到6個(gè)碳原子的烷基，并且可以是直鏈或支鏈，例如有甲基，乙基，正丁基，異丁基，叔丁基。
“環(huán)烷基”指飽和或不飽和的環(huán)烴鏈，包括橋連、稠合、螺環(huán)狀化合物，優(yōu)選由3到約12個(gè)碳原子組成，更優(yōu)選3到約8個(gè)碳原子組成。
“非干擾性取代基”是這樣一些基團(tuán)，當(dāng)存在于分子中時(shí)，它與在該分子內(nèi)所含的其它官能團(tuán)典型地?zé)o反應(yīng)活性。
如在例如“取代的烷基”中的術(shù)語“取代的”是指被一個(gè)或多個(gè)非干擾的取代基所取代的結(jié)構(gòu)部分(例如，烷基)，該取代基例如是，但不限于C3-C8環(huán)烷基，例如，環(huán)丙基，環(huán)丁基，等等；鹵素，例如，氟，氯，溴，和碘；氰基；烷氧基，低級苯基；取代的苯基；等等。對于在苯基環(huán)上的取代，取代基可以是任何取向(即，鄰，間，或?qū)?。
“烷氧基”指-O-R基團(tuán)，其中R是烷基或取代的烷基，優(yōu)選C1-C20烷基(例如，甲氧基，乙氧基，丙氧基，芐基，等等)，優(yōu)選C1-C7。
在這里使用的“鏈烯基”指具有1-15個(gè)碳原子的長度的含有至少一個(gè)雙鍵的支化或未支化的烴基團(tuán)，如乙烯基，正丙烯基，異丙烯基，正丁烯基，異丁烯基，辛烯基，癸烯基，十四碳烯基等等。
在這里使用的術(shù)語“炔基”是指具有2-15個(gè)碳原子的長度的、含有至少一個(gè)叁鍵的支化或未支化的烴基團(tuán)，如乙炔基，正丙炔基，異丙炔基，正丁炔基，異丁炔基，辛炔基，癸炔基等等。
“芳基”是指一個(gè)或多個(gè)芳族環(huán)，每一個(gè)環(huán)具有5或6個(gè)的核上碳原子。芳基包括多個(gè)芳基環(huán)，它可以是稠合的，如在萘基中，或是未稠合，如在聯(lián)苯基中。芳基環(huán)也可以與一個(gè)或多個(gè)環(huán)烴、雜芳基或雜環(huán)發(fā)生稠合或未稠合。在這里使用的“芳基”包括雜芳基。
“雜芳基”是含有一個(gè)到四個(gè)雜原子(優(yōu)選N，O或S，或它們的結(jié)合物)的芳基。雜芳基環(huán)也可以與一個(gè)或多個(gè)環(huán)烴，雜環(huán)，芳基或雜芳基環(huán)稠合。
“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”是指具有5-12個(gè)原子，優(yōu)選5-7個(gè)原子的，有或沒有不飽和鍵或芳香特性并具有至少一個(gè)不是碳的環(huán)原子的一個(gè)或多個(gè)環(huán)。優(yōu)選的雜原子包括硫，氧，和氮。
“取代的雜芳基”是具有一個(gè)或多個(gè)非干擾的基團(tuán)作為取代基的雜芳基。
“取代的雜環(huán)”是具有由非干擾的取代基形成的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈的雜環(huán)。
“親電子試劑”是指離子，原子，或原子的聚集體，它可以是離子的，具有親電中心即尋求電子的中心，能夠與親核試劑反應(yīng)。
“親核試劑”是指離子，原子，或原子的聚集體，它可以是離子的，具有親核中心即尋求親電中心的中心，和能夠與親電子試劑反應(yīng)。
在這里使用的“活化劑”包括可以提供在活體內(nèi)或活體外所表明的一些藥理(常常有益的)效果的任何試劑，藥物，化合物，物質(zhì)的組合物或混合物。這包括食品，食品增補(bǔ)劑，營養(yǎng)物，營養(yǎng)藥，藥物，疫苗，抗體，維生素類，和其它有益的試劑。在這里使用的，這些術(shù)語進(jìn)一步包括在患者體內(nèi)產(chǎn)生局部或全身效果的任何生理或藥理活性物質(zhì)。
“可藥用的賦形劑”或“可藥用的載體”是指能夠包括在本發(fā)明的組合物中但不對患者引起顯著的不利的毒理效果的賦形劑。
“藥理有效量”，“生理有效量”，和“治療有效量”在這里可互換地用于表示為了在血液中或在靶組織中提供預(yù)期水平的活化劑和/或接合物所需要的在藥物制劑中存在的PEG-活化劑接合物的量。精確的量取決于很多的因素，例如，特定的活化劑，藥物制劑的組分和物理特性，預(yù)定的患者群體，患者考慮因素等，并且能夠容易地由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員以這里所提供的和在相關(guān)文獻(xiàn)中可獲得的信息為基礎(chǔ)來確定。
本發(fā)明的聚合物相關(guān)的“多官能的”意指具有包含在其中的3個(gè)或3個(gè)以上官能團(tuán)的聚合物骨架，其中該官能團(tuán)可以是相同的或不同的，并且典型地在聚合物末端上存在。本發(fā)明的多官能聚合物典型地含有約3-100個(gè)官能團(tuán)，或3-50個(gè)官能團(tuán)，或3-25個(gè)官能團(tuán)，或3-15個(gè)官能團(tuán)，或3-10個(gè)官能團(tuán)，或在聚合物骨架內(nèi)含有3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)官能團(tuán)。
“雙官能”聚合物是指具有兩個(gè)含在其中的官能團(tuán)的聚合物，典型地在聚合物末端上。當(dāng)官能團(tuán)相同時(shí)，聚合物被說成是同類雙官能的。當(dāng)官能團(tuán)不同時(shí)，聚合物被說成是非同類雙官能的。
這里所述的堿性或酸性反應(yīng)物包括中性，帶電荷的，和它們的任何相應(yīng)鹽形式。
“聚烯烴醇”是指有多個(gè)側(cè)掛羥基連接于聚合物骨架上的包括烯烴聚合物骨架如聚乙烯的一種聚合物。舉例的聚烯烴醇是聚乙烯醇。
在這里使用的“非肽的”是指聚合物骨架基本上不含肽鍵。然而，聚合物可以包括少量的沿著重復(fù)單體子單元所間隔的肽鍵，例如，不超過1個(gè)肽鍵每約50個(gè)單體單元。
在這里使用的“水合物”是指由水分子加成到醛基上所形成的水合的醛，它以兩個(gè)羥基替換羰基官能團(tuán)。醛類與相應(yīng)的水合物n水達(dá)到平衡。
術(shù)語“硫?qū)僭仡愃莆铩笔侵溉╊愃莆?，其中氧原子被另一個(gè)雜原子(一般為硫，硒，或碲)替代。
術(shù)語“患者”是指遭受或易患一種病癥的活生物并包括人和動(dòng)物，該病癥能夠由本發(fā)明的聚合物(典型地但不一定是聚合物-活化劑接合物的形式)的給藥來防止或治療。
“任選的”或“任選地”指隨后描述的情況可以發(fā)生或不發(fā)生，這樣該敘述包括該情況發(fā)生的情形和不發(fā)生的情形。
聚合物在第一方面，本發(fā)明提供了具有反應(yīng)活性醛基的水溶性聚合物。本發(fā)明的聚合物在許多方面是獨(dú)特的。它們不僅以高產(chǎn)率制得，而且因?yàn)椴淮嬖谀軌驅(qū)е戮酆衔镦溄到夂筒畹木酆衔锒喾稚⑿缘挠泻Ψ磻?yīng)副產(chǎn)物而是貯存穩(wěn)定的。該聚合物，尤其封端的聚合物，另外以高純度制備，例如，不存在可檢測量的PEG-二醇派生的和其它聚合物的雜質(zhì)類。這一特征特別地有利用于制備高分子量封端PEG聚合物，例如，具有約30kDa或更大的分子量，其中在原料如mPEG中PEG二醇雜質(zhì)的量能夠是約2wt％至30wt％或更大，這取決于供應(yīng)商。而且，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明聚合物在反應(yīng)活性上低于其它已知的聚合物醛，使得它們在接合反應(yīng)中更有區(qū)別和在轉(zhuǎn)化，處理，和反應(yīng)后處理中更穩(wěn)定。
一般結(jié)構(gòu)特征和鏈烷醛部分一般而言，本發(fā)明的聚合物具有經(jīng)由中間連接基結(jié)構(gòu)部分連接到在醛官能團(tuán)(即，鏈烷醛部分)上終止的約1-約21個(gè)鄰接亞甲基或取代的亞甲基上的聚合物鏈段。對應(yīng)于本發(fā)明的聚合物的通用化結(jié)構(gòu)在下面作為結(jié)構(gòu)I來提供。
結(jié)構(gòu)I參考以上與結(jié)構(gòu)I相結(jié)合的敘述，聚合物鏈段是由POLY表示，連接基結(jié)構(gòu)部分是由X’表示，且鄰接的亞甲基(形成亞烷基鏈)或取代的亞甲基(形成取代的亞烷基鏈)是由-C(R1)(R2)-表示。更具體地說，在結(jié)構(gòu)I中，POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分；和z’是1到約21的整數(shù)。R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或有機(jī)基，如烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基。R2，在各情況下，也獨(dú)立地是H或有機(jī)基，如烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基。雖然在這里具體提供的許多結(jié)構(gòu)是醛，但是應(yīng)該理解的是，這些相同的結(jié)構(gòu)和實(shí)際上本發(fā)明總體上延伸到相應(yīng)的醛水合物、保護(hù)形式的醛、和硫?qū)僭仡愃莆铮渲性诮Y(jié)構(gòu)I中的羰基氧被硫，硒，或碲替代。
本發(fā)明提供了對于連接到醛基上的亞烷基鏈的尺寸而言的相當(dāng)大的靈活性。該碳鏈長度應(yīng)理解為是羰基碳(C1)加上將羰基碳連接到連接基上的中間碳原子的數(shù)目，(例如，構(gòu)成聚合物的[-C(R1)(R2)]z’部分的C的總數(shù))。該碳鏈長度典型地具有3到約22個(gè)碳原子，或更典型地約4到約13個(gè)碳原子。參考以上結(jié)構(gòu)I，這意味著z’的值典型地是2-約21，或更典型地約3-12。更明確地，z’的值最典型是下列當(dāng)中的一個(gè)1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或更大。最優(yōu)選的是在2-約8范圍內(nèi)的z’值。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的聚合物鏈烷醛是其中z’是3的聚合物鏈烷醛。
參考以上結(jié)構(gòu)I，某些類型的鏈烷醛是特別優(yōu)選的。此類化合物包括具有位于在碳鏈中的至少一個(gè)“C”上的至少一個(gè)有機(jī)基團(tuán)的如上所述鏈烷醛。有機(jī)基團(tuán)可以是上述有機(jī)基團(tuán)中的任何一種，例如烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基，其中烷基是優(yōu)選的。典型地，該烷基是直鏈低級烷基或支化低級烷基，如甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，戊基，等等，其中直鏈一般是優(yōu)選的。一個(gè)特別優(yōu)選的烷基取代基是甲基。
雖然聚合物的鏈烷醛部分可以具有位于在碳鏈中的一個(gè)或多個(gè)“C”上的一個(gè)以上有機(jī)基團(tuán)，但是一種類型的優(yōu)選鏈烷醛是其中在碳鏈中僅僅一個(gè)“C”被有機(jī)基團(tuán)取代和全部其它R1和R2是H的一種鏈烷醛。例如，不管亞烷基鏈的長度，優(yōu)選的是其中全部的R1和R2變量是H的鏈烷醛，例外的是(i)位于C-2上的R1或R2中的一個(gè)是烷基，或(ii)位于C-3上的R1或R2中的一個(gè)是烷基；或(iii)位于C-4上的R1或R2中的一個(gè)是烷基；或(iv)位于C-5上的R1或R2中的一個(gè)是烷基，等等。在這方面一個(gè)特別優(yōu)選類型的取代基是低級烷基如甲基，乙基，或丙基。本發(fā)明的示例的2-甲基取代的鏈烷醛，mPEG-2-甲基丁醛的合成描述在實(shí)施例17中。
現(xiàn)在關(guān)注聚合物的鏈烷醛部分，下面示出了某些優(yōu)選的鏈烷醛。
結(jié)構(gòu) I-A.
結(jié)構(gòu)I-A是其中在結(jié)構(gòu)I中的z’的值是3的一種鏈烷醛。這一結(jié)構(gòu)，不管C2，C3或C4中的任何一個(gè)或多個(gè)是否被如上所述的烷基或其它有機(jī)基團(tuán)取代，在這里稱作“丁醛(butyral dehyde)”或稱作“丁醛(butanal)”。本發(fā)明的示例的聚合物丁醛包括其中聚合物的鏈烷醛部分是2-甲基丁醛，異戊醛，或4-甲基丁醛，2-乙基丁醛，3-乙基丁醛，或4-乙基丁醛的那些。
結(jié)構(gòu) I-B結(jié)構(gòu)I-B是其中在結(jié)構(gòu)I中的z’的值是4的一種鏈烷醛。這一結(jié)構(gòu)，不管C2，C3，C4或C5中的任何一個(gè)或多個(gè)是否被如上所述的烷基或其它有機(jī)基團(tuán)取代，在這里稱作“戊醛(pentanal)”或稱作“戊醛(valeraldehyde)”。本發(fā)明的示例的聚合物戊醛包括其中聚合物的鏈烷醛部分是2-甲基戊醛，3-甲基戊醛，4-甲基戊醛，或5-甲基戊醛的那些。另外的聚合物戊醛包括其中聚合物的鏈烷醛部分是2-乙基戊醛，3-乙基戊醛，4-乙基戊醛，或5-乙基戊醛的那些。
結(jié)構(gòu) I-C結(jié)構(gòu)I-C是其中在結(jié)構(gòu)I中的z’的值是5的一種鏈烷醛。這一結(jié)構(gòu)，不管C2，C3，C4，C5或C6中的任何一個(gè)或多個(gè)是否被如上所述的烷基或其它有機(jī)基團(tuán)取代，在這里稱作“己醛”。本發(fā)明的示例聚合物己醛包括其中聚合物的鏈烷醛部分是2-甲基己醛，3-甲基己醛，4-甲基己醛，5-甲基己醛，6-甲基己醛，2-乙基戊醛，3-乙基戊醛，4-乙基戊醛，或5-乙基戊醛的那些。
本發(fā)明的聚合物的另外鏈烷醛組分包括庚醛，辛醛，壬醛，等等。
連接基結(jié)構(gòu)部分現(xiàn)在參見連接基結(jié)構(gòu)部分，本發(fā)明的連接基結(jié)構(gòu)部分或簡單地“連接基”一般由變量X’表示。該連接基結(jié)構(gòu)部分是將聚合物的鏈烷醛部分與聚合物鏈段連接的整個(gè)聚合物的那一部分(在下面更詳細(xì)地描述)。本發(fā)明的連接基可以是單個(gè)原子，如氧或硫，兩個(gè)原子，或多個(gè)原子。連接基典型地但不一定是線形的。連接基的總長度典型地是1-約40個(gè)原子，其中長度指在單個(gè)鏈中的原子數(shù)目，不計(jì)取代基。例如，-CH2-視為對于整個(gè)連接基長度而言的一個(gè)原子，-CH2CH2O-視為3個(gè)原子長度。優(yōu)選地，連接基將具有約1-約20個(gè)原子，或約2-約15個(gè)原子的長度。
本發(fā)明的連接基能夠是單個(gè)官能團(tuán)如酰胺，酯，脲烷，或脲，或可以含有在單個(gè)官能團(tuán)的任一側(cè)翼連接的亞甲基或者其它亞烷基基團(tuán)?；蛘?，連接基可以含有相同或不同的官能團(tuán)的結(jié)合物。另外，本發(fā)明的連接基能夠是亞烷基鏈，任選地含有一個(gè)或多個(gè)氧或硫原子(即，醚或硫醚)。優(yōu)選的連接基是水解穩(wěn)定的那些連接基。當(dāng)在結(jié)構(gòu)I的范圍內(nèi)觀察時(shí)，連接基是當(dāng)被認(rèn)為是整個(gè)聚合物的一部分時(shí)不會導(dǎo)致含有過氧鍵(-O-O-)或-N-O-或-O-N-鍵的整體結(jié)構(gòu)的一種連接基。
示例性的連接基X’是對應(yīng)于下列結(jié)構(gòu)中的任何一個(gè)的那些連接基-(CH2)c-De-(CH2)f-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-。
在參見以上連接基結(jié)構(gòu)時(shí)，變量“c”是0-8；“D”是O，NH，或S；變量“e”是0或1；變量“f”是0-8；變量“p”是0-8；“M”是-NH或O；“K”是NH或O；變量“q”是0-8，和變量“r”和“s”各自獨(dú)立地是0或1。
在結(jié)構(gòu)I的范圍內(nèi)，本發(fā)明的連接基X’可以是下列的任何一種-O-，-NH-，-S-，-C(O)-，C(O)-NH，NH-C(O)-NH，O-C(O)-NH，-C(S)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-，-CH2-O-，-O-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH2-，-CH2-C(O)-O-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-，-C(O)-O-CH2-CH2-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-，-NH-CH2-，-NH-CH2-CH2-，-CH2-NH-CH2-，-CH2-CH2-NH-CH2-，-C(O)-CH2-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，二價(jià)環(huán)烷基，-N(R6)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-，和前述基團(tuán)中的任何兩個(gè)或多個(gè)的結(jié)合，其中(h)是0-6，(j)是0-20，R6是H或選自烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基和取代芳基中的有機(jī)基團(tuán)。其它特定的連接基具有以下結(jié)構(gòu)-C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-，或-NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-或-OC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-，其中在各亞甲基之后的下標(biāo)值表示包含在連接基結(jié)構(gòu)中的亞甲基的可能數(shù)量，例如，(CH2Z)1-6是指連接基可以含有1，2，3，4，5或6個(gè)亞甲基。
然而，對于本公開物，當(dāng)一系列的原子緊鄰于聚合物鏈段POLY且該一系列的原子是另一種單體而使得所建議的連接基結(jié)構(gòu)部分代表了聚合物鏈的僅僅延伸部分時(shí)，該一系列的原子不應(yīng)認(rèn)為是連接基結(jié)構(gòu)部分。例如，假設(shè)一種部分結(jié)構(gòu)“POLY-X’-”，其中在這一情況下的POLY被定義為“CH3O(CH2CH2O)n-”，該連接基結(jié)構(gòu)部分將不是“-CH2CH2O-”，因?yàn)樵摱x僅僅代表了聚合物的延伸。然而這不是說本發(fā)明的連接基不能具有一個(gè)或多個(gè)鄰接-CH2CH2O-部分。例如，連接基可以含有一個(gè)或多個(gè)(-CH2CH2O-)子單元，在一側(cè)或兩側(cè)翼帶有以上所例舉的示例性連接基的一種或多種結(jié)合物。
也就是說，如以上所述的連接基也能夠包括低聚物如-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-，其中b和g各自獨(dú)立地是1-約20。申請人發(fā)現(xiàn)，將此類低聚物包含在連接基內(nèi)通過延長在醛官能團(tuán)和在連接基內(nèi)含有的任何反應(yīng)活性基團(tuán)之間的距離來為最終的聚合物鏈烷醛產(chǎn)物提供穩(wěn)定性。這樣，分子內(nèi)相互作用被削弱，導(dǎo)致在制備過程中提高了產(chǎn)率和改進(jìn)聚合物鏈烷醛產(chǎn)物的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，變量b和g是約1-10，或在某些情況下是約1-6。在連接基中具有四個(gè)鄰接-(CH2CH2O)-單元的示例性聚合物鏈烷醛的合成描述在實(shí)施例5中。
下面給出了含有-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-低聚物鏈段的特定連接基的另外例子，其中X’包括或由下式定義-(CH2)c-De-(CH2)f-P-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-。
在以上的示例性結(jié)構(gòu)中，P和T各自獨(dú)立地是-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-，b和g各自獨(dú)立地是1-20，和剩余變量如以上所定義。這一類型的優(yōu)選連接基的例子是-O-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，-NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，-O-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-，-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-，和-NH-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-。
在某些情況下，例如，當(dāng)POLY表示線形聚合物鏈段時(shí)，則優(yōu)選在聚合物鏈烷醛中存在的羰基的總數(shù)是0或2或更大，其中羰基的總數(shù)不包括醛羰基。然而，當(dāng)連接基X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)鏈段時(shí)，則優(yōu)選的是在聚合物鏈烷醛中存在的羰基的總數(shù)是0，或1，或2，或3，或更大。
重新參見結(jié)構(gòu)I，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)X’是氧或包括至少一個(gè)(-CH2CH2O-)鏈段時(shí)，和z’是2-12時(shí)，則在至少一種情況下R1或R2中的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)，或者，聚合物是非同類雙官能化的。對于聚合物是非同類雙官能化的情況，聚合物鏈段POLY優(yōu)選在一個(gè)末端具有不是羥基的反應(yīng)活性基團(tuán)。
優(yōu)選，該連接基是水解穩(wěn)定的，和可以含有一個(gè)或多個(gè)下列官能團(tuán)酰胺，脲烷，醚，硫醚，或脲。然而，水解可降解的連接鍵，如羧酸酯，磷酸酯，原酸酯，酸酐，亞胺，縮醛，酮縮醇，低聚核苷酸，或肽，也可以存在于本發(fā)明的連接基中。雜原子連接基如O或S，是特別優(yōu)選的，對于如上所述的含有低聚-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g鏈段的連接基是這種情況。
用于制備聚合物鏈烷醛的聚合物鏈段/聚合物如在以上示例性結(jié)構(gòu)中所示，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛含有水溶性聚合物鏈段。代表性POLY包括聚(亞烷基二醇)如聚(乙二醇)，聚(丙二醇)(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物，聚(烯烴醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羥烷基甲基丙烯酰胺)，聚(甲基丙烯酸羥烷基酯)，聚(糖)，聚(α-羥基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰基嗎啉)。POLY能夠是均聚物，交替共聚物，無規(guī)共聚物，嵌段共聚物，交替三元共聚物，無規(guī)三元共聚物，或任何上述聚合物的嵌段三元共聚物。水溶性聚合物鏈段優(yōu)選是，雖然不一定，聚(乙二醇)或“PEG”或它的衍生物。
聚合物鏈段能夠具有許多不同的幾何形狀中的任何一種，例如，POLY能夠是線形，支化，或分叉的。最典型地，POLY是線形的或是支化的，例如，具有2個(gè)聚合物分支。雖然這里的許多討論是針對作為示例性POLY的PEG，但是在這里給出的討論和結(jié)構(gòu)能夠容易地延伸到包括如上所述的水溶性聚合物鏈段中的任何一種。
具有至少一個(gè)反應(yīng)活性末端的任何水溶性聚合物能夠用于制備根據(jù)本發(fā)明的聚合物鏈烷醛且本發(fā)明在這一方面不受限制。雖然能夠使用攜帶僅僅單個(gè)反應(yīng)活性末端的水溶性聚合物，但是適合于轉(zhuǎn)化成如這里所述的聚合物鏈烷醛的攜帶兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)，九個(gè)，十個(gè)，十一個(gè)，十二個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)活性末端的聚合物都能夠使用。有利地，隨著在水溶性聚合物鏈段上羥基或其它反應(yīng)活性結(jié)構(gòu)部分的數(shù)量的提高，供引入鏈烷醛基團(tuán)的有效位點(diǎn)的數(shù)量增加。與水溶性聚合物鏈段相結(jié)合的羥基和/或反應(yīng)活性結(jié)構(gòu)部分的數(shù)量的上限的非限制性例子包括500，100，80，40，20，和10。
現(xiàn)在參見優(yōu)選的POLY，PEG，“PEG”包括呈現(xiàn)線形、支化或多分支形式中的任何一種的聚(乙二醇)，其中包括封端PEG，分叉PEG，支化PEG，側(cè)掛PEG，和含有一個(gè)或多個(gè)分開該單體子單元的可降解的連接鍵的PEG，下面將更充分地描述。
為了制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛，一種常用的PEG起始原料是游離PEG，一種在每一端以羥基終端的線形聚合物HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-OH。
以上聚合物α-，ω-二羥基聚(乙二醇)能夠以簡單形式表示為HO-PEG-OH，在這里也稱作PEG-二醇，其中在“HO-PEG-OH”中的“-PEG-”對應(yīng)于-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2-和(n)典型地是約3-約4,000，或約3-約3,000，或更多優(yōu)選約20-約1,000。參見結(jié)構(gòu)I，POLY例如可以是羥基終端的PEG如HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2-。
用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的另一類型PEG是封端的PEG，其中PEG以惰性封端基團(tuán)來封端。優(yōu)選的封端PEG是具有作為封端結(jié)構(gòu)部分的基團(tuán)如烷氧基，取代的烷氧基，鏈烯氧基，取代的鏈烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，取代的芳氧基的那些PEG。優(yōu)選的是封端基團(tuán)如甲氧基，乙氧基，和芐氧基。
現(xiàn)在參見結(jié)構(gòu)I和I-A至I-C，在某些實(shí)施方案中POLY是或包括對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)的聚(乙二醇)“Z-(CH2CH2O)n”或“Z-(CH2CH2O)nCH2CH2-”，其中n是約3到約4000，或約10到約4000，和Z是或包括官能團(tuán)如羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂類，生物素，和熒光素。再次，緊接著在以上示出的POLY結(jié)構(gòu)可以表示線形聚合物鏈段或可以構(gòu)成支化或分叉聚合物鏈段的一部分。對于聚合物鏈段是支化的情況，緊接著在以上的POLY結(jié)構(gòu)可以是，例如，對應(yīng)于聚合物分支，后者構(gòu)成了整個(gè)POLY結(jié)構(gòu)的一部分。另外地，對于其中POLY具有分叉結(jié)構(gòu)的情況，以上POLY結(jié)構(gòu)例如可以對應(yīng)于在分支點(diǎn)之前的聚合物鏈段的線形部分。
POLY也可以對應(yīng)于具有2個(gè)分支，3個(gè)分支，4個(gè)分支，5個(gè)分支，6個(gè)分支，7個(gè)分支，8個(gè)分支或更多的支化PEG分子。用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的支化聚合物可以具有2到300個(gè)左右的反應(yīng)活性末端基。優(yōu)選的是具有2或3個(gè)聚合物分支的支化聚合物鏈段。如在US專利No.5,932,462中所述的示例性支化POLY對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu) 在這些表述中，R″是非反應(yīng)活性結(jié)構(gòu)部分，如H，甲基或PEG，以及P和Q是非反應(yīng)活性連接鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，支化PEG聚合物鏈段是甲氧基聚(乙二醇)二取代的賴氨酸。
在以上特定的支化構(gòu)型中，支化聚合物鏈段具有從“C”分支點(diǎn)延伸的單個(gè)反應(yīng)活性部位，后者用于反應(yīng)活性鏈烷醛基團(tuán)經(jīng)由連接基的定位。支化PEG如用于本發(fā)明的這些典型地具有低于4個(gè)PEG分支，和更優(yōu)選，將具有2或3個(gè)PEG分支。此類支化PEG帶來了具有單個(gè)反應(yīng)活性位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，在其上聯(lián)接了比它們的線形PEG對應(yīng)物更大、更致密的聚合物云。
一種特定類型的支化PEG鏈烷醛對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)(MeO-PEG-)iG-X’-鏈烷醛，其中i等于2或3，和G是賴氨酸或其它合適的氨基酸殘基。
本發(fā)明的示例性支化聚合物鏈烷醛具有下面所示的結(jié)構(gòu) 在這一情況下，該連接基對應(yīng)于C(O)-NH，任選含有位于在酰胺氮與聚合物的鏈烷醛部分之間的低聚-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-鏈段，如在下面的結(jié)構(gòu)V-B中所示。示例性的低聚物鏈段將具有在約1-約40，或約1-約30的b或g值。優(yōu)選b或g具有在20或20以下的值。優(yōu)選，b或g將具有下列值中的一個(gè)2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更大。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，b或g是2-6，和mPEGa和mPEGb是相同的或是不同的。
某些實(shí)施方案對于具有支化結(jié)構(gòu)的聚合物鏈烷醛是優(yōu)選的。例如，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，例如當(dāng)在結(jié)構(gòu)I中的POLY是支化的時(shí)，則在至少一種情況下R1或R2中的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，例如，對于POLY包括賴氨酸殘基的情況，當(dāng)在結(jié)構(gòu)I中的POLY是支化的時(shí)，則X’包括-(CH2CH2O)b-，其中b是1-約20。偶然地當(dāng)POLY具有2個(gè)聚合物分支時(shí)，優(yōu)選的是，對于POLY包括“C-H”作為分支點(diǎn)的情況，聚合物分支包括氧作為唯一的雜原子。
用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的支化PEG另外包括更一般由通式G(PEG)n表示的那些，其中G是中心或核分子，從它延伸出2個(gè)或更多個(gè)PEG分支。變量n表示PEG分支的數(shù)目，其中聚合物分支能夠獨(dú)立地是封端的或另外在它的末端具有反應(yīng)活性官能團(tuán)，如鏈烷醛或其它反應(yīng)活性官能團(tuán)。支化PEG如一般由以上結(jié)構(gòu)式G(PEG)n表示的那些具有2個(gè)聚合物分支到約300個(gè)聚合物分支(即，n是2到約300)。支化PEG如這些PEG優(yōu)選具有2到約25個(gè)聚合物分支，更優(yōu)選2到約20個(gè)聚合物分支，和更優(yōu)選2到約15個(gè)聚合物分支或更少。最優(yōu)選的是有3，4，5，6，7或8個(gè)分支的多分支聚合物。
在如上所述的支化PEG中的優(yōu)選的芯分子是多元醇。此類多元醇包括具有1到10個(gè)碳原子和1到10個(gè)羥基的脂族多元醇，其中包括乙二醇，鏈烷烴二醇，烷基二醇，烷叉基烷基二醇，烷基環(huán)烷烴二醇，1，5-十氫萘二醇，4，8-雙(羥甲基)三環(huán)癸烷，環(huán)烷叉基二醇，二羥基鏈烷烴，三羥基鏈烷烴等等。脂環(huán)族多元醇也可以使用，其中包括直鏈或閉環(huán)的糖和糖醇，如甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，木糖醇，白堅(jiān)木醇，蘇糖醇，阿糖醇，赤蘚醇，阿東糖醇，衛(wèi)矛醇，facose，核糖，阿糖，木糖，來蘇糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，果糖，山梨糖，甘露糖，吡喃糖，阿卓糖，塔羅糖，塔格糖(tagitose)，吡喃糖苷，蔗糖，乳糖，麥芽糖，等等。另外的脂族多元醇包括甘油醛，葡萄糖，核糖，甘露糖，半乳糖，和相關(guān)的立體異構(gòu)體的衍生物。可以使用的其它芯多元醇包括冠醚，環(huán)糊精，糊精和其它碳水化合物如淀粉和直鏈淀粉。優(yōu)選的多元醇包括甘油，季戊四醇，山梨糖醇，和三羥甲基丙烷。
用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的多分支PEG包括可從Nektar，Huntsville，Alabama獲得的多分支PEG。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多分支聚合物鏈烷醛對應(yīng)于下式，其中分子的鏈烷醛部分的細(xì)節(jié)在本文其它地方提供。

n＝0 to 4結(jié)構(gòu)XIII-A。
或者，聚合物鏈烷醛可以具有總體分叉結(jié)構(gòu)。分叉PEG的例子對應(yīng)于結(jié)構(gòu)PEG-Y-CH-(X’-[C(R1)(R2)]z-CHO)2，其中PEG是在這里描述的PEG的任何形式，Y是連接基團(tuán)，優(yōu)選水解穩(wěn)定的連接鍵，和另一個(gè)變量對應(yīng)于該連接基和該鏈烷醛部分如以上所定義。
另外的示例性分叉PEG鏈烷醛衍生物對應(yīng)于下式PEG-Q-CH-[(CH2)m-X0，1-C(O)-Y-V-alkanal]2結(jié)構(gòu)XIII-B。
其中PEG是在這里描述的PEG的形式的任何一種。Q是水解穩(wěn)定的連接鍵，如氧，硫，或-C(O)-NH-；m是1-10，(即，m能夠等于1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10)，但優(yōu)選，m是1，2，3，或4；X是任選的原子，和當(dāng)存在時(shí)，是O或N；Y是NH或O；和V是任選的低聚鏈段例如前面所述的-(CH2CH2O)b-或(CH2CH2NH)g-。在以上結(jié)構(gòu)式中對應(yīng)于“PEG”的示例性支化PEG是mPEG二取代的賴氨酸，其中“PEG”對應(yīng)于 或者，用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的PEG聚合物鏈段可以是沿著PEG鏈長度而不是在末端上具有側(cè)掛反應(yīng)活性基團(tuán)的PEG分子，得到了具有由連接基X’連接于PEG鏈上的一個(gè)或多個(gè)側(cè)掛鏈烷醛基團(tuán)的聚合物鏈烷醛。
此外，聚合物鏈段可以具有一個(gè)或多個(gè)弱或可降解的連接鍵，如容易發(fā)生水解的酯鍵。可以包含在POLY中的其它的水解可降解的連接鍵包括碳酸酯，亞胺，磷酸酯，和腙。
一般，水溶性聚合物鏈段POLY的標(biāo)稱平均分子量將會變化。POLY的標(biāo)稱平均分子量典型地屬于下列范圍中的一個(gè)或多個(gè)范圍內(nèi)約100道爾頓到約100,000道爾頓，約500道爾頓到約80,000道爾頓，約1,000道爾頓到約50,000道爾頓，約2,000道爾頓到約25,000道爾頓，約5,000道爾頓到約20,000道爾頓。用于水溶性聚合物鏈段POLY的示例性標(biāo)稱平均分子量包括約1,000道爾頓，約5,000道爾頓，約10,000道爾頓，約15,000道爾頓，約20,000道爾頓，約25,000道爾頓，約30,000道爾頓，和約40,000道爾頓。低分子量聚具有約250，500，750，1000，2000，或5000道爾頓的分子量。
代表性聚合物鏈烷醛按照以上一般性敘述，下列是說明了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選聚合物鏈烷醛的一些示例性結(jié)構(gòu)。
例如，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛，當(dāng)為線形時(shí)可以具有根據(jù)以下結(jié)構(gòu)II的同類雙官能化或非同類雙官能化的結(jié)構(gòu)。根據(jù)以下結(jié)構(gòu)的同類雙官能的結(jié)構(gòu)是其中兩個(gè)末端相同的一種結(jié)構(gòu)。
X’和-CR1R2-的優(yōu)選值是如以上所定義。根據(jù)結(jié)構(gòu)II的特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是這樣一些，其中POLY是聚(乙二醇)，和X’是-O-C(O)-NH-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，或-NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-，和z’是2到約12，和更優(yōu)選2，3，4，5或6。更具體地，本發(fā)明的代表性聚合物鏈烷醛包括下列
結(jié)構(gòu)III-A 結(jié)構(gòu)IV-A 結(jié)構(gòu)III-C 結(jié)構(gòu)IV-C，其中PEG是聚(乙二醇)，b和g各自獨(dú)立地是0到20，a是0-6，和剩余變量如前面所定義。優(yōu)選的是其中b和g是在1-8范圍或另外是在1-約6范圍的結(jié)構(gòu)。雖然z’是1-約21，但是優(yōu)選的是其中z’是2-6，例如，是3或4，的那些結(jié)構(gòu)。
下面提供了其中變量“a”(如在緊接著以上的結(jié)構(gòu)中所示)是零的兩種聚合物鏈烷醛的結(jié)構(gòu)示意圖。

結(jié)構(gòu)III-B。
結(jié)構(gòu)IV-B。
示例性聚合物丁醛具有以下結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)III-D。
對應(yīng)于以上結(jié)構(gòu)III-D的特別優(yōu)選的PEG包括Z-(CH2CH2O)n-或 根據(jù)本發(fā)明的另外的支化結(jié)構(gòu)如下，其中b典型地是0到20，a典型地是0到6，和d是1，2或3， 結(jié)構(gòu)VI-A或 結(jié)構(gòu)VI-B在以上結(jié)構(gòu)VI-A和B中，PEG能夠是成形或支化的。優(yōu)選地，R1和R2在各情況下是H，和z’是3到12，和更優(yōu)選是3，4，5，或6。作為一個(gè)例子，根據(jù)結(jié)構(gòu)VI-B的聚合物滿足以下條件的一種PEG對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)
其中Z是如前面所定義的封端基或官能團(tuán)。
本發(fā)明的另一示例性支化聚合物鏈烷醛具有下面所示的結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)XIV在上述實(shí)施方案中，聚合物鏈烷醛也具有分叉結(jié)構(gòu)和適合以共價(jià)鍵連接于兩個(gè)生物活性劑上。以上結(jié)構(gòu)含有，在從-CH-分支點(diǎn)延伸的部分中，包含低聚-(CH2CH2O)-鏈段的連接基，其中在各部分中此類鏈段的數(shù)量是3。在以上結(jié)構(gòu)中此類低聚鏈段的數(shù)量能夠根據(jù)以上提供的通用化敘述來改變。
其它示例性聚合物鏈烷醛結(jié)構(gòu)包括下列這些，其中變量如前面所定義 結(jié)構(gòu)VII 結(jié)構(gòu)VII-A 結(jié)構(gòu)VIII。
優(yōu)選，以上結(jié)構(gòu)中的任何一種作為具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的組成特征的組合物來提供，下面更詳細(xì)地描述。
所形成的聚合物鏈烷醛組合物的特征和制備方法本發(fā)明的聚合物鏈烷醛具有與先前制備的聚合物醛相比的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，聚合物鏈烷醛以很高的產(chǎn)率制得，部分地歸因于所使用的合成方法的簡單性，特別對于有氧作為該連接基結(jié)構(gòu)部分的鏈烷醛類。另外，在考察本發(fā)明的丁醛的穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些類型的鏈烷醛在堿性條件下比先前已知的聚合物醛衍生物(例如丙醛，乙醛)更穩(wěn)定，并且是在沒有較大量或甚至沒有可檢測量的逆Michael型反應(yīng)副產(chǎn)物的情況下形成的。例如，如在實(shí)施例3中所說明，在堿性條件下，mPEG丙醛經(jīng)歷逆Michael型反應(yīng)，產(chǎn)生較大量的mPEG-OH和消去產(chǎn)物(丙烯醛)(在室溫和pH8下24小時(shí)過后，幾乎40％的PEG-丙醛已經(jīng)分解)。相反，mPEG丁醛在堿性條件下顯著地更穩(wěn)定，說明在所使用的條件下基本上沒有這一類型的分解。
此外，本發(fā)明的丁醛聚合物衍生物在水中以其相應(yīng)水合物在約50％水合物下達(dá)到平衡，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于由丙醛顯示出的70％水合物平衡和由乙醛顯示出的100％水合物。本發(fā)明的聚合物衍生物的較低反應(yīng)活性也可通過在堿性條件下本發(fā)明的衍生物的顯著更大的穩(wěn)定性來證明(參見下面的實(shí)施例3)。在本發(fā)明的醛衍生物和蛋白質(zhì)或其它分子之間在堿性pH下的接合反應(yīng)中沒有觀察到丙烯醛副產(chǎn)物。本發(fā)明的醛衍生物的較低反應(yīng)活性說明本發(fā)明的衍生物更具選擇性，意味著本發(fā)明的衍生物能夠以更大的選擇性或特異性與在蛋白質(zhì)或肽上的特定氨基，尤其N-末端氨基進(jìn)行反應(yīng)，這與在蛋白質(zhì)或肽分子上的許多氨基之間的無選擇性的或隨機(jī)的反應(yīng)相反。在許多應(yīng)用中，聚合物骨架的選擇性N-末端連接可以更好地保持蛋白質(zhì)構(gòu)象和生物活性。
另外，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛在溫和的酸性條件下，即在不如PEG乙醛或PEG丙醛所需要的苛刻的酸性條件下，由水解作用從相應(yīng)的縮醛前體形成。如果需要，這一溫和條件允許本發(fā)明的聚合物衍生物與蛋白質(zhì)，肽，或其它分子靶物的直接原位接合，無需中間的分離步驟。此外，由于所使用的合成方法，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛也能夠以高純度提供，常常不存在含碘的物質(zhì)或能夠促進(jìn)聚合物鏈段的分解的物質(zhì)。
歸因于所使用的合成方法的溫和性，和進(jìn)一步歸因于在這里提供的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性質(zhì)，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛另外作為基本上不存在逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物的組合物而獲得。因此，在這里提供的聚合物鏈烷醛組合物尤其是貯存穩(wěn)定的，顯示出非常有限量(如果有的話)的聚合物分解。作為一個(gè)例子，以隨時(shí)間推移所收集到的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛被發(fā)現(xiàn)當(dāng)在40℃下貯存15天時(shí)顯示出聚合物醛基低于約10％的降解。這一百分?jǐn)?shù)降解率是由NMR分析測定的。另外，所提供的是基本上不含相應(yīng)PEG-二鏈烷醛(即，由于在mPEG-OH原料中一定量PEG-二醇的存在而產(chǎn)生的同類雙官能化PEG雜質(zhì))的本發(fā)明的線形mPEG聚合物鏈烷醛。
現(xiàn)在更具體地描述制造本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的方法，聚合物鏈烷醛一般通過具有至少一個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)Y的水溶性聚合物與適合被Y替代或者與Y反應(yīng)的含有反應(yīng)活性基團(tuán)K的受保護(hù)的鏈烷醛試劑之間在有效形成被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛的條件下進(jìn)行反應(yīng)來制備。一般，被保護(hù)的鏈烷醛試劑將具有約2-約20個(gè)碳原子。所形成的被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛然后典型地例如在堿性條件下水解形成所需要的水溶性聚合物鏈烷醛。
典型地，偶聯(lián)反應(yīng)(即，反應(yīng)性聚合物和被保護(hù)的鏈烷醛試劑的偶聯(lián))是在有機(jī)溶劑如甲苯，氯仿，二氯甲烷，乙腈，丙酮，二噁烷，甲醇，和乙醇中進(jìn)行的。反應(yīng)優(yōu)選在惰性氣氛下，在約20℃到約150℃的溫度下進(jìn)行的。水解形成所需鏈烷醛的過程典型地由酸來促進(jìn)，并且是在低于7.0的pH下來進(jìn)行的，其中優(yōu)選的pH是約3到約6.5。水解能夠在約3，4，5或6的pH下進(jìn)行，其中在3左右的較低pH是優(yōu)選的。
以上給出的合成方法的詳細(xì)實(shí)例在實(shí)施例1，2，5，和17中提供。
最典型地，聚合物鏈段偶聯(lián)到被保護(hù)的鏈烷醛試劑上是經(jīng)由Williamson醚合成來進(jìn)行的。更具體地說，聚合物的反應(yīng)活性基團(tuán)Y是羥基(它在強(qiáng)堿存在下轉(zhuǎn)化成它的相應(yīng)陰離子或烷氧基形式)，且在被保護(hù)的鏈烷醛試劑縮醛上的反應(yīng)活性基團(tuán)K是良好的離去基團(tuán)如鹵素(優(yōu)選Cl-或Br-)或甲基硫酸根(磺酸酯)，它們能夠容易地被位于聚合物末端上的氧陰離子所置換。所形成的優(yōu)選的連接鍵是將POLY連接到鏈烷醛上的醚連接鍵(O-)。
在連接到POLY上之后，被保護(hù)的鏈烷醛在酸性pH下水解形成相應(yīng)醛或鏈烷醛官能團(tuán)。如上所指出，鏈烷醛縮醛如丁醛縮醛在比相應(yīng)丙醛或乙醛縮醛更溫和的條件下水解。例如，當(dāng)z’是3或更大的時(shí)，本發(fā)明的鏈烷醛縮醛能夠在約3或4或更高的pH下水解，尤其當(dāng)R1和R2在全部情況下是H時(shí)。如在實(shí)施例2和4中所表明，其中描述的丁醛乙縮醛基在pH3下在約3小時(shí)的時(shí)間中水解。在溫和酸性條件下形成這一鏈烷醛官能團(tuán)的能力是有利的，因?yàn)樗軌蛟诤芯酆衔镦溚槿┑娜芤褐泻偷竭m合于接合的pH(典型地約5到約10的pH)之后使得醛官能化的聚合物原位用于接合到蛋白質(zhì)或其它生物活性分子上。相反，線形聚合物丙醛需要在接合之前的分離，這歸因于為了中和低pH溶液所需要的堿的量和在該中和步驟中產(chǎn)生的相應(yīng)較大量的鹽。
在所使用的方法中，被保護(hù)的鏈烷醛試劑典型地是縮醛如二甲基縮醛，二乙基縮醛，二異丙基縮醛，二芐基縮醛，2，2，2-三氯乙基縮醛，雙(2-硝基芐基)縮醛，S，S’-二甲基縮醛，和S，S’-二乙基縮醛。另外地，該縮醛可以是環(huán)狀縮醛或環(huán)狀硫代縮醛。
更具體地說，被保護(hù)的鏈烷醛通常具有如下結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)XI-D。
在這一結(jié)構(gòu)中，z’是1到約21的整數(shù)。對于以上提供的聚合物醛，R1在各情況下獨(dú)立地是H或選自烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；和R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)。其中Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，以及R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。
優(yōu)選，K是下列反應(yīng)活性基團(tuán)中的一個(gè) 在這一方法中，處于被保護(hù)形式的聚合物鏈烷醛典型地以大于約85％產(chǎn)率，和甚至更優(yōu)選以大于約90-95％產(chǎn)率形成。
在水解獲得所需的醛官能化聚合物之后，如果需要的話該產(chǎn)物可以通過中和反應(yīng)混合物，例如升高pH至約6.0到約7.5，隨后將聚合物鏈烷醛萃取到有機(jī)溶劑中，和通過例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，或蒸餾除去溶劑而分離。
由于既不使用直接的氧化方法又不使用含有碘的物質(zhì)來得到所需醛官能團(tuán)的這一方法的簡單性，所形成的產(chǎn)物是高純度的，表現(xiàn)出與其它已知聚合物醛相比的提高的貯存穩(wěn)定性，和具有低的多分散性(低于約1.5，優(yōu)選低于約1.2，和典型地低于約1.1，1.08，1.05，1.04，和1.3的多分散性)。因此制備了具有低到1.03，1.02和1.01的多分散性的聚合物。
本發(fā)明的所分離的聚合物鏈烷醛優(yōu)選具有至少約95％的純度，基于聚合物污染物。
實(shí)施例1和2說明了mPEG聚合物鏈烷醛的形成。對于聚合物起始原料是PEG-二醇的情況，PEG羥基中的一個(gè)一般在與被保護(hù)的鏈烷醛試劑反應(yīng)之前加以保護(hù)，隨后在偶聯(lián)之后去保護(hù)。所形成的全部示例性的聚合物保護(hù)鏈烷醛由下面的結(jié)構(gòu)XI-E來表示。
結(jié)構(gòu)XI-E。
如果需要，PEG的羥基末端能夠支化成官能團(tuán)，得到同類雙官能化的或非同類雙官能化的保護(hù)鏈烷醛。合適的官能團(tuán)包括氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，酰肼，異硫氰酸酯，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，和硅烷。優(yōu)選的是官能團(tuán)如N-羥基琥珀酰亞胺基酯，苯并三唑基碳酸酯，胺，乙烯基砜，和馬來酰亞胺，N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，酰肼，琥珀酰亞胺基丙酸酯，琥珀酰亞胺基丁酸酯，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯，琥珀酰亞胺基酯，縮水甘油醚，氧基羰基咪唑，對-硝基苯基碳酸酯，醛，鄰吡啶基(orthopyridyl)-二硫化物，和丙烯?；?。
其它代表性鏈烷醛試劑由下面結(jié)構(gòu)來描述 結(jié)構(gòu)XI-F 結(jié)構(gòu)XI-G。
在又一個(gè)途徑中，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛有利地從色譜分離法提純的POLY-Y制備。這樣，如果存在的聚合物雜質(zhì)，和尤其來源于PEG-二醇的雙官能的雜質(zhì)被除去，使得形成了如前面所述的極純的聚合物鏈烷醛產(chǎn)物。這一方法在實(shí)施例5中舉例來說明。所使用的總體合成方法的概述、它的優(yōu)點(diǎn)、它對這里所述一般方法的適用性、以及所進(jìn)行的反應(yīng)的細(xì)節(jié)都提供于實(shí)施例5中。
雖然任何色譜分離方法都可以使用，但是特別優(yōu)選的是離子交換色譜法，其中在POLY-Y中的Y是可電離的基團(tuán)或是可電離的基團(tuán)如羧酸，活性酯，胺等的衍生物。
本發(fā)明的示例性聚合物鏈烷醛縮醛可具有下列結(jié)構(gòu)中的任何一個(gè)，其中變量已經(jīng)在前面進(jìn)行了描述
結(jié)構(gòu)IX或 結(jié)構(gòu)IX-A在制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的又一個(gè)途徑中，聚合物鏈烷醛能夠通過將聚合物鏈段POLY直接構(gòu)造在縮醛前體上，例如，通過直接聚合來制備的。更具體地說，在這一方法中，首先提供具有適合于引發(fā)聚合的至少一個(gè)活性陰離子部位的縮醛前體?？s醛前體的陰離子部位然后與能夠聚合的反應(yīng)活性單體相接觸，由此引發(fā)該反應(yīng)活性單體聚合到縮醛前體之上，作為該接觸步驟的結(jié)果，將另外的反應(yīng)活性單體加成到該縮醛前體中以形成聚合物鏈，該接觸繼續(xù)進(jìn)行到達(dá)到了所希望的聚合物鏈長度為止，隨后終止反應(yīng)得到本發(fā)明的聚合物醛前體。
如果需要，所形成的聚合物醛前體能夠進(jìn)一步水解成如以上所述的相應(yīng)鏈烷醛。最優(yōu)選，反應(yīng)活性單體是環(huán)氧乙烷和含在縮醛前體之內(nèi)的反應(yīng)活性陰離子部位是醇鹽陰離子(O-)，優(yōu)選伴有堿金屬或其它合適的抗衡離子。在縮醛前體中存在的醇鹽端基對于環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合形成本發(fā)明的聚合物鏈烷醛而言是有活性的。
更具體地說，該縮醛前體一般具有對應(yīng)于下式的結(jié)構(gòu) 其中變量具有如上所述的值，例外的是X’是以氧陰離子或O-(例如，在它的中性形式X’典型地以羥基或-OH終端，和在強(qiáng)堿存在下轉(zhuǎn)化成相應(yīng)醇鹽)。合適的抗衡離子包括Na+，K+，Li+和Cs+。該終止步驟一般包括中和該反應(yīng)，例如，通過添加酸。任選地，聚合物鏈段可以通過烷基化試劑或適合提供非反應(yīng)活性末端的其它試劑的添加來封端。
在以上方法的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，POLY-Y對應(yīng)于結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和Z選自-OCH3，-OCH2CH3和-OCH2(C6H5)。在另一實(shí)施方案中，POLY-Y對應(yīng)于結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O-M+，其中POLY-Y是通過環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合到封端的醇鹽如Z-CH2CH2O-M+(由強(qiáng)堿使Z-CH2CH2OH的末端-OH基團(tuán)金屬取代而制得)上所制備的。M+表示金屬抗衡離子如Na+，K+，Li+，Cs+，Rb+。所制備的POLY-Y適合與如上所述的受保護(hù)的鏈烷醛試劑反應(yīng)。
概括這一方法的通用化反應(yīng)歷程在這里作為圖1來提供，并且進(jìn)行該反應(yīng)或系列反應(yīng)的條件被提供在實(shí)施例15中。
聚合物鏈烷醛試劑的貯存優(yōu)選地，本發(fā)明的聚合物鏈烷醛是在惰性氣氛下，如在氬氣或在氮?dú)庀沦A存的，因?yàn)槿┕倌軋F(tuán)能夠與大氣氧反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸。由于該分子的醛部分與水的反應(yīng)的潛力(例如，暴露于水分形成相應(yīng)水合物)，還優(yōu)選的是最大程度減少本發(fā)明的聚合物鏈烷醛對水分的暴露。因此，優(yōu)選的貯存條件是在低于約-15℃的溫度下在干氬氣或其它干燥惰性氣體下。在低溫條件下的貯存會減少聚合物醛水解成相應(yīng)水合物形式的速率。另外，對于聚合物鏈烷醛的聚合物鏈段是PEG的情況，該鏈烷醛的PEG部分與氧緩慢地反應(yīng)從而沿著該分子的PEG部分形成過氧化物。過氧化物的形成能夠最終導(dǎo)致鏈斷裂，因此提高了PEG鏈烷醛試劑的多分散性?？紤]到以上情況，另外優(yōu)選的是將本發(fā)明的PEG鏈烷醛在黑暗中貯存。
生物活性接合物偶聯(lián)化學(xué)性質(zhì)接合到蛋白質(zhì)上-隨機(jī)的和N-末端選擇性上述聚合物鏈烷醛可用于接合到生物活性劑或帶有至少一個(gè)供反應(yīng)用的氨基的表面上。典型地，本發(fā)明的PEG醛通過還原性胺化作用偶聯(lián)到氨基上，導(dǎo)致在聚合物鏈段與表面或生物活性劑之間仲胺連接鍵的形成。在本發(fā)明的聚合物鏈烷醛與含氨基的生物活性劑或表面接合時(shí)，聚合物鏈烷醛與靶含氨基分子在合適的溶劑中反應(yīng)形成相應(yīng)的亞胺連接的中間體，它然后被還原而在聚合物與生物活性劑或表面之間形成仲胺連接鍵。亞胺還原成相應(yīng)胺是通過還原劑的添加來實(shí)現(xiàn)的。示例性的還原劑包括氰基硼氫化鈉，硼氫化鈉，氫化鋰鋁，等等。
一般，本發(fā)明的聚合物醛能夠用于有選擇地瞄準(zhǔn)在某些條件下N-末端的改性，這些條件可以分化在N-末端氨基酸上的α胺的反應(yīng)性。本發(fā)明的某些聚合物鏈烷醛似乎表明比先前已知的醛衍生物更大的選擇性，因此更適合于需要選擇性N-末端蛋白質(zhì)改性的應(yīng)用。制備N-末端改性蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)條件包括(i)將需要改性的蛋白質(zhì)或肽溶解在不含胺的緩沖劑(例如，在約4-約6.5，優(yōu)選約5-6.5的pH下，最優(yōu)選在約5-5.5的pH下)中，(ii)在該蛋白質(zhì)或肽溶液中添加本發(fā)明的聚合物鏈烷醛，(iii)讓蛋白質(zhì)或肽和聚合物鏈烷醛反應(yīng)形成亞胺-偶聯(lián)的聚合物接合物，隨后(iv)添加還原劑，形成相應(yīng)仲胺偶聯(lián)的聚合物接合物。聚合物鏈烷醛的隨機(jī)連接的反應(yīng)條件基本上等同于如上所述的那些，不同的是pH多少更高一些(將在下面更詳細(xì)討論)。
為了有利于N-末端改性，約5-5.5的pH是最優(yōu)選的，因?yàn)橛捎谠贜-末端氨基酸的氨基和賴氨酸的氨基的pKa值上的差異，而據(jù)信促進(jìn)選擇性N-末端改性。一般而言，有利于N-末端選擇性的條件包括低于7，和典型地不低于約4的pH。促進(jìn)N-末端選擇性的最有利的pH能夠由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來確定，并取決于需要改性的具體蛋白質(zhì)。進(jìn)行接合的合適的緩沖劑包括磷酸鈉，乙酸鈉，碳酸鈉，和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。典型地，聚合物鏈烷醛是以與靶蛋白質(zhì)等摩爾量或相對于靶蛋白質(zhì)摩爾過量被添加到含有蛋白質(zhì)的溶液中。聚合物鏈烷醛被添加到該靶蛋白質(zhì)中，按照約1∶1(聚合物鏈烷醛∶蛋白質(zhì))，1.5∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，8∶1，或10∶1的摩爾比率。PEG-鏈烷醛相對于靶蛋白質(zhì)的摩爾過量典型地是在約2至5之間。該還原性胺化反應(yīng)典型地在等于或低于約室溫(25℃)的溫度下進(jìn)行，雖然溫度可以是約-15℃-100℃，更優(yōu)選約4℃-37℃，大約一個(gè)到二十四個(gè)小時(shí)。該還原劑也典型地以過量添加，也就是說，以相對于聚合物-蛋白質(zhì)接合物的約2倍至30倍摩爾過量的用量。優(yōu)選的是以相對于聚合物-蛋白質(zhì)接合物的10倍至20倍摩爾過量添加還原劑。準(zhǔn)確的反應(yīng)時(shí)間是通過檢測隨時(shí)間的推移該反應(yīng)的進(jìn)程來確定的。反應(yīng)的進(jìn)程典型地通過在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從反應(yīng)混合物中取出等分試樣并由SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜分析法或任何其它合適的分析方法分析來檢測。所形成的PEG化的接合物進(jìn)一步通過使用諸如MALDI，毛細(xì)管電泳，凝膠電泳，和/或色譜分析之類的分析方法來表征。
更具體地說，為了將醛聚合物衍生物偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或肽上，可以使用許多不同的方法。一個(gè)方法(即，隨機(jī)的PEG化方法)是以共價(jià)鍵將PEG連接于有表面可供使用的任何數(shù)量的賴氨酸殘基上。為了進(jìn)行此類反應(yīng)，蛋白質(zhì)或肽(如下面提供的那些示例性質(zhì)的生物分子)典型地與本發(fā)明的聚合物鏈烷醛在不含胺的緩沖劑中在一般約5-8的溫和pH下進(jìn)行反應(yīng)。(不含胺的緩沖劑是優(yōu)選的，因?yàn)樵诰彌_劑中的氨基與蛋白質(zhì)氨基競爭偶聯(lián)于聚合物鏈烷醛上)。合適的不含胺的緩沖劑在選擇時(shí)要求具有合適的pK，以便有所需的pH范圍來進(jìn)行該接合化學(xué)過程。偶聯(lián)反應(yīng)一般是在數(shù)分鐘到幾個(gè)小時(shí)(例如，從5分鐘到24小時(shí)或更長時(shí)間)之間進(jìn)行，平均起來偶聯(lián)在約0.2和4小時(shí)之間進(jìn)行以形成亞胺偶聯(lián)的接合物。然后向反應(yīng)混合物中添加如上所述的許多合適還原劑中的任何一種(例如，氰基硼氫化鈉)。所形成的混合物然后在低溫到環(huán)境溫度條件下，例如4℃到37℃下進(jìn)行大約一個(gè)小時(shí)到48小時(shí)。優(yōu)選，該還原反應(yīng)在低于約24小時(shí)內(nèi)完成。隨機(jī)偶聯(lián)在7到7.5左右的pH下受到促進(jìn)，而在N-末端上的偶聯(lián)在低pH(例如，在5.5左右)下受到促進(jìn)。
為了提高改性的程度，即，為了促進(jìn)以共價(jià)鍵在有效位點(diǎn)上連接于靶分子上的PEG的數(shù)量的提高，上述條件中的任何一個(gè)或多個(gè)(例如，聚合物鏈烷醛與蛋白質(zhì)或肽的摩爾比率、溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH等)能夠單獨(dú)或同時(shí)提高。不管所使用的PEG鏈烷醛的分子量，所形成的產(chǎn)物混合物優(yōu)選地但必進(jìn)行提純以分離出過量的試劑、未PEG化蛋白質(zhì)(或任何靶分子)、多PEG化的接合物、和游離或未反應(yīng)的PEG鏈烷醛。
示例性蛋白質(zhì)的隨機(jī)PEG化已提供于實(shí)施例4和6中。示例性蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性PEG化描述在實(shí)施例7到13中。
PEG-鏈節(jié)(MER)的表征/任選的分離任選地，由本發(fā)明的PEG醛與生物活性劑反應(yīng)所生產(chǎn)的接合物被提純而獲得/分離出不同的PEG化物質(zhì)?；蛘撸瑢τ谳^低分子量PEG，例如具有低于約20千道爾頓，優(yōu)選小于或等于約10千道爾頓的分子量，更優(yōu)選地，該產(chǎn)物混合物能夠提純而獲得某些數(shù)量的PEG/蛋白質(zhì)分子附近的一種分布。例如，產(chǎn)物混合物能夠提純而獲得一個(gè)到五個(gè)PEG/蛋白質(zhì)的平均值，典型地約3個(gè)PEG/蛋白質(zhì)的平均值。最終的接合反應(yīng)混合物的提純的策略將取決于多個(gè)因素-所使用的聚合物的分子量、具體的蛋白質(zhì)、所需的劑量用法、和各接合物質(zhì)的殘留活性和活體內(nèi)性能。
如果需要，具有不同分子量的PEG接合物能夠使用凝膠過濾色譜法來分離。也就是說，凝膠過濾色譜法用來分級不同的PEG-鏈節(jié)(1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)，3-鏈節(jié)，等等)，基于它們的不同分子量(其中該差異主要對應(yīng)于PEG鏈的平均分子量)。例如，在其中100kDa蛋白質(zhì)無規(guī)接合到具有約20kDa的分子量的PEG鏈烷醛上的示例性反應(yīng)中，所形成的反應(yīng)混合物很可能含有未改性的蛋白質(zhì)(Mw 100kDa)，單-PEG化的蛋白質(zhì)(Mw 120kDa)，二-PEG化的蛋白質(zhì)(Mw 140kDa)，等等。盡管這一方法能夠用于分離具有不同分子量的PEG接合物，但是這一方法一般對于分離在蛋白質(zhì)內(nèi)具有不同PEG化位點(diǎn)的位置異構(gòu)物卻是效率低的。例如，凝膠過濾色譜法可用于從PEG 1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)，3-鏈節(jié)等的混合物中彼此分離，雖然所回收的PEG-鏈節(jié)組合物的每一種可以含有連接于在蛋白質(zhì)內(nèi)的不同反應(yīng)活性氨基(例如，賴氨酸殘基)上的PEG。
適合于進(jìn)行這一類型的分離的凝膠過濾柱包括從AmershamBiosciences商購的SuperdexTM和SephadexTM柱。具體柱的選擇將取決于所希望的分級范圍。洗脫一般通過使用非胺型緩沖劑如磷酸鹽，乙酸鹽等來進(jìn)行。所收集的級分可以通過多種不同的方法來分析，例如(i)對于蛋白質(zhì)含量的在280nm下的OD，(ii)BSA蛋白質(zhì)分析，(iii)對于PEG含量的碘試驗(yàn)(Sims G.E.C.等人，Anal.Biochem，107，60-63，1980)，或者，(iv)通過運(yùn)行SDS PAGE凝膠，隨后用碘化鋇染色。
位置異構(gòu)物的分離通過使用RP-HPLC C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反轉(zhuǎn)相色譜分析法或通過使用離子交換柱例如可從Amersham Biosciences商購的Sepharose離子交換柱的離子交換色譜法來進(jìn)行。任一種方法可用于分離具有相同分子量的PEG-生物分子異構(gòu)體(位置異構(gòu)物)。
貯存取決于所形成的PEG-接合物的預(yù)定用途，在接合和任選的附加分離步驟之后，接合物混合物可以濃縮，無菌過濾，并在約-20℃到約-80℃的低溫下貯存?；蛘?，該接合物可以凍干，有或沒有殘留緩沖劑并作為凍干粉末來貯存。在一些情況下，優(yōu)選的是將用于接合的緩沖劑如乙酸鈉交換成揮發(fā)性緩沖劑如碳酸銨或乙酸銨，它們在冷凍干燥過程中容易被除去，因此凍干的蛋白質(zhì)接合物粉末配制劑不存在殘留緩沖劑?；蛘撸彌_劑交換步驟可以使用配制劑緩沖劑來應(yīng)用，因此，凍干的接合物處于這樣一種形式，該形式適合于重新組成為配制劑緩沖劑和最終給哺乳動(dòng)物給藥。
小分子接合本發(fā)明的PEG-鏈烷醛接合到小分子如兩性霉素B上一般按照在實(shí)施例14中所述來進(jìn)行，雖然準(zhǔn)確的反應(yīng)條件將根據(jù)需要改性的小分子來變化。典型地，該接合是通過使用相對于小分子而言稍微摩爾過量的PEG試劑來進(jìn)行的，例如約1.2-1.5倍到約5-10倍摩爾過量。在一些情況下，取決于該分子，該小分子藥物實(shí)際上可以過量使用，如當(dāng)PEG-小分子接合物沉淀在反應(yīng)溶劑例如醚中，而未反應(yīng)的藥物保留在溶液中時(shí)。
靶分子和表面本發(fā)明的反應(yīng)性聚合物鏈烷醛可以以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接于許多實(shí)體上，其中包括膜、化學(xué)分離和提純表面、固體載體、金屬/金屬氧化物表面如金，鈦，鉭，鈮，鋁，鋼，和它們的氧化物、二氧化硅、高分子、和小分子。另外，本發(fā)明的聚合物也可用于生物化學(xué)傳感器，生物電子開關(guān)，和柵門。本發(fā)明的聚合物鏈烷醛也可用作肽合成的載體，用于聚合物涂敷的表面和聚合物接枝體的制備，制備供親合力分配用的聚合物-配位體接合物，制備交聯(lián)或未交聯(lián)的水凝膠，和制備用于生物反應(yīng)器的聚合物-輔因子加合物。
用于偶聯(lián)到本發(fā)明的聚合物上的生物活性劑可以是下列當(dāng)中的任何一種或多種。合適的試劑可以選自，例如，安眠藥和鎮(zhèn)靜劑，精神興奮藥，鎮(zhèn)定劑，呼吸道藥物，抗驚厥藥，肌肉松弛藥，抗帕金森癥試劑(多巴胺拮抗劑)，鎮(zhèn)痛藥，抗發(fā)炎劑，抗焦慮藥(抗焦慮抑制藥)，食欲抑制劑，抗偏頭痛試劑，肌肉收縮劑，抗感染劑(抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑，疫苗)，抗關(guān)節(jié)炎藥，抗瘧藥，止吐藥，anepileptics，支氣管擴(kuò)張藥，細(xì)胞活素，生長因子，抗癌試劑，抗血栓形成的試劑，抗高血壓藥，心血管藥物，抗心律失常藥，antioxicants，抗哮喘試劑，激素試劑，其中包括避孕藥，擬交感神經(jīng)藥，利尿藥，類脂調(diào)節(jié)劑，抗雄激素藥，抗寄生蟲藥，抗凝血?jiǎng)鼓[瘤形成藥，抗腫瘤藥，治療血糖過低的藥，營養(yǎng)劑和補(bǔ)充劑，生長補(bǔ)充劑，抗腸炎試劑，疫苗，抗體，診斷劑，和造影劑。
更具體地說，該活化劑可以落入多個(gè)結(jié)構(gòu)等級中的一個(gè)之中，包括但不限于小分子(優(yōu)選不溶性的小分子)，肽，多肽，蛋白質(zhì)，多糖，甾類，核苷酸，低聚核苷酸，多核苷酸，脂肪，電解質(zhì)，等等。優(yōu)選地，偶聯(lián)到本發(fā)明的聚合物鏈烷醛上的活化劑具有自然的氨基，或者，經(jīng)過改性含有適合于偶聯(lián)到本發(fā)明的聚合物鏈烷醛上的至少一個(gè)反應(yīng)活性氨基。
適合于以共價(jià)鍵連接于本發(fā)明的聚合物上的活性劑的特定例子包括但不限于門冬酰胺酶，amdoxovir(DAPD)，抗排卵肽，becaplermin，降血鈣素，cyanovirin，denileukin diftitox，紅細(xì)胞生成素(EPO)，EPO激動(dòng)劑(例如，如在WO96/40749中描述的約10-40個(gè)氨基酸長度并包括特殊芯序列的肽)，鏈球菌DNA酶α，紅細(xì)胞生成刺激蛋白質(zhì)(NESP)，凝血因子如凝血因子V，凝血因子VII，凝血因子VIIa，凝血因子VIII，凝血因子IX，凝血因子X，凝血因子XII，凝血因子XIII，von Willebrand因子，ceredase，cerezyme，α-葡糖苷酶，膠原，環(huán)孢子菌素，α防衛(wèi)素，β防衛(wèi)素，exedin-4，粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)，血小板生成素(TPO)，α-1蛋白酶抑制因子，elcatonin，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，血纖蛋白原，filgrastim，生長激素人生長激素(hGH)，生長激素釋放激素(GHRH)，GRO-β，GRO-β抗體，骨形貌生成蛋白質(zhì)如骨形貌生成蛋白質(zhì)-2，骨形貌生成蛋白質(zhì)-6，OP-1；酸性成纖維細(xì)胞生長因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，CD-40配體，肝素，人血清白蛋白，低分子量肝素(LMWH)，干擾素如干擾素α，干擾素β，干擾素γ，干擾素Ω，干擾素τ，consensus干擾素；白細(xì)胞介素和白細(xì)胞介素受體如白細(xì)胞介素-1受體，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-2融合蛋白質(zhì)，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑，白細(xì)胞介素-3，白細(xì)胞介素-4，白細(xì)胞介素-4受體，白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-8，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-13受體，白細(xì)胞介素-17受體；乳鐵蛋白和乳鐵蛋白片段，黃體激素釋放激素(LHRH)，胰島素，前胰島素，胰島素類似物(例如，單酰化的胰島素，如在US專利No.5,922,675中所述)，糊精，C-肽，生長激素釋放抑制激素，生長激素釋放抑制激素類似物，其中包括奧曲肽，血管升壓素，促卵泡激素(FSH)，流感疫苗，胰島素樣生長因子(IGF)，insulintropin，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，血纖維蛋白溶解酶原活化劑如alteplase，尿激酶，reteplase，鏈激酶，pamiteplase，lanoteplase，和teneteplase；神經(jīng)生長因子(NGF)，osteoprotegerin，血小板衍生生長因子，組織生長因子，轉(zhuǎn)化生長因于-1，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，白血病抑制因子，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)，膠質(zhì)細(xì)胞生長因子(GGF)，T細(xì)胞受體，CD分子/抗原，腫瘤壞死因子(TNF)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1，內(nèi)皮生長因子，甲狀旁腺激素(PTH)，胰高血糖素樣肽，促生長激素，胸腺素α1，胸腺素α1 IIb/IIIa抑制劑，胸腺素β10，胸腺素β9，胸腺素β4，α-1抗胰蛋白酶，磷酸二酯酶(PDE)化合物，VLA-4(非常晚期抗原-4)，VLA-4抑制劑，bisphosponates，呼吸道合胞病毒抗體，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(CFTR)基因，脫氧核糖核酸酶(Dnase)，殺菌/滲透性增大蛋白質(zhì)(BPI)，和抗-CMV抗體。示例性的單克隆抗體包括etanercept(由連接到IgGI的Fc部分上的人75kD TNF受體的細(xì)胞外配體-結(jié)合部分組成的二聚融合蛋白質(zhì))，abciximab，afeliomomab，basiliximab，daclizumab，infliximab，ibritumomabtiuexetan，mitumomab，muromonab-CD3，碘131 tositumomab接合物，olizumab，rituximab，和trastuzumab(herceptin)。
適合以共價(jià)鍵連接于本發(fā)明的聚合物上的附加試劑包括但不限于阿米斯丁，胺碘酮，氨基己酸，氨基馬尿酸鹽鈉，氨魯導(dǎo)眠能，氨基酮戊酸，氨基水楊酸，安吖啶，阿那格雷，蒽環(huán)類藥，天冬酰胺酶，anthracyclines，bexarotene，bicalutamide，博來霉素，布舍瑞林，白消安，卡麥角林，capecitabine，卡鉑，卡氮芥，苯丁酸氮芥，西司他丁鈉，順鉑，克拉立平，氯屈膦酸鹽，環(huán)磷酰胺，環(huán)丙孕酮，阿糖胞苷，喜樹堿，13-反視黃酸，全反式視黃酸；達(dá)卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，去鐵繁，地塞米松，雙氯芬酸，己烯雌酚，docetaxel，阿霉素，表阿霉素，雌氮芥，依托泊甙，依西美坦，fexofenadine，氟達(dá)拉濱，氟氫可的松，氟尿嘧啶，氟甲睪酮，氟利坦，gemcitabine，腎上腺素，左旋多巴，羥基脲，去甲氧柔紅霉素，異環(huán)磷酰胺，imatinib，irinotecan，依他康唑，性瑞林，letrozole，亞葉酸，左旋四咪唑，賴諾普利，lovothyroxine鈉，環(huán)己亞硝脲，氮芥，甲羥基孕酮，甲地孕酮，苯丙氨酸氮芥，巰基嘌呤，酒石酸間羥胺，甲氨喋呤，甲氧氯普胺，美西律，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，納洛酮，煙堿，尼魯米特，善得定，奧沙利鉑，氨羥二磷酸二鈉，噴司他丁，pilcamycin，porfimer，潑尼松，甲基芐肼，丙氯拉，奧丹西隆，raltitrexed，sirolimus，鏈脲霉素，藤霉素，他莫昔芬，替莫唑胺，鬼臼噻吩糖苷，睪丸激素，四氫大麻酚，酞胺哌啶酮，硫鳥嘌呤，噻替派，托泊替堪，維A酸，valrubicin，長春堿，長春新堿，長春地辛，維諾利賓，dolasetron，谷尼色創(chuàng)；福莫特羅，氟地松，高丙瑞林，咪達(dá)唑侖，阿普唑侖，兩性霉素B，鬼臼毒素，核苷抗病毒素，芳酰基腙，舒馬曲坦；大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素，竹桃霉素，三乙酰竹桃霉素，羅力得，clarithromycin，davercin，阿齊紅霉素，氟力索霉素，地紅霉素，交沙霉素，螺旋霉素，麥迪霉素，白霉素，麥白霉素，丙酰白霉素，andazithromycin，并且swinolide a；fluoroquinolones比如環(huán)丙沙星，氧氟沙星，左氟沙星，trovafloxacin，alatrofloxacin，moxifloxicin，諾氟沙星，依諾沙星，格雷沙星，gatifloxacin，洛美沙星，西洛沙星，替馬氟沙星，培氟沙星，氨氟沙星，氟羅沙星，托氟沙星，prulifloxacin，依洛沙星，pazufloxacin，克林沙星，和sitafloxacin；氨基糖苷類如慶大霉素，萘替米星，草履蟲素，妥布霉素，阿木卡星，卡那霉素，新霉素，和鏈霉素，去甲萬古霉素，替考拉寧，雷莫拉寧，mideplanin，粘菌素，daptomycin，短桿菌肽，粘菌素；多粘菌素如多粘菌素B，卷曲霉素，桿菌肽，penems；青霉素包括青霉素酶-敏感性試劑象青霉素G，青霉素V；耐青霉素酶的試劑象甲氧苯青霉素，苯唑西林，氯唑西林，雙氯青霉素，氟氯青霉素，乙氧萘青霉素；革蘭氏陰性微生物活性劑象氨芐西林，阿莫西林，并且海他西林，cillin，和galampicillin；antipseudomonal青霉素如羧芐青霉素，羧噻吩青霉素，阿諾西林，美洛西林，和哌拉西林；頭孢菌素如頭孢泊肟，cefprozil，頭孢布坦，頭孢唑肟，頭孢曲松，頭孢噻吩，頭孢吡硫，頭孢氨芐，頭孢拉定，頭孢西丁，頭孢孟多，頭孢唑啉，頭孢噻啶，頭孢克洛，頭孢羥氨芐，頭孢來星，頭孢呋辛，頭孢雷特，頭孢噻肟，頭孢三嗪，頭孢乙腈，頭孢吡肟，頭孢克肟，頭孢尼西，頭孢哌酮，頭孢替坦，頭孢美唑，頭孢他啶，loracarbef，和拉氧頭孢，單菌霉素如氨曲南；和carbapenems如亞胺培南，美羅匹寧，戊烷脒β-羥乙磺酸鹽，硫酸舒喘靈，利多卡因，硫酸異丙喘寧，倍氯美松雙丙酸酯，氟醋酸曲安縮松，布地縮松丙酮化合物，氟地松，異丙阿托品，氟尼縮松，色甘酸二鈉，和酒石酸麥角胺；taxanes如紫杉醇；SN-38，和酪氨酸磷酸化抑制劑。
偶聯(lián)于本發(fā)明的聚合物鏈烷醛上的優(yōu)選小分子是具有至少一個(gè)氨基的那些。優(yōu)選的分子包括氨基馬尿酸鈉，兩性霉素B，阿霉素，氨基己酸，氨基乙酰丙酸，氨基水楊酸，酒石酸間羥胺，氨羥二磷酸二鈉，柔紅霉素，甲狀腺素鈉，賴諾普利，西司他丁鈉，美西律，頭孢氨芐，去鐵敏，和阿米斯丁。
偶聯(lián)于本發(fā)明的聚合物鏈烷醛上的優(yōu)選的肽或蛋白質(zhì)包括EPO，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，consensus IFN，凝血因子VII，凝血因子VIII，凝血因子IX，IL-2，remicade(infliximab)，Rituxan(rituximab)，Enbrel(etanercept)，Synagis(palivizumab)，Reopro(abciximab)，Herceptin(trastuzimab)，tPA，Cerizyme(imiglucerase)，Hepatitus-B疫苗，rDNAse，α-1蛋白酶抑制因子，GCSF，GMCSF，hGH，胰島素，F(xiàn)SH和PTH。
以上示例性的生物活性劑希望包括，如果適用的話，類似物，興奮劑，拮抗劑，抑制劑，異構(gòu)體，和它們的可藥用鹽形式。關(guān)于肽和蛋白質(zhì)，本發(fā)明希望包括合成的，重組的，天然的，糖基化的，和非糖基化的形式，以及它們的生物活性片段。以上生物活性蛋白質(zhì)另外希望包括有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的、缺失的等等的變體，只要所形成的變體蛋白質(zhì)具有母體(自然)蛋白質(zhì)的活性的至少一些。
藥物組合物本發(fā)明還包括藥物制劑，后者包括這里所提供的接合物和藥物賦形劑。一般，該接合物本身是固體形式(例如，沉淀物)，它能夠與固體或液體形式的合適的藥物賦形劑相混合。
示例性的賦形劑包括，但不限于，選自碳水化合物，無機(jī)鹽，抗微生物劑，抗氧化劑，表面活性劑，緩沖劑，酸，堿和它們的結(jié)合物中的那些。
碳水化合物如糖，衍生化糖如糖醇，醛糖酸，酯化的糖，和/或糖聚合物可以作為賦形劑來列舉。特定的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖類，如果糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纖維二糖，等等；多糖，如棉子糖，松三糖，麥芽糖糊精，葡聚糖，淀粉，等等；和糖醇，如甘露糖醇，木糖醇，麥芽糖酸，乳糖醇，木糖醇，山梨糖醇(葡糖醇)，吡喃糖基山梨糖醇，肌醇，等等。
該賦形劑還可以包括無機(jī)鹽或緩沖劑，如檸檬酸，氯化鈉，氯化鉀，硫酸鈉，硝酸鉀，磷酸一鈉，磷酸氫二鈉，和它們的結(jié)合物。
該制劑還可以包括用于防止或制止微生物生長的抗微生物劑。適合于本發(fā)明的抗微生物劑的非限制性例子包括氯其烷銨，苯索氯銨，芐醇，十六烷基氯化吡啶鎓，氯丁醇，苯酚，苯乙醇，硝酸苯汞，硫柳汞，和它們的結(jié)合物。
抗氧化劑同樣能夠存在于該制劑中?？寡趸瘎┯糜诜乐寡趸纱朔乐乖撝苿┑慕雍衔锘蚱渌M分的退化。用于本發(fā)明的合適抗氧化劑包括，例如，棕櫚酸抗壞血酸酯，丁基化羥基苯甲醚，丁基化羥基甲苯，次磷酸，單硫代甘油，棓酸丙酯，亞硫酸氫鈉，甲醛合次硫酸氫鈉，焦亞硫酸鈉，和它們的結(jié)合物。
表面活性劑可以作為賦形劑而存在。示例性的表面活性劑包括聚山梨醇酯(polysorbates)，如“Tween 20”和“Tween 80”，和Pluronic如F68和F88(兩者從BASF，Mount Olive，New Jersey商購)；脫水山梨糖醇酯；類脂，如磷脂類如卵磷脂和其它磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺(雖然優(yōu)選不呈現(xiàn)脂質(zhì)體形式)，脂肪酸和脂肪酸酯；甾類，如膽固醇；和螯合劑，如EDTA，鋅和其它此類合適的陽離子。
酸或堿可以作為賦形劑存在于該制劑中。能夠使用的酸的非限制性例子包括選自氫氯酸，乙酸，磷酸，檸檬酸，蘋果酸，乳酸，甲酸，三氯乙酸，硝酸，高氯酸，磷酸，硫酸，富馬酸，和它們的結(jié)合物中的那些酸。合適的堿的例子包括，沒有限制，選自氫氧化鈉，乙酸鈉，氫氧化銨，氫氧化鉀，乙酸銨，乙酸鉀，磷酸鈉，磷酸鉀，檸檬酸鈉，甲酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀，富馬酸鉀，和它們的結(jié)合物中的堿。
該藥物制劑包括所有類型的配制劑和尤其適合注射的那些，例如能夠重配的粉末以及懸浮液和溶液。接合物(即，在活性劑和這里描述的聚合物之間形成的接合物)在組合物中的量將根據(jù)多個(gè)因素來變化，但(當(dāng)組合物在單位劑量容器(例如小瓶)中貯存時(shí)最佳是治療有效量。另外，該藥物制劑能夠裝入注射器中。治療有效量能夠在實(shí)驗(yàn)上通過漸增量的接合物的反復(fù)給藥以確定產(chǎn)生所需臨床終點(diǎn)效果的量來確定。
任何單個(gè)賦形劑在組合物中的量將取決于賦形劑的活性和組合物的具體需要來變化。典型地，任何單個(gè)賦形劑的最佳量通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定，即，通過制備含有不同量的賦形劑(從低到高)的組合物，考察穩(wěn)定性和其它參數(shù)，然后測定達(dá)到最佳性能但沒有顯著的不利影響的用量范圍。
然而，一般來說，賦形劑是以約1％-約99％(重量)，優(yōu)選約5％-98％(重量)，更優(yōu)選約15-95％(重量)的賦形劑的量存在于組合物中，其中低于30％(重量)的濃度是最優(yōu)選的。
這些前述的藥物賦形劑與其它賦形劑一起已描述在“RemingtonThe Science & Practice of Pharmacy”，第十九版，Williams &Williams(1995)，“Physician′s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbookof Pharmaceutical Excipients，第三版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000。
本發(fā)明的藥物制劑典型地，雖然不必經(jīng)注射途徑給藥，因此在給藥之前一般是液體溶液或懸浮液。該藥物制劑也可以采取其它形式如糖漿劑，霜?jiǎng)?，軟膏，藥片，粉末，等等。其它模式的給藥也包括在內(nèi)，如經(jīng)肺，經(jīng)直腸，經(jīng)皮，經(jīng)粘膜，口服，鞘內(nèi)，皮下，動(dòng)脈內(nèi)等等。
如前面所述，該接合物能夠通過靜脈注射由腸胃外途徑注入，或不太優(yōu)選地通過肌注或皮下注射。腸胃外投藥的合適配制劑類型包括即用的注射溶液，在使用之前與溶劑混合的干燥粉，注射用的懸浮液，在使用之前與媒介物混合的干燥不溶性組合物，和在施用之前需要稀釋的乳液和液體濃縮物，等等。
給藥的方法本發(fā)明還提供了將這里提供的接合物給藥于患有對用接合物的治療有響應(yīng)的一種癥狀的患者的方法。方法包括，一般經(jīng)由注射，給藥治療有效量的接合物(優(yōu)選作為藥物制劑的一部分提供)。給藥的方法可用于治療可由特定接合物的給藥來醫(yī)治或防止的任何癥狀。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到特定的接合物能夠有效地治療哪些癥狀。被給藥的實(shí)際劑量將取決于主體的年齡、體重和一般狀況以及所治療的癥狀的嚴(yán)重性，護(hù)理專業(yè)人員的判斷，和所給藥的接合物來變化。治療有效量是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的和/或描述在相關(guān)的參考教科書和文獻(xiàn)中。一般，治療有效量是約0.001mg-100mg，優(yōu)選按0.01mg/天到75mg/天的劑量，和更優(yōu)選按0.10mg/天到50mg/天的劑量。
任何給定的接合物(還是優(yōu)選作為藥物制劑的一部分提供)的單位劑量能夠以各種劑量給藥程序來施用，這取決于臨床醫(yī)生的判斷、患者的需要，等等。特定的劑量給藥程序是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的或通過使用常規(guī)方法經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來確定。示例性的劑量給藥程序包括，但不限于，一天給藥五次，一天四次，一天三次，一天兩次，每天一次，一周三次，一周兩次，一周一次，一月兩次，一月一次，和它們的任何結(jié)合。一旦臨床終點(diǎn)效果已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，組合物的劑量給藥則停止。
本發(fā)明給藥的接合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是各個(gè)水溶性聚合物部分能夠斷裂。當(dāng)因?yàn)榫酆衔锍叽缍沟脧捏w內(nèi)清除是潛在性問題時(shí)，這一結(jié)果是理想的。最佳地，各水溶性聚合物部分的斷裂可通過使用生理可分裂的和/或酶促可降解的連接鍵如脲烷，酰胺，碳酸酯或含酯的連接鍵來促進(jìn)。這樣，接合物的清除(經(jīng)由各個(gè)水溶性聚合物部分的斷裂)能夠通過選擇聚合物分子大小和提供所需清除性能的官能團(tuán)類型來調(diào)整。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能夠確定聚合物的合適分子大小以及可分裂的官能團(tuán)。例如，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員，使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲ㄟ^首先制備具有不同聚合物分子量和可斷裂的官能團(tuán)的各種聚合物衍生物，然后通過將聚合物衍生物給藥于患者和獲取周期性的血和/或尿樣品獲得清除曲線(例如通過血或尿的周期取樣)，來確定合適的分子大小和可斷裂的官能團(tuán)。一旦獲得一系列的對于各試驗(yàn)的接合物的清除曲線，能夠確定合適的接合物。
這里提及的全部文章、書籍、專利、專利出版物和其它出版物以它們的全部內(nèi)容被引入這里供參考。
實(shí)施例需要理解的是，盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的某些優(yōu)選的特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是前面的敘述以及后面的實(shí)施例用于說明但不限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和改性對于本發(fā)明所涉及的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
原料和方法。
在所附實(shí)施例中的全部PEG試劑都可以商購，除非另有說明。全部NMR數(shù)據(jù)由Bruker制造的300MHz核磁共振波譜儀來獲得。
溶菌酶由Sigma獲得。
實(shí)施例1MPEG(2K)-丁醛的合成
A.mPEG(2K Da)-丁醛，二乙基縮醛的制備
mPEG(2K Da)(2.0g)和甲苯(30ml)的混合物在減壓下通過蒸餾出甲苯來進(jìn)行共沸干燥。將干燥的mPEG(分子量，2千道爾頓)溶于無水甲苯(15ml)中，在其中添加叔丁醇鉀在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩爾)和4-氯丁醛二乙基縮醛(0.5g，0.00277摩爾)(AlfaAesar)。混合物在100-105℃下在氬氣氛中攪拌一夜。在冷卻到室溫之后，混合物被過濾和添加到處于0-5℃下的150ml乙基醚中。沉淀的產(chǎn)物被濾出并在減壓下干燥。產(chǎn)量1.6g。反應(yīng)基本按定量的產(chǎn)率來進(jìn)行。就是說，基本上全部的mPEG起始原料轉(zhuǎn)化成相應(yīng)二乙基縮醛，這點(diǎn)基于不存在1H NMR測得的對應(yīng)于mPEG-OH起始原料的羥基質(zhì)子。
NMR(d6-DMSO)1.09ppm(t，CH3-C-)1.52ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46ppm(t，-CH，縮醛)。
B.mPEG(2KD)-丁醛的制備 來自以上A.的mPEG(2K Da)丁醛，二乙基縮醛(1.0g)，去離子水(20ml)，和調(diào)節(jié)pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。向該混合物中添加氯化鈉(1.0g)和通過添加0.1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.8。該產(chǎn)物，mPEG(2D)丁醛用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和在減壓下蒸餾出溶劑而得到了離析形式的mPEG丁醛產(chǎn)物。產(chǎn)量0.72g。
反應(yīng)基本按定量的產(chǎn)率來進(jìn)行。就是說，基本上全部的mPEG丁醛二乙基縮醛轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛，這點(diǎn)基于不存在1H NMR測得的對應(yīng)于mPEG-OH起始原料的羥基質(zhì)子和對應(yīng)于二乙基縮醛的羥基質(zhì)子。
NMR(d6-DMSO)1.75ppm(p.-CH2-CH2-CHO-)2.44ppm(dt，-CH2-CHO)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，9.66ppm(t，-CHO)。
實(shí)施例2mPEG(30kD)-丁醛的合成A.mPEG(30KDa)-丁醛，二乙基縮醛的制備mPEG30K-O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH3)2mPEG(30kD)(在甲苯中60％溶液，3.30g)，甲苯(30ml)和BHT(丁基化羥基甲苯，0.004g)的混合物通過在減壓下餾出溶劑來進(jìn)行共沸干燥。將干燥的mPEG 30K溶于無水甲苯(15ml)中，向該溶液中添加叔丁醇鉀在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩爾)，4-氯丁醛二乙基縮醛(0.5g，0.00277摩爾)(Alfa Aesar)和溴化鉀(0.05g)。所形成的混合物在105℃下在氬氣氛中攪拌一夜。混合物進(jìn)行過濾，在減壓下濃縮到干燥為止，和將粗產(chǎn)物溶于20ml的二氯甲烷中。
將該含有產(chǎn)物的溶液添加到在室溫下的乙基醚(300ml)中以沉淀產(chǎn)物。沉淀的產(chǎn)物通過過濾來分離和在減壓下干燥。產(chǎn)量1.92g。
NMR(d6-DMSO)1.09ppm(t，CH3-C-)1.52ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46(t，-CH，縮醛)。
以產(chǎn)物的產(chǎn)量和分析為基礎(chǔ)，縮醛試劑在mPEG-OH試劑的羥基末端上的取代在非常高的效率下進(jìn)行，那就是說基本上100％取代。以高純度生產(chǎn)出產(chǎn)物(無需進(jìn)一步提純)，沒有可檢測的或顯著的量的未反應(yīng)的mPEG-OH。典型地，本發(fā)明的鏈烷醛或縮醛聚合物以高純度生產(chǎn)-就是說，典型地，所需的鏈烷醛產(chǎn)物以至少85％純度，優(yōu)選至少90％純度，和更優(yōu)選至少95％純度的存在于最終組合物中。
B.mPEG(30K Da)-丁醛的制備mPEG30K-O-CH2(CH2)2-C(O)H來自以上A.的mPEG(30K Da)丁醛，二乙基縮醛(1.0g)，去離子水(20ml)，和調(diào)節(jié)pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。向該混合物中添加氯化鈉(1.0g)和通過添加0.1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.8。該產(chǎn)物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和蒸餾除去溶劑。濕產(chǎn)物在減壓下干燥。產(chǎn)量0.82g。
NMR(d6-DMSO)1.75ppm(p，-CH2-CH2-CHO-)2.44ppm(dt，-CH2-CHO)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，9.66ppm(t，-CHO)。
取代度～100％。
轉(zhuǎn)化成相應(yīng)醛的過程基本上按定量的產(chǎn)率來進(jìn)行。
實(shí)施例3在堿性pH下mPEG-丙醛和mPEG-丁醛的對比穩(wěn)定性甲氧基-PEG-丙醛和mPEG-丁醛各自以較長時(shí)間暴露于高pH條件下以對比各聚合物在堿性pH條件下的相對穩(wěn)定性。如下面所說明，較大量的丙醛PEG在這些條件下反應(yīng)形成mPEG-OH和釋放出丙烯醛(由于逆Michael型反應(yīng))然而沒有檢測到PEG丁醛化合物的損失。這一實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)在下面提供。
A.在堿性pH下mPEG(2K Da)-丁醛的穩(wěn)定性將mPEG(2K Da)-丁醛(來自實(shí)施例1)(0.5g)溶于10ml 5mM磷酸鹽緩沖液(pH＝8.0)和所形成的溶液在室溫下攪拌24h。添加NaCl(0.5g)，產(chǎn)物用二氯甲烷(3×10ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和在減壓下于25℃餾出溶劑。
以1H NMR分析為基礎(chǔ)，該產(chǎn)物是無變化的。就是說，沒有檢測到PEG-丁醛的分解，即使在這些堿性pH條件下經(jīng)過較長時(shí)間之后。
B.在堿性pH下mPEG(5K Da)-丙醛的穩(wěn)定性將mPEG(5KDa)-丙醛(Shearwater Corporation，醛取代度82％)(0.5g)溶于10ml 5mM磷酸鹽緩沖液(pH＝8.0)中。所形成的溶液在室溫下攪拌24h。氣相色譜法頂部空間氣體分析表明，溶液含有從在堿性條件(如典型用于蛋白質(zhì)接合的那些)下的消去反應(yīng)所產(chǎn)生的丙烯醛(CH2＝CH-CHO)。添加NaCl(0.5g)，產(chǎn)物用二氯甲烷(3×10ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和在減壓下于25℃餾出溶劑。
以1H NMR分析為基礎(chǔ)，mPEG(5k Da)丙醛的取代度降至62％(就是說，38％的PEG-丙醛已經(jīng)分解)，且該產(chǎn)物含有較大量的mPEG-OH，從與PEG-丙醛的丙醛部分對應(yīng)的C-3鏈段的損失得出。
實(shí)施例4溶菌酶的PEG化 (“溶菌酶-NH2”是指具有一個(gè)的所示反應(yīng)活性氨基的溶菌酶分子)。
A.使用2KD PEG鏈烷醛的無規(guī)PEG化。
模型蛋白質(zhì)，溶菌酶，129氨基酸分泌酶，用于說明本發(fā)明的鏈烷醛聚合物與示例性蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。溶菌酶含有六個(gè)賴氨酸殘基作為PEG化的潛在部位。
將溶菌酶(2.1mg)溶于1ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)中，在其中添加mPEG(2kD)-丁醛(來自實(shí)施例1，1.5mg)。向該溶液中添加還原劑NaCNBH3(氰基硼氫化鈉)，溶液在室溫下攪拌24小時(shí)。所形成的溶菌酶接合物具有由中間的-(CH2)4-鏈偶聯(lián)于溶菌酶氨基上的PEG鏈。
反應(yīng)產(chǎn)物通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法進(jìn)行分析并顯示出了與在質(zhì)量相差大約2000Da的16208Da、18422Da和20520Da(對應(yīng)于PEG丁醛試劑的尺寸)下溶菌酶的三種PEG化物質(zhì)對應(yīng)的峰。未改性(天然)溶菌酶的質(zhì)量由MALDI-TOF測得是14153。因此，所形成的接合物其實(shí)是單PEG化蛋白質(zhì)，二PEG化蛋白質(zhì)，和三PEG化蛋白質(zhì)(1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)和3-鏈節(jié))的混合物。
以上說明了本發(fā)明的示例性蛋白質(zhì)的無規(guī)PEG化，得到PEG化產(chǎn)物的分布。如果需要，反應(yīng)混合物能夠進(jìn)一步分離以離析出各PEG接合物，即連接了一個(gè)PEG分子的溶菌酶，連接兩個(gè)PEG分子的溶菌酶，和連接三個(gè)PEG分子的溶菌酶。在如上所述的接合物組合物的每一種之內(nèi)(1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)，3-鏈節(jié))，該P(yáng)EG分子可以連接于在溶菌酶分子內(nèi)的不同的反應(yīng)活性氨基位點(diǎn)上。
B.使用5KD PEG鏈烷醛，mPEG-2-甲基丁醛，的PEG化。
模型蛋白質(zhì)(溶菌酶)的接合通過使用α支化PEG試劑，mPEG5kD-2-甲基丁醛來重復(fù)。將溶菌酶(3mg)溶于大約1mL的在約5.5到7.5的pH下的磷酸鈉緩沖劑中。將兩至五倍摩爾過量的PEG試劑，mPEG5kD-2-甲基丁醛，添加到溶菌酶溶液中，所形成的溶液被放置在旋轉(zhuǎn)混合器上和在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。在大約15分鐘后，添加20倍摩爾過量的NaCNBH3和讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。在各個(gè)時(shí)間間隔(4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，16小時(shí)等)取出等分試樣和由SDS-PAGE和MALDI-TOF質(zhì)譜分析法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。
在反應(yīng)完成之后，所形成的接合物混合物被濃縮，無菌過濾，和在低溫條件(-20℃到-80℃)下貯存，直至進(jìn)一步使用為止。
實(shí)施例5支化PEG 2(40.3KDA)-丁醛的制備下面提供了具有支化PEG鏈段的示例性聚合物鏈烷醛的制備方法。
概述。整個(gè)合成包括首先四(乙二醇)間隔劑偶聯(lián)到反應(yīng)活性鏈烷醛前體，4-氯丁醛二乙基縮醛上。低聚乙二醇間隔劑的引入可通過延長在反應(yīng)活性醛(或縮醛)基團(tuán)和包含在連接基結(jié)構(gòu)部分X’中的反應(yīng)活性基團(tuán)之間的鏈長度來為所形成的產(chǎn)物提供更高的穩(wěn)定性，因此最大程度地減少了潛在副反應(yīng)的發(fā)生和改進(jìn)產(chǎn)率。
低聚間隔劑如四甘醇的使用也提供了能夠轉(zhuǎn)化(如果需要的話)的反應(yīng)活性官能團(tuán)(在這一情況下為羥基)以便偶聯(lián)于已經(jīng)通過色譜分離法提純而除去聚合物雜質(zhì)如PEG-二醇，mPEG-OH等的聚合物鏈段上。用這種方法，在PEG鏈段偶聯(lián)于鏈烷醛前體上得到最終產(chǎn)物即基本上不含聚合物雜質(zhì)的水溶性聚合物鏈烷醛之前，從PEG鏈段中除去不希望有的官能化聚合物雜質(zhì)如PEG-二醛(由PEG二醇產(chǎn)生)等。
下面轉(zhuǎn)換到具體的反應(yīng)，四(乙二醇)間隔劑偶聯(lián)于4-氯丁醛二乙基縮醛上會導(dǎo)致被二鏈烷醛產(chǎn)物和起始四(乙二醇)污染的所需單-鏈烷醛產(chǎn)物的形成。然而，利用在反應(yīng)混合物中全部組分的溶解度差異的直接后處理使得可以實(shí)現(xiàn)高純度單鏈烷醛產(chǎn)物(即具有在四(乙二醇)分子的反應(yīng)活性羥基的僅僅一個(gè)上取代的鏈烷醛(縮醛)官能團(tuán))的容易制備。(反應(yīng)A.)。來自反應(yīng)A的產(chǎn)物然后通過與甲烷磺酰氯的反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)甲烷磺酸酯，即，四(乙二醇)的游離羥基首先轉(zhuǎn)化成甲磺酸酯(反應(yīng)B)，隨后甲磺酸酯轉(zhuǎn)化成伯氨基(反應(yīng)C)。縮醛試劑的反應(yīng)活性氨基然后偶聯(lián)到具有適合與縮醛試劑的氨基反應(yīng)的反應(yīng)活性羰基碳的示例性支化聚合物骨架鏈段上。PEG反應(yīng)物的前體，mPEG-二取代的賴氨酸，在轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的活化酯之前由離子交換色譜法提純以除去聚合物雜質(zhì)。mPEG-二取代賴氨酸的N-羥基琥珀酰亞胺基酯然后與氨基鏈烷醛縮醛反應(yīng)，經(jīng)由酰胺鍵的形成，形成支化PEG-間隔劑-鏈烷醛縮醛。該縮醛然后在酸催化的反應(yīng)中容易地水解形成相應(yīng)的鏈烷醛，尤其2-分支支化PEG(40KDa)丁醛。
這一合成方法，即，不局限于支化聚合物鏈段而可以用于具有任何這里所述幾何結(jié)構(gòu)的聚合物鏈段。
總體合成的概述
A.四(乙二醇)單-丁醛，二乙基縮醛HO-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2四(乙二醇)(97.1g，0.500摩爾)和甲苯(200ml)的混合物通過在減壓(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下餾出甲苯進(jìn)行共沸干燥。將干燥的四(乙二醇)溶于無水甲苯(180ml)并添加叔丁醇鉀在叔丁醇的1.0M溶液(120.0ml，0.120摩爾)中和4-氯丁醛二乙基縮醛(18.1g，0.100摩爾)(AlfaAesar)?；旌衔镌?5-100℃下在氬氣氛中攪拌一夜。在冷卻到室溫之后，混合物進(jìn)行過濾和在減壓下餾出溶劑。將粗產(chǎn)物溶于1000ml去離子水中并且所形成的溶液經(jīng)活性炭過濾。添加氯化鈉(10g)并且該產(chǎn)物用二氯甲烷(250，200和150ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO4上)和在減壓(由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))下餾出溶劑。
將粗產(chǎn)物溶于300ml 10％磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)中，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取出雜質(zhì)。該產(chǎn)物用二氯甲烷(200，150，和100ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO4上)和在減壓(由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))下餾出溶劑。
產(chǎn)量20.3g。NMR(d6-DMSO)1.10ppm(t，CH3-C-)1.51ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.49ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.46ppm(t，-CH，縮醛)，4.58ppm(t，-OH)。
純度～100％(沒有未反應(yīng)起始原料的跡象)。
B.四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-丁醛，二乙基縮醛，CH3-S(O)2-O-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2四(乙二醇)單-丁醛，二乙基縮醛(12.5g，0.037摩爾)和甲苯(120ml)的混合物通過在減壓(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下餾出甲苯進(jìn)行共沸干燥。將干燥的四(乙二醇)單-丁醛，二乙基縮醛溶于無水甲苯(100ml)中。向溶液中添加20ml的無水二氯甲烷和5.7ml的三乙胺(0.041摩爾)。然后滴加4.5g的甲磺酰氯(0.039摩爾)。溶液在室溫下在氮?dú)夥罩袛嚢枰灰埂＝又砑犹妓徕c(5g)，混合物攪拌1小時(shí)。然后過濾溶液和在減壓(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下餾出溶劑。
1.10ppm(t，CH3-C-)1.51ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.17ppm(s，CH3-甲烷磺酸酯)，3.49ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.30ppm(m，-CH2-甲烷磺酸酯)，4.46ppm(t，-CH，縮醛)。
純度～100％。
C.四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基縮醛H2N-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-丁醛，二乙基縮醛(14.0g)，濃氫氧化銨(650ml)，和乙醇(60ml)的混合物在室溫下攪拌42小時(shí)。接著在減壓下餾出全部揮發(fā)性物質(zhì)。將粗產(chǎn)物溶于150ml去離子水中，溶液的pH用1.0M NaOH調(diào)節(jié)到12。該產(chǎn)物用二氯甲烷(3×100ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO4上)和在減壓(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下餾出溶劑。
產(chǎn)量10.6g。NMR(D2O)1.09ppm(t，CH3-C-)1.56ppm(m，C-CH2-CH2-)，2.69ppm(t，CH2-N)，3.56ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.56ppm(t，-CH，縮醛)。純度～100％。
D.支化PEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基縮醛 從相應(yīng)的PEG2-賴氨酸制備PEG2(40KDa)-N-羥基琥珀酰亞胺(如在US專利No.5,932,462(Harris，J.等人)中所述的。前體PEG-2賴氨酸，一種具有可電離的羧基的支化PEG，通過離子交換色譜法提純，也如在US專利No.5,932,462中所述。
向PEG2(40KDa)-N-羥基琥珀酰亞胺(5.0g，0.000125摩爾)(Shearwater Corporation)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中添加四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基縮醛(0.50g，0.000148摩爾)和三乙胺(0.035ml)，反應(yīng)混合物在室溫下在氬氣氛中攪拌一夜。溶劑通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至干燥。將粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷中并用異丙醇沉淀。濕產(chǎn)物在減壓下干燥。產(chǎn)量4.8g。
NMR(d6-DMSO)1.10ppm(t，CH3-C)，1.51ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46ppm(t，-CH-，縮醛)。取代度～100％。
E.支化PEG2(40.3KDa)-丁醛 將支化PEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基縮醛(4.8g)溶于100ml水中并且溶液的pH用稀磷酸調(diào)節(jié)至3。溶液在室溫下攪拌3小時(shí)，隨后添加0.5M氫氧化鈉足以調(diào)節(jié)溶液的pH到約7。該產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，且萃取液用無水硫酸鎂干燥。溶劑被減壓餾出。
產(chǎn)量4.2g。NMR(d6-DMSO)1.75ppm(p，-CH2-CH2-CHO-)，2.44ppm(dt，-CH2-CHO)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，9.66ppm(t，-CHO)。
取代度～100％。
以上舉例說明本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案——代表性支化PEG鏈烷醛的制備。以上也舉例說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中聚合物鏈烷醛含有短的低聚基團(tuán)，在這種情況下為插入在聚合物骨架和該分子的鏈烷醛鏈段之間的四甘醇。此外，這一實(shí)施例舉例說明了含有可電離基團(tuán)的前體聚合物鏈段的使用，使得該聚合物鏈段在偶聯(lián)于鏈烷醛-縮醛試劑上之前能夠由離子交換色譜法提純，從而在反應(yīng)歷程的早些時(shí)候有效地除去聚合物雜質(zhì)。在這一情況下，所形成的產(chǎn)物不存在雙官能的聚合物雜質(zhì)如從PEG-二醇，或mPEG，或單PEG化賴氨酸等的反應(yīng)產(chǎn)生的那些，它們可能存在于mPEG2-賴氨酸前體中，但通過色譜分離法除去。
實(shí)施例6聚合物-鏈烷醛蛋白質(zhì)接合物的制備EPO的無規(guī)PEG化重組EPO(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)或另一種微生物源)偶聯(lián)于mPEG-丁醛30kDa(如在實(shí)施例2中所述制得)。
將EPO(～2mg)溶于1ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)并且mPEG(30kDa)-丁醛以5倍于EPO摩爾濃度的量被添加進(jìn)去。添加還原劑NaCNBH3，溶液在室溫下攪拌24小時(shí)將PEG-丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)混合物由SDS-PAGE分析測定PEG化程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的物質(zhì)的所顯示峰相差約30,000Da。所形成的反應(yīng)混合物含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。提高PEG試劑與蛋白質(zhì)的比率可以提高多PEG化的程度，即，2-鏈節(jié)，3-鏈節(jié)等的形成。
分子量大于約20kDa的高分子量PEG鏈烷醛的使用有利于單-PEG化物質(zhì)的形成。較小分子量PEG鏈烷醛，當(dāng)偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上時(shí)，在這些條件下更傾向于多-PEG化物質(zhì)的形成。
以上說明了本發(fā)明的示例性蛋白質(zhì)的無規(guī)PEG化，得到PEG化EPO產(chǎn)物的分布。如果需要，反應(yīng)混合物能夠進(jìn)一步分離以離析出各異構(gòu)體，如下所述。
具有不同分子量的PEG接合物然后通過凝膠過濾色譜法分離。不同的PEG接合物(1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)，3-鏈節(jié)等)以它們的不同分子量為基礎(chǔ)來分級(在這種情況下，變化大約30kDa)。具體地說，該分離通過使用適合于在所觀察的分子量范圍內(nèi)有效分離產(chǎn)物的系列柱系統(tǒng)，例如，SuperdexTM200柱(Amersham Biosciences)來進(jìn)行。該產(chǎn)物用10ml乙酸鹽緩沖劑在1.5ml/min的流速下進(jìn)行洗脫。所收集的級分(1ml)由在280nm下OD分析蛋白質(zhì)含量和使用碘試驗(yàn)分析PEG含量(Sims G.E.C.等，Anal.Biochem，107，60-63，1980)?；蛘?，通過運(yùn)轉(zhuǎn)SDS PAGE凝膠，隨后用碘化鋇染色來顯現(xiàn)結(jié)果。收集與洗脫峰對應(yīng)的級分，通過使用10-30kD截止薄膜進(jìn)行濃縮，并凍干。這一方法導(dǎo)致了具有相同分子量的接合物的分離/提純，但無法實(shí)現(xiàn)具有相同分子量但具有不同PEG化位點(diǎn)的接合物(即，位置異構(gòu)物)的分離。
位置異構(gòu)物的分離通過使用RP-HPLC C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)由反相色譜分析法來進(jìn)行的。這一程序可以有效地分離具有相同分子量(位置異構(gòu)物)的PEG-生物分子異構(gòu)體。該反相色譜法通過使用RP-HPLC C18制備柱來進(jìn)行的并用水/0.05％TFA(洗脫劑A)和乙腈/0.05％TFA(洗脫劑B)的梯度來洗脫。
收集與洗脫峰對應(yīng)的級分，蒸發(fā)除去乙腈和TFA，隨后除去溶劑而分離出各PEG-位置異構(gòu)體。
實(shí)施例7聚合物-鏈烷醛蛋白質(zhì)接合物的制備EPO的N-末端PEG化重組EPO(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞，但不限于它)或另一種微生物源)偶聯(lián)于mPEG-丁醛30kDa(實(shí)施例2)。
將EPO(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)和mPEG(30kDa)-丁醛(來自實(shí)施例2)以5倍于EPO摩爾濃度的量被添加進(jìn)去。添加還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)將PEG-丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)混合物由SDS-PAGE分析測定PEG化程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的物質(zhì)的所顯示峰相差約30,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離EPO和更高分子量物質(zhì)。
N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG與蛋白質(zhì)的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化蛋白質(zhì)。
以上說明了本發(fā)明的示例性蛋白質(zhì)的PEG化，得到主要N-末端單PEG化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例8GCSF的N-末端PEG化重組GCSF(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)或其它微生物源)偶聯(lián)于mPEG-丁醛(30kDa)上。
將GCSF(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)中并且mPEG(30kDa)-丁醛(來自實(shí)施例2)以5倍于GCSF摩爾濃度的量被添加進(jìn)去。添加還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)將PEG-丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)混合物由SDS-PAGE分析測定PEG化程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的物質(zhì)的所顯示峰相差約30,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的GCSF的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離GCSF和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG與蛋白質(zhì)的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化蛋白質(zhì)。
實(shí)施例9干擾素α的N-末端PEG化重組體IFN-α(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞，但不限于它)或其它微生物源)偶聯(lián)于mPEG-丁醛(30kDa)上。
將干擾素-α(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)中并且mPEG(30kDa)-丁醛(來自實(shí)施例2)以5倍于IFN摩爾濃度的量被添加進(jìn)去。添加還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)將PEG-丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)混合物由SDS-PAGE分析測定PEG化程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的物質(zhì)的所顯示峰相差約30,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離干擾素α和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG與蛋白質(zhì)的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化IFN。
蛋白質(zhì)hGH，IFN-β，和FSH接合到另一種示例性PEG-鏈烷醛(mPEG-2-甲基丁醛，20kDa)上基本上按照在上述實(shí)施例中所述的方法來進(jìn)行。
實(shí)施例10人生長激素的N-末端PEG化重組人生長激素(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO，但不限于它)或另一種微生物源)偶聯(lián)于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。
將人生長激素(～2mg)溶于1ml的0.1mm乙酸鈉(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于hGH摩爾濃度的量添加。添加5-20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)以使PEG-α甲基丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)的進(jìn)程SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析，以測定PEG化的程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的和其它的物質(zhì)的所顯示峰相差約20,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離hGH和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG醛與蛋白質(zhì)的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化hGH的群。
實(shí)施例11干擾素-β的N-末端PEG化重組干擾素-β(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞，但不限于它)或另一種微生物源)偶聯(lián)于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。
將干擾素-β(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于IFN-β摩爾濃度的量添加。添加5-20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)以使PEG-α甲基丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)的進(jìn)程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析，以測定PEG化的程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的和其它的物質(zhì)的所顯示峰相差約20,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離IFN-β和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG醛與蛋白質(zhì)的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化IFN-β的群。
實(shí)施例12FSH的N-末端PEG化重組促卵泡激素(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO，但不限于它)或另一種微生物源)偶聯(lián)于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。
將促卵泡激素，F(xiàn)SH(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于FSH摩爾濃度的量添加。添加5-20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)以使PEG-α甲基丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)的進(jìn)程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析，以測定PEG化的程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的和其它的物質(zhì)的所顯示峰相差約20,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離FSH和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。提高PEG醛與蛋白質(zhì)的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化FSH的群。
實(shí)施例13人生長激素的N-末端PEG化重組hGH(在大腸桿菌中產(chǎn)生，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO，但不限于它)或另一種微生物源)以共價(jià)鍵連接于支化PEG2(40.3kDa)-丁醛(實(shí)施例5E)上。
將人生長激素(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸鈉(pH5)中并且支化PEG2(40.3KDa)-丁醛以5倍于hGH摩爾濃度的量添加。添加5-20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，溶液在4℃下攪拌24小時(shí)以使支化PEG2(40.3KDa)-丁醛試劑經(jīng)由胺鍵偶聯(lián)于蛋白質(zhì)上。
反應(yīng)的進(jìn)程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析，以測定PEG化的程度。PEG化的程度，1-鏈節(jié)，2-鏈節(jié)(如果有的話)等的證實(shí)進(jìn)行通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法來進(jìn)行。對于天然的和單PEG化的和其它的物質(zhì)的所顯示峰相差約40,000Da。所形成的反應(yīng)混合物主要含有天然的和單PEG化的蛋白質(zhì)的混合物，尤其由于支化PEG鏈烷醛試劑的尺寸和幾何結(jié)構(gòu)。單PEG化物質(zhì)由柱色譜法提純以除去游離hGH和更高分子量物質(zhì)。N-末端PEG化的證實(shí)是通過作肽圖來進(jìn)行的。
實(shí)施例14兩性霉素B的PEG化小分子兩性霉素B的氨基通過聚合物鏈烷醛的連接來改性。
向兩性霉素B.HCl在去離子水中的溶液中添加2倍摩爾過量的已溶于pH6.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的mPEG2k-丁醛(實(shí)施例1)。向該混合物中添加NaCNBH3(以1.5-10倍摩爾過量)在pH6.5的磷酸鹽緩沖液中的溶液，所形成的溶液在室溫下在氬氣氛中攪拌一夜。反應(yīng)混合物的等分試樣在各個(gè)時(shí)間間隔取出，由1H NMR監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程。一旦完成，反應(yīng)混合物通過添加水來進(jìn)一步稀釋，并添加NaCl達(dá)到飽和。該產(chǎn)物然后用二氯甲烷萃取，且合并的有機(jī)萃取物在無水硫酸鈉上干燥，過濾除去干燥劑，并由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物然后通過二乙醚的添加來沉淀，在真空下干燥一夜?；厥盏漠a(chǎn)物由凝膠滲透色譜法分析以測定接合的程度。
粗產(chǎn)物通過使用Poros 50 HS陽離子交換樹脂(PerSeptiveBioSystems，F(xiàn)ramingham，MA)由陽離子交換色層分離法提純。在用去離子水洗滌色譜柱之后，產(chǎn)物用1N NaCl溶液洗脫。含有萃取液的接合物被合并，產(chǎn)物用二氯甲烷萃取。有機(jī)溶液在無水硫酸鈉上干燥，過濾，并由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來蒸發(fā)溶劑。提純的接合物通過二乙醚的添加來提純。
如果需要，產(chǎn)物通過使用Betasil C18柱(Keystone Scientific)由反相HPLC色譜分離法進(jìn)一步提純。
實(shí)施例15由環(huán)氧乙烷的陰離子開環(huán)聚合直接到陰離子縮醛前體上制備PEG(3500DA)-α-羥基-ω-丁醛的方法在這一實(shí)施例中，具有適合于引發(fā)環(huán)氧乙烷的開環(huán)聚合的部位的縮醛前體通過4-氯丁醛二乙基縮醛與二醇(乙二醇)反應(yīng)來制備。以這種方法，鹵素-縮醛轉(zhuǎn)化成羥基終端縮醛。羥基，當(dāng)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)醇鹽陰離子時(shí)，提供了引發(fā)環(huán)氧乙烷(EO)的聚合的部位，從而形成聚合物鏈烷醛前體。聚合物鏈烷醛前體(縮醛)，在水解之后，轉(zhuǎn)化成所需的聚合物鏈烷醛。
用于制備本發(fā)明的聚合物鏈烷醛的這一合成方法的通用化反應(yīng)歷程示于圖1中。
A.2-(4，4-二乙氧基-丁氧基)乙醇(化合物15A)的制備。
無水乙二醇(120g，1.93摩爾)，叔丁醇鉀在叔丁醇中的1.0M溶液(70ml，0.07摩爾)，和4-氯丁醛二乙基縮醛(11g，0.061摩爾)的混合物在100℃下在氬氣氛中攪拌一夜。在冷卻到室溫之后，反應(yīng)混合物被加入到600ml蒸餾水中。產(chǎn)物用二氯甲烷(150，125和125ml)萃取。合并的萃取液然后用無水硫酸鎂干燥和在減壓下于25℃餾出溶劑。接著讓產(chǎn)物進(jìn)行真空蒸餾(kugelrohr，t＝90-110℃，0.10毫米汞柱)。產(chǎn)量5.5g。
NMR(d6-DMSO)1.11ppm(t，6H)，1.53ppm(m，-CH2CH，2H)，1.64ppm(m，-CH2CH2CH，2H)，3.37ppm(t，-O-CH2CH2CH2CH，2H)，3.53ppm(t，HO-CH2CH2O-，2H)，3.62ppm(q，-CH2CH3，4H)，3.70ppm(t，HO-CH2-，2H)，4.38ppm(t，-CH縮醛，1H)，4.54ppm(t，1H，-OH)。
B.PEG(3,500Da)-α-羥基-ω-丁醛二乙基縮醛的制備 化合物15A(0.51g，0.00247摩爾)，THF 200ml，和萘基鉀(0.3mol/L-四氫呋喃溶液，20ml，0.006摩爾)被添加到玻璃反應(yīng)器中并在氬氣氛中攪拌3分鐘。將環(huán)氧乙烷(8.8g 0.20摩爾)加入到該溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌44小時(shí)。接著，混合物用氬氣吹掃，添加0.1M磷酸鹽緩沖液(pH＝8,100ml)。分離THF層和廢棄它。由乙醚萃取從溶液中除去萘。產(chǎn)物用二氯甲烷(3×50ml)從殘留物中萃取出來。萃取液用無水硫酸鈉干燥并濃縮到約30ml。接著添加乙醚(250ml)，混合物在0℃下攪拌15分鐘。沉淀的產(chǎn)物被濾出并在減壓下干燥。
產(chǎn)量7.2g。
NMR(d6-DMSO)1.09ppm(t，CH3-，3H)1.52ppm(m，C-CH2-CH2-，4H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.46ppm(t，-CH，縮醛，1H)，4.57ppm(t-OH，1H)。
C.PEG(3,500Da)-α-羥基-ω-丁醛PEG(3,500)-α-羥基-ω-丁醛二乙基縮醛(1.0g)，去離子水(20ml)，和調(diào)節(jié)pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。接著，添加氯化鈉(1.0g)，通過添加0.1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.8。該產(chǎn)物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和餾出溶劑。濕產(chǎn)物在減壓下干燥。產(chǎn)量0.82g。
NMR(d6-DMSO)1.75ppm(p，-CH2-CH2-CHO-)，2.44ppm(dt，-CH2-CHO)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.57ppm(t，-OH)，9.66ppm(t，-CHO)。
實(shí)施例16甲氧基-PEG(3500Da)丁醛的制備這一實(shí)施例說明了從PEGα-羥基-ω-鏈烷醛縮醛制備示例性封端PEG-鏈烷醛的方法。
A.mPEG(3,500Da)-丁醛二乙基縮醛PEG(3,500Da)-α-羥基-ω-丁醛二乙基縮醛(3.5g，0.001摩爾)，甲苯(50ml)，叔丁醇鉀在叔丁醇中的1.0M溶液(5ml，0.005摩爾)和對-甲苯磺酸甲基酯(0.75g，0.004摩爾)的混合物在45℃下攪拌一夜。接著，在減壓下餾出溶劑(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。將粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷中和被添加到冷乙醚中。沉淀的產(chǎn)物被濾出并在減壓下干燥。產(chǎn)量3.1g。
NMR(d6-DMSO)1.09ppm(t，CH3-，3H)1.52ppm(m，C-CH2-CH2-，4H)，3.24ppm(s，CH3O-，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.46ppm(t，-CH，縮醛，1H)。
B.mPEG(3,500Da)-丁醛mPEG(3,500)-丁醛二乙基縮醛(1.0g)，去離子水(20ml)，和調(diào)節(jié)pH到3.0的5％磷酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。接著，添加氯化鈉(1.0g)，通過添加0.1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.8。該產(chǎn)物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥和餾出溶劑。濕產(chǎn)物在減壓下干燥。產(chǎn)量0.85g。
NMR(d6-DMSO)1.75ppm(p，-CH2-CH2-CHO-，2H)2.44ppm(dt，-CH2-CHO，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，9.66ppm(t，-CHO，1H)。
實(shí)施例17甲氧基-PEG(2kDA)2-甲基丁醛的制備這一實(shí)施例描述了本發(fā)明的示例性聚合物2-烷基取代的鏈烷醛的合成方法。這一聚合物，不是具有將醛碳與連接基分開的亞烷基直鏈，而是具有在C-2位置上的甲基取代基。
綜述保護(hù)的縮醛試劑，17-A是從商購的起始原料2-甲基-4-氯丁酸酯制備的，這通過首先將丁酸酯碳還原成相應(yīng)的醇，隨后氧化成丁醛來實(shí)現(xiàn)。該丁醛然后作為相應(yīng)縮醛被保護(hù)，得到用于偶聯(lián)于PEG上的保護(hù)縮醛試劑。在偶聯(lián)于PEG上之后，所形成的聚合物縮醛在酸中水解得到所需聚合物鏈烷醛。
A.4-氯-2-甲基丁醛二乙基縮醛的制備4-氯-2-甲基丁醇-1的制備2-甲基-4-氯丁酸酯(TCI America)(22.0g，0146摩爾)在乙醚(80ml)中的溶液在30分鐘內(nèi)在氬氣氛中被滴加到處于0℃下的氫化鋰鋁(4.55g，0.12摩爾)在乙醚(360ml)中的攪拌溶液中。接著經(jīng)30分鐘滴加甲醇(12ml)，然后經(jīng)過20分鐘時(shí)間滴加冰冷的2N HCl(420ml)。反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并分離含有4-氯-2-甲基丁醇-1的醚層。另外的產(chǎn)物用乙醚從水層中萃取(3×200ml)。醚萃取液被合并，用無水硫酸鎂干燥和在減壓下餾出溶劑。產(chǎn)量18.6g。
NMR(d6-DMSO)0.84ppm(d，-CH3，3H)，1.50ppm(m，-CH2CH2Cl，1H)，1.68ppm(m，-CH-，1H)，1.82ppm(m，-CH2CH2Cl，1H)3.26ppm(t，-CH2OH，2H)，3.66ppm(m，-CH2Cl，2H)，4.50ppm(t，-OH，1H)。
4-氯-2-甲基丁醛將氯鉻酸吡啶鎓(23.6g，0.110g)逐漸添加到4-氯-2-甲基丁醇-1(8.80g，0.078摩爾)在無水二氯甲烷(470ml)中的攪拌溶液中。混合物在室溫下在氬氣氛中攪拌一夜。添加干燥乙醚(820ml)；混合物攪拌20分鐘，然后過濾除去多余的氧化劑。溶液然后經(jīng)填充了400g Florisil的柱進(jìn)行過濾，并在減壓下餾出溶劑。產(chǎn)量6.0g。
NMR(d6-DMSO)1.06ppm(d，-CH3，3H)，1.74ppm(m，-CH2CH2Cl，1H)，2.14ppm(m，-CH2CH2Cl，1H)，2.56ppm(m，-CH，1H)，3.69ppm(m，-CH2Cl，2H)，9.60ppm(t，-CHO，1H)。
4-氯-2-甲基丁醛二乙基縮醛4-氯-2-甲基丁醛(4.8g，0.040摩爾)，原甲酸三乙酯(6.48g，0.044摩爾)，乙醇(3.0g)，和對甲苯磺酸一水合物(0.0144g，0.000757摩爾)的混合物在45℃下在氬氣氛中攪拌一夜。接著，在冷卻到室溫之后，添加Na2CO3(0.40g)并且混合物攪拌15分鐘。反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾并在減壓下餾出乙醇和殘留的原甲酸三乙酯。殘留物進(jìn)行真空分餾，得到3.2g的純4-氯-2-甲基丁醛二乙基縮醛。
NMR(d6-DMSO)0.85ppm(d，-CH3，3H)1.13ppm(m，-CH3，6H)，1.52ppm(m，-CH-，1H)，1.87ppm(m，-CH2CH2Cl，2H)，3.35-3.75ppm(bm，-OCH2CH3，4H，和-CH2Cl，2H)，4.22ppm(d，-CH縮醛，1H)。
B.mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛，二乙基縮醛mPEG(2K Da)(2.0g，0.001摩爾)和甲苯(30ml)的溶液在減壓下通過蒸餾出甲苯來進(jìn)行共沸干燥。干燥的mPEG 2K溶于無水甲苯(15ml)中和添加叔丁醇鉀在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩爾)和來自以上A的4-氯-2-甲基丁醛二乙基縮醛(0.5g，0.00277摩爾)。接著，添加溴化鋰(0.05g)并且混合物在100℃下在氬氣氛中攪拌一夜。在冷卻到室溫之后，混合物被過濾和添加到處于0-5℃下的150ml乙基醚中。沉淀的產(chǎn)物被濾出并在減壓下干燥。產(chǎn)量1.5g。
NMR(d6-DMSO)0.83ppm(d，-CH3，3H)1.10ppm(m，-CHC3O，6H)，1.24ppm(m，-CH-，1H)，1.72ppm(m，PEG-O-CH2-CH2-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.18ppm(d，-CH縮醛，1H)。
取代度～100％。
C.mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛含有來自以上B的mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛，二乙基縮醛(1.0g)，去離子水(20ml)，和調(diào)節(jié)pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。接著，添加氯化鈉(1.0g)，并通過添加0.1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.8。
該產(chǎn)物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用無水硫酸鎂干燥并在減壓下餾出溶劑。產(chǎn)量0.83g。
NMR(d6-DMSO)1.01ppm(d，-CH3，3H)1.56ppm(m，-CH，1H)，1.90ppm(m，PEG-O-CH2-CH2-，1H)，2.45ppm(m，PEG-O-CH2-CH2-，1H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，9.56ppm(d，-CH醛，1H)。
取代度～100％。
權(quán)利要求
1.具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物 其中POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分；z’是1到約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)，和進(jìn)一步其中下列條件適用-當(dāng)POLY是線形的時(shí)(a)在聚合物中存在的羰基總數(shù)為0或2或更大，但是當(dāng)X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)鏈段時(shí)除外，(b)和進(jìn)一步其中X’是氧或包括至少一個(gè)(-CH2CH2O-)鏈段和z’是2-12，則在至少一種情況下R1或R2中的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或該聚合物是非同類雙官能化的，其中POLY在一個(gè)末端上包括不是羥基的反應(yīng)活性基團(tuán)，和-當(dāng)POLY是支化的時(shí)(c)或者(i)在至少一種情況下R1或R2的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或者(ii)對于POLY包括賴氨酸殘基的情況，X’包括-(CH2CH2O)b-，其中b是1-約20，(d)和進(jìn)一步其中POLY具有2個(gè)聚合物分支，則對于POLY包括“C-H”作為分支點(diǎn)的情況，沒有聚合物分支包括氧作為唯一的雜原子。
2.權(quán)利要求1的聚合物，其中z’是2到21。
3.權(quán)利要求1的聚合物，其中z’是3到12。
4.權(quán)利要求1的聚合物，具有以下結(jié)構(gòu) 其中POLY，X’，各R1，各R2和R3如前面所定義。
5.權(quán)利要求4的聚合物，其中連接于C2上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
6.權(quán)利要求5的聚合物，其中連接于C2上的R1是低級烷基。
7.權(quán)利要求6的聚合物，其中連接于C2上的R1選自甲基，乙基和丙基。
8.權(quán)利要求4的聚合物，其中連接于C3上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
9.權(quán)利要求8的聚合物，其中連接于C3上的R1是低級烷基。
10.權(quán)利要求4的聚合物，其中連接于C4上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
11.權(quán)利要求10的聚合物，其中連接于C4上的R1是低級烷基。
12.權(quán)利要求1的聚合物，具有下列結(jié)構(gòu) 其中POLY，X’，和各R1和各R2如前面所定義。
13.權(quán)利要求12的聚合物，其中連接于C2上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
14.權(quán)利要求12的聚合物，其中連接于C3或C4上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
15.權(quán)利要求1的聚合物，具有下列結(jié)構(gòu) 其中POLY，X’，和各R1和各R2如前面所定義。
16.權(quán)利要求15的聚合物，其中連接于C2上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
17.權(quán)利要求15的聚合物，其中連接于C3或C4或C5上的R1變量中的一個(gè)是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
18.權(quán)利要求1的聚合物，其中X’包括對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)部分-(CH2)c-De-(CH2)f-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-其中c是0-8，D是O，NH，或S，e是0，1f是0-8，p是0-8，M是-NH，OK是NH，Oq是0-8，和r和s各自獨(dú)立地是0，1。
19.權(quán)利要求1的聚合物，其中X’包括對應(yīng)于結(jié)構(gòu)-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-的結(jié)構(gòu)部分，以及b和g各自獨(dú)立地是1-20。
20.權(quán)利要求19的聚合物，其中b和g各自獨(dú)立地是1-10。
21.權(quán)利要求20的聚合物，其中b和g各自獨(dú)立地是1-6。
22.權(quán)利要求18的聚合物，其中X’包括對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)部分-(CH2)c-De-(CH2)f-P-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-其中P和T各自獨(dú)立地是-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g，b和g各自獨(dú)立地是1-20，和剩余變量如在權(quán)利要求18中所定義。
23.權(quán)利要求1的聚合物，其中X’包括-C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-或-NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-。
24.權(quán)利要求1的聚合物，其中POLY選自聚(烯化氧)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚噁唑啉，聚(丙烯?；鶈徇?，和聚(乙氧基化的多元醇)。
25.權(quán)利要求1的聚合物，其中POLY是聚(烯化氧)。
26.權(quán)利要求25的聚合物，其中POLY是聚(乙二醇)。
27.權(quán)利要求26的聚合物，其中聚(乙二醇)被封端結(jié)構(gòu)部分所封端。
28.權(quán)利要求27的聚合物，其中封端結(jié)構(gòu)部分獨(dú)立地選自烷氧基，取代的烷氧基，鏈烯氧基，取代的鏈烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，和取代的芳氧基。
29.權(quán)利要求28的聚合物，其中封端結(jié)構(gòu)部分選自甲氧基，乙氧基，和芐氧基。
30.權(quán)利要求26的聚合物，其中聚(乙二醇)具有約100道爾頓到約100,000道爾頓的標(biāo)稱平均分子量。
31.權(quán)利要求26的聚合物，其中聚(乙二醇)具有約1,000道爾頓到約50,000道爾頓的標(biāo)稱平均分子量。
32.權(quán)利要求26的聚合物，其中聚(乙二醇)具有約2,000道爾頓到約30,000道爾頓的標(biāo)稱平均分子量。
33.權(quán)利要求1的聚合物，包括以下結(jié)構(gòu) 其中POLY，各X’，各(z’)，各R1和各R2如前面所定義。
34.權(quán)利要求33的聚合物，其中POLY是線形的和聚合物是同類雙官能化的。
35.權(quán)利要求26的聚合物，其中該聚(乙二醇)具有選自線形、支化和分叉類型中的結(jié)構(gòu)。
36.權(quán)利要求26的聚合物，其中聚(乙二醇)包括以下結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)n-或Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n是約10到約4000，和Z包括選自羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂類，生物素，和熒光素的結(jié)構(gòu)部分。
37.權(quán)利要求1的聚合物，具有選自以下這些的結(jié)構(gòu) 和 其中PEG是聚(乙二醇)，b和g各自獨(dú)立地是0到20，a是0-6，和剩余變量如權(quán)利要求1中所定義。
38.權(quán)利要求37的聚合物，具有以下結(jié)構(gòu) 或 其中變量如在權(quán)利要求37中所定義。
39.權(quán)利要求37的聚合物，其中PEG具有選自線形，支化和分叉類型中的結(jié)構(gòu)。
40.權(quán)利要求37的聚合物，其中b和g各獨(dú)立地是1-8。
41.權(quán)利要求37的聚合物，其中b和g各獨(dú)立地是1-6。
42.權(quán)利要求37的聚合物，其中z’是2到6。
43.權(quán)利要求37的聚合物，其中z’是3。
44.權(quán)利要求37的聚合物，其中a是0或1。
45.權(quán)利要求37的聚合物，具有以下結(jié)構(gòu) 46.權(quán)利要求45的聚合物，其中“PEG”是具有對應(yīng)于以下這些的結(jié)構(gòu)的聚(乙二醇)Z-(CH2CH2O)n-，或 其中在各情況下n獨(dú)立地是約10到約4000，和Z包括選自羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂類，生物素，和熒光素的結(jié)構(gòu)部分。
47.權(quán)利要求46的聚合物，其中Z是烷氧基，和在各情況下n是相同的并且在約100-600范圍內(nèi)。
48.權(quán)利要求1的聚合物，具有以下結(jié)構(gòu) 或 其中PEG是聚(乙二醇)，b是0到20，s是0到6，d是1，2或3，和剩余變量如在權(quán)利要求1中所定義。
49.權(quán)利要求48的聚合物，其中PEG是線形或支化。
50.權(quán)利要求48的聚合物，其中R1和R2在各情況下是H。
51.權(quán)利要求48的聚合物，其中z’是3到12。
52.權(quán)利要求48的聚合物，其中z’是3。
53.權(quán)利要求48的聚合物，其中d是2和PEG對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu) 其中n是約10到約4000，和Z包括選自羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂類，生物素，和熒光素的結(jié)構(gòu)部分，以及剩余變量如權(quán)利要求48中所定義。
54.權(quán)利要求53的聚合物，其中Z是烷氧基或芐氧基，n是約200-約1500，和b是1-8。
55.包括具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物的組合物 其中POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分，和z’是1到約21的整數(shù)，和該組合物不含有可檢測量的含有碘的物質(zhì)或逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物。
56.包括具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物的組合物 其中POLY是線形，末端封閉的水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分，z’是1到約21的整數(shù)，和該組合物不存在可檢測量的二醛聚合物衍生物。
57.權(quán)利要求55或56的組合物，其中z’是2-21。
58.權(quán)利要求55或56的組合物，其中z’是3-12。
59.權(quán)利要求55或56的組合物，其中z’是3-8。
60.權(quán)利要求55或56的組合物，其中POLY選自聚(烯化氧)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚噁唑啉，聚(丙烯?；鶈徇?，和聚(乙氧基化的多元醇)。
61.權(quán)利要求55的組合物，其中POLY是聚(烯化氧)。
62.權(quán)利要求61的組合物，其中POLY是聚(乙二醇)。
63.權(quán)利要求56的組合物，其中POLY是聚(烯化氧)。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中POLY是聚(乙二醇)。
65.權(quán)利要求55的組合物，其中該聚合物包括以下結(jié)構(gòu)
66.權(quán)利要求65的組合物，其中POLY是聚(乙二醇)。
67.權(quán)利要求56的組合物，其中該聚合物包括以下結(jié)構(gòu)
68.權(quán)利要求67的組合物，其中POLY是聚(乙二醇)。
69.權(quán)利要求65的組合物，其中X’包括對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)部分-(CH2)c-De-(CH2)f-或-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-其中c是0-8，D是O，NH，或S，e是0，1f是0-8，p是0-8，M是-NH，OK是NH，Oq是0-8，和r和s各自獨(dú)立地是0，1。
70.權(quán)利要求65的組合物，其中X’是水解穩(wěn)定的。
71.權(quán)利要求65的組合物，其中POLY對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X’是O，n是約10-約4000，和Z包括選自羥基，氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酰肼，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，芐氧基，硅烷，類脂，磷脂類，生物素，和熒光素的結(jié)構(gòu)部分。
72.權(quán)利要求71的組合物，其中Z是C1-C20烷氧基或芐氧基。
73.權(quán)利要求71的組合物，其中該聚合物包括以下結(jié)構(gòu) 其中n如在權(quán)利要求71中所定義。
74.權(quán)利要求72的組合物，其中Z是甲氧基。
75.權(quán)利要求66的組合物，其中該聚(乙二醇)具有選自線形，支化和分叉類型中的結(jié)構(gòu)。
76.權(quán)利要求66的組合物，其中X’包括對應(yīng)于結(jié)構(gòu)-(CH2CH2O)b-或-(CH2CH2NH)g-的結(jié)構(gòu)部分，以及b和g各自獨(dú)立地是1-20的低聚結(jié)構(gòu)部分。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中b和g各自獨(dú)立地是1-10。
78.權(quán)利要求20的組合物，其中b和g各自獨(dú)立地是1-6。
79.權(quán)利要求76的組合物，其中該低聚結(jié)構(gòu)部分以共價(jià)鍵連接于C4亞甲基上。
80.權(quán)利要求79的組合物，其中該X’進(jìn)一步包括酰胺或脲烷。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中X’包括選自-C(O)NH-(CH2CH2O)b-，-OC(O)NH-(CH2CH2O)b-，-C(O)NH-(CH2CH2NH)g-，-OC(O)NH-(CH2CH2NH)g-中的結(jié)構(gòu)部分，以及b和g如在權(quán)利要求76中所定義。
82.由權(quán)利要求1的水溶性聚合物形成的水合物或縮醛。
83.由權(quán)利要求55的水溶性聚合物形成的水合物或縮醛。
84.權(quán)利要求82的縮醛，其中縮醛選自二甲基縮醛，二乙基縮醛，二異丙基縮醛，二芐基縮醛，2，2，2-三氯乙基縮醛，雙(2-硝基芐基)縮醛，S，S’-二甲基縮醛，和S，S’-二乙基縮醛。
85.權(quán)利要求1的水溶性聚合物，作為二氧戊環(huán)被保護(hù)。
86.包括以下結(jié)構(gòu)的聚合物 其中POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分，z’是1到約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)，Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，和R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。
87.權(quán)利要求83的聚合物，其中下列條件適用-當(dāng)POLY是成形的時(shí)(a)則在聚合物存在的羰基總數(shù)是0或2或更大，但是當(dāng)X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)鏈段時(shí)除外，(b)和進(jìn)一步其中X’是氧或包括至少一個(gè)(-CH2CH2O-)鏈段和z’是2-12，則在至少一種情況下R1或R2中的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或該聚合物是非同類雙官能化的，其中POLY在一個(gè)末端上包括不是羥基的反應(yīng)活性基團(tuán)，和-當(dāng)POLY是支化的時(shí)(c)則或者在至少一種情況下R1或R2的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或X’包括-(CH2CH2O)b-，其中b是1-約20，和進(jìn)一步對于POLY包括賴氨酸殘基的情況，(d)和具有2個(gè)聚合物分支，則對于POLY包括“C-H”作為分支點(diǎn)的情況，沒有聚合物分支包括氧作為唯一的雜原子。
88.具有以下結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物 其中POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分，z’是1到約21的整數(shù)，Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，和R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。
89.權(quán)利要求88的聚合物，其中該聚合物不存在可檢測量的含碘的物質(zhì)或逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物。
90.由生物活性劑與權(quán)利要求1的聚合物反應(yīng)所形成的接合物。
91.由生物活性劑與權(quán)利要求55的組合物反應(yīng)所形成的接合物。
92.由生物活性劑與權(quán)利要求56的組合物反應(yīng)所形成的接合物。
93.包括下列結(jié)構(gòu)的接合物 其中POLY是水溶性聚合物鏈段；X’是連接基結(jié)構(gòu)部分；z’是1到約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)，-“NH-生物活性劑”表示包括氨基的生物活性劑，和進(jìn)一步其中下列條件適用-當(dāng)POLY是成形的時(shí)(a)在聚合物存在的羰基總數(shù)是0或2或更大，但是當(dāng)X’包括一個(gè)或多個(gè)鄰接(-CH2CH2O-)鏈段時(shí)除外，(b)和X’是氧或包括至少一個(gè)(-CH2CH2O-)鏈段和z’是2-12，則在至少一種情況下R1或R2中的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或該聚合物是非同類雙官能化的，其中POLY在一個(gè)末端上包括不是羥基的反應(yīng)活性基團(tuán)，和-當(dāng)POLY是支化的時(shí)(c)則或者在至少一種情況下R1或R2的至少一個(gè)是如以上所定義的有機(jī)基團(tuán)或X’包括-(CH2CH2O)b-，其中b是1-約20，和進(jìn)一步對于POLY包括賴氨酸殘基的情況，(d)和具有2個(gè)聚合物分支，則對于POLY包括“C-H”作為分支點(diǎn)的情況，沒有聚合物分支包括氧作為唯一的雜原子。
94.使用權(quán)利要求1的水溶性聚合物所形成的水凝膠。
95.使用權(quán)利要求55的組合物所形成的水凝膠。
96.包括選自下列這些中的結(jié)構(gòu)的被保護(hù)醛 XI-C其中z’是1到約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)，Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，和R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。b和g各自獨(dú)立地是1-20，和G是官能團(tuán)。
97.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中G是離去基團(tuán)。
98.權(quán)利要求97的保護(hù)醛，其中G選自Cl，Br，對-甲苯基磺酸酯，甲基磺?；?，三氟磺?；?，就三氟乙基磺?；ァ?br> 99.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中G是選自-OH，-NH2，-SH，和它們的被保護(hù)形式中的官能團(tuán)。
100.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中z’是2-12。
101.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中在選自C2(α)，C3(β)和C4(γ)中的任何一個(gè)位置上的R1是烷基，和全部其它R1和R2變量是H。
102.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中b和g各自獨(dú)立地是1-8。
103.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中b和g各自獨(dú)立地是1-6。
104.權(quán)利要求96的保護(hù)醛，其中b和g各等于4。
105.形成任選地處于被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛的方法，方法包括下列步驟在有效形成屬于被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛的條件下，讓包含至少一個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)Y的水溶性聚合物與包括約2到20個(gè)碳原子和適合于被Y替代或者與Y反應(yīng)的反應(yīng)活性基團(tuán)K的受保護(hù)的鏈烷醛試劑進(jìn)行反應(yīng)。
106.權(quán)利要求105的方法，其中該反應(yīng)步驟是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的。
107.權(quán)利要求106的方法，其中該有機(jī)溶劑選自甲苯，氯仿，二氯甲烷，乙腈，丙酮，二噁烷，甲醇，和乙醇。
108.權(quán)利要求105的方法，其中該反應(yīng)是在惰性氣氛下進(jìn)行的。
109.權(quán)利要求105的方法，其中該反應(yīng)是在約20℃到約150℃的溫度下進(jìn)行的。
110.權(quán)利要求105的方法，進(jìn)一步包括在酸性條件下水解處于被保護(hù)形式下的水溶性聚合物鏈烷醛，得到相應(yīng)的水溶性聚合物鏈烷醛。
111.權(quán)利要求110的方法，其中該水解是在含水溶劑中進(jìn)行的。
112.權(quán)利要求111的方法，其中鏈烷醛試劑包括4個(gè)或4個(gè)以上碳原子。
113.權(quán)利要求112的方法，其中水解是在不低于約3的pH下進(jìn)行的。
114.權(quán)利要求105的方法，其中該鏈烷醛試劑是作為縮醛來保護(hù)的。
115.權(quán)利要求114的方法，其中縮醛選自二甲基縮醛，二乙基縮醛，二異丙基縮醛，二芐基縮醛，2，2，2-三氯乙基縮醛，雙(2-硝基芐基)縮醛，S，S’-二甲基縮醛，和S，S’-二乙基縮醛，環(huán)狀縮醛和環(huán)狀硫縮醛。
116.權(quán)利要求105的方法，其中水溶性聚合物包括結(jié)構(gòu)POLY-Y，和受保護(hù)的鏈烷醛試劑包括以下結(jié)構(gòu) 其中z’是1到約21的整數(shù)；R1，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)；R2，在各情況下，獨(dú)立地是H或選自烷基，取代的烷基，鏈烯基，取代的鏈烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有機(jī)基團(tuán)，Wa和Wb各自獨(dú)立地是O或S，和R3和R4各自獨(dú)立地是H，或選自甲基，乙基，異丙基，芐基，1，1，1-三氯乙基，和硝基芐基中的有機(jī)基團(tuán)，或當(dāng)連接在一起時(shí)，是-(CH2)2-或-(CH2)3-，當(dāng)與Wa、C1和Wb一起考慮時(shí)形成5員或6員環(huán)。
117.權(quán)利要求116的方法，其中POLY選自聚(烯化氧)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚噁唑啉，聚(丙烯?；鶈徇?，和聚(乙氧基化的多元醇)。
118.權(quán)利要求117的方法，其中POLY是聚(乙二醇)。
119.權(quán)利要求118的方法，其中聚(乙二醇)被封端結(jié)構(gòu)部分所封端。
120.權(quán)利要求119的方法，其中封端結(jié)構(gòu)部分獨(dú)立地選自烷氧基，取代的烷氧基，鏈烯氧基，取代的鏈烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，和取代的芳氧基。
121.權(quán)利要求120的方法，其中封端結(jié)構(gòu)部分選自甲氧基，乙氧基，和芐氧基。
122.權(quán)利要求119的方法，其中POLY-Y包括結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和Z是選自-OCH3，-OCH2CH3，-OCH2(C6H5)，和K選自 其中R1和R2各自獨(dú)立地是H或低級烷基，和Wa和Wb各自是O。
123.權(quán)利要求122的方法，其中z’是4-約12。
124.權(quán)利要求122的方法，其中z’是4-約8。
125.權(quán)利要求122的方法，其中R1和R2在各情況下都是H。
126.權(quán)利要求122的方法，其中處于被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛以大于約85％產(chǎn)率形成。
127.權(quán)利要求126的方法，其中處于被保護(hù)形式的水溶性聚合物鏈烷醛以大于約95％產(chǎn)率形成。
128.權(quán)利要求122的方法，進(jìn)一步包括在酸性條件下水解處于被保護(hù)形式下的水溶性聚合物鏈烷醛，從而在反應(yīng)混合物中形成相應(yīng)的水溶性聚合物鏈烷醛。
129.權(quán)利要求128的方法，其中該水解在含水溶劑中進(jìn)行。
130.權(quán)利要求126的方法，進(jìn)一步包括從反應(yīng)混合物中分離該鏈烷醛的步驟。
131.權(quán)利要求130的方法，其中分離包括將反應(yīng)混合物的pH升高至約6.0-7.5，將鏈烷醛萃取到有機(jī)溶劑中，和除去溶劑。
132.權(quán)利要求131的方法，其中分離的鏈烷醛不存在可檢測量的Z-(CH2CH2O)nNH和逆Michael型反應(yīng)產(chǎn)物。
133.權(quán)利要求132的方法，其中分離的鏈烷醛具有至少約95％的純度，以聚合物污染物為基礎(chǔ)計(jì)。
134.權(quán)利要求118的方法，其中POLY-Y包括該結(jié)構(gòu)HO-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和K選自 其中R1和R2各自獨(dú)立地是H或低級烷基，和Wa和Wb各自是O，形成具有以下結(jié)構(gòu)的處于被保護(hù)形式的鏈烷醛
135.權(quán)利要求118的方法，其中POLY-Y包括結(jié)構(gòu)Z-(CH2CH2O)nH，其中n是約10-約4000，和Z是保護(hù)的羥基，和K選自 其中R1和R2各自獨(dú)立地是H或低級烷基，和Wa和Wb各自是O。
136.權(quán)利要求135的方法，進(jìn)一步包括在反應(yīng)步驟后，將被保護(hù)的羥基進(jìn)行去保護(hù)而形成 和XI-E將在聚(乙二醇)上的末端-OH轉(zhuǎn)化成除羥基以外的官能團(tuán)。
137.權(quán)利要求136的方法，其中官能團(tuán)選自氨基，酯，碳酸酯，醛，鏈烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，異氰酸酯，酰肼，異硫氰酸酯，馬來酰亞胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，和硅烷。
138.權(quán)利要求137的方法，其中官能團(tuán)選自N-羥基琥珀酰亞胺基酯，苯并三唑基碳酸酯，胺，保護(hù)胺，乙烯基砜，和馬來酰亞胺。
139.權(quán)利要求136的方法，進(jìn)一步包括在酸性條件下水解處于被保護(hù)形式下的水溶性聚合物鏈烷醛，從而形成相應(yīng)的水溶性聚合物鏈烷醛的步驟。
140.權(quán)利要求118的方法，其中在POLY-Y中的Y是可電離的基團(tuán)或可電離的基團(tuán)的衍生物。
141.權(quán)利要求140的方法，其中Y選自羧酸，活性酯，和胺。
142.權(quán)利要求141的方法，其中POLY-Y在用于反應(yīng)步驟中之前已經(jīng)由色譜分離法提純。
143.權(quán)利要求142的方法，其中POLY-Y已經(jīng)由離子交換色譜法提純。
144.權(quán)利要求142的方法，其中用于反應(yīng)步驟中的POLY-Y基本上不存在可檢測量的聚合物雜質(zhì)。
145.權(quán)利要求142的方法，其中用于該反應(yīng)步驟中的POLY-Y是封端的，和基本上不存在可檢測量的PEG-二醇或雙官能的PEG雜質(zhì)。
146.權(quán)利要求142的方法，其中該聚(乙二醇)具有選自線形，支化和分叉類型中的結(jié)構(gòu)。
147.權(quán)利要求142的方法，其中鏈烷醛試劑包括以下結(jié)構(gòu) 或 其中g(shù)和b各自獨(dú)立地是約1-約20。
148.權(quán)利要求147的方法，其中R1和R2各自獨(dú)立地是H或低級烷基，以及Wa和Wb各自是O。
149.權(quán)利要求147的方法，其中K包括了選自羧酸，活性酯，胺，活性碳酸酯，和異氰酸酯中的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)部分。
150.權(quán)利要求148的方法，其中鏈烷醛試劑包括以下結(jié)構(gòu) 和該反應(yīng)步驟的產(chǎn)物包括以下結(jié)構(gòu)
151.權(quán)利要求147的方法，進(jìn)一步包括在酸性條件下水解處于被保護(hù)形式下的水溶性聚合物鏈烷醛，從而以大于50％產(chǎn)率形成相應(yīng)的水溶性聚合物鏈烷醛的步驟。
152.權(quán)利要求151的方法，其中水解步驟有效地以大于約90％產(chǎn)率形成水溶性聚合物鏈烷醛。
153.權(quán)利要求110的方法，進(jìn)一步包括將水溶性聚合物鏈烷醛與包含氨基的生物活性劑接合的步驟。
154.權(quán)利要求147的方法，其中該反應(yīng)步驟是在環(huán)境溫度下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及水溶性聚合物如聚(乙二醇)的鏈烷醛衍生物，它們的相應(yīng)水合物和縮醛，和涉及制備和使用此類聚合物鏈烷醛的方法。本發(fā)明的聚合物鏈烷醛是以高純度制備的和顯示出貯存穩(wěn)定性。
文檔編號C07CGK1688631SQ03824049
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
發(fā)明者A·柯澤羅斯克 申請人:尼克塔治療亞拉巴馬公司