專利名稱：抑制磷酸肌醇3－激酶β的制作方法
背景技術(shù)：
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明廣泛涉及一種新的抗血栓形成療法和用于新療法的化合物。更特別的是，本發(fā)明涉及磷酸肌醇(PI)3-激酶β的選擇性抑制劑，該選擇性抑制劑在抗血栓形成療法中的應(yīng)用，以及通過檢測(cè)化合物的PI 3-激酶β的選擇性抑制活性來篩選可用于該新的抗血栓形成療法的化合物的方法。
II.相關(guān)領(lǐng)域的描述血小板是特殊的粘著細(xì)胞，它們?cè)谥寡^程中起重要的作用。在正常情況下，血小板即不粘著，也不被血管內(nèi)皮激活。然而，內(nèi)皮的損傷或者斑塊的破裂，使流動(dòng)的血液暴露于各種血栓形成因素包括膠原、纖連蛋白和馮維勒布蘭德因子(vWF)中。循環(huán)的血小板承受這些血栓形成因素的受體。凝血酶，血清素，和血管收縮神經(jīng)血栓烷A2(TxA2).在血管損傷的情況下，經(jīng)由糖蛋白(GP)Ib受體，在破裂的扁平區(qū)部位，血小板粘著于特定的內(nèi)皮下粘著蛋白例如馮維勒布蘭德因子(vWF)(血小板粘著)，變?yōu)榧せ顮顟B(tài)(血小板激活)，產(chǎn)生若干物質(zhì)包括腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、血清素和血管收縮神經(jīng)血栓烷A2(TxA2)。被激活的ADP受體反過來將血小板表面上的GP IIb/IIIa受體激活。這些受體變成纖維蛋白橋的部位，將血小板連接在一起(血小板聚集)并隨后形成血栓。
因此，先期形成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的突然破裂或裂開，引起過度的血小板粘著反應(yīng)，導(dǎo)致血管閉塞的血小板血栓的形成。在冠狀或腦循環(huán)中這些血栓的形成分別導(dǎo)致心肌梗塞和中風(fēng)，它們合起來代表工業(yè)化社會(huì)中死亡的首要原因。血小板血栓形成也導(dǎo)致多種其它的臨床癥狀，包括不穩(wěn)定性心絞痛、猝死、暫時(shí)性局部缺血發(fā)作、暫時(shí)性黑內(nèi)障以及四肢和內(nèi)部器官的急性局部缺血。若干因素對(duì)破裂斑塊的血栓形成可能性的增加有影響，包括(1)斑塊中粘著性基底的高反應(yīng)性，(2)損傷中組織因子的存在，以及(3)由粥樣血栓形成過程造成血管內(nèi)腔變窄而引起的高剪切的直接的血小板激活效應(yīng)。
現(xiàn)有的抗血栓形成療法主要以血栓形成過程中的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵步驟為目標(biāo)。通過給予合適的抗凝血藥，包括一種或多種香豆素衍生物(例如華法林和雙香豆素)或帶電的聚集物(例如肝素、水蛭素或水蛭素類似物)，或通過使用抗血小板藥(例如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、雙嘧達(dá)莫或幾種GPIIb/IIIa受體拮抗劑中的一種)，在許多情況下能夠減少或消除血塊。然而，由于副作用例如出血、再閉塞、“白血塊”綜合征、刺激、生育缺陷、血小板減少和肝功能障礙的原因，抗凝血藥和血小板抑制劑受到很大的限制。此外，長(zhǎng)期給予抗凝血藥和血小板抑制劑能夠顯著增加威脅生命的疾病或出血的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，為了避免現(xiàn)有抗血栓形成的前述缺陷，需要開發(fā)一種選擇性地以對(duì)病理學(xué)血栓形成具有關(guān)鍵意義的過程為目標(biāo)而又不妨礙正常止血的新的抗血栓形成療法。
流變學(xué)紊亂(高剪切和湍流)在促進(jìn)病理學(xué)血栓中起著主要作用，因此這樣的一個(gè)策略應(yīng)該是，通過以血小板中的機(jī)械性感覺要素為目標(biāo)，削弱血小板高剪切應(yīng)力的激活效應(yīng)。然而，在本發(fā)明之前，對(duì)于切應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板活化而不是對(duì)止血具有重要意義的信號(hào)作用，還沒有被確認(rèn)。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供瓦解在高剪切狀態(tài)下發(fā)生的血小板聚集以及粘著的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI 3-激酶抑制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗血栓形成方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI 3-激酶β抑制劑。按照該方法，通過靶向作用于對(duì)由剪切誘導(dǎo)的血小板活化具有重要意義的PI 3-激酶β，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)血栓形成的特異性抑制而不影響正常止血。因此本發(fā)明不會(huì)牽涉由正常止血破壞而引起的副作用例如出血時(shí)間的延長(zhǎng)。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抑制由剪切誘導(dǎo)的血小板活化的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI 3-激酶β抑制劑。通過向有此需要的患者給藥有效量的PI 3-激酶β抑制劑，提供預(yù)防或治療心血管疾病例如冠狀動(dòng)脈阻塞、中風(fēng)、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、急性心肌梗塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和不穩(wěn)定型心絞痛的方法，也是本發(fā)明的一個(gè)目的。在此方法中，PI 3-激酶β抑制劑的使用能夠避免由破壞正常止血引起的副作用例如出血時(shí)間的延長(zhǎng)。
本發(fā)明優(yōu)選使用通過下述方法確定的選擇性PI 3-激酶β抑制劑，所述方法包括將候選化合物與分離的PI 3-激酶同種型接觸，檢測(cè)所述化合物對(duì)每一同種型的抑制效果，其中所述化合物對(duì)每一同種型的檢測(cè)效果的比較決定所述化合物作為選擇性PI 3-激酶β抑制劑。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供PI 3-激酶β的篩選方法，所述方法包括將候選化合物與分離的PI 3-激酶同種型接觸，檢測(cè)所述化合物對(duì)每一同種型的抑制效果，其中所述化合物對(duì)每一同種型的檢測(cè)效果的比較決定所述化合物作為選擇性PI 3-激酶β抑制劑。
在生化測(cè)定中，相對(duì)于其它類型的I PI 3-激酶同種型，選擇性PI 3-激酶β抑制劑對(duì)PI 3-激酶β抑制的選擇性優(yōu)選是至少約≥10倍，更優(yōu)選≥20倍，更優(yōu)選≥30倍。這樣的其它類型的選擇性I PI 3-激酶包括PI 3-激酶α、γ和δ。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及抗血栓形成的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI 3-激酶β抑制劑，條件是所述抑制劑不是式(II)化合物 其中，R是H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1是H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH- 芳基、C≡C-芳基、(CHR3)n-芳基、NR3-C1-C6烷基、NR3-環(huán)烷基、NR3-(CHR3)n-芳基、(CHR3)n-NR3-烷基、(CHR3)n-NR3-環(huán)烷基、(CHR3)n-O-芳基、(CHR3)n-O-烷基、(CHR3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR3)n-芳基、S-(CHR3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1、或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR3、OS3-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR3、NHSO2R3、CONHR3或SO2NHR3；并且R3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基但是選自下列的式(II)化合物除外9-(3-吡啶基甲基)氧基-2-嗎啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-140)；7-甲基-9-苯基氨基甲基-2-嗎啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-183)；8-(4-甲基苯基)2-)4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-113)；8-(4-氟苯氧基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-121)；2-嗎啉基-8-(苯基甲基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-90)；2-(4-嗎啉基)-8-(4-氟-2-甲基苯基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-184)；9-[[(2-氯苯基)-甲基]氨基-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-167)；9-[[(2-甲氧基苯基)-甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-137)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[(苯基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-126)；9-[[(4-氟-2-甲基苯基)氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-170)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[[(1R)-l-苯基乙基]氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-123)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[(2-吡啶基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-161)；9-[[(4-氯苯基)甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-108)；2-(4-嗎啉基)-9-(苯基甲基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-040)；
7-甲基-9-(N-甲基-N-苯基)氨基甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；2-(4-嗎啉基)-8-(苯基甲基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-102)；2-(4-嗎啉基)-8-(苯基甲基)氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-204)；2-(4-嗎啉基)-8-苯基氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-324)；8-(3-氯苯基)氧基-2-(4-嗎啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-259)；8-(3-甲基苯基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-127)；8-(2-氟苯基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-143)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(3-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-304)。
在本發(fā)明的另一個(gè)目的中，抗血栓形成的方法涉及施用式(I)的選擇性PI 3-激酶β抑制劑 其中R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR；X是C或N，且Y是N或O。
在本發(fā)明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及施用式(III)的選擇性PI 3-激酶β抑制劑 其中X和Y分別是C和O，或分別是C和NH，或都是N；R是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1、R2和R3獨(dú)立地為H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’3)n-芳基、NR’3-C1-C6烷基、NR’3-環(huán)烷基、NR’3-(CHR’3)n-芳基、(CHR’3)n-NR’3-芳基、(CHR’3)n-NR’3-烷基、(CHR’3)n-NR’3-環(huán)烷基、(CHR’3)n-O-芳基、(CHR’3)n-O-烷基、(CHR’3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR’3)n-芳基、S-(CHR’3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R’3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR’3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’3、NHSO2R’3、CONHR’3或SO2NHR’3；并且R’3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
本發(fā)明的一個(gè)目的涉及具有式(III)的新化合物
其中X和Y分別是C和O，或分別是C和NH，或都是N；R是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1、R2和R3獨(dú)立地為H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’3)n-芳基、NR’3-C1-C6烷基、NR’3-環(huán)烷基、NR’3-(CHR’3)n-芳基、(CHR’3)n-NR’3-芳基、(CHR’3)n-NR’3-烷基、(CHR’3)n-NR’3-環(huán)烷基、(CHR’3)n-O-芳基、(CHR’3)n-O-烷基、(CHR’3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR’3)n-芳基、S-(CHR’3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R’3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR’3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’3、NHSO2R’3、CONHR’3或SO2NHR’3；并且R’3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
在本發(fā)明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及給藥式(I)的2-嗎啉代取代的衍生物，其中R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基；R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、支鏈或直鏈C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR；X是C或N，并且Y是N或O。
在本發(fā)明的另一目的中，抗血栓形成的方法涉及給藥選自下列的PI 3-激酶抑制劑(±)-7-甲基-9-{[甲基(苯基)氨基]甲基}-2-嗎啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(4-氟苯基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-224)；(±)-9-[1-(3，4-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-237)；(±)-9-[1-(2，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-238)；(±)-9-[1-(3，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；(±)-9-[1-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-240)；(±)-9-[1-(4-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-243)；(±)-9-[1-(3，4-二氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-244)；(±)-9-[1-(3-氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-247)；(±)-9-[1-(3-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-248)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(2-噻唑基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-261)；(±)-7-甲基-9-[1-(3-甲基苯基氨基)乙基]-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-262)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基]-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-264)；和(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)；
(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸(KN-309)；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯(KN-321)；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)芐腈(KN-320)；(±)-7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-325)；(±)-2-(4-嗎啉基)-8[1-(苯基氨基)乙基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-280)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供式(III)化合物，其中R1選自CH3、C2H5、



還涉及一種具體的式(III)化合物，其中R是甲基，且R1是
還涉及一種具體的式(III)化合物，其中R是甲基，且R1是 還涉及一種具體的式(III)化合物，其中R是甲基，且R1是 還涉及一種具體的式(III)化合物，其中R是H，且R1是 還涉及一種具體的式(III)化合物，其中R是H，且R1是 本發(fā)明也涉及一種抑制患者中的磷酸肌醇3-激酶的方法，所述方法包括向患者給藥一定量的能有效抑制患者中磷酸肌醇3-激酶的式(III)化合物。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療心血管疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的式(III)化合物。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療呼吸疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的式(III)化合物。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的式(III)化合物。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與白細(xì)胞功能障礙有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的式(III)化合物。
本發(fā)明方法的一個(gè)目的涉及給藥下面的抑制劑 本發(fā)明方法的一個(gè)目的涉及給藥6-甲基-8-[1-(苯基氨基)乙基]-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
本發(fā)明的一個(gè)目的涉及給藥6-甲基-8-{1-[(2-氨基苯基)氨基]乙基}-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
本發(fā)明也涉及選自下列的新化合物(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)芐腈；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯和(±)-7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑--基)苯基]氨基}乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。
因此，提供抑制PI 3-激酶β的方法，包括向患者給藥一定量的一種具有式(I)的化合物，其中所述的量能夠有效抑制患者中的PI 3-激酶β，仍然是本發(fā)明另外一個(gè)目的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1E代表證實(shí)用LY294002或渥曼青霉素抑制PI 3-激酶消除血小板對(duì)加速剪切的反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用基于體外流動(dòng)的粘著測(cè)定能夠使我們同時(shí)分析血小板粘著動(dòng)力學(xué)和在固定的von Willebrand因子(vWf)上的活化(通過監(jiān)測(cè)胞質(zhì)鈣流量)。簡(jiǎn)單的說，將分離的血小板經(jīng)由vWf(100μg/ml)包被的微毛細(xì)管灌注，并用共焦顯微鏡實(shí)時(shí)分析胞質(zhì)鈣流量。
圖1A圖解顯示，在各種血流狀態(tài)下與vWf相互作用的形成不可逆粘著的血小板的比例。在圖(i)中，將分離的血小板以恒定的剪切速率(600、1800或10,000 s-1)灌注到vWf基質(zhì)上，在圖(ii)中，讓分離的血小板在vWf基質(zhì)上沉積，并隨后使之以10,000.s-2的剪切速率梯度(↑Δγ)加速。
圖1B顯示單個(gè)血小板在固定的vWf表面上的狀況；該圖表示胞質(zhì)鈣流量(Δ[Ca2+]c)曲線和單個(gè)血小板隨時(shí)間(秒)的伴隨置換(μm)關(guān)系曲線。在施加加速剪切速率(↑Δγ)之前，以1秒的間隔讓分離的血小板在vWf表面上沉積。箭頭(↓)表示剪切施加點(diǎn)持續(xù)的，表示血小板經(jīng)歷與固定粘著相聯(lián)系的擺動(dòng)的Δ[Ca2+]c；短暫的，表示血小板經(jīng)歷伴隨短暫固定粘著的Δ[Ca2+]c峰值；波動(dòng)的，表示血小板顯示最小的Δ[Ca2+]c和在vWf表面上的快速移位。
圖1C圖解顯示，在用載體(DMSO＜0.25％v/v)、0.5U/ml腺苷三磷酸雙磷酸酶、1mM阿司匹林或25μM LY294002預(yù)處理后，表現(xiàn)持續(xù)、短暫或波動(dòng)狀態(tài)的vWf粘著的血小板的比例。
圖1D顯示代表性單個(gè)血小板記錄，說明用GPIb/V/IX結(jié)合調(diào)節(jié)體、利托菌素(1mg/ml)處理后在固定的vWf表面上的GPIb/V/IX依賴性Δ[Ca2+]c。在分析之前，將血小板用整合素αIIbβ3拮抗劑、Aggrastat(200nM)處理10分鐘固定的，表示在37℃沒有剪切的情況下將血小板在vWf包被的板條表面上放置10分鐘。在10分鐘時(shí)將Δ[Ca2+]c監(jiān)測(cè)1.5分鐘；恒定γ，表示以1800.s-1的恒定剪切速率下將血小板灌注到vWf基質(zhì)上；↑Δγ(0-10,000.s-1)，表示讓血小板在固定vWf表面上沉積，隨后以1秒的間隔使γ逐漸增加至10,000.s-1。箭頭(↓)表示剪切施加點(diǎn)；+LY294002，表示用20μM PI 3-激酶抑制劑LY294002預(yù)處理10分鐘后，將↑Δγ施加于血小板上。
圖1E顯示GPIb/V/IX粘著血小板的比例，表現(xiàn)以1秒或60秒間隔高頻率Δ[Ca2+]c對(duì)↑Δγ的反應(yīng)。
新PI 3-激酶β同種型選擇性抑制劑的特性圖2A顯示TGX 221的選擇性，使用分離的PI 3-激酶同種型進(jìn)行，其中通過產(chǎn)生PI 3-激酶產(chǎn)物磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns(3)P)測(cè)定活性。上部條形圖說明用薄層色譜法檢測(cè)PtdIns(3)P的生成以及由p110α和p110β同種型中的TGX-221產(chǎn)生的劑量反應(yīng)抑制。曲線圖表示三個(gè)主要血小板PI 3-激酶同種型p110α、p110β和p110γ的TGX-221抑制劑量反應(yīng)曲線。
TGX-221的功能分析圖3A說明表示在錐-板粘度計(jì)中由剪切(5000sec-1，2分鐘)激活后，TGX-221對(duì)血小板中脂質(zhì)產(chǎn)生的劑量反應(yīng)抑制的條形圖。施加于錐板裝置后，隨之吸取血小板樣本并用Sysmex KN-21N血液學(xué)分析儀分析單個(gè)血小板計(jì)數(shù)。
圖3B表示說明在各種TGX-221濃度中，相對(duì)于未處理(對(duì)照)的樣本，單個(gè)血小板計(jì)數(shù)的成比例增加。
通過用HPLC初始分離脂質(zhì)以及用明確的PtdIns(4，5)P2和PtdIns(3，4)P2標(biāo)準(zhǔn)物鑒定脂質(zhì)峰值，來測(cè)定在完整血小板中的脂質(zhì)產(chǎn)物PtdIns(4，5)P2和PtdIns(3，4)P2。脂質(zhì)被積分和標(biāo)準(zhǔn)化成施加的總脂質(zhì)，并作為未處理(對(duì)照)樣本的分?jǐn)?shù)表示。
證明由TGX-221抑制PI 3-激酶消除血小板對(duì)加速剪切的反應(yīng)圖4A顯示群體分析的條形圖，說明用0.5μM TGX-221處理對(duì)vWf粘著血小板的比例的影響，表示以1秒的間隔暴露于最高達(dá)10,000.s-1的剪切速率梯度(↑Δγ)后的持續(xù)、短暫或波動(dòng)狀態(tài)(上面所述)。
圖4B顯示代表性信號(hào)血小板記錄，說明在vWf表面上的GPIb/V/IX依賴性Δ[Ca2+]c。如上所述，恒定γ；血小板暴露于1800s-1的剪切速率，↑Δγ(10,000.s-2)；血小板暴露于剪切加速，↑Δγ(10,000.s-2)+TGX-221(0.5μM)；將↑Δγ施加于用0.5μm TXG-221預(yù)處理10分鐘的血小板。
圖4C顯示FACS分析，說明生理學(xué)激動(dòng)劑刺激后整合素αIIbβ3的活化水平(通過PAC-1結(jié)合確定)以及P-選擇蛋白的表面表達(dá)對(duì)照，血小板被再懸浮于Tyrodes緩沖液+1mM CaCl2/MgCl2中(無激動(dòng)劑處理)；DMSO，激動(dòng)劑刺激之前將血小板用0.25％DMSO(載體)預(yù)處理；TGX-221，激動(dòng)劑刺激之前將血小板用0.5mM TGX-221預(yù)處理10分鐘。激動(dòng)劑凝血酶，lU/ml；ADP，12.5mM；U46619，1μM；可溶性膠原10μg/ml。
TGX-221的體內(nèi)抗血栓形成活性圖5A顯示，在Folts模型中，每30分鐘期間，給藥前(a；-30-0分鐘)和給藥后(b-d；分別1-30、31-60&61-90分鐘)，在戊巴比妥麻醉的大鼠(A)和兔(B)中，載體(丙二醇)或TGX-221對(duì)循環(huán)的腦動(dòng)脈血流減低(CFR)的平均數(shù)量的影響。在給藥和給藥后90分鐘，對(duì)CFR監(jiān)測(cè)30分鐘。n動(dòng)物數(shù)量。誤差范圍是±1SEM。
圖5B顯示，在電解模型中，在戊巴比妥麻醉的大鼠中，在電解損傷后(7mA電流4分鐘(時(shí)間-4-0分鐘)零血流；在0分鐘放開動(dòng)脈夾具)載體(丙二醇)或TGX-221對(duì)頸動(dòng)脈血流(ml/分鐘每100g體重)的影響。在時(shí)間9分鐘(即施加電流5分鐘以前)以靜脈內(nèi)快速濃注方式給予治療。誤差范圍是來自重復(fù)測(cè)定ANOVA的平均SEM。圖5B插入圖說明，在戊巴比妥麻醉的大鼠中，電解損傷后治療對(duì)頸動(dòng)脈血流體積(刺激后60分鐘期間內(nèi)血流曲線下面積)的影響。誤差范圍是±1SEM。
圖5C顯示，在分別用TGX-221、TGX-221+肝素、阿司匹林、氯吡格雷、氯吡格雷+肝素、氯吡格雷+肝素+TGX-221、阿司匹林+肝素、和阿司匹林+肝素+TGX-221治療的氟烷麻醉的大鼠中，大鼠尾巴出血時(shí)間的比較。
圖6A和6B顯示各種濃度的TGX-286對(duì)ROS反應(yīng)的作用。
圖7顯示各種濃度的TGX-286對(duì)彈性蛋白酶釋放的作用。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述兩個(gè)主要的血小板粘著受體GPIb/V/IX(“GPIb”)和整合素αIIbβ3在流體學(xué)擾動(dòng)狀態(tài)下(高剪切和剪切快速加速)相對(duì)于血小板活化具有獨(dú)特的機(jī)械性感覺功能。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過兩個(gè)受體的信號(hào)傳輸受到剪切速率快速加速(↑Δγ)的調(diào)節(jié)，包括通過PI 3-激酶依賴性信號(hào)傳輸過程的血小板激活。
因此，本發(fā)明者闡明了在高剪切狀態(tài)下的決定性信號(hào)傳輸機(jī)制，從而確認(rèn)在病理學(xué)血流狀態(tài)下PI 3-激酶β作為引起血小板活化的因素。阻斷特定血小板粘著受體的現(xiàn)有抗血小板治療法不能在病理學(xué)和正常的止血血小板活化之間進(jìn)行識(shí)別。因此，本發(fā)明者的這一發(fā)現(xiàn)，即PI 3-激酶β的選自性抑制能夠避免由剪切速率的病理學(xué)增加引起的血小板活化而又不影響由生理學(xué)激動(dòng)劑引起的血小板活化，為抗血栓形成治療法提供了一種新的獨(dú)特的方法，包括用于這種療法的新的化合物。
如圖1A所說明，剪切環(huán)境調(diào)節(jié)血小板的活化和血小板對(duì)vWf的粘著。與暴露于穩(wěn)定狀態(tài)剪切的血小板比較，暴露于剪切速率加速(↑Δγ)導(dǎo)致更多的血小板活化和穩(wěn)定的粘著接觸。通過監(jiān)測(cè)胞質(zhì)鈣流量而對(duì)血小板活化進(jìn)行的更為周密的檢查，揭示↑Δγ對(duì)GPIb和整合素αIIbβ3鈣信號(hào)傳輸具有特殊而令人稱道的影響。在整合素鈣信號(hào)傳輸?shù)那闆r下，↑Δγ引起特定在血小板中保持的能夠繼續(xù)穩(wěn)固地粘著于vWf的快速啟動(dòng)鈣信號(hào)傳輸。這種由剪切調(diào)節(jié)的整合素αIIbβ3鈣信號(hào)的發(fā)生與血小板激動(dòng)劑(ADP和TXA2)無關(guān)，但完全取決于PI 3-激酶(圖1B和1C)?！う靡鹦碌腉PIb鈣信號(hào)，其與先前在Nesbit等人，2002，J.Biol.Chen.，2772965.中所辨別的GPIb鈣瞬態(tài)截然不同(圖1D)?！う肎PIb鈣信號(hào)的三個(gè)定義特征包括(1)它對(duì)于γ的加速速率的嚴(yán)格依賴(圖1E)，(2)鈣響應(yīng)的增加的頻率(圖1D)，和(3)它對(duì)PI 3-激酶抑制劑的敏感性(1D)。
因?yàn)镚PIb和整合素αIIbβ3鈣信號(hào)傳輸取決于PI 3-激酶，所以PI 3-激酶導(dǎo)致由剪切速率(↑Δγ)觸發(fā)的GPIb和整合素αIIbβ3鈣信號(hào)的消除。
結(jié)構(gòu)非相關(guān)的PI 3-激酶抑制劑例如LY294002或渥曼青霉素(見下文)阻止剪切引起的血小板聚集的能力的初始研究，對(duì)于剪切引起的血小板活化，提出PI 3-激酶的一個(gè)重要的機(jī)械性感覺信號(hào)傳輸功能的設(shè)想。由于這些化合物在各種PI 3-激酶同種型中沒有顯示，所以，仍然不清楚哪一個(gè)特別的PI 3-激酶同種型或同種型涉及與剪切有關(guān)的血小板活化。

本發(fā)明選擇性抑制PI 3激酶β的例證性化合物顯示于下 或 式(I)的2-嗎啉代取代的衍生物定義于下 其中X是C或N，Y是N或O；R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR。
除了作為PI 3-激酶β活性抑制劑的式(I)化合物以外，新的選擇性抑制PI 3-激酶β的式(III)化合物定義如下 其中X和Y分別是C和O，或分別是C和NH，或都是N；R是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1、R2和R3獨(dú)立地為H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’3)n-芳基、NR’3-C1-C6烷基、NR’3-環(huán)烷基、NR’3-(CHR’3)n-芳基、(CHR’3)n-NR’3-芳基、(CHR’3)n-NR’3-烷基、(CHR’3)n-NR’3-環(huán)烷基、(CHR’3)n-O-芳基、(CHR’3)n-O-烷基、(CHR’3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR’3)n-芳基、S-(CHR’3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R’3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR’3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’3、NHSO2R’3、CONHR’3或SO2NHR’3；并且R’3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的化合物包括式(I)的2-嗎啉代取代的吡啶并嘧啶衍生物，其中R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基；
R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、支鏈或直鏈C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR；X是C或N，并且Y是N或O。
某些具體式(I)抑制劑的實(shí)例包括(±)-7-甲基-9-{[甲基(苯基)氨基]甲基}-2-嗎啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221)；(±)-9-[1-(3，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；(±)-9-[1-(4-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-243)；(±)-9-[1-(3，4-二氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-244)；(±)-9-[1-(3-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-248)；(±)-7-甲基-9-[1-(3-甲基苯基氨基)乙基]-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-262)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基]-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-264)；和(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)。
在本描述的上下文中，術(shù)語“烷基”指直鏈或支鏈的飽和脂族烴基。優(yōu)選地，烷基具有1-6個(gè)碳原子，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。烷基任選被一個(gè)或多個(gè)選自下列的基團(tuán)取代F、Cl、Br或I；CN；CO2R3；NO2；CF3；取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C3-C6環(huán)烷基；取代或未取代的芳基；OCF3、OR3、取代或未取代的胺；NHCOR3；NHSO2R3；CONHR3；或SO2NHR3，其中R3是H、取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
術(shù)語“環(huán)烷基”指非雜環(huán)(例如碳環(huán))或雜環(huán)。在這方面，非雜環(huán)的實(shí)例是取代或未取代的環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)己烷二酮、環(huán)戊烷二酮、醌等。適宜的雜環(huán)烷基基團(tuán)包括取代或未取代的吡咯烷、哌啶、哌嗪、2-哌啶酮、氮雜環(huán)己-2-酮和嗎啉基團(tuán)。環(huán)烷基任選在一個(gè)或多個(gè)位置上被下列基團(tuán)取代鹵素例如F、Cl、Br或I；CN；CO2R3；NO2；CF3、取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C3-C6環(huán)烷基；取代或未取代的芳基；OCF3、OR3、取代或未取代的胺；NHCOR3；NHSO2R3；CONHR3；或SO2NHR3，其中R3是H、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
術(shù)語“芳基”指芳族或芳族雜環(huán)。芳基的實(shí)例是吡咯烷、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-惡三唑、1，2，3，5-惡三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑、四唑、苯、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、茚、萘、吲哚、異吲哚、中氮茚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、異喹啉、噌啉、2，3-二氮雜萘、喹唑啉、喹喔啉、1，5-二氮雜萘、蝶啶、芴、咔啉、吖啶、吩嗪、和蒽。芳基基團(tuán)任選在一個(gè)或多個(gè)位置上被下列基團(tuán)取代鹵素例如F、Cl、Br或I；CN；CO2R3；NO2；CF3；取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C3-C6環(huán)烷基；取代或未取代的芳基；OCF3、OR3、取代或未取代的胺；NHCOR3；NHSO2R3；CONHR3；或SO2NHR3，其中R3是H、取代或未取代C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
此中所用的術(shù)語“選擇性PI 3-激酶β抑制劑”指一種化合物，其對(duì)PI 3-激酶β的抑制效果至少比PI 3-激酶家族的其它同種型≥10倍，優(yōu)選≥20倍，更優(yōu)選≥30倍。與傳統(tǒng)上和通常稱為PI 3-激酶抑制劑例如LY294002或渥曼青霉素的化合物相比，“選擇性PI 3-激酶β抑制劑”化合物被認(rèn)為對(duì)PI 3-激酶β更具選擇性。選擇地抑制PI 3-激酶β表現(xiàn)或活性的任何類型的化合物都能夠被用作本發(fā)明方法的選擇性PI 3-激酶β抑制劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明吡啶取代的化合物能夠抑制脂質(zhì)信號(hào)傳輸酶PI 3-激酶，其在高剪切血流狀態(tài)下調(diào)節(jié)血小板粘著過程，并因而表現(xiàn)出抗血栓形成活性以及下面相信描述的其它藥理學(xué)特性。PI 3-激酶產(chǎn)生3-磷酸化PI第二信息，包括磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI(3)P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PI(3，4)P2)、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI(3，4，5)P3)。這些第二信息被認(rèn)為調(diào)節(jié)不同范圍的細(xì)胞現(xiàn)象，包括葡萄糖輸送、脫噬作用阻止、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞支架重組。
關(guān)于在病理生理學(xué)相關(guān)流動(dòng)狀態(tài)下PI 3-激酶β抑制劑對(duì)血小板粘著的影響，沒有發(fā)表的報(bào)告。盡管如此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PI 3-激酶，特別是在生理學(xué)流動(dòng)狀態(tài)下，在調(diào)節(jié)血小板粘著方面起關(guān)鍵作用。因此，用本發(fā)明化合物的血小板治療來抑制PI 3-激酶、(PI(3)P)、(PI(3，4)P2)和(PI(3，4，5)P3)的磷酸化脂質(zhì)的形成，在降低流動(dòng)狀態(tài)下血小板粘著到vWf模型方面產(chǎn)生顯著的效果。這種血小板粘著的降低與異常的血小板擴(kuò)展和血栓形成相聯(lián)系。因?yàn)榕c剪切有關(guān)的血小板粘著和活化在動(dòng)脈血栓形成中具有重要意義，所以PI 3-激酶對(duì)于心血管疾病的治療介入是一個(gè)重要的靶目標(biāo)。
這些PI 3-激酶抑制劑在其它各種疾病中也具有潛在治療應(yīng)用意義。例如，在血管分支即血管平滑肌細(xì)胞中，Thyberg，1998，EuropeanJournal of Cell Biology 76(1)33-42，和在肺(氣管平滑肌細(xì)胞)中，Krymskaya等人，1999，American Journal of Physiology 27765-78，PI 3-激酶在促進(jìn)平滑肌的增生中起重要作用。血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖在動(dòng)脈粥樣硬化血小板的形成和在侵襲性血管處置后新血管內(nèi)膜增生的發(fā)展中起重要作用。Scwartz等人，1984，Progress inCardiovascular Disease 26355-372；Colwes等人，1978，LaboratoryInvestigations 39141-150。而且，在氣喘和慢性氣管炎中，氣管平滑肌細(xì)胞的過度增生導(dǎo)致COPD的發(fā)展。因此PI 3-激酶抑制劑可以被用來預(yù)防血管再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和COPD。
PI 3-激酶也在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和在這些細(xì)胞經(jīng)歷脫噬作用生長(zhǎng)中起重要作用。Sellers等人，1999，The Journal of Clinical Investigation1041655-1661。另外，由脂質(zhì)磷酸酶PTEN造成的PI 3-激酶脂質(zhì)產(chǎn)物PI(3，4，5)P3和PI(3，4)P2的調(diào)節(jié)失控，在許多人惡性腫瘤的發(fā)展中起重要作用。Leevers等人，1999，Current Opinion in Cell Biology11219-225。因此，PI 3-激酶抑制劑可以被用于人腫瘤的治療。
PI 3-激酶在白細(xì)胞功能(Fuller等，1999，The Journal ofImmunology 162(11)6337-6340；Eder等，1998，The Journal ofBiological Chemistry 273(43)28025-31)和淋巴細(xì)胞功能(Vicente-Manzanares等，1999，The Journal of Immunology 163(7)4001-4012)中也起重要作用。例如，粘著于發(fā)炎的內(nèi)皮的白細(xì)胞涉及通過與PI 3-激酶有關(guān)的信號(hào)傳輸過程激活內(nèi)源性白細(xì)胞整聯(lián)蛋白。另外，嗜中性白細(xì)胞中的氧化爆發(fā)(Nishioka等，1998，F(xiàn)EBS Letters 441(1)63-66)和細(xì)胞骨架再組織(Kirsch等，1999，Proceedings National Academy ofSciences 96(11)6211-6216)似乎涉及PI 3-激酶的信號(hào)傳輸。因此，PI 3-激酶抑制劑可用于減少白細(xì)胞粘著和炎癥部位的激活，因此可用于治療急性和/或慢性炎性疾病。PI 3-激酶也在淋巴細(xì)胞增殖和激活中起重要作用。Fruman等，1999，Science 283(5400)393-397。已知淋巴細(xì)胞在自身免疫疾病中的重要作用，PI 3-激酶抑制劑可用于治療這類疾病。
通過例如根據(jù)預(yù)先確定的程度測(cè)定每一化合物抑制活性的濃度然后將結(jié)果加以比較，可以確定作為酶活性的抑制劑的化合物的相對(duì)效能。通常，優(yōu)選的測(cè)定是在生化分析中抑制50％活性的濃度，即50％抑制濃度或“IC50”。IC50可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。
按照本發(fā)明，已經(jīng)確認(rèn)血小板中的PI 3-激酶β具有關(guān)鍵的和剪切引起的血小板激活和閉塞性血栓形成有關(guān)的機(jī)械性感覺功能。PI 3-激酶β抑制劑TGX-221通過GPIb和整合素αIIbβ3對(duì)機(jī)械性傳導(dǎo)作用的分析，證明對(duì)于通過兩個(gè)受體的↑Δγ引起的鈣流出，PI 3-激酶β是絕對(duì)的必要條件(圖4A和圖4B)。TGX-221對(duì)鈣流出的作用是剪切選擇性的，因?yàn)樗灰种痞靡蕾嚨腉PIb鈣信號(hào)傳輸(圖4B)。二氫，其它由凝血酶、膠原和ADP引起的血小板的活化反應(yīng)，例如整合素αIIbβ3活化(PAC-1結(jié)合)和α顆粒分泌(P-選擇蛋白表達(dá))，不受TGX-221影響(圖4C)。
PI 3-激酶β的信號(hào)傳輸控制兩個(gè)主要血小板粘著受體GPIb和整合素αIIbβ3的下流，在流變學(xué)擾動(dòng)條件下促進(jìn)胞質(zhì)液的鈣流出和血小板活化。由于這些受體的機(jī)械性感覺功能，PI 3-激酶β的抑制能夠消除閉塞性血栓形成而不妨礙止血所要求的的正常血小板功能反應(yīng)。
為了研究本化合物的抗血栓形成潛能，使用兩個(gè)截然不同的血栓形成模型；修改的Folts鼠和兔模型(Folts等人，1991，Circulation，IV-3-IV-14)和鼠電解損傷頸動(dòng)脈模型(Bush等人，1991，F(xiàn)aseb J.，43087)。用2mg/kg發(fā)明化合物例如TGX-221注射試驗(yàn)動(dòng)物，在兩個(gè)模型中(圖5A和圖5B)完全阻止閉塞性血栓的形成而同時(shí)在損傷后60分鐘期間維持腸頸動(dòng)脈血流體積(圖5B插入圖)。而且，在Folts和電解研究的損傷的頸動(dòng)脈中，TGX-221對(duì)基線動(dòng)脈血壓、心律或血流都沒有影響(沒有顯示數(shù)據(jù))。意義重要的是，如對(duì)由尾巴或耳朵出血時(shí)間或者當(dāng)聯(lián)合給藥時(shí)由其它抗凝血?jiǎng)├绺瘟字?、阿司匹林或氯吡格雷引起的延長(zhǎng)出血進(jìn)行的分析，TGX-221對(duì)這些動(dòng)物中的正常止血沒有不利影響。
于此概述的本發(fā)明解釋了與剪切引起的血小板活化和閉塞性血栓形成有關(guān)的血小板中的PI 3-激酶β的關(guān)鍵機(jī)械性感覺功能。在不干涉與止血有關(guān)的正常血小板的功能性反應(yīng)的情況下，PI 3-激酶β抑制劑TGX-221消除閉塞性血栓形成的證明，解釋這種新穎的脂質(zhì)激酶抑制劑作為用于抗血栓形成療法的一種重要的新藥劑。
有利的是，在預(yù)防或治療疾病的本發(fā)明方法中，可以將一種本化合物的有效量以劑量的形式給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，劑量?jī)?yōu)選以片劑(例如用于口服、舌下和口腔給藥而制成的片劑)、膠囊(例如含有粉末、液體或控制釋放劑型的膠囊)、靜脈內(nèi)制劑、鼻內(nèi)制劑、肌肉注射制劑、糖漿、栓劑、氣霧劑、舌下制劑、經(jīng)皮制劑、或陰道栓劑。優(yōu)選地，劑量含有約5-50mg化合物，更優(yōu)選含有約25-300mg化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有吡啶取代的本發(fā)明化合物以及一種或多種可藥用載體和/或溶劑的藥物組合物。下文，術(shù)語“活性成分”可以是任何吡啶取代的本發(fā)明化合物，或者它們的可藥用鹽、溶劑化物、或功能性衍生物。
這種藥物組合物的給藥優(yōu)選用任何方便的方法進(jìn)行。劑量的給藥可以每天、周、月或在其它適宜的時(shí)間間隔，經(jīng)由例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或栓劑或通過植入途徑(例如用緩慢釋放分子)進(jìn)行。如果活性化合物以片劑形式給藥，該片劑含有粘合劑例如西黃蓍膠、玉米淀粉、或明膠；崩解劑，例如藻酸；和滑潤(rùn)劑例如硬脂酸鎂。
適宜注射用的藥物組合物包括無菌水溶液或分散液，和用于無菌注射溶液或分散液的臨時(shí)制劑的無菌粉末，或者以乳劑或其它適宜于局部施用的形式。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)、它們的適宜的混合物、和菜籽油。例如，通過使用包衣例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所要求的顆粒尺寸，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。使用各種抗菌和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以避免由微生物造成的污染。優(yōu)選可以包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸附劑例如一硬脂酸鋁和明膠，可以延長(zhǎng)注射組合物的吸附。
通過以要求的量將活性化合物與上面列舉的各種其它成分在適宜的容積中混合，制備無菌注射溶液。一般地，通過將各種滅菌的活性化合物混合到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)的無菌載體和一種或多種上述的成分中，制備分散液。在無菌粉末的情況下制備無菌注射溶液，優(yōu)選的制備方法是，將真空干燥和凍干產(chǎn)生的活性化合物粉末加上從先前無菌過濾溶液得到的所要求的任何輔助成分。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可以含有結(jié)合劑例如樹脂、阿拉伯膠、玉米淀粉或凝膠；賦形劑例如磷酸二鈣、崩解劑例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；滑潤(rùn)劑例如硬脂酸鎂；和甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；或者調(diào)味劑例如薄荷油、冬青油或櫻桃香料。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除了上述類型的材料外，其可以含有液體載體。各種各樣的其它材料可以作為包衣以改善劑型單位的物理外形。例如可以將片劑、丸劑或膠囊用蟲膠、糖或兩者包衣。糖漿劑或酏劑也含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和調(diào)味劑例如櫻桃或桔子香料。當(dāng)然，用于制備任何劑量單位形式的任何材料應(yīng)當(dāng)是藥物學(xué)純凈的并且在使用量上基本無毒性。另外，可以將活性化合物混合到延遲釋放制劑和劑型中。
通過參考下面僅作為例證說明而陳述的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例中的任何東西都不應(yīng)當(dāng)被作為本發(fā)明全體范圍的限制。
合成實(shí)施例實(shí)施例1.合成(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221R1＝CH3，R2＝CH3，R3＝H) 化合物2在冰冷的溫度下向2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(1)(45g，0.45mol)在二氯甲烷(500mL)內(nèi)的溶液中加入丙二酰二氯(25mL，0.25mol)。在室溫將混合物攪拌48小時(shí)。通過過濾收集沉淀的淡黃色固體，用二氯甲烷(3×100mL)洗滌，然后在真空下干燥，得到產(chǎn)物2(52.5g)。將濾液減壓濃縮。將所得殘余物懸浮于水中并攪拌1小時(shí)。把溶液過濾，然后將濾液用固體NaNCO3中和，得到未反應(yīng)的2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(6g)。無需進(jìn)一步純化將粗制化合物用于下一合成步驟。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 8.72(s，1H)，8.28(s，1H)，5.50(s，1H)，2.33(s，3H).
化合物3在冰冷溫度下，向化合物2(12.75g，0.05mol)在二氯甲烷(300mL)內(nèi)的懸浮液中加入三乙胺(14mL，0.1mol)，然后加入甲磺酰氯(5.42mL，0.07mol)。然后在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌0.5小時(shí)。加入嗎啉(13mL，0.15mol)后，將反應(yīng)混合物在回流溫度下攪拌24小時(shí)。將混合物減壓濃縮，然后用H2O(300mL)稀釋，得到淡黃色沉淀物。把固體過濾，在減壓干燥，鑒定為酮3(6.8g，通過HPLC分析純度＞80％)。無需進(jìn)一步純化將產(chǎn)物3用于下一反應(yīng)步驟。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 8.69(s，1H)，7.84(s，1H)，5.58(s，1H)，3.80(m，4H)，3.70(m，4H)，2.32(s，3H).
化合物4向溴化物3(35mol)在DMF(70mL)內(nèi)的溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(18mL)、丁基乙烯基醚(13mL)和二氯化1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵鈀(II)(1.09g，1.5mol)。在120℃下把懸浮液(20分鐘后變?yōu)榫?攪拌16小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻并倒入1M HCl(200mL)的冰冷溶液中，然后攪拌1小時(shí)。用二氯甲烷萃取該溶液，然后將有機(jī)層用水洗滌，在Na2SO4上干燥(*避免用NaCl水溶液洗滌，因?yàn)槿芤簳?huì)變成乳液)。在真空中濃縮后，將黑色殘余物用柱色譜法純化(硅膠、3∶1乙酸乙酯/石油醚)，得到淡黃色固體。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ 8.86(s，1H)，7.84(s，1H)，5.63(s，1H)，3.79(m，4H)，3.62(m，4H)，2.77(s，3H)，2.36(s，3H).
TGX 221向酮4(1mmol)在甲苯(10mL)內(nèi)的的溶液加入苯胺(3mmol)并回流4小時(shí)。將反應(yīng)混合物逐漸冷卻，然后在冰冷溫度下加入硼氫化鈉(1mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物進(jìn)一步攪拌1小時(shí)。用二氯甲烷(30mL)稀釋該溶液，將有機(jī)層用水、鹽水洗滌，然后在Na2SO4上干燥。真空干燥后，將殘余物用柱色譜法(硅膠、3∶1乙酸乙酯/石油醚)純化，得到淡黃色固體(產(chǎn)率＞60％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ 8.65(s，1H)，7.58(s，1H)，(7.11br t，2H)，6.68(t，J＝7.5Hz，1H)，6.46(br t，2H)，5.66(s，1H)，5.12(m，1H)，4.24(br s，-NH，1H)，3.80(m，4H)，3.68(m，4H)，2.26(s，3H)，1.57(d，J＝6.7Hz，3H).
實(shí)施例2.制備吡啶取代的苯并吡喃酮衍生物按照下面由Cushman和Nagarathnam，1990，Tetrahedron Letters316497改進(jìn)的一般方法制備8-(取代的)-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮。簡(jiǎn)單地說，將各種前體2-羥基苯乙酮(1)用異煙酸甲酯和衍生物處理，然后通過環(huán)合脫水處理作用，制得吡啶取代的產(chǎn)物(3)。然后通過各種偶聯(lián)反應(yīng)在R1上導(dǎo)入特定取代基。
在苯乙酮(R)上的取代基可以包括但不限于溴、羥基、乙酰氨基、甲氧基甲基、甲基、乙基、甲氧基、三氟甲磺酰氧基和乙酰基取代基。在異煙酸酯(R’)上的取代基包括但不限于氯、甲基和氨基取代基。用于縮合反應(yīng)的試劑包括使用在溶劑例如四氫呋喃或N，N-二甲基甲酰胺中的二(三甲基甲硅烷基)氨基鋰、氫化鈉、1，8-二氮雜二環(huán)[2.2.2]十一烷、丁醇鈉或甲醇鈉?？梢允褂迷噭┗旌衔锢缫掖贾械牧蛩?、甲醇中的鹽酸、DMF中的1，8-二氮雜二環(huán)[2.2.2]十一烷、二氯甲烷中的三氟甲磺酸酐進(jìn)行環(huán)合脫水作用。
產(chǎn)物(3)的進(jìn)一步反應(yīng)可以包括在R上的鈀催化的交聯(lián)反應(yīng)，其中R是鹵化物或三氟甲磺酰氧基以獲得其中R是芳基、芳基氨基、烷基氨基或乙?；漠a(chǎn)物。在R是乙酰基官能團(tuán)的情況下，進(jìn)一步的反應(yīng)可以包括還原或還原胺化以得到其中R是羥基乙基或氨基乙基的產(chǎn)物。在R是甲氧基烷基或羥基烷基官能團(tuán)的情況下，進(jìn)一步的反應(yīng)可以得到其中R是溴烷基的產(chǎn)物。在R是溴烷基的情況下，進(jìn)一步的反應(yīng)可以得到其中R是芳基氨基烷基或芳氧基烷基的產(chǎn)物。在R是羥基的情況下，進(jìn)一步的反應(yīng)可以得到其中R＝芳氧基或烷氧基的產(chǎn)物。在R是氨基的情況下，進(jìn)一步的反應(yīng)可以得到其中R是芳基氨基或烷基氨基的產(chǎn)物。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步用來說明本發(fā)明。
中間體的制備實(shí)施例2a6-甲基-8-乙酰基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮
3′-乙?；?2′-羥基-5′-甲基苯乙酮將2-羥基-5-甲基苯乙酮(15g，0.1mol)在二氯甲烷(100ml)中的混合物用三乙胺(13.9ml)、二甲基氨基吡啶(1.22g)和乙酸酐(9.5ml)處理，然后在室溫下攪拌過夜。然后把混合物倒入水(300ml)中并用二氯甲烷(3×60ml)萃取。將合并的混合物用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(Na2SO4)并除去溶劑，得到無色油狀物(19.5g)。
在0℃下把該產(chǎn)物溶解入二氯甲烷(200ml)中，并用氯化鋁(19.5g)處理，然后在室溫下攪拌5天。將溶液用冰(50g)和2N鹽酸(50ml)處理，然后在室溫下攪拌1小時(shí)。把二氯甲烷層分離，將水層用二氯甲烷(2×60ml)萃取。將合并的萃取物用飽和NaCl水溶液洗滌，干燥(Na2SO4)，并把溶劑除去，得到粗產(chǎn)物。將產(chǎn)物用柱色譜法純化(0-25％乙酸乙酯在汽油中混合物)，得到黃/綠色固體(11.4g)。
8-乙?；?6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮在-78℃于氮?dú)夥障?，?′-乙酰基-2′-羥基-5′-甲基苯乙酮(3.0g，15.6mmol)在無水THF(100ml)內(nèi)的溶液中加入二(二甲基甲硅烷基)氨基鋰(1.0M在THF中的溶液，50ml，50mmol)，然后在0℃下將混合物攪拌1小時(shí)。把混合物冷卻至-78℃，并加入異煙酸甲酯(2.14ml，15.6mmol)。將反應(yīng)混合物加熱至室溫并繼續(xù)攪拌過夜。把混合物倒入1N鹽酸溶液(200ml)，在真空下除去THF。將混合物用1N氫氧化鈉水溶液中和然后過濾。將濾餅在高度真空下干燥過夜。
將所得固體(3.0g)依次用乙酸(40ml)和濃硫酸(2ml)處理，然后在80℃加熱3小時(shí)。在冷卻下將混合物用水(100ml)稀釋，用1N氫氧化鈉水溶液中和。將沉淀過濾，用水洗滌并在高度真空下干燥。將粗產(chǎn)物通過柱色譜法純化，用0-20％甲醇在乙酸乙酯中的混合物進(jìn)行梯度洗脫，得到棕褐色固體。
ES-MS280.36(M+H)以相似的方法也制得了由2，3-二羥基苯乙酮制得8-羥基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS240.2(M+H)；由3-溴-5-甲基-2-羥基苯乙酮制得8-溴-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS316.2，318.2(M+H)；由2，4-二羥基苯乙酮制得7-羥基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS240.15(M+H)；由3-乙酰氨基-2-羥基苯乙酮制得8-乙酰氨基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；ES-MS281.2(M+H)；由3-乙酰氨基-2-羥基苯乙酮制得8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮；ES-MS239.2(M+H)；8-乙?；?6-甲基-2-(2-氯-6-甲基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS328.12，330.12(M+H)；8-乙?；?6-甲基-2-(2-氨基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS295.5(M+H)；6-甲基-8-乙?；?2-(3-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮ES-MS280.3(M+H)；和6-甲氧基-8-甲氧基甲基-2-(3-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮ES-MS316.2(M+H)。
實(shí)施例2b溴-色酮的Heck偶聯(lián)8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(另一方法) 6-甲基-8-(乙?；?-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮將8-溴-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(0.12g，0.36mmol)、正丁基乙烯基醚(0.047ml，0.36mmol)、三乙胺(0.050ml，0.36mmol)在DMF(5ml)中的混合物用N2清掃，然后用PdCl2(dppf)(27mg，0.036mmol)處理。將混合物在90℃加熱過夜。將混合物冷卻至室溫，用1N鹽酸(30ml)處理，然后攪拌過夜。將該混合物用水(50ml)稀釋并凍干。將殘余物經(jīng)由C8-HPLC柱洗脫，并將產(chǎn)物分離出來，得到白色固體(2.5mg)。該產(chǎn)物與上面所述產(chǎn)物完全一樣。
實(shí)施例2c乙?；倪€原8-(1-羥基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮將8-乙?；?6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4.6g，16.5mmol)在甲醇(100ml)中的混合物用硼氫化鈉(1.22g、33mmol)處理并加熱回流過夜。在冷卻下加入水(2ml)，然后真空下將溶液濃縮至接近干燥。加入水(100ml)，將形成的沉淀物過濾，得到灰白色固體(4.0g)。
實(shí)施例2d醇的溴化8-(1-溴乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮將8-(1-羥基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4.0g)在冰醋酸(45ml)中的混合物用48％的氫溴酸水溶液(34ml)處理并在80℃加熱過夜，在冷卻下把混合物倒入冰冷的水中，用50％氫氧化鈉中和，用二氯甲烷(3×40ml)萃取。將合并的萃取物干燥并除去溶劑。將殘余物經(jīng)由硅膠柱色譜純化，用0-10％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脫，得到灰白色固體(1.1g)。ESI-MS344.1，346.1(M+H)(作為選擇，該產(chǎn)物可以通過用PBr3在二氯甲烷中的混合物處理醇來獲得)。
實(shí)施例2e醇的甲磺?；?-(1-甲磺酰氧基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮將在冰浴中的8-(1-羥基乙基)-2-(4-吡啶基)-6-甲基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(2.4g)在二氯甲烷(100ml)中的混合物先用三乙胺(1.3ml)而后用甲磺酰氯(0.67ml)處理，然后把混合物在0℃下攪拌30分鐘。然后將溶液用1N鹽酸(2×30ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，除去溶劑，得到油狀棕色固體，無需將其進(jìn)一步純化。
實(shí)施例2f6-甲基-8-溴甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮6-甲基-8-溴甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮
2’-羥基-5’-甲基-3′-甲氧甲基苯乙酮將2’-羥基-5’-甲基苯乙酮(1.0g，6.7mmol)用低聚甲醛(0.18g)和濃鹽酸(5ml)處理，然后在60℃加熱過夜。在冷卻下，用甲苯(3×30ml)萃取混合物，將合并的萃取物干燥(Na2SO4)并除去溶劑，得到黃色油狀物。將油狀物用甲醇(30ml)處理并加熱回流1小時(shí)。在冷卻下，把溶液蒸發(fā)至接近干燥，將殘余物在硅膠柱上色譜純化，用0-10％乙酸乙酯在石油醚中的混合物洗脫。獲得的純化產(chǎn)物為白色粉末。
8-溴甲基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮在-78℃下向苯乙酮(0.76g，3.9mmol)在THF(30ml)內(nèi)的溶液中加入二(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(1.0M在THF中的溶液，11.8ml，11.8mmol)，然后將混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。將混合物冷卻至-78℃，然后加入異煙酸甲酯(0.53ml，3.9mmol)。把反應(yīng)混合物加熱至室溫并繼續(xù)攪拌過夜。將混合物注入1N鹽酸溶液(200ml)，在真空中除去THF。將混合物用1N氫氧化鈉水溶液中和，然后過濾。把濾餅在真空下干燥過夜。
將殘余物先用乙酸(6ml)而后用氫溴酸(48％在水中的溶液，6ml)處理，并將混合物在80℃下加熱過夜。在冷卻下，用2N氫氧化鈉溶液將混合物調(diào)至pH 5。把所得沉淀物過濾，并在真空下干燥。將殘余物經(jīng)由硅膠柱色譜純化，用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脫，將產(chǎn)物分離出來得到灰白色固體(310mg)。LC-MS332，334(M+H)實(shí)施例2g8-三氟甲磺酰氧基-2-(4-吡啶基)--4H 1-苯并吡喃-4-酮向8-羥基-2-(4-吡啶基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮(10mg)在乙腈(2ml)內(nèi)的混合物中加入二異丙基乙胺(20uL)，然后加入N-phenyltriflimide(20mg)，然后在室溫下將混合物攪拌2小時(shí)。將混合物在硅膠上吸附，用乙酸乙酯作為洗脫劑經(jīng)由硅膠柱洗脫，得到為棕褐色固體的本標(biāo)題化合物(10mg)。ESI-MS372.1(M+H)。
實(shí)施例2h酮的還原胺化8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-286)向8-乙酰基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(0.28g)在甲醇(30ml)內(nèi)的懸浮液中加入冰醋酸(2.5ml)、苯胺(2.5ml)和氰基硼氫化鈉(62mg)，然后將混合物在70℃加熱過夜。在冷卻下，將混合物吸附到硅膠上并用柱色譜法純化，用0-10％甲醇在乙酸乙酯中的混合物進(jìn)行梯度洗脫，得到棕褐色固體(200mg)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.65(d，3H，J＝1.2Hz)，2.39(s，3H)，5.186(m，1H)，6.51(d，2H，J＝7.8Hz)，6.69(t，1H，J＝7.5Hz)，6.94(s，1H)，7.11(t，J＝8.1Hz)，7.65(d，1H，J＝1.8Hz)，7.73(d，2H，J＝6Hz)，7.90(s，1H)，8.80(d，2H，J＝6Hz).
ES-MS357.3(M+H)，264.3.
以類似的方法也制備了8-1-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-303)；ES-MS389.3(M+H)8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(3-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-305)；ES-MS 357.3(M+H)8-1-(6-甲基吡啶-2-基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-310)；ES-MS372.3(M+H)8-1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-322)；ES-MS425.0(M+H)8-1-(苯基氨基)乙基-6-甲基-2-(2-氯-6-甲基-4-吡啶基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(KN-340)；ES-MS405.44，407.42(M+H)實(shí)施例2i溴烷基取代的色酮與苯酚或苯胺的反應(yīng)6-甲基-8-苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-312)將8-溴甲基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(48mg，0.15mmol)在乙腈(5ml)中的混合物用苯胺(48uL，0.52mmol)處理，然后將該混合物在70℃加熱4小時(shí)。在冷卻下，將該混合物用固體碳酸鉀(60mg)處理，將該混合物吸附到硅膠(1.0g)上，然后除去溶劑。將殘余物施加于硅膠柱上，把產(chǎn)物用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脫。將產(chǎn)物分離出來，得到黃色粉末(25mg)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.41(s，3H)，4.19(s，1H)，4.71(s，2H)，6.68(d，2H，J＝8.4Hz)，6.77(t，1H，J＝7.2Hz)，6.9(s，1H)，7.21(t，2H，7.5Hz)，7.59(s，1H)，7.67(d，2H，4.8Hz)，7.91(s，1H)，8.74(s，2H).
LC-MS343.08(M+H)，249.98以類似的方法也制備了6-甲基-8-苯氧基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-313)ES-MS 344.16-甲基-8-(2-吡啶基)氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-315)ES-MS344.16-甲基-8-1-(苯氧基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-317)ES-MS 358.16-甲基-8-(2-羧基)苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-323)ES-MS 387.04(M+H)6-甲基-8-(2-乙酰氨基)苯基氨基甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-326)ES-MS413.9(M+H)6-甲基-8-[1-(2-羧基)苯基氨基]乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-334)ES-MS401.4實(shí)施例2j8-(1-(2-氨基苯基氨基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮將8-(1-甲磺酰氧基)乙基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(2.4g)在乙腈(50ml)中的混合物用碳酸鉀(2.4g)和單-Boc苯二胺(2.7g)處理，然后把混合物在70℃加熱過夜。在冷卻下將混合物用二氯甲烷處理并吸附到硅膠上。除去溶劑，把殘余物施加于硅膠柱上，然后將產(chǎn)物用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脫。使產(chǎn)物分離出來，得到黃色油狀物(0.9g)。
ES-MS472.3(M+H)將8-(1-(Boc-2-氨基苯基氨基)乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(0.9g)在二氯甲烷(12ml)中的混合物用三氟乙酸(8ml)處理，然后在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用二氯甲烷(30ml)稀釋，先用水(30ml)然后用1N濃鹽酸(30ml)萃取。把合并的含水萃取物用氫氧化鈉中和，并用二氯甲烷(3×50ml)萃取。然后將合并的有機(jī)萃取物用0.3N鹽酸水溶液(2×50ml)再萃取。然后把合并的含水提取物凍干至干燥，得到紅褐色固體(0.61g)。
ES-MS372.3以類似的方法制備了6-甲基-8-1-(2-三氟甲基-苯并咪唑-1-基)-乙基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-328)ES-MS450(M+H)實(shí)施例2k8-芐氧基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-335)將8-羥基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(52mg)和無水碳酸鉀(117mg)在乙腈中的混合物用芐基溴處理，并加熱回流過夜。在冷卻下將混合物用二氯甲烷處理，吸附到硅膠上，并施加于硅色譜柱上。把產(chǎn)物用0-4％甲烷在乙酸乙酯中的混合物洗脫，將所要求的產(chǎn)物分離出來，得到褐色固體(17mg)。
ES-MS330.2(M+H)以類似的方法制備了7-芐氧基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-342)ES-MS330.5(M+H)實(shí)施例2l8-芐基氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-336)將8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(16mg)、苯甲醛(40μL)和乙酸(20μL)在甲醇(5ml)中的混合物用氰基硼氫化鈉(5mg)處理，并在70℃加熱過夜。在冷卻下把溶液吸附到硅膠上，經(jīng)由硅膠色譜純化，用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物梯度洗脫。將所要求的產(chǎn)物分離出來，得到黃色固體。ES-MS329.3(M+H)實(shí)施例2m8-苯基氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(KN-341)將8-氨基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(20mg)、苯基硼酸(30mg，0.25mmol)和三乙胺(70uL，0.5mmol)在二氯甲烷(5ml)中的混合物用乙酸銅(45mg，0.25mmol)處理，并在室溫下將混合物攪拌過夜。把混合物吸附到硅膠上，施加于硅膠柱上并用0-5％甲醇在乙酸乙酯中的混合物洗脫。獲得所要求的化合物，為黃色固體(4mg)。
ES-MS315.5(M+H)。
以相似的方法制備了8-(3-氟苯基氨基)-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮(KN-351)ES-MS333.3(M+H)實(shí)施例2n8-苯基-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(TGX-25S)將8-溴-6-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-1-酮(0.1g，0.32mmol)、磷酸鉀(0.2g，0.95mmol)、苯基硼酸(0.042g，0.35mmol)和PdCl2(dppf)(7.8mg，0.009mmol)在二氧雜環(huán)己烷(6ml)中的氮?dú)獯祾叩幕旌衔锛訜峄亓鬟^夜。在冷卻下過濾混合物，并將濾液濃縮至干燥。將殘余物經(jīng)由C8HPLC柱色譜純化，用0-60％乙腈在0.1％濃TFA中的混合物作為洗脫劑。將純化的級(jí)分合并，得到黃色粉末(53.4mg)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.53(s，3H)，7.03(s，1H)，7.55(m，6H)，7.80(d，J＝5.7Hz，2H)，8.04(s，1H)，8.80(d，J＝5.7Hz，2H).ES-MS314.3(M+H)實(shí)施例2o合成6-甲基-8-溴-3-羥基-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-l-酮 向3′-溴-2′-羥基-5′-甲基苯乙酮(1.15g)和吡啶-4-甲醛(0.54g)在乙醇(10ml)內(nèi)的混合物中滴加50％氫氧化鈉溶液，并在室溫下把混合物攪拌4小時(shí)。將混合物用冰冷的冰醋酸處理至pH 5.5，形成沉淀物，過濾得到查耳酮中間體，作為黃色固體(0.85g)。
在0℃下將查耳酮(0.132g)在甲醇(2.3ml)中的溶液先用2N氫氧化鈉(2.1ml)而后用30％(v/v)過氧化氫溶液(189μL)處理。在4℃下將該混合物攪拌過夜。用2N硫酸中和該混合物并形成沉淀物，將其過濾得到棕褐色固體。ES-MS332.0，334.0(M+H)實(shí)施例3.制備吡啶取代的喹諾酮衍生物按照下面一般方法制備本發(fā)明吡啶取代的喹諾酮化合物
試劑i.對(duì)甲苯磺酸、甲苯，回流；ii.Ph2O，加熱。
i.酯中間體(化合物3)的合成將β-氧代-4-吡啶丙酸乙酯(化合物1，4.35mmol)[Lesher等人，1984，J.Heterocycl.Chem.21(6)1849]、苯胺(化合物2，3.35mmol)和對(duì)甲苯磺酸(0.54mmol)在甲苯(30mL)中的混合物在回流溫度下加熱18小時(shí)，共沸除去水。將溶劑減壓蒸發(fā)，得到粗制的黃色油狀物，在用石油醚/乙酸乙酯(1∶1)作為洗脫劑的快速色譜純化后，得到酯中間體(化合物3，70-80％)。
ii.喹諾酮(化合物4)的合成將酯中間體(化合物3)(2.58mmol)在二苯基醚(3mL)中回流20分鐘，冷卻至室溫然后用石油醚處理得到膏狀固體。將沉淀物過濾，用石油醚洗滌數(shù)次，然后經(jīng)由快速色譜純化，用乙酸乙酯/甲醇(9∶1)作為洗脫劑，得到所要求的喹諾酮化合物4(60-70％)。
8-苯氧基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-319)通過在甲苯中回流將酯中間體(化合物3，其中R是OPh)在原位環(huán)合，得到喹諾酮(化合物4)(步驟i)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.64(d，J＝1.9Hz，1H)，7.06(dd，J＝8.0，1.1Hz，1H)，7.15(dd，J＝7.7，0.7Hz，2H)，7.20-7.31(m，2H)，7.44(td，J＝7.7，0.7Hz，2H)，7.57dd，J＝5.0，1.4Hz，2H)，8.06(dd，J＝8.0，1.1Hz，1H)，8.80(d，J＝5.0Hz，2H)，8.88(br.s，NH)；MS-ES m/e 315(M+H).
8-溴-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-343)酯中間體(化合物3，其中R是Br)
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.33(t，J＝7.1Hz，3H)，4.25(q，J＝7.1Hz，2H)，5.17(s，1H)，6.31(dd，J＝7.7，1.6Hz，1H)，6.81(td，J＝7.7，1.6Hz，1H)，6.89(td，J＝7.7，1.6Hz，1H)，7.21(d，J＝5.2Hz，2H)，7.54(dd，J＝7.7，1.6Hz，1H)，8.56(d，J＝5.2Hz，2H)，10.16(br.s，NH)；MS-ESm/e347(M+H).
喹諾酮(化合物4)1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ7.45(t，J＝7.9Hz，1H)，7.49(s，1H)，8.12(d，J＝5.2Hz，2H)，8.14(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.19(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.78(d，J＝5.2Hz，2H)，12.02(br.s，NH)；MS-ES m/e 301(M+H).
在各種其它吡啶取代的喹諾酮類似物的合成中KN-343是中間體。
8-(4-氟-2-甲基苯氧基)-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-337)酯中間體(化合物3，其中R是4-氟-2-甲基苯氧基)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 1.29(t，J＝7.1Hz，3H)，2.26(s，3H)，4.20(q，J＝7.1Hz，2H)，5.07(s，1H)，6.41(dd，J＝7.7，1.9Hz，1H)，6.56(dd，J＝7.7，1.9Hz，1H)，6.69(td，J＝7.7，1.9Hz，1H)，7.76(dd，J＝8.9，5.0Hz，1H)，6.81-6.86(m，2H)，6.97(dd，J＝8.9，3.1Hz，1H)，7.27(dd，J＝4.5，1.5Hz，2H)，8.57(dd，J＝4.5，1.5Hz，2H)，10.25(s，NH)；MS-ES m/e 393(M+H).
喹諾酮(化合物4)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 2.23(s，3H)，6.67(d，J＝2.1Hz，1H)，6.76(dd，J＝8.1，1.0Hz，1H)，6.98(td，J＝8.2，2.8Hz，1H)，7.03-7.07(m，2H)，7.20(t，J＝8.1Hz，1H)，7.62(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.02(dd，J＝8.1，1.0Hz，1H)，8.84(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.86(s，NH)；MS-ES m/e 347(M+H).
8-甲氧基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-344)通過在甲苯中回流將酯中間體(化合物3，其中R是OMe)在原位環(huán)合，得到喹諾酮(化合物4)(步驟i)1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ3.99(s，3H)，6.66(s，1H)，7.25(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，7.32(t，J＝7.9Hz，1H)，7.70(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，7.82(dd，J＝4.4，1.7Hz，2H)，8.72(dd，J＝4.4，1.7Hz，2H)；MS-ES m/e253(M+H).
在各種其它吡啶取代的喹諾酮類似物中KN-344是關(guān)鍵的中間體。
8-苯基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-345)通過在甲苯中回流將酯中間體(化合物，其中R是苯基)在原位環(huán)合，得到喹諾酮(化合物4)(步驟i)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.65(d，J＝2.0Hz，1H)，7.38(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)，7.46(td，J＝8.1，1.6Hz，1H)，7.52-7.56(m，3H)，7.58-7.63(m，2H)，8.42(dd，J＝8.1，1.6Hz，2H)，8.75(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)；MS-ES m/e 299(M+H).
8-芐基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-346)通過在甲苯中回流將酯中間體(化合物3，其中R是芐基)在原位環(huán)合，得到喹諾酮(化合物4)(步驟i)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.34(s，2H)，6.52(s，1H)，7.27-7.33(m，3H)，7.37-7.44(m，4H)，7.63(d，J＝6.9Hz，2H)，8.35(d，J＝8.3Hz，1H)，8.67(br.s，2H)；MS-ES m/e 313(M+H).
8-硝基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-352)在合成喹諾酮(化合物4)中，使用無需進(jìn)一步純化的粗制酯中間體(化合物3，其中R是硝基)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.77(d，J＝2Hz，1H)，7.51(t，J＝7.9Hz，1H)7.65(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)，8.72(dd，J＝7.9，1.6Hz，1H)8.80(ddd，J＝7.9，1.6，0.6Hz，1H)8.89(dd，J＝4.5，1.7Hz，2H)；MS-ESm/e268(M+H).
8-氨基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-353)用Pd/C在乙醇中的混合物將8-硝基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-352)氫化，得到本標(biāo)題化合物MS-ES m/e 238(M+H)。
8-萘基-2-(4-吡啶基)-4(1H)-喹諾酮(KN-350)酯中間體(化合物3，其中R是萘氧基)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 1.23(t，J＝7.1Hz，3H)，4.13(q，J＝7.1Hz，2H)，5.01(d，J＝1.6Hz，1H)，6.56(dd，J＝7.8，1.6Hz，1H)，6.77-6.82(m，3H)，6.88(td，J＝7.8，1.6Hz，1H)，7.27(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，7.37(t，J＝8.1Hz，1H)，7.50-7.54(m，2H)，7.62(d，J＝8.1Hz，1H)，7.85-7.89(m，1H)，8.18-8.21(m，1H)，8.57(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，10.24(s，NH)；MS-ES m/e 410(M+H).
喹諾酮(化合物4)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.69(d，J＝2.1Hz，1H)，6.97(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.16(dd，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.21(t，J＝8.1Hz，1H)，7.48(t，J＝7.9Hz，1H)，7.52-7.55(m，2H)，7.59(td，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.78(d，J＝8.1Hz，1H)，7.96(d，J＝7.9Hz，1H)，8.07(d，J＝7.9Hz，1H)，8.08(d，J＝8.1Hz，1H)，8.79(dd，J＝4.5，1.6Hz，2H)，8.94(br.s，NH)；MS-ES m/e 365(M+H).
實(shí)施例4.制備吡啶取代的吡啶并嘧啶酮衍生物實(shí)施例4a一般試驗(yàn)方法將胺(3.00mmol)和γ-氧代-4-吡啶丙酸乙酯(3.00mmol)的混合物在180-200℃下加熱20-45分鐘。隨后將該粗產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜純化(SiO2，EtOAc)，得到所要求的嘧啶化合物。反應(yīng)產(chǎn)物在10-20％之間。
9-甲基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-347)1H NMR(CDCl3，200MHz)δ 2.75(s，3H)；7.03(s，1H)；7.15(t，J＝6.97Hz，1H)，7.69-7.73(bd，J＝6.91Hz，1H)；8.12-8.15(bd，J＝6.05Hz，2H)；8.82-8.84(bd，J＝4.73Hz，2H)；9.01-9.05(bd，J＝7.40Hz，1H).LCMS m/z 238(M++H).
9-芐基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-349)
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ 4.50(s，2H)；7.03(s，1H)；7.16(t，J＝7.03Hz，1H)；7.28-7.39(m，5H)；7.56-7.58(m，1H)；8.21(bs，2H)；8.83(bs，2H)；9.02-9.05(m，1H).LCMS m/z 314(M++H).
9-苯基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-348) 1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.50(d，J＝1.07Hz，3H)；7.00(s，1H)；7.48-7.56(m，4H)；7.71-7.75(m，4H)；7.90(bs，2H)；8.96(m，1H).LCMS m/z 314(M++H).
9-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮 1H NMR(DMSO，300MHz)δ 2.42(m，3H)；7.23(s，1H)；8.19(dd，J＝4.48，1.66Hz，2H)；8.40(d，J＝1.95Hz，1H)；8.77(dd，J＝4.56，1.65Hz，2H)；8.83(m，1H).LCMS m/z316(M+).
實(shí)施例4b9-(2-苯乙基)氨基-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-316) 在回流溫度于氮?dú)夥障?，將溴衍生?(324mg，1mmol)、(R)-(+)-α-甲基芐胺2(122mg，1mmol)、叔丁醇鉀(225mg，2mmol)和PdCl2(dppf)(35mg，0.05mmol)在THF中的混合物攪拌20小時(shí)。把反應(yīng)混合物冷卻并用乙酸乙酯稀釋。將有機(jī)層用水、鹽水洗滌并在Na2SO4上干燥。在真空下將乙酸乙酯層濃縮，并將殘余物經(jīng)由柱色譜法(硅膠，乙酸乙酯)純化，得到所要求的產(chǎn)物3。
1H NMR(300MHz，CDCl3)，δ 8.78(br s，2H)，8.21(s，1H)，7.92(d，J＝5.9Hz，2H)，7.4-7.26(m，5H)，6.90(s，1H)，6.50(d，J＝5.5Hz，1H，-NH)，6.27(s，1H)，4.60(m，1H)，2.23(s，3H)，1.71(d，J＝6.9Hz，3H).MS(m/z)＝357.13(m+1).
實(shí)施例4c9-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮 將異煙酸乙酯(5.0ml，25.91mmol)和4-乙?；鶈徇?3.0ml，25.91mmol)在THF(25ml)中的溶液用二(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(7.0g，41.83mmol)在THF(25ml)中的溶液處理。在室溫下把該溶液攪拌24小時(shí)。過濾該溶液并用乙醚(3×50ml)洗滌。把濾液溶解于水(100ml)中，用冰醋酸酸化，用CH2Cl2(3×30ml)萃取，干燥(Na2SO4)，過濾并蒸發(fā)至干燥。將粗制的反應(yīng)混合物經(jīng)由柱色譜法(SiO2，乙酸乙酯)純化，得到為黃色粘性油狀物的化合物5，其在靜置下固化。1HNMR(CDCl3，300MHz)酮與烯醇醚的合并的NMR δ 3.47-3.57(bm，8H)；3.95和5.77(s，1H)；7.44和7.61dd，J＝4.43，1.62Hz，2H)；8.49(bd，J＝5.93Hz)和8.64(dd，J＝4.44，1.62Hz)2H.LCMS m/z235(M++H).
將2-氨基-3-溴-5-甲基吡啶(1.00g，4.30mmol)、化合物5(1.20g，6.40mmol)和對(duì)甲苯磺酸一水合物(203.0mg，1.07mmol)在甲苯(50ml)中的混合物回流4天。在真空中除去甲苯，將所得粗制反應(yīng)混合物經(jīng)由柱色譜法(SiO2，乙酸乙酯)純化，得到化合物5，為黃色沉淀物(0.66g，65％)。
實(shí)施例4d 在90-100℃于氮?dú)夥障孪拢瑢?-溴-2-(4-吡啶基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮1(232.1mg，0.73mmol)、丁基乙烯基醚(0.19ml，1.08mmol)，碳酸鉀(149.2g，1.49mmol)和Pd(OAc)2(4.8mg，21.6μmol)在無水DMF(6ml)中的溶液攪拌2小時(shí)。用1M鹽酸處理該溶液直至混合物呈酸性(～pH4)，然后在室溫下將該后成溶液攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)物用水(10ml)稀釋，用NaHCO3中和并將水層用CH2Cl2(3×15ml)萃取。把合并的有機(jī)萃取液用水(3×15ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮至干，得到褐色沉淀物。將該固體用乙醚研制，過濾，用另外的乙醚(3×15ml)洗滌，然后空氣干燥，得到所要求的酮6，其為黃色沉淀物(61.4mg，30％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ 2.50(d，J＝3.29Hz，3H)；2.93(s，3H)；7.03(s，1H)；8.03(d，J＝2.18Hz，1H)；8.16(bd，J＝6.37Hz，2H)；8.83(bs，2H)；9.03(m，1H).LCMS m/z280(M++H).
生物學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例1.PI 3-激酶β的選擇性使用體外酶分析來測(cè)定相對(duì)于其它I型PI 3-激酶家族成員或其它相關(guān)激酶家族酶，TGX-221選擇性抑制PI 3-激酶β活性的能力。
為了測(cè)定TGX-221對(duì)PI 3-激酶α、β、或δ同種型或PI4激酶的抑制活性，將洗滌的血小板用1×溶胞緩沖液(10Mm Tris，pH 7.6，10mM PMSF，5mM EDTA，2mM芐脒，0.1％Triton X-100)溶解，然后通過以15,000×g離心分離5分鐘將全部細(xì)胞溶解物澄清。對(duì)于每一免疫沉淀，在4℃下將1mg溶解產(chǎn)物用抗-p110α(1μg)、抗-p110β(1μg)、抗-p110δ(1μg)或抗-PI激酶抗體(2-5μg)和50μl 50％A蛋白球漿液培養(yǎng)過夜。對(duì)于PI 3-激酶測(cè)定，將A蛋白球免疫混合物用溶胞緩沖液洗滌兩次并用1 x PI 3-激酶測(cè)定緩沖液(20mM Hepes，pH7.2，5mM MgCl2，0.25mM EDTA)洗滌兩次以上，然后用40μl PI 3-激酶酶底物磷脂酰肌醇(PtdIns)、10μl ATP混合液(0.5μl γ32P-ATP+0.5μl 10mM ATP)、10μl 10x激酶緩沖液、15μl milliQ H2O和1μlTGX-221(0-10μM)在室溫下培養(yǎng)25μl免疫沉淀的p110α或β同種型。對(duì)于PI4激酶測(cè)定，將A蛋白球免疫混合物也用溶胞緩沖液洗滌兩次，然后用1X PI4激酶測(cè)定緩沖液(20mM Hepes，pH7.5，10mMMgCl2，0.3％Tron X-100)洗滌兩次，并加入其它測(cè)定組合物，如上面所述。通過加入100μl 1M HCl、200μl氯仿/甲醇(1∶1)和500μl 2MKCl和通過以15,000xg離心分離2分鐘萃取的脂質(zhì)，結(jié)束全部反應(yīng)。通過TLC分析確定PI3或PI4激酶脂質(zhì)產(chǎn)物PtdIns(3)P和PtdIns(4)P的產(chǎn)生。然后從TLC板上除去脂質(zhì)點(diǎn)斑點(diǎn)并量化放射性水平以準(zhǔn)確測(cè)定PtdIns(3)P/PtdIns(3)P產(chǎn)生的水平。
為測(cè)定TGX-221抑制PI 3-激酶γ同種型的能力，將0.5μl p110γ重組蛋白用10μl10X激酶緩沖液(2.5mM EDTA，200mM HEPES，50mM MgCl2pH7.2)、30μl milliQ H2O、40μl PI(150μl/ml)、10μl ATP混合液(0.5μl γ32P-ATP+0.5μl 10mM ATP)和1μl TGX-221(0-10μM)在室溫培養(yǎng)20分鐘。如上面所述的其它PI 3-激酶同種型測(cè)定，結(jié)束反應(yīng)并分析脂質(zhì)產(chǎn)物。
TGX-221對(duì)其它酪氨酸和Ser/Thr激酶的抑制活性經(jīng)由MDSPharma Services(Panlabs，Taiwan)進(jìn)行。
TGX 221PI對(duì)3-激酶β顯示5nM的IC50，對(duì)血小板中的兩種其它主要類型I PI 3-激酶同種型(PI 3-激酶α和PI 3-激酶γ)顯示＞100倍的選擇性。
在范圍廣泛的蛋白激酶中，TGX-221對(duì)PI 3-激酶β顯示＞1000倍的選擇性。此結(jié)果顯示于圖2D。TGX-221顯示對(duì)PI4激酶最小的抑制效果(圖2D)，并選擇性地抑制體內(nèi)PI 3-激酶脂質(zhì)產(chǎn)生(圖3A)，而不改變常規(guī)的磷酸肌醇、PtdIns、PtdIns(4)P(未顯示數(shù)據(jù))和PtdIns(4，5)P2(圖3A)。
每一試驗(yàn)化合物的抑制濃度列于下表。
表I選擇的化合物抗PI 3-激酶同種型的活性
實(shí)施例2.剪切引起的血小板聚集研究使用定制的錐-板裝置來測(cè)定TGX-221抑制PI 3-激酶脂質(zhì)產(chǎn)物和由剪切病理學(xué)水平引起的血小板聚集。
對(duì)于該分析，在抗凝血?jiǎng)6體積血液1體積抗凝血?jiǎng)?90檸檬酸鈉，7mM檸檬酸，pH4.6，140mM葡萄糖和70mM茶堿)]存在的情況下采集血液，并將血小板離析，用改進(jìn)的Baezinger和Majerus方法(1974)洗滌。簡(jiǎn)單的說，通過以200χg將全血離心分離30分鐘，獲得富含血小板的血漿(PRP)。然后通過在2,000χg下離心分離PRP 10分鐘，使血小板球狀化。把血小板球再懸浮于血小板洗滌緩沖液(PWB)[4.3Mm K2HPO4，4.3mM Na2HPO4，24.3mM NaH2PO4，pH6.5，113mM NaCl，5.5mM葡萄糖，0.5％牛血清(BSA)和10mM茶堿]中。用含有血小板活化抑制劑茶堿(10mM)的無磷酸鹽Tyrode緩沖液洗滌血小板兩次，然后在37℃下用0.3mCi/ml無機(jī)32P標(biāo)記2小時(shí)。在有茶堿(10mM)存在的情況下通過用無磷酸鹽Tyrode緩沖液洗滌血小板兩次將未溶合的32P除去，然后把血小板再懸浮于含有1mM鈣的無磷酸鹽Tyrode緩沖液中。在增加TGX-221(0-500nM)濃度的同時(shí)在37℃下將放射性標(biāo)記的血小板培養(yǎng)30分鐘。迅速加入vWf(10μg/ml)，然后使血小板經(jīng)受5000s-1的病理學(xué)剪切速率2分鐘。按照Stephens等人(1997，Cell，89105-114)，通過HPLC分析，將血小板溶解，萃取并分離。將與市售PtdIns(3，4)P2和PtdIns(4，5)P2標(biāo)準(zhǔn)物一起洗脫下來的脂質(zhì)峰積分和標(biāo)準(zhǔn)化成施加的總脂質(zhì)，并作為對(duì)照樣本的分?jǐn)?shù)表示。
為了測(cè)定TGX-221對(duì)由病理學(xué)剪切速率引起的血小板聚集的作用，在增加TGX-221(0-1μM)濃度的同時(shí)，將懸浮于含有1mM鈣(350×109)的Tyrode緩沖液中的洗滌的血小板在37℃下培養(yǎng)10分鐘。立即加入vWf(10μg/ml)，然后使血小板經(jīng)受5000s-1的病理學(xué)剪切速率5分鐘。抽出血小板樣本，通過使用SysmexTMKN-21N血液學(xué)分析儀分析未溶合的單個(gè)血小板的數(shù)目，確定血小板聚集的水平。將全部數(shù)據(jù)歸一化至對(duì)照試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并表達(dá)為相對(duì)于對(duì)照樣本的比例增加。TGX-221在濃度范圍(ICso＝0.05-0.1μM)有效地抑制剪切引起的血小板聚集，與抑制3-磷酸化的脂質(zhì)(圖3B)相差不大。
實(shí)施例3.FACS分析用FACS分析確定來TGX-221對(duì)粘合素活化和血小板活化的作用。將懸浮于含有1mM CaCl2/1mM MgCl2的Tyrode緩沖液中的洗滌的血小板，用抗-P選擇素或1μg/ml PAC-1抗體和單獨(dú)的載體或0.5μM TGX-221，在37℃下培養(yǎng)10分鐘。將血小板用凝血酶(1U/ml)、ADP(12.5mM)、U46619(1AM)或膠原質(zhì)(10μg/ml)在室溫下刺激20分鐘，然后在室溫下用2％多聚甲醛固定45分鐘。將固定的血小板用Tyrode緩沖液洗滌兩次，用1μg/ml FITC-綴合的抗小鼠(ab)2’抗體培養(yǎng)15分鐘，用Tyrode緩沖液洗滌兩次，再懸浮于Tyrode緩沖液中至500μl的最終體積，并用FACS進(jìn)行分析。
實(shí)施例4.體內(nèi)流動(dòng)研究用基于流動(dòng)的粘著分析來測(cè)定TGX-221對(duì)血小板鈣流出的作用。將懸浮于PWB中的洗滌的血小板(1.5×109)用鈣指示劑顏料、OregonGreen 488BAPTA-1、AM(1μM)和Fura Red、AM(1.25μM)在37℃下培養(yǎng)30分鐘。再懸浮于含有1mM鈣的Tyrode緩沖液之前，用PWB洗滌血小板兩次。在進(jìn)行靜態(tài)或基于流動(dòng)的粘著測(cè)定之前，將血小板用單獨(dú)的載體、TGX-221(0.5μM)、LY294002(20μM)、阿司匹林(1mM)、腺苷三磷酸雙磷酸酶(0.5U/ml)或Aggrastat(200nM)培養(yǎng)10分鐘。
對(duì)于靜態(tài)粘著測(cè)定，在37℃下把血小板在vWf包衣的蓋玻片的表面上放置30分鐘。對(duì)于流動(dòng)測(cè)定，在600、1800或10,000s-1的恒定剪切速率下將血小板灌注到vWf包衣的微毛細(xì)管上，或者把血小板放置在vWf包衣的微毛細(xì)管的表面上，然后在1秒間隔使其通過10,000s-1的剪切梯度。對(duì)于靜態(tài)和基于流動(dòng)的測(cè)定，分別在30分鐘培養(yǎng)期間以1秒間隔，或以0.586間隔直到175秒，監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)血小板鈣流出。
實(shí)施例5.在改進(jìn)的Folts模型中的測(cè)定在麻醉大鼠和兔子中，用改良的folts模型研究TGX-221的體內(nèi)抗血栓形成活性。研究由University of Melbourne Animal EthicsCommittee按照National Health & Medical Research Council ofAustralia的準(zhǔn)則驗(yàn)收。對(duì)于Sprague-Dawley大鼠(260-400g)用戊巴比妥鈉(Nembutal；60mg/kg i.p.；Merial Australia Pty.Ltd.，Sydney，NSW，Australia)進(jìn)行麻醉，對(duì)于New Zealand白兔(2-3kg)用戊巴比通(15mg/kg i.v.)和芬太奴(6Rg/kg i.v.；David Bull Laboratories，Mulgrave，VIC，Australia)進(jìn)行麻醉。對(duì)動(dòng)物用補(bǔ)充以O(shè)2的室內(nèi)空氣予以機(jī)械通風(fēng)(Ugo Basile通風(fēng)機(jī)，Comerio，VA，Italy)。在試驗(yàn)過程中保持體溫。通過將股動(dòng)脈連接到壓力傳感器(Model 1050.1，AD儀器，Sydney，NSW)來測(cè)量動(dòng)脈血壓，并在每一(對(duì)照和試驗(yàn))動(dòng)脈周圍設(shè)置血流探針(1mm i.d.用于大鼠& 2.5mm i.d.用于兔子；流量計(jì)T206，Transonic Systems Inc.，Ithaca，NY，USA)；將全部參數(shù)記錄于PowerLab數(shù)據(jù)系統(tǒng)(8SP；AD儀器)。將絲縫合線圍繞流動(dòng)探針末梢的1動(dòng)脈扎緊，用于隨后的狹窄。試驗(yàn)前5分鐘靜脈給藥克賽(0.24mg/kg大鼠&1mg/kg兔子；依諾肝素鈉；Aventis Australia Pty.Ltd.，Sydney，NSW，Australia)。將縫合線扎緊引起狹窄，使動(dòng)脈血流減少50％。然后通過用鑷子在縫合線上夾壓動(dòng)脈5次，將狹窄下的動(dòng)脈段去內(nèi)皮細(xì)胞。監(jiān)測(cè)頸動(dòng)脈血流直至其達(dá)到0ml/min，標(biāo)志在狹窄處形成凝塊。1分鐘后，將狹窄處輕輕彈動(dòng)，使凝塊消失并恢復(fù)血流。再一次監(jiān)測(cè)血流直至其達(dá)到0ml/min并記錄時(shí)間。給藥前30分鐘，觀察循環(huán)流動(dòng)的減少量(CFRs)。30分鐘后，大劑量給藥25ml/kg作為載體的丙二醇或2mg/kg TGX-221，并對(duì)血壓繼續(xù)測(cè)量90分鐘。在此期間，如果CFR沒有消失，或者消失一段時(shí)間后恢復(fù)，每一次血流達(dá)到零時(shí)用物理法消除(通過輕彈血管)，以便恢復(fù)CFRs。TGX-221在100％大鼠(n＝8)和兔子(n＝9)中(圖5A)。
實(shí)施例6.電解模型中的測(cè)定在左頸動(dòng)脈血流探針末端，把一片Parafilm嵌入血管下面用于電離析。把動(dòng)脈放在鉤狀白金電極上，然后，在末端將其固定到電極上以閉塞血流，用連接到Grass SD9刺激儀的(Model CCU1，Grass儀器，Quincy，MA，USA)通以7mA電流4分鐘。刺激結(jié)束后對(duì)血流監(jiān)測(cè)60分鐘。通過血流降至零可以確定血栓形成。在用大鼠電解損傷頸動(dòng)脈模型的(Bush&Shebuski，1990)中，與載體治療的大鼠(7l＝10)(圖5B)90％的閉塞率相比，損傷前5分鐘注射TGX-221(2mg/kg在PG中的溶液)完全阻止閉塞性血栓形成(n＝6)，并且在損傷后60分鐘保持血流體積(圖5B插入圖)。在Folts和電解研究中，TGX-221對(duì)原始血壓、心律或未損傷的頸動(dòng)脈中的血流沒有影響。
實(shí)施例7.大鼠中尾巴出血研究在補(bǔ)充以O(shè)2的室內(nèi)空氣中用氟烷將大鼠麻醉。給藥前15分鐘(-15)分鐘以及給藥后5和30分鐘，測(cè)量尾巴出血時(shí)間。對(duì)于有關(guān)用阿司匹林和氯吡格雷預(yù)處理的試驗(yàn)，在第一次灌食法給藥前的-25小時(shí)，也對(duì)尾巴出血時(shí)間進(jìn)行測(cè)量。在每一時(shí)間點(diǎn)，將尾巴上割以5mm長(zhǎng)和1mm深的切口，并且每30秒監(jiān)測(cè)出血情況，直到停止出血為止(＝尾巴出血時(shí)間)。
如圖5中所示，對(duì)大鼠的研究顯示，當(dāng)以＞20倍最小治療濃度給藥時(shí)TGX-221不增加出血時(shí)間。重要的是，當(dāng)將TGX-221(20mg/kg注射)單獨(dú)或與肝素(100U/kg注射)一起給藥時(shí)，大鼠尾巴出血時(shí)間未受影響(5C)。在與氯吡格雷(10mg/kg口服)+肝素(100U/kg注射)或阿司匹林(200mg/kg口服)+肝素(100U/kg注射)合并用藥時(shí)，TGX-221(2mg/kg注射)并不加劇延長(zhǎng)由這些藥劑引起的出血時(shí)間(圖5C)。當(dāng)與氯吡格雷或阿司匹林合并給藥時(shí)，TGX-221(2mg/kg注射)也不影響出血時(shí)間。
實(shí)施例8.體內(nèi)PI 3-激酶測(cè)定用體內(nèi)PI 3-激酶測(cè)定來確定吡啶取代的化合物對(duì)PI 3-激酶活性的作用。用由人血小板免疫沉淀的PI 3-激酶作為酶和PI作為酶作用物進(jìn)行此測(cè)定。如前面所述(Susa等人，1992，The Journal of BiologicalChemistry 267(32)22951-22956.)，通過測(cè)量酶結(jié)合[32p]進(jìn)入PI形成PI([32P]-3)P，來測(cè)量PI 3-激酶活性。
將洗滌的人血小板溶解于Triton X-100溶解緩沖液(10mM三羥甲基氨基甲烷，pH 7.4，1％Triton X-100，2mM EDTA，1mM PMSF)中30分鐘。通過以15,000g離心分離細(xì)胞溶解物10分鐘，除去TritonX-100不能溶解的級(jí)分。通過將500μg細(xì)胞溶解物與1μg抗PI 3-激酶的p85/110形式的兔抗大鼠抗體和30μl 50％蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠珠在4℃下混合2小時(shí)，來免疫沉淀PI 3-激酶。通過以15,000g將凝膠珠?；?秒鐘，用冰冷的Triton X-100溶解緩沖液洗滌3次，然后用PI 3-激酶測(cè)定緩沖液(20mM HEPES，pH 7.4，1mM EGTA，5mMMgCl2)洗滌4次，將蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠結(jié)合的PI 3-激酶離析。
在N2下將貯存于CHCl3的PI干燥，以330μg/ml的最終濃度再懸浮于脂質(zhì)緩沖液(50mM HEPES，pH 7.2，1mM EDTA)中，并在冰上超聲處理6分鐘。通過將免疫沉淀的PI 3-激酶與40μl PI、10μlATP(1mM)和32P-r-ATP(0.5μCi，1μCi/nmol)、10μl l0x激酶緩沖液在用H2O調(diào)整的100μl最終測(cè)定體積中混合，產(chǎn)生PI([32P]-3)P。在加入ATP之前，將TGX用PI 3-激酶預(yù)培養(yǎng)5分鐘。用100μl 1NHCl結(jié)束測(cè)定，并且用200μl氯仿∶甲醇(1∶1)和500μl 2M KCl萃取PI([32P]-3)P產(chǎn)物。通過薄層色譜法，用含有CHCl3∶MeOH∶HAC∶H2O(43∶38∶5∶7)(v∶v∶v∶v)的溶劑系將氯仿相中的PI([32P]-3)P溶解，并用自動(dòng)射線照像顯示。然后從TLC盤上刮去The PI([32P]-3)P斑點(diǎn)，在53℃下用1ml甲胺∶丁醇∶甲醇(42∶9∶47)(v∶v∶v)脫乙?；?小時(shí)，用脂質(zhì)閃爍計(jì)數(shù)器(LKB 1209RackBETA)測(cè)定數(shù)值。
實(shí)施例9.基于流動(dòng)的重組測(cè)定用基于流動(dòng)的粘著測(cè)定來確定TGX-286對(duì)血小板粘著的影響。在紅細(xì)胞重組至50％血細(xì)胞比容之前，在37℃下將洗滌的血小板用10、25、或50nM TGX-286或?qū)φ站彌_液(0.1％DMSO)預(yù)處理30分鐘。把血小板和重組的紅血細(xì)胞以1800s-1的剪切速率灌注通過vWf-包衣的玻璃微載玻片1分鐘。通過在1800s-1下洗滌10分鐘除去微粘著的細(xì)胞，測(cè)定粘著血小板的數(shù)目并表達(dá)為平均±SEM。TGX-286以劑量依賴的方式抑制血小板粘著的能力，當(dāng)將血小板用10、25和50nMTGX-286預(yù)處理時(shí)，顯示51、67和86％的血小板粘著降低。
實(shí)施例10.富含血小板的血漿的CD9-抗體引起的血小板聚集在富含血小板的血漿(PRP)中確定TGX286和KN327對(duì)由抗體CD9引起的血小板聚集的作用。將PRP懸浮液用20-100nM TGX286或?qū)φ站彌_液(0.1％DMSO)培養(yǎng)，然后用抗體可分量處理。在4通道的集合度計(jì)中對(duì)攪拌下的聚集監(jiān)測(cè)10分鐘。把聚集水平作為光線透射通過樣本細(xì)胞中的變化測(cè)量。IC50濃度推導(dǎo)為PRP聚集受到50％抑制的試驗(yàn)化合物的濃度。
全血流動(dòng)測(cè)定由于通過洗滌的血小板形成的血栓小而且不易再生，所以用全血流動(dòng)測(cè)定來確定TGX-286對(duì)血小板血栓形成的抑制作用。在以1800s-1的剪切速率灌注通過vWf包衣的玻璃微載玻片2分鐘之前，將抗凝的全血用50、100、或200nM TGX-286或?qū)φ站彌_液(0.1％DMSO)培養(yǎng)30分鐘并附以輕輕搖晃。通過在1800s-1下洗滌10分鐘除去未粘著的血小板，然后用1％草酸銨將粘著的紅血球溶解。通過用分光光度測(cè)定法測(cè)量整體細(xì)胞溶解物的血小板LDH(U/L)水平，直接測(cè)量血栓形成水平。全血灌注2分鐘后，在微載玻片的表面上觀察到富含血小板的血栓。用TGX-286預(yù)處理以劑量依賴的方式在vWf區(qū)域抑制血小板血栓形成的能力。相對(duì)于對(duì)照，用50、100和200nM TGX-286預(yù)處理全血，導(dǎo)致血栓形成降低25、53和80％實(shí)施例11.頸內(nèi)動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物模型在適當(dāng)建立的Folts等人，1982，Circulation 65248-255的動(dòng)脈血栓動(dòng)物模型中，確定TGX-286的抑制作用。這種模型用于研究體內(nèi)抗凝血藥物對(duì)響應(yīng)壓碎損傷繼之以動(dòng)脈狹窄的凝固時(shí)間的影響。
把麻醉的大鼠的頸動(dòng)脈解剖出來，將電磁流動(dòng)探針圍繞動(dòng)脈置放以測(cè)量血流。緊靠流動(dòng)探針，將動(dòng)脈用包裹以硅膠管的手術(shù)鉗夾住以對(duì)血管壁引起中度損害。將結(jié)扎線或適當(dāng)內(nèi)徑的塑料筒圍繞動(dòng)脈束緊以產(chǎn)生動(dòng)脈直徑的70％減少。
血小板在狹窄的損傷的動(dòng)脈血管區(qū)域聚集，逐漸形成閉塞性血小板血栓，視作血流方面的減少。當(dāng)血栓形成時(shí)，血壓升高，在靠近狹窄部位引起血栓破裂和栓塞發(fā)生。如果血栓沒有自然發(fā)生栓塞，將狹窄區(qū)域輕輕搖動(dòng)以使血栓移動(dòng)。這引起血流的突然恢復(fù)。血小板在狹窄區(qū)域再次聚集并損害動(dòng)脈血管，重復(fù)血栓-栓塞形成模式。這種劇烈的以血小板為媒介的血栓形成繼之以栓塞發(fā)生，在血流中造成循環(huán)流動(dòng)減少(CFR)。一旦大鼠產(chǎn)生經(jīng)常性的CFR，經(jīng)由頸靜脈給藥抗血栓形成化合物或載體對(duì)照。
以2.5mg/kg和4mg/kg的劑量經(jīng)由靜脈給藥TGX-286或KN327，并記錄血流穩(wěn)定性。以14.0mg/kg給藥的TGX-286和KN327在10分鐘內(nèi)使80％的治療動(dòng)物恢復(fù)基線，表示該化合物在治療冠狀動(dòng)脈閉塞方面有效。
實(shí)施例12.TGX-286和KN-327對(duì)于在流動(dòng)下血小板血栓形成的影響在37℃將加檸檬酸鹽的全血用50、100或200nM TGX-286、KN-327或?qū)φ站彌_液(0.1％DMSO)預(yù)處理10分鐘。以600s-1將血液灌注通過von Willebrand因子-(vWf)包被的微毛細(xì)管2分鐘。通過以600s-1灌注緩沖液2分鐘除去未粘著的細(xì)胞，通過用1％草酸銨處理將任何粘著的紅血球溶解。然后通過加入1％Triton X-100將粘著的血小板溶解，并用分光光度測(cè)定法分析乳酸脫氫酶(LDH)水平(U/L)。與對(duì)照相比，用50、100、200nM TGX-286預(yù)處理全血導(dǎo)致血栓形成的降低。
實(shí)施例13.同種型選擇性的體外PI3K酶測(cè)定進(jìn)行體外酶測(cè)定作為確定藥物的選擇同種型的親合性和特異性的primary screen。用得自Santa Cruz Biotechnology的能夠識(shí)別p100α(sc-7174)和β(sc-603)同種型的抗體，將PI3K的α和β同種型從血小板溶胞產(chǎn)物中免疫沉淀出來。在Kinacia實(shí)驗(yàn)室γ同種型是作為重組體蛋白質(zhì)制得的。以類似的方法，用δ特異抗體(sc-7176)從THP-1細(xì)胞中免疫沉淀出δ同種型。在有或沒有抑制劑的情況下，用使用磷脂酰肌醇和32p的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化作用分析，測(cè)量酶在免疫沉淀中的活性。在抑制劑濃度的一定范圍中確定酶的活性來確定IC50值。
PI3激酶抑制劑LY294002(8-苯基-2-(4-嗎啉基)-4H苯并吡喃-4-酮、Sigma & num；L9908)抑制PI3K的各種同種型的IC50，與先前報(bào)道的值(0.5-1.5pM相同。
實(shí)施例14.嗜中性白細(xì)胞ROS響應(yīng)由人血液制備白血球把3ml無防腐劑的全血放入50ml錐管中。在25℃下加入48ml紅血球溶解液并在血液學(xué)nutator上逆向輕輕混合10分鐘，隨后在桌面離心機(jī)中25℃下以350×g離心分離10分鐘。把富含白血球的丸再懸浮于補(bǔ)充以10％w/v凝膠(PBS-凝膠)的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，并如上面所述進(jìn)行分離。將白血球丸用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗滌一次，以2×106/ml的最終細(xì)胞數(shù)再懸浮并立即使用。
測(cè)量得自嗜中性白細(xì)胞的ROS產(chǎn)生反應(yīng)性氧類(ROS)的產(chǎn)生是嗜中性白細(xì)胞活性的標(biāo)志。若干趨化因子和細(xì)胞因子通過嗜中性白細(xì)胞促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。測(cè)量用趨化肽刺激后的PI3K抑制劑TGX-286對(duì)ROS產(chǎn)生的作用。經(jīng)由熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)，通過修改Robinson等人，(pp 9.7.5-9.7.9，Curr.Protocols in Cytometry(1997))的方法，監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氫羅丹明123(DHR)的氧化，來測(cè)量ROS的產(chǎn)生。將白血球懸浮液松散負(fù)載以2μl 50mM DHR/ml細(xì)胞(最終是50mM)，并在37℃下培養(yǎng)12分鐘。將500℃可分量的DHR負(fù)載的細(xì)胞用5μl 100uM fmlp作用液在37℃下刺激20分鐘，并隨后在冰上猝滅。使用用于DHR散發(fā)的520±20nm通帶將流式細(xì)胞儀設(shè)定為激發(fā)波長(zhǎng)為488nm。使用未刺激的對(duì)照樣本來鑒別和門控嗜中性白細(xì)胞種群并經(jīng)由抗-CD14免疫染色校正。用這些門控對(duì)照白血球校正熒光基線數(shù)據(jù)。分析刺激細(xì)胞樣本，并且對(duì)每一樣本的5000門控白血球監(jiān)測(cè)綠色熒光(DHR)。為了測(cè)量ROS的相對(duì)值，將由對(duì)照樣本獲得的值從總數(shù)值中減去，并歸一化至由單獨(dú)的fmlp樣本(無抑制劑)獲得的值。
實(shí)施例15.嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶釋放由人血液制備嗜中性白細(xì)胞將等份試樣(24ml)的得自健康志愿者的肝素化血液鋪在Histopaque-119和Histopaque-1077(Sigma)的12ml墊上，然后在25℃以700×g離心分離30分鐘。收集Histopaque-119墊正上面的富含嗜中性白細(xì)胞的條帶并用HBSS洗滌。用0.2％NaCl通過低滲溶胞作用除去殘余紅血球。將嗜中性白細(xì)胞標(biāo)本用HBSS洗滌兩次并立即使用。
嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶胞吐作用的測(cè)定激活的嗜中性白細(xì)胞通過釋放一定的蛋白酶對(duì)一系列刺激物作出反應(yīng)而，而這種蛋白酶在發(fā)炎過程中是造成組織和胞外基質(zhì)破壞的主要原因。作為蛋白酶釋放的指示，測(cè)量TGX-286對(duì)嗜中性彈性蛋白酶胞吐作用。通過修改Ciesla等人，(The Journal of Trauma，48(3)388-395(2000))的方法，對(duì)彈性蛋白酶胞吐作用予以量化，如下所述。通過裂解特異彈性蛋白酶基質(zhì)AAPV-pNA來測(cè)量嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放。將分離的嗜中性白細(xì)胞(6.25×105細(xì)胞)在37℃下預(yù)培養(yǎng)5分鐘，然后用0.11M fmlp刺激20分鐘。隨后將細(xì)胞懸浮液以400×g離心作用5分鐘，然后抽出所得上清液并保留之。
通過向96孔微板上的、含有0.33mM特異彈性蛋白酶生色底物AAPV-pNA在33.3mM羥基亞乙基哌嗪乙磺酸鹽和0.17mM NaCl中的混合物的單個(gè)孔中加入100μl沒有細(xì)胞的上清液，測(cè)定彈性蛋白酶的釋放?？湛滓埠袕椥缘鞍酌敢种苿〢APV-CK(0.17mM)?？偡磻?yīng)體積為150μL，每個(gè)試驗(yàn)用單獨(dú)的AAPV-CK空白以一式兩份進(jìn)行。將96孔平板在37℃下培養(yǎng)60分鐘，并測(cè)量在405nm的吸光度。為了測(cè)量彈性蛋白酶的相對(duì)釋放率，將得自對(duì)照樣本的數(shù)值從總值中減去，并歸一化至由單獨(dú)的fmlp樣本(無抑制劑)獲得的數(shù)值。
實(shí)施例16.細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)定TGX-286對(duì)U937(單核)細(xì)胞系的抗增殖活性。持續(xù)4天通過計(jì)算細(xì)胞數(shù)目監(jiān)測(cè)化合物的細(xì)胞毒性，并用代謝活動(dòng)的比色測(cè)定來測(cè)定細(xì)胞的生存能力。
試驗(yàn)化合物在每一生物活性中的抑制劑濃度(nM)列于下面表II。
表II
表III
制劑實(shí)施例實(shí)施例1.含有吡啶取代的化合物的藥物組合物的制備和給藥本發(fā)明某些優(yōu)選的藥物制劑描述如下。
用于口服給藥的片劑用于口服給藥的片劑的組分列于下面表IV中。片劑A、B和C是這樣制得的將表IV中列出的前6種組分與聚乙烯吡咯烷酮一起進(jìn)行濕式制粒，然后加入硬脂酸鎂，隨后壓片。
用于舌下給藥的片劑
用于舌下給藥的兩種片劑的組分列在下面表V中。片劑A和B是這樣制得的將表V中列出的前6種組分與聚乙烯吡咯烷酮一起進(jìn)行濕式制粒，然后加入硬脂酸鎂，隨后壓片。
用于頰給藥的片劑用于頰給藥的片劑是這樣制得的將下面表VI中列出的組分混合，然后將混合的組分直接壓片。
粉末填充的膠囊劑兩種粉末填充的膠囊劑的組分列在下面表VII中。膠囊A和B是這樣制得的將組分混合，用所得混合物填充兩半式硬明膠膠囊。
液體填充的膠囊劑兩種液體填充的膠囊劑的組分列在下面表VIII中。膠囊A是這樣制得的將Macrogol 4000BP熔化，把活性組分分散在該熔化物中，用其填充兩半式硬明膠膠囊。膠囊B是這樣制得的將活性組分分散在卵磷脂和花生油中，用所得分散液填充軟的彈性明膠膠囊。
控釋膠囊劑用于控釋的膠囊劑是這樣制得的將下面表IX中列出的前4種組分混合和擠出，將所得擠出物球化和干燥。將干燥的小丸用作為控釋膜的乙基纖維素包衣，將所得小丸填充到兩半式硬明膠膠囊中。
靜脈內(nèi)給藥用制劑含有下面表X中列出的組分的靜脈內(nèi)給藥用制劑是這樣制得的將活性組分置于檸檬酸鹽緩沖液中，然后用鹽酸將該溶液的pH調(diào)節(jié)至pH 7。將所得溶液補(bǔ)足至所要的體積，然后經(jīng)由微孔濾器過濾到密封的無菌玻璃瓶中，填充后再次密封。
鼻內(nèi)給藥用制劑含有下面表XI中列出的組分的鼻內(nèi)給藥用制劑是這樣制得的將活性組分置于羥基苯甲酸鹽的混合物中，用在檸檬酸鹽緩沖液中的鹽酸將所得溶液的pH調(diào)節(jié)至pH 7。將所得溶液補(bǔ)足至所要的體積，然后經(jīng)由微孔濾器過濾到密封的無菌玻璃瓶中，填充后再次密封。
肌內(nèi)注射用制劑含有下面表XII中列出的組分的肌內(nèi)注射用制劑是這樣制得的將活性組分溶解在Glycofurol中。然后加入苯甲醇并溶解，加入水至最終體積為3ml。然后將該混合物經(jīng)由微孔濾器過濾到密封的無菌玻璃瓶中，填充后再次密封。
糖漿劑含有在下面表XIII中列出的組分的糖漿劑是這樣制得的將苯甲酸鈉溶解在一部分純化水中，然后加入山梨醇溶液。加入活性組分并溶解。然后將所得溶液與甘油混合，用純化水補(bǔ)足至所要的體積。
栓劑含有在下面表XIV中列出的組分的栓劑是這樣制得的將五分之一Witepsol在蒸汽夾套的鍋內(nèi)于45℃的最高溫度熔化。然后將活性組分經(jīng)由200μm篩網(wǎng)過篩，使用裝配有切頭的Silverson混合器與熔化的基質(zhì)混合，直至獲得平滑的分散液。保持45℃的溫度，向懸浮液中加入其余Witepsol H15，將其攪拌以保證均勻混合。然后將整個(gè)懸浮液過250μm不銹鋼篩網(wǎng)，在持續(xù)攪拌下冷卻至40℃。在38-40℃的溫度下，將2.0g等份試樣的混合物填充到合適的塑料模子內(nèi)。讓所得栓劑冷卻至室溫。
1所用的活性組分是粉末，其中至少90％顆粒的直徑為63μm或更低。
氣霧劑含有在下面表XV中列出的組分的氣霧劑是這樣制得的將活性化合物與乙醇混合，加入注射用水。然后將該溶液加到一部分Propellant 22中，冷卻至-30℃，并轉(zhuǎn)移到填充裝置中。然后將所需量進(jìn)料到不銹鋼容器中，用其余推進(jìn)劑稀釋。然后將閥門裝配到容器上。
子宮托制劑子宮托制劑是通過將在下面表XVI中列出的組分直接混合而制得的。子宮托是通過將所得混合物壓縮而制得的。
1所用的活性組分是粉末，其中至少90％顆粒的直徑為63μm或更低。
權(quán)利要求
1.瓦解在高剪切狀態(tài)下發(fā)生的血小板聚集以及粘著的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI3-激酶抑制劑。
2.抗血栓形成的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的選擇性PI3-激酶β抑制劑，條件是所述抑制劑不是式(II)化合物 其中，R是H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1是H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR3)n-芳基、NR3-C1-C6烷基、NR3-環(huán)烷基、NR3-(CHR3)n-芳基、(CHR3)n-NR3-烷基、(CHR3)n-NR3-環(huán)烷基、(CHR3)n-O-芳基、(CHR3)n-O-烷基、(CHR3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR3)n-芳基、S-(CHR3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1、或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR3、NHSO2R3、CONHR3或SO2NHR3；并且R3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基但是選自下列的式(II)化合物除外9-(3-吡啶基甲基)氧基-2-嗎啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-140)；7-甲基-9-苯基氨基甲基-2-嗎啉基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-183)；8-(4-甲基苯基)2-)4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-113)；8-(4-氟苯氧基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-121)；2-嗎啉基-8-(苯基甲基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-90)；2-(4-嗎啉基)-8-(4-氟-2-甲基苯基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-184)；9-[[(2-氯苯基)-甲基]氨基-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-167)；9-[[(2-甲氧基苯基)-甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-137)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[(苯基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-126)；9-[[(4-氟-2-甲基苯基)氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-170)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[[(1R)-l-苯基乙基]氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-123)；7-甲基-2-(4-嗎啉基)-9-[(2-吡啶基甲基)氨基]-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-161)；9-[[(4-氯苯基)甲基]氨基]-7-甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-108)；2-(4-嗎啉基)-9-(苯基甲基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-040)；7-甲基-9-(N-甲基-N-苯基)氨基甲基-2-(4-嗎啉基)-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；2-(4-嗎啉基)-8-(苯基甲基)氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-102)；2-(4-嗎啉基)-8-(苯基甲基)氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-204)；2-(4-嗎啉基)-8-苯基氨基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-324)；8-(3-氯苯基)氧基-2-(4-嗎啉基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-259)；8-(3-甲基苯基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-127)；8-(2-氟苯基)-2-(4-嗎啉基)-4(1H)-喹諾酮(TGX-143)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(3-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-304)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述選擇性PI3-激酶β抑制劑是式(I)化合物 其中R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基、或芳基或(CH2)n-芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR；X是C或N，且Y是N或O。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述選擇性PI3-激酶β抑制劑是式(III)化合物 其中X和Y分別是C和O，或分別是C和NH，或都是N；R是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1、R2和R3獨(dú)立地為H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’3)n-芳基、NR’3-C1-C6烷基、NR’3-環(huán)烷基、NR’3-(CHR’3)n-芳基、(CHR’3)n-NR’3-芳基、(CHR’3)n-NR’3-烷基、(CHR’3)n-NR’3-環(huán)烷基、(CHR’3)n-O-芳基、(CHR’3)n-O-烷基、(CHR’3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR’3)n-芳基、S-(CHR’3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R’3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR’3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’3、NHSO2R’3、CONHR’3或SO2NHR’3；并且R’3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
5.具有式(III)的化合物 其中X和Y分別是C和O，或分別是C和NH，或都是N；R是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、芳基或(CH2)n-芳基；R1、R2和R3獨(dú)立地為H、OH、F、Cl、Br、I、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、CH＝CH-芳基、C≡C-芳基、(CHR’3)n-芳基、NR’3-C1-C6烷基、NR’3-環(huán)烷基、NR’3-(CHR’3)n-芳基、(CHR’3)n-NR’3-芳基、(CHR’3)n-NR’3-烷基、(CHR’3)n-NR’3-環(huán)烷基、(CHR’3)n-O-芳基、(CHR’3)n-O-烷基、(CHR’3)n-O-環(huán)烷基、O-(CHR’3)n-芳基、S-(CHR’3)n-芳基或CO-芳基，其中n是0、1或2，且所述烷基、環(huán)烷基或芳基任選被以下基團(tuán)取代F、Cl、Br、I、CN、CO2H、CO2R’3、NO2、CF3、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCF3、OR’3、OSO2-芳基、取代或未取代的胺、NHCOR’3、NHSO2R’3、CONHR’3或SO2NHR’3；并且R’3是H、或取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基。
6.權(quán)利要求2的方法，所述方法包括施用式(I)的2-嗎啉代取代的衍生物，其中R是H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R1是H、OH、OCH3、OCF3、F、Cl、CF3、C1-C6支鏈或直鏈烷基；R2是R或S構(gòu)型的H、C1-C6支鏈或直鏈烷基或芳基；R3是一個(gè)或多個(gè)H、F、Cl、Br、CN、CO2H、CO2R、NO2、CF3、支鏈或直鏈C1-C6烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OR、取代或未取代的胺、NHCOR、NHSO2R、CONHR或SO2NHR；X是C或N，并且Y是N或O。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所施用的抑制劑選自(±)-7-甲基-9-{[甲基(苯基)氨基]甲基}-2-嗎啉-4-基吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-195)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-221)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(4-氟苯基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-224)；(±)-9-[1-(3，4-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-237)；(±)-9-[1-(2，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-238)；(±)-9-[1-(3，5-二氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-239)；(±)-9-[1-(4-氟-2-甲基苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-240)；(±)-9-[1-(4-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-243)；(±)-9-[1-(3，4-二氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-244)；(±)-9-[1-(3-氟苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-247)；(±)-9-[1-(3-氯苯基氨基)乙基]-7-甲基-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-248)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(2-噻唑基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-261)；(±)-7-甲基-9-[1-(3-甲基苯基氨基)乙基]-2-嗎啉-4-基-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-262)；(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(3-三氟甲基苯基氨基)乙基]-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-264)；和(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-[1-(2-吡啶基氨基)乙基]吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(TGX-295)；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸(KN-309)；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯(KN-321)；(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)芐腈(KN-320)；(±)-7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮(KN-325)；(±)-2-(4-嗎啉基)-8[1-(苯基氨基)乙基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮(TGX-280)。
8.權(quán)利要求5的化合物，其中R1選自CH3、C2H5、
9.權(quán)利要求5的化合物，其中R是甲基，且R1是
10.權(quán)利要求5的化合物，其中R是甲基，且R1是
11.權(quán)利要求5的化合物，其中R是甲基，且R1是
12.權(quán)利要求5的化合物，其中R是H，且R1是
13.權(quán)利要求5的化合物，其中R是H，且R1是
14.一種抑制患者中的磷酸肌醇3-激酶的方法，所述方法包括向患者給藥一定量的能有效抑制患者中磷酸肌醇3-激酶的權(quán)利要求5的化合物。
15.預(yù)防或治療心血管疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求5的化合物。
16.預(yù)防或治療呼吸疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求5的化合物。
17.預(yù)防或治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求5的化合物。
18.預(yù)防或治療與白細(xì)胞功能障礙有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求5的化合物。
19.權(quán)利要求2的方法，其中所施用的抑制劑是
20.權(quán)利要求4的方法，其中所施用的抑制劑是6-甲基-8-[1-(苯基氨基)乙基]-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
21.權(quán)利要求4的方法，其中所施用的抑制劑是6-甲基-8-{1-[(2-氨基苯基)氨基]乙基}-2-(4-吡啶基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
22.化合物(±)-7-甲基-2-嗎啉-4-基-9-(1-苯基氨基乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。
23.化合物(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸。
24.化合物(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)芐腈。
25.化合物(±)-2-({1-[7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1，2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸甲酯。
26.化合物(±)-7-甲基-2-(嗎啉-4-基)-9-(1-{[2-(2H-四唑-5-基)苯基]氨基}乙基)吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸肌醇(PI)3－激酶β的選擇性抑制劑，所述選擇性抑制劑在抗血栓形成療法中的應(yīng)用，以及通過檢測(cè)化合物的PI 3－激酶β的選擇性抑制活性來篩選可用于新的抗血栓形成療法的化合物的方法。
文檔編號(hào)C07D405/04GK1688575SQ03824362
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者S·P·杰克遜, A·D·羅伯遜, V·肯切, P·湯普遜, H·普拉巴哈蘭, K·安德遜, B·阿博特, I·貢卡爾夫斯, W·內(nèi)斯比特, S·舍恩維爾德, D·賽利克 申請(qǐng)人:基納西亞股份有限公司