專利名稱：被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血清穩(wěn)定性或體內循環(huán)半衰期被提高的治療性蛋白或肽以及可溶的毒素受體片段，它們被融合或插入到被修飾以減少或抑制糖基化、鐵結合和/或轉鐵蛋白受體結合的轉鐵蛋白分子上。特別地，本發(fā)明包括被融合到或插入到轉鐵蛋白分子或被修飾的轉鐵蛋白分子上的IFN-β、GLP-1、EMP1和T-20。本發(fā)明還包括抗毒素融合蛋白，其包含被融合到或插入到轉鐵蛋白分子或被修飾的轉鐵蛋白分子上的突觸結合蛋白1的片段。
背景技術：
天然狀態(tài)下的或者重組制備的治療性蛋白和肽通常是不穩(wěn)定的分子，具有短的血清穩(wěn)定性周期或者短的體內循環(huán)半衰期。此外，當這些分子被配制特別是在水溶液中用于診斷和治療目的時，通常是非常不穩(wěn)定的。
只有極少數(shù)實用辦法可以被用于延長或提高蛋白的治療性分子的體內或體外穩(wěn)定性。聚乙二醇(PEG)是可以結合到蛋白質上的物質，從而使該蛋白質具有長期、持續(xù)的活性。如果蛋白質活性通過結合到PEG上被延長，那么就可以降低施用該蛋白質的頻率。但是，PEG結合常常降低或破壞蛋白質的治療活性。在有些情況下，PEG結合會降低蛋白質的免疫原性，而在其它情況下可能提高其免疫原性。
還可以通過融合到能夠延長治療性蛋白質的體內循環(huán)半衰期的蛋白質上來穩(wěn)定治療性蛋白質或肽。例如，與處于未被融合狀態(tài)下的治療性蛋白質相比，被融合到白蛋白或抗體片段上的治療性蛋白質的體內循環(huán)半衰期被延長，參見美國專利5,876,969和5,766,883。
另一種血清蛋白，糖基化的人轉鐵蛋白(Tf)也已經(jīng)被用于與治療性蛋白質一起融合，來靶向遞送到細胞內部或用于攜帶試劑跨越血腦屏障。通過將全長Tf融合到因子上，這些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已經(jīng)被用于引導神經(jīng)生長因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)跨越血腦屏障，參見美國專利5,672,683和5977,307。在這些融合蛋白中，該分子的Tf部分被糖基化并結合兩個鐵原子，鐵原子是Tf結合到細胞上的受體所需的，并且如這些專利的發(fā)明人所述，Tf引導遞送NGF或CNTF跨越血腦屏障。已經(jīng)通過將HIV-1蛋白酶靶向序列插入到糖基化轉鐵蛋白的外露表面環(huán)上，研究制備通過Tf受體靶向遞送到細胞內部的另一種形式的Tf融合物的可能性，已經(jīng)制備了轉鐵蛋白融合蛋白(Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。
血清轉鐵蛋白(Tf)是分子量為80,000道爾頓的單聚體糖蛋白，其在循環(huán)中結合鐵，并通過轉鐵蛋白受體(TfR)將鐵轉運到各種組織中(Aisen等(1980)Ann.Rev.Biochem.49357-393；MacGillivray等(1981)J.Biol.Chem.2583543-3553，美國專利5,026,651)。Tf是最常見的血清分子之一，包含多達約5-10％的總血清蛋白。在酗酒個體的血液中，存在高水平的缺乏糖的轉鐵蛋白，并且這種轉鐵蛋白的半衰期(約14-17天)比被糖基化的轉鐵蛋白(約7-10天)更長。參見van Eijk等(1983)Clin.Chim.Acta 132167-171，Stibler(1991)Clin.Chem.372029-2037(1991)，Arndt(2001)Clin.Chem.47(1)13-27和Stibler等″Carbohydrate-deficient consumption″，Advances in the Biosciences，(Nordmann等編輯)，Pergamon，1988，71，353-357)。
Tf的結構已經(jīng)被充分表征，受體結合、鐵結合及釋放以及碳酸鐵的結合的機制已經(jīng)被闡述(美國專利5,026,651、5,986,067和MacGillivray等(1983)J.Biol.Chem.258(6)3543-3546)。
轉鐵蛋白和結合轉鐵蛋白受體的抗體也已經(jīng)被用于遞送或攜帶毒性試劑到腫瘤細胞中，作為癌癥治療的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且轉鐵蛋白也被用作非病毒性基因治療載體，將DNA遞送到細胞中(Frank等1994；Wagner等1992)。使用轉鐵蛋白作為進入點來將蛋白質遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的能力也已經(jīng)用數(shù)種蛋白質和肽證明，包括CD4(Walus等1996)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(Pardridge等，1994)、神經(jīng)膠質來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Albeck等)、腸道血管(vasointestinal)肽類似物(Bickel等，1993)、β-淀粉狀蛋白肽(Saito等，1995)，以及反義寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，還沒有修飾或遺傳工程化轉鐵蛋白融合蛋白來延長治療性蛋白或肽的體內循環(huán)半衰期，或者通過減少或抑制Tf部分的糖基化或者減少或防止鐵和/或Tf受體的結合來提高生物利用度。
發(fā)明概述如下文的更加詳細的描述，本發(fā)明包括包含至少一種治療性蛋白質、多肽或肽單位(peptide entity)的被修飾的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遺傳工程化來提高該分子的體內循環(huán)半衰期或生物利用度。本發(fā)明還包括包含該融合蛋白的藥物制劑和組合物，通過融合到被修飾的轉鐵蛋白上來延長治療性蛋白質的體內循環(huán)半衰期和生物利用度的方法，編碼被修飾的Tf融合蛋白的核酸分子等。本發(fā)明的另一個方面涉及用被修飾的Tf融合蛋白治療患者的方法。
優(yōu)選地，被修飾的Tf融合蛋白包含人轉鐵蛋白Tf部分，該部分已被修飾以減少或防止糖基化和/或鐵的結合和受體的結合。
本發(fā)明提供包含被融合到或插入到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上的治療性蛋白質的融合蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的治療性蛋白包括β-干擾素(β-IFN)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、EPO(促紅細胞生成素)模擬肽(EMP1)和T-20。
本發(fā)明還提供包含結合毒素的可溶的毒素受體片段的融合蛋白，該片段被融合到或插入到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上。可溶的毒素受體可以是突觸結合蛋白1，而可溶片段是氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
附圖簡介附

圖1顯示人(Hu)轉鐵蛋白(Tf)(SEQ ID NO3)的N-結構域和C-結構域的比對，相似和相同部分突出顯示。
附圖2A-2B顯示來自不同物種的轉鐵蛋白序列之間的比對。淡陰影相似；濃陰影相同(SEQ ID NO84-90)。
附圖3顯示治療性蛋白、多肽或肽的大量Tf表面暴露的插入位點的位置。
附圖4顯示mTf-T20在兩只兔子中的藥物代謝動力學。
詳細描述總體描述本發(fā)明部分地基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以通過將治療性蛋白質基因融合到轉鐵蛋白、被修飾的轉鐵蛋白，或其足以延長治療性蛋白質在血清中的半衰期的部分上來穩(wěn)定治療性蛋白質，以提高治療性蛋白質的體內血清半衰期和/或活性。被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白包括被共價連接到治療性蛋白質或肽上的轉鐵蛋白或者結構域，其中與野生型轉鐵蛋白序列相比，轉鐵蛋白部分被修飾以含有一個或多個氨基酸取代、插入或刪除。在一個實施方案中，Tf融合蛋白被工程化來減少或防止Tf或Tf結構域中的糖基化。在另一個實施方案中，Tf蛋白或Tf結構域被修飾以減少或不結合鐵或碳酸鐵，或者對Tf受體(TfR)的親合力降低或不結合Tf受體。
本發(fā)明包括的治療性蛋白質包括，但是不限于多肽、抗體、肽、或片段或其變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的治療性蛋白包括β-干擾素(β-IFN)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、EPO(促紅細胞生成素)模擬肽(EMP1)和T-20。
本發(fā)明還包括包含被融合到或插入到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白中的可溶的毒素受體片段的抗毒素融合蛋白。優(yōu)選地，可溶的毒素受體的片段結合特定毒素。在一個實施方案中，可溶的毒素受體的片段是突觸結合蛋白1的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
因此，本發(fā)明包括轉鐵蛋白融合蛋白，包含融合蛋白的治療性組合物，和通過施用融合蛋白來治療、預防或緩解疾病或紊亂的方法。本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白包括至少治療性蛋白質的片段或變體和至少被修飾的轉鐵蛋白的片段或變體，它們相互結合在一起，優(yōu)選通過基因融合(即，通過核酸翻譯來生成轉鐵蛋白融合蛋白，其中編碼治療性蛋白質的全部或部分的多核苷酸在讀框內與編碼被修飾的轉鐵蛋白的全部或部分的多核苷酸相連接)或者相互化學偶聯(lián)。一旦治療性蛋白質和轉鐵蛋白是轉鐵蛋白融合蛋白的一部分時，可以被稱作轉鐵蛋白融合蛋白的“部分”、“區(qū)域”或“半分子”(例如“治療性蛋白部分”或者“轉鐵蛋白部分”)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種轉鐵蛋白融合蛋白，其包含或者可選擇地由治療性蛋白質和被修飾的血清轉鐵蛋白組成。在其它實施方案中，本發(fā)明提供一種轉鐵蛋白融合蛋白，其包含或者可選擇地由治療性蛋白質和被修飾的轉鐵蛋白的生物活性和/或治療活性片段組成。在其它實施方案中，本發(fā)明提供一種轉鐵蛋白融合蛋白，其包含或者可選擇地由治療性蛋白質和被修飾的轉鐵蛋白的生物活性和/或治療活性變體組成。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種包含治療性蛋白質以及被修飾的轉鐵蛋白的生物活性和/或治療活性片段的轉鐵蛋白融合蛋白。
除非另外定義，在此所用的所有科學技術術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意義。雖然任何類似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于實施和驗證本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料被描述。
定義如在此所用，轉鐵蛋白序列中的“相應氨基酸”或“等價氨基酸”是通過比對來最大化第一條轉鐵蛋白序列和至少第二條轉鐵蛋白序列之間的相同性和相似性而確定的。用于確定第二條轉鐵蛋白序列中的等價氨基酸的編號是基于用于確定第一條轉鐵蛋白序列中的相應氨基酸的編號。在某些情況下，這些短語被用于描述與兔血清轉鐵蛋白中的特定氨基酸相對的人轉鐵蛋白中的氨基酸殘基。
如在此所用，術語“生物活性”是指治療性分子、蛋白或肽在生物學范圍內(context)(在生物體中或其體外模擬物中)執(zhí)行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保護的融合蛋白的治療性分子部分的功能，例如，但是不限于，誘導從相應細胞系中分泌到細胞外基質，誘導激素分泌，誘導化學向性，誘導有絲分裂，誘導分化，或抑制相應細胞的細胞分裂。如果本發(fā)明的融合蛋白或肽具有其治療性蛋白的天然配對物的一種或多種生物學活性，則融合蛋白或肽被視為具有生物學活性。
如在此所用，“粘合劑”是用于給粉末狀物質賦予粘著性質的試劑。粘合劑，或者有時稱作“成粒劑”，賦予片劑粘著性，確保片劑在被壓縮之后仍保持完整，并且配制具有期望硬度和大小的顆粒來提高流動性。通常被用作結合劑的物質包括淀粉；明膠；糖，例如蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、糖密和乳糖；天然和合成的樹膠(gum)，例如阿拉伯樹膠、藻酸鈉、愛爾蘭苔蘚提取物、panwar膠、ghatti膠、isapol husks膠、羥甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、Veegum、微晶纖維素、微晶葡聚糖、直鏈淀粉和落葉松阿拉伯樹膠等。
如在此所用，術語“載體”是指與組合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者媒介物。這種藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。
如在此所用，“著色劑”是賦予片劑更令人喜歡的外觀，以及在加工過程中幫助生產(chǎn)商控制生產(chǎn)和幫助使用者確定產(chǎn)品的試劑。被批準認證的水溶性FD&C染料的任何一種或其混合物，或者它們的相應色淀可以被用于染色片劑。染色色淀(color lake)是通過將水溶性染料吸附到含水的重金屬氧化物上的組合物，產(chǎn)生不溶形式的染料。
如在此所用，“稀釋劑”是被添加來提高制劑的體積的惰性物質，使得片劑具有用于壓縮的大小。通常所用的稀釋劑包括磷酸鈣、硫酸鈣、乳糖、高嶺土、甘露醇、氯化鈉、干燥淀粉、糖粉、硅石等。
如在此所用，“分解劑”或“分解質”是便于片劑在被施用后崩解或瓦解的物質。在化學上，作為分解質的物質已經(jīng)被劃分成淀粉、粘土、纖維素或樹膠。其它分解劑包括Veegum HV、甲基纖維素、瓊脂、斑脫土、纖維素、和木材制品、天然海綿、陽離子交換樹脂、褐藻酸、guar膠、柑桔果肉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、羥甲基纖維素等。
術語“可分散性”或“可分散的”是指干燥粉末的水分含量小于約10％(重量百分比)重量的水分，通常低于約5％重量和優(yōu)選低于約3％重量；約1.0-5.0pm的塊狀平均直徑(MMD)的顆粒大小，通常1.0-4.0μm MMD和優(yōu)選1.0-3.0μm MMD；遞送劑量約＞30％，通常＞40％，優(yōu)選＞50％和最優(yōu)選＞60％；以及氣霧劑顆粒大小分布為1.0-5.0μm的塊狀平均空氣動力學直徑(MMAD)，通常為1.5-4.5μm MMAD和優(yōu)選1.5-4.0pm MMAD。
術語“干燥”是指組合物具有使顆粒容易分散在吸入裝置中以形成氣霧劑的水分含量。這種水分含量通常低于約10％重量(％w)的水分，通常低于約5％w和優(yōu)選低于約3％w。
如在此所用，“有效量”是指藥物或藥學活性和試劑的含量，其足以在任何藥物治療中以合理的有益/危險比例(benfit/risk ratio)產(chǎn)生期望的局部或系統(tǒng)性效果和性能。
如在此所用，“調味劑”在化學結構上變化很大，從簡單的酯、醇和醛到碳水化合物和復雜的揮發(fā)性油脂。幾乎可以獲得任何類型的合成調味劑。
如在此所用，術語“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf蛋白或其突變體的至少約5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列。
如在此所用，術語“基因”是指與生物學功能相關的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括，但是不限于，編碼序列和/或其表達所需的調控序列?；蜻€可以包括未被表達的DNA片段，例如，構成其它蛋白的識別序列的DNA片段?；蚩梢詮母鞣N來源中獲得，包括從目標來源中克隆得到，或從已知的或預測的序列信息中合成，而且包括具有期望參數(shù)的被設計的序列。
如在此所用，“異源多核苷酸”或“異源核酸”或“異源基因”或“異源序列”或“外源的DNA區(qū)段”是指從特定宿主之外的來源獲得的多核苷酸、核酸或DNA區(qū)段，或者，如果來自相同來源，則被修飾以區(qū)別于其原始形式。宿主細胞中的異源基因包括特定宿主細胞的內在的、但是被修飾的基因。因此，該術語是指細胞的外源或異源的、或者與細胞同源但是存在于該宿主細胞的核酸中的該元件通常不存在的位置上的DNA區(qū)段。作為例子，被連接到人Tf序列上的酵母細胞天然信號序列是異源的。
如在此所用，“被分離的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳確定至少約20％純度，優(yōu)選至少約40％純度，更加優(yōu)選至少約60％純度，甚至更加優(yōu)選約80％純度，最優(yōu)選約90％純度，和甚至最優(yōu)選約95％純度。例如，可以通過在遺傳工程化中將核酸序列從其天然位置重新定位到其將被復制的不同位置上的標準克隆操作來獲得被分離的核酸序列?？寺〔僮骺梢园ㄇ谐头蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將該片段插入到載體分子上，和將重組載體插入到宿主細胞中，在宿主細胞中，核酸序列的多個拷貝或克隆被復制。核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成來源的或它們的任何組合。
如在此所用，當DNA編碼序列被翻譯成多肽時，由于DNA編碼序列之間的讀框內融合，兩條或多條編碼序列被認為“被連接”或“被融合”。當涉及Tf融合時，術語“融合”包括，但是不限于，至少一種治療性蛋白、多肽或肽被連接到Tf的N末端，被連接到Tf的C末端和/或被插入到Tf中的任何兩個氨基酸之間。
如在此所用，“滑潤劑”在片劑加工中具有多種功能的物質，例如提高片劑顆粒的流動率，防止片劑物質附著到?jīng)_模和沖床的表面上、減少顆粒間的摩擦和便于片劑從沖模腔內噴射出來。常用的滑潤劑包括滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸和氫化植物油?；瑵檮┑牡湫秃康姆秶诩s0.1％重量到約5％重量。
如在此所用，“被修飾的轉鐵蛋白”用于此來指與野生型轉鐵蛋白相比，氨基酸序列具有至少一種修飾的轉鐵蛋白分子。
如在此所用，“被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白”被用于此是指通過將至少一個被修飾的轉鐵蛋白分子(或其片段或變體)融合到至少一個治療性蛋白分子(或其片段或變體)上形成的蛋白質。
如在此所用，術語“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特別限定，該術語包括含有與參比核酸具有類似結合特性的天然核苷酸的類似物的核酸，并且以與天然核苷酸相似的方式被代謝。除非另外指出，特定核酸序列還暗指包括其保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補序列以及被明確指定的序列。特別地，簡并密碼子取代可以通過生成其中一個或多個所選擇(或全部的)密碼子的第三個位置用混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基取代的序列(Batzer等(1991)NucleicAcid Res.195081；Ohtsuka等(1985)J.Biol.Chem.2602605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol.Cell.Probes 891-98)。術語核酸與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。
如在此所用，當DNA區(qū)段與另一種DNA區(qū)段處于功能性聯(lián)系中，則被稱作是“被可操作地連接的”。例如，信號序列的DNA以參與融合蛋白分泌的前蛋白(preprotein)被表達時，則其被可操作地連接到編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA上；如果啟動子或增強子刺激序列的轉錄，則被可操作地連接到編碼序列上。一般地，被可操作地連接的DNA序列是相鄰的，并且在為信號序列或融合蛋白的情況下，為相鄰的并在讀框內。但是，增強子與轉錄被其所控制的編碼序列可以不必是相鄰的。在本文中，連接是通過在便利的限制性位點連接或在被插入到該位置上的連接物或接頭上進行連接來完成。
如在此所用，“藥學上可接受”是指生理學上耐受的物質和組合物，并且通常在被施用給人時不會產(chǎn)生過敏的或類似不適的反應例如反胃、頭昏眼花等。一般地，如在此所用，術語“藥學上可接受的”是指被聯(lián)邦管理機構或政府部門認可的或被列舉在美國藥典或其它用于動物特別是人的被公認的藥典中的。
如在此所用，“藥學上的有效量”是被遞送給個體來產(chǎn)生期望緩解或治療作用的含量。該含量特定于各種藥物，是其最終的被認可的劑量水平。
如在此所用，術語“粉末”是指由極細的分散固體顆粒組成的組合物，這些顆粒是流動的并且容易分散在吸入裝置中，隨即被個體吸入，使得顆粒到達肺部以滲透進入肺泡中。因此，該粉末被認為是“可吸入的”。優(yōu)選平均顆粒大小為直徑小于約10微米(μm)，具有相對一致的半球形分布。更加優(yōu)選地，直徑小于約7.5μm和最優(yōu)選小于約5.0μm。通常，顆粒大小分布在直徑約0.1μm和約5pm之間，特別在約0.3μm到約5μm之間。
如在此所用，術語“啟動子”是指涉及結合RNA聚合酶來起始轉錄的DNA區(qū)域。
如在此所用，術語“重組體”是指已經(jīng)用基因或DNA的新組合轉化的細胞、組織或生物體。
如在此所用，術語“個體”可以是人、哺乳動物或動物。被治療的個體是需要治療的患者。
如在此所用，靶向單位、蛋白質、多肽或肽是指特異地結合到特定細胞類型上[正常(例如，淋巴細胞)或異常例如(癌細胞)]的分子，因而可以被用于將Tf融合蛋白或化合物(藥物或細胞毒性劑)特異地靶向該細胞。
如在此所用，“片劑”是含有藥物固體藥學制劑形式，有或沒有合適的稀釋劑，通過本領域知曉的壓縮或模鑄方法來制備。片劑從19世紀后期開始被廣泛地使用，隨后繼續(xù)被普及。由于片劑給生產(chǎn)商(例如，生產(chǎn)簡單而經(jīng)濟，穩(wěn)定，包裝、運輸和分發(fā)方便)和患者(例如用量精確、簡潔、可攜帶、味覺柔和，以及容易施用)都帶來好處，仍然是一種流行的制劑形式。雖然，片劑最通常為鐵餅狀的，也可以是圓形的、卵形的、長方形的、圓柱形的或三角形的。它們可以在大小和重量上顯著區(qū)別，取決于所含藥物的含量和特定的施用方法。它們被劃分成兩種常規(guī)類型，(1)壓縮片劑和(2)模鑄片劑或片劑粉末。除了活性或治療性成分，片劑含有大量惰性材料或添加劑。第一組這種添加劑包括那些有助于賦予制劑令人滿意的壓縮特性的材料，包括稀釋劑、結合劑和滑潤劑。第二組這種添加劑有助于賦予已經(jīng)制備的片劑其它期望物理特性，例如分解劑、著色劑、調味劑和甜味劑。
如在此所用，術語“治療有效量”是指包含治療性分子的轉鐵蛋白融合蛋白的含量，當被施用給需要此的個體時，足以達到治療目的。構成“治療有效量”的轉鐵蛋白融合蛋白的含量將會隨著所用的治療性蛋白質、病癥或疾病的嚴重性、被治療個體的年齡和體重而變化，這可通過本領域普通技術人員根據(jù)自己的知識和本公開常規(guī)地確定。
如在此所用，“治療性蛋白質”是指蛋白質、多肽、肽或片段或其變體，具有一種或多種治療性和/或生物學活性。包含在本發(fā)明的治療性蛋白質包括但是不限于蛋白質、多肽、肽和抗體以及生物制劑。術語肽、蛋白質和多肽在此被相互交換使用。此外，術語“治療性蛋白質”是指治療性蛋白質的內在的或天然的相關物(correlate)。“治療活性”的多肽或具有“治療活性的”蛋白質是指具有一種或多種已知的與治療性蛋白質相關的生物學的和/或治療性活性的多肽，治療性蛋白質例如在此公開或本領域另外知曉的一種或多種治療性蛋白質。作為非限制性例子，“治療性蛋白質”是用于治療、預防或緩解疾病、病癥或紊亂的蛋白質。這種疾病、病癥或紊亂可以是人或非人類動物患有的，例如獸醫(yī)用途。
在此所用，術語“毒素”是指生物學來源的毒性物質。
如在此所用，術語“轉化”是指核酸(即核酸聚合物)轉移到細胞中。如在此所用，術語“遺傳轉化”是指DNA特別是重組DNA轉移和結合到細胞中。
如在此所用，術語“轉化體”是指已經(jīng)轉化的細胞、組織或生物體。
如在此所用，術語“轉基因”是指以確保其功能的方式被插入到生物體、宿主細胞或載體中的核酸。
如在此所用，術語“轉基因的”是指細胞、細胞培養(yǎng)物、生物體、細菌、真菌、動物、植物，它們的任何一種的后代，通過各種轉化方法之一接受外源的或被修飾的基因，特別是編碼被修飾的Tf融合蛋白質的基因，其中外源的或被修飾的基因來自與接受外源的或被修飾的基因的生物體種類相同或不同的種類。
“變體”是指不同于參比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，變體大體上是非常相似的，并且在許多區(qū)域與參比核酸或多肽相同。如在此所用，“變體”是指本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分，其序列區(qū)別于天然治療性蛋白質，但是保留至少其一種本文別處或本領域另外知曉的功能的和/或治療的特性。
如在此所用，術語“載體”泛指任何編碼外源核酸的質粒、噬菌?；虿《?。該術語還被解釋為包括非質粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便將核酸轉移到病毒子或細胞中，例如，多溶素(polylysine)化合物等。載體可以是適合作為將核酸或其突變體遞送給細胞的遞送媒介的病毒載體，或者該載體可以是適用于相同目的的非病毒載體。用于將DNA遞送給細胞和組織的病毒和非病毒載體的例子在本領域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746)中。病毒載體的例子包括，但是不限于，重組痘病毒載體、重組腺病毒、重組逆轉錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組鳥痘病毒等(Cranage等1986，EMBO J.53057-3063；1994年8月18日公開的國際專利申請WO 94/17810；1994年10月27日公開的國際專利申請WO 94/23744)。非病毒載體的例子包括，但是不限于，脂質體、DNA的多胺衍生物等。
如在此所用，術語“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
轉鐵蛋白和轉鐵蛋白修飾本發(fā)明提供包含治療性蛋白質或可溶的毒素受體片段的融合蛋白和轉鐵蛋白，或被修飾的轉鐵蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的治療性蛋白質包括β-IFN、GLP-1、EMP1和T-20。優(yōu)選地，可溶的毒素受體片段是突觸結合蛋白1的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。任何轉鐵蛋白可以被用于制備本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白。
任何轉鐵蛋白可以被用于制備本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白。作為例子，野生型人Tf(Tf)是約75kDa的679個氨基酸的蛋白質(未考慮糖基化)，具有兩個主要的結構域，N(約330個氨基酸)和C(約340個氨基酸)，其似乎來源于基因復制。參見GenBank登錄號NM_001063、XM_002793、M12530、XM_039845、XM_039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，所有這些以及SEQ ID NO1、2和3在此完全引入作為參考。這兩個結構域持續(xù)背離(diverge)，但是保持較高程度的同一性/相似性(附圖1)。
各個N-結構域和C-結構域進一步被分成兩個亞結構域，N1和N2，Cl和C2。Tf的功能是將鐵轉運到機體細胞內。該過程受Tf受體(TfR)的調節(jié)，Tf受體在所有細胞上被表達，特別是在活躍生長的細胞上。TfR識別鐵結合形式的Tf(每個受體結合兩分子Tf)，當TfR/Tf復合物被轉運到內涵體中時，發(fā)生內吞作用，此時局部的pH下降導致被結合的鐵的釋放，以及TfR/Tf復合物再循環(huán)到細胞表面并釋放Tf(未結合鐵的形式稱作為apoTf)。受體結合是通過Tf的C-結構域實現(xiàn)。由于未糖基化的鐵結合Tf不結合受體，C-結構域的兩個糖基化位點似乎不參與受體結合。
每個Tf分子能夠攜帶兩個鐵離子(Fe3+)。它們在N1和N2，C1和C2亞結構域之間的空間內發(fā)生復合，導致分子的構象發(fā)生變化。Tf通過Tf受體跨越血腦屏障(BBB)。
在人的轉鐵蛋白中，鐵結合位點包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Asp63(包括天然Tf信號序列的SEQ ID NO2中的Asp 82)，Asp 392(SEQ ID NO2的Asp 411)，Tyr 95(SEQ ID NO2的Tyr 114)，Tyr 426(SEQ ID NO2的Tyr445)，Tyr 188(SEQ ID NO2的Tyr 207)，Tyr 514或517(SEQ ID NO2的Tyr533或Tyr 536)，His 249(SEQ ID NO2的His 268)和His 585(SEQ ID NO2的His 604)。鉸鏈區(qū)包含至少SEQ ID NO3的N結構域氨基酸殘基94-96，245-247和/或316-318以及C結構域氨基酸殘基425-427，581-582和/或652-658。碳酸鹽結合位點包含至少SEQ ID NO3的氨基酸Thr 120(SEQID NO2的Thr 139)，Thr 452(SEQ ID NO2的Thr 471)，Arg 124(SEQ ID NO2的Arg 143)，Arg 456(SEQ ID NO2的Arg 475)，Ala 126(SEQ ID NO2的Ala 145)，Ala 458(SEQ ID NO2的Ala 477)，Gly 127(SEQ ID NO2的Gly 146)和Gly 459(SEQ ID NO2的Gly 478)。
在本發(fā)明的實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的人轉鐵蛋白，盡管任何動物的Tf分子可以被用于制備本發(fā)明的融合蛋白，包括人Tf變體，奶牛、豬、綿羊、狗、兔、大鼠、小鼠、倉鼠、echnida、鴨嘴獸、雞、青蛙、天蛾幼蟲、猴以及其它種類的牛、犬和鳥類。所有這些Tf序列很容易從GenBank和其它公共數(shù)據(jù)庫中獲得。人Tf核苷酸序列是可獲得的(參見SEQ ID NO1，2和3以及上面描述的登錄號，并且可以從www.ncbi.nlm.nih.gov/獲得)，并用于制備Tf或Tf結構域與所選的治療性分子的基因融合物。還可以從相關分子例如乳鐵傳遞蛋白(乳鐵蛋白)GenBankAccNM002343)或者黑素轉鐵蛋白(melanotransferrin)(GenBankAcc.NM_013900，小鼠黑素轉鐵蛋白)。
黑素轉鐵蛋白是以高含量存在于惡性黑素瘤細胞中的糖基化蛋白質，最早被命名為人黑素瘤抗原p97(Brown等1982，Nature，296171-173)。其與人血清轉鐵蛋白、人乳鐵蛋白和雞轉鐵蛋白具有很高的序列同一性(Brown等1982，Nature，296171-173；Rose等Proe.Natl.Acad.Sci.USA，1986，831261-1265)。但是，與這些受體不同，還沒有確定黑素轉鐵蛋白的細胞受體。黑素轉鐵蛋白可逆地(reversibly)結合鐵，并且以兩種形式存在，其中之一是通過糖基磷脂酰肌糖錨結合到細胞表面上，而另一種形式是可溶的，并且被活躍地分泌(Baker等，1992，F(xiàn)EBS Lett，298215-218；Alemany等，1993，J.Cell Sci.，1041155-1162；Food等，1994，J.Biol.Chem.2747011-7017)。
乳鐵蛋白(Lf)是天然防御的鐵結合蛋白，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥的活性。這些蛋白質以通常暴露于正常菌群中的外分泌物存在乳汁、眼淚、鼻腔分泌物、唾液、支氣管粘液、胃腸道液、子宮頸-陰道粘液和精液。此外，Lf是循環(huán)多形核粒細胞(PMNs)的次級特定顆粒的主要成分。脫輔基蛋白在腐爛區(qū)在PMNs脫顆粒時被釋放。Lf的基本功能是清除液體和發(fā)炎區(qū)域的游離鐵，抑制游離自由基介導的破壞，并降低金屬侵入微生物和贅生性細胞的可獲得性。在成人中的檢測125ILf的轉化率的試驗中，結果表明Lf迅速被肝臟和脾臟吸收，肝臟和脾臟中持續(xù)存在數(shù)周放射性(Bennett等(1979)，Clin.Sci.(Lond.)57453-460)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括轉鐵蛋白剪切變體。在一個實施方案中，轉鐵蛋白剪切變體可以是人轉鐵蛋白的剪切變體。在一個特定實施方案中，人轉鐵蛋白剪切變體可以是Genbank登錄號AAA61140的蛋白。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括乳鐵蛋白的剪切變體。在一個實施方案中，人血清乳鐵蛋白剪切變體可以是嗜中性粒細胞乳鐵蛋白的新剪切變體。在一個特定實施方案中，嗜中性粒細胞乳鐵蛋白剪切變體可以是Genbank登錄號AAA59479的蛋白。在另一個特定實施方案中，嗜中性粒細胞乳鐵蛋白剪切變體可以包含如下氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQ ID NO8)，其包括新的剪切變異區(qū)域。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括黑素轉鐵蛋白變體。
被修飾的Tf融合體可以用任何Tf蛋白、片段、結構域或遺傳工程化結構域來制備。例如，融合蛋白可以用全長Tf序列來制備，含有或不含天然Tf信號序列。Tf融合蛋白還可以用單一的Tf結構域來制備，例如各個N或C結構域或者包含2N或2C結構域的被修飾形式的Tf(參見2002年8月30日申請的美國在先專利申請60/406,977，在此全文引入作為參考)。在一些實施方案中，可以制備治療性蛋白質融合單一的C-結構域上的融合物，其中C-結構域被改變來減少、抑制或防止糖基化。在其它實施方案中，由于Tf糖基化位點存在于其本身的C-結構域和N-結構域上，采用單一的N-結構域是有利的。優(yōu)選實施方案是具有單一N-結構域的Tf融合蛋白，以高水平被表達。
如在此所用，C-結構域或被修飾來作為N-樣結構域的圓形突出部分(lobe)被修飾，具有實質上類似于天然的或野生型的N-結構域或圓形突出部分的糖基化模式或鐵結合特性。在優(yōu)選實施方案中，C-結構域或圓形突出部分被修飾，使得其不被糖基化，并且通過相關C-結構域或氨基酸取代存在于天然的或野生型的N-結構域的相應區(qū)域或位點上的那些氨基酸，而不結合鐵。
如在此所用，包含“兩個N-結構域或圓形突出部分的Tf部分包括Tf分子，Tf分子被修飾來用天然或野生型的N-結構域或圓形突出部分或被修飾的N結構域或圓形突出部分來替換天然的C-結構域或圓形突出部分，或者含有已被修飾從而實質上類似于野生型或被修飾的N結構域起作用的C-結構域。
通過重疊兩個結構域(Swiss PDB Viewer 3.7b2，Iterative Magic Fit)或者通過直接氨基酸比對(ClustalW multiple alignment)來分析兩個結構域，結果表明這兩個結構域相互背離。氨基酸比對表明兩個結構域之間具有42％同一性和59％相似性。但是，由于結構相當，約80％的N-結構域與C-結構域匹配。與N-結構域相比，C-結構域還具有幾個額外的二硫鍵。
N末端和C-結構域的分子模型比對顯示如下結構等同物。

兩個結構域的二硫鍵的排列如下

黑體排列的二硫鍵斜體橋連肽在一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個轉鐵蛋白的N末端圓形突出部分。在還有一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個轉鐵蛋白的N末端圓形突出部分，該轉鐵蛋白來源于人血清轉鐵蛋白。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分至少包括、包含或至少由兩個轉鐵蛋白的N末端圓形突出部分組成，其在至少一個選自SEQ ID NO3上的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188和His249的氨基酸殘基上具有突變。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉鐵蛋白N末端圓形突出部分突變體。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分至少包括、包含或至少由兩個轉鐵蛋白的C末端圓形突出部分組成。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個來源于人血清轉鐵蛋白的C末端圓形突出部分。
在另一個實施方案中，C末端圓形突出部分的突變體在至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一上還包括一個突變，使得不能糖基化。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個轉鐵蛋白的C末端圓形突出部分，該轉鐵蛋白在至少一個選自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體保留結合金屬的能力。在一個可選擇的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個轉鐵蛋白的C末端圓形突出部分，其在至少一個選自SEQ ID NO3上的Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體保留結合金屬的能力。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括至少兩個轉鐵蛋白的C末端圓形突出部分，該轉鐵蛋白在至少一個選自SEQ ID NO3上的Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體不具有結合金屬的能力，并且實質上如同N-結構域那樣起作用。
在一些實施方案中，Tf或Tf部分將具有足夠的長度，以相對于處于未被融合狀態(tài)下的治療性蛋白質或肽或可溶的毒素受體的體內循環(huán)半衰期、血清穩(wěn)定性、體外溶解穩(wěn)定性或生物利用度，提高治療性蛋白質或肽或可溶的毒素受體的體內循環(huán)半衰期、血清穩(wěn)定性、體外溶解穩(wěn)定性或生物利用度。穩(wěn)定性、血清半衰期或生物利用度方面的提高可以比未被融合的治療性蛋白質或肽或可溶的毒素受體約高30％、50％、70％、80％、90％或更高。在某些情況下，包含被修飾的轉鐵蛋白的轉鐵蛋白融合蛋白具有約10-20天或更長，約12-18天或約14-17天的血清半衰期。
當Tf的C-結構域是融合蛋白的一部分時，兩個對應于SEQ ID NO3的N413和N611的氨基酸殘基的N聯(lián)糖基化位點被突變，在酵母系統(tǒng)中表達，以防止糖基化或超甘露糖基化，并延長融合蛋白和/或治療性蛋白質(用于制備唾液酸(sialo)-Tf，或有時為單唾液酸(monosialo)-Tf或雙唾液酸(disialo)-Tf)的血清半衰期。除了對應于N413和N611的Tf氨基酸，突變可以在N-X-S/T糖基化位點內的鄰近殘基上，以防止或實質上減少糖基化。參見Funk等的美國專利5,986,067。已經(jīng)報導，在Pichia pastoris中表達的Tf的N-結構域與單一的己糖在S32上發(fā)生O-聯(lián)糖基化，也在S32上進行突變或修飾來防止這種糖基化。
因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中該轉鐵蛋白的糖基化減少，包括但是不限于唾液酸-、單唾液酸-和雙唾液酸-形式的Tf。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括重組的轉鐵蛋白突變體，其被突變來防止糖基化。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括完全被糖基化的重組轉鐵蛋白突變體。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括被突變來防止糖基化的重組人血清轉鐵蛋白，其中至少SEQ ID NO3的Asn413和Asn611之一被突變成不能進行糖基化的氨基酸。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括被突變來防止或實質上減少糖基化的重組人血清轉鐵蛋白，其中在N-X-S/T糖基化位點中的鄰近殘基進行突變。而且，可以通過突變絲氨酸或蘇氨酸殘基來減少或防止糖基化。此外，已知將X改變?yōu)楦彼峥梢砸种铺腔?br> 如下文更加詳細的討論，本發(fā)明的被修飾的Tf融合蛋白還可以被工程化，以不結合鐵和/或不結合Tf受體。在本發(fā)明的其它實施方案中，保留鐵結合的能力，并且Tf結合鐵的能力被用于將治療性蛋白質或肽遞送到細胞的內部，跨越上皮或內皮細胞膜和/或跨越BBB。這些結合鐵和/或Tf受體的融合蛋白通常被工程化來減少或防止糖基化，以延長治療性蛋白質的血清半衰期。當攜帶鐵時，單獨的N-結構域不會結合到TfR上，并且結合鐵的C-結構域將結合TfR，但是與完整分子的親合性不同。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有一個突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結合金屬離子的能力。在一個可替代實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有一個突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體對金屬離子的結合親合力比野生型血清轉鐵蛋白的低。在一個可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉鐵蛋白更強的對金屬離子的結合親合力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結合轉鐵蛋白受體的能力。在一個可替代實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體對轉鐵蛋白受體的結合親合力比野生型血清轉鐵蛋白的低。在一個可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉鐵蛋白更強的對轉鐵蛋白受體的結合親合力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有一個突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體未保留結合碳酸鹽離子的能力。在一個可替代實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體對碳酸鹽離子的結合親合力比野生型血清轉鐵蛋白的低。在一個可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括具有突變的重組轉鐵蛋白突變體，其中該突變體具有比野生型血清轉鐵蛋白更強的對碳酸鹽離子的結合親合力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括重組人血清轉鐵蛋白突變體，該突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一個氨基酸殘基上具有一個突變，其中該突變體保留結合金屬離子的能力。在一個可替代實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括重組人血清轉鐵蛋白突變體，該突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr514、Tyr517和His585的至少一個氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體結合金屬離子的能力降低。在另一個實施方案中，重組人血清轉鐵蛋白突變體在選自SEQ ID NO3的Asp63、Gly65、Tyr95、Tyr188、His249、Asp392、Tyr426、Tyr517和His585的至少一個氨基酸殘基上具有突變，其中該突變體未保留結合金屬離子的能力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括在SEQID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉鐵蛋白突變體，其中該突變體對金屬離子具有比野生型人血清轉鐵蛋白(參見美國專利5,986,067，其在此被全文引入作為參考)更強的結合親合性。在可選擇的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉鐵蛋白突變體，其中該突變體對金屬離子具有比野生型人血清轉鐵蛋白更弱的結合親合性。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分包括在SEQ ID NO3的Lys206或His207上具有突變的重組人血清轉鐵蛋白突變體，其中該突變體不結合金屬離子。
任何可獲得的技術可以被用于制備本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白，包括但是不限于通常可以獲得的分子技術，例如，那些公開在Sambrook等分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉巷實驗室出版社，1989中的技術。當采用本領域熟知的用于位點特異性誘變的技術進行核苷酸取代時，所編碼的氨基酸的變化優(yōu)選為次要性質(minornature)，也就是說，保守性氨基酸取代，雖然也包括非保守性取代，特別是在制備Tf融合蛋白的被修飾的轉鐵蛋白部分時，例如具有糖基化減少、鐵結合下降等的被修飾的Tf蛋白質。特別可以預期的是氨基酸取代、小片段缺失或插入，通常為1-約30個氨基酸；轉鐵蛋白結構域之間的插入；小的氨基或羧基末端的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基，或者在轉鐵蛋白結構域之間的或者連接轉鐵蛋白與治療性蛋白或肽或可溶的毒素受體的少于50，40，30，20或10個殘基的小接頭肽，或者便于純化的小延伸片段，例如多聚組氨酸序列、抗原性表位或結合結構域。
保守性氨基酸取代的例子為在相同組內進行的取代，例如在堿性氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內進行的取代。
非保守性取代包括用一組氨基酸取代另一組氨基酸。例如，非保守性氨基酸取代將包括用極性氨基酸取代疏水性氨基酸。對于核苷酸取代的一般描述參見，例如Ford等(1991)，Prot.Exp.Pur.295-107。非保守性取代、刪除和插入對于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白是特別有用的，該Tf融合蛋白不或減少與鐵的結合，不或減少與Tf受體的結合和/或不或減少糖基化。
可以通過突變來減少或破壞鐵結合和/或受體結合，包括刪除、取代或插入對應于Tf的N-結構域殘基Asp63、Tyr95、Tyrl188、His249和/或C-結構域殘基Asp392、Tyr426、Tyr514和/或SEQ ID NO3的His585的一個或多個的氨基酸殘基。鐵結合還受到對SEQ ID NO3的氨基酸Lys206、His207或Arg632進行突變的影響。碳酸鹽結合可能通過突變而被減少或破壞，包括刪除、取代或插入對應于Tf的N-結構域殘基Thr120、Arg124、Ala126、Gly127和/或C-結構域殘基Thr452、Arg456、Ala458和/或SEQ ID NO3的Gly459的一個或多個的氨基酸殘基。碳酸鹽結合的減少或破壞不利地影響鐵和/或受體的結合。
與Tf受體的結合可能通過突變被降低或破壞，包括刪除、取代或插入對應于上述對于鐵結合的Tf的N-結構域殘基的一個或多個的氨基酸殘基。
如上所討論，可以通過突變來減少或防止糖基化，包括對對應于圍繞對應于C-結構域殘基N413和/或N611的N-X-S/T位點的Tf的C-結構域殘基的一個或多個的氨基酸殘基(參見美國專利5,986,067)進行刪除、取代或插入。例如，N413和/或N611被突變?yōu)镚lu殘基。
在本發(fā)明的Tf融合蛋白未被修飾來防止糖基化、鐵結合、碳酸鹽結合和/或受體結合的情況下，糖基化、鐵和/或碳酸鹽離子可能從融合蛋白上被剝離或裂解。例如，可獲得的去糖基化酶被用于從融合蛋白上斷裂糖基化殘基，特別是附著到Tf部分上的糖殘基，缺乏糖基化酶的酵母可以被用于防止糖基化和/或在存在能夠防止糖基化的試劑例如衣霉素下培養(yǎng)重組細胞。
通過使用去糖基化酶處理融合蛋白，酶促減少或完全去除融合蛋白上的糖類。去糖基化酶在本領域是熟知的。去糖基化酶的例子包括但是不限于半乳糖苷酶、PNGase A、PNGase F、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶和Endo H去糖基化酶。
然而，在某些情況下，融合蛋白的Tf部分是完全糖基化的，優(yōu)選用于口服施用。
可以對Tf進行其它突變來改變Tf的三維結構，例如修飾鉸鏈區(qū)以防止鐵結合和Tf受體識別所需的構象變化。例如，可以在N-結構域的氨基酸殘基94-96、245-247和/或316-318以及C-結構域的氨基酸殘基425-427、581-582和/或652-658上或者其周圍進行突變。此外，可以在這些位點的側翼區(qū)或其周圍進行突變來改變Tf結構和功能。
在本發(fā)明的一個方面，轉鐵蛋白融合蛋白可以作為載體蛋白，以延長治療性蛋白質的半衰期或生物利用度，以及在有些情況下，將治療性蛋白質遞送到細胞內部和/或跨過血腦屏障。在一個可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中轉鐵蛋白未保留跨過血腦屏障的能力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中轉鐵蛋白分子保留結合轉鐵蛋白受體和將治療性肽轉運到細胞內部的能力。在可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中轉鐵蛋白分子未保留結合轉鐵蛋白受體和將治療性肽轉運到細胞內部的能力。
在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中該轉鐵蛋白分子保留結合轉鐵蛋白受體和將治療性肽轉運到細胞內部的能力，并且保留跨過血腦屏障的能力。在可替代的實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被修飾的轉鐵蛋白分子，其中該轉鐵蛋白分子保留跨過血腦屏障的能力，但是未保留結合轉鐵蛋白受體和將治療性肽轉運到細胞內部的能力。
被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白本發(fā)明的蛋白質融合物含有被連接到Tf蛋白質的N末端和/或C末端的一個或多個拷貝的治療性蛋白質或多肽或可溶的毒素受體。在一些實施方案中，治療性蛋白質或多肽或可溶的毒素受體被連接到Tf蛋白質的N末端和C末端，而且該融合蛋白可以在Tf的一端或兩端含有治療性蛋白質或多肽的一個或多個等價物。在其它實施方案中，治療性蛋白質或多肽被插入到已知的Tf蛋白質結構域中，例如，插入到Tf的一個或多個環(huán)中(參見Ali等(1999)J.Biol.Chem.274(34)24066-24073)。實際上，治療性蛋白質或多肽可以被插入到轉鐵蛋白的所有五個環(huán)中，生成對抗原、受體或靶向分子的親合力提高的五價分子，治療性蛋白結合該分子。在其它實施方案中，治療性蛋白或多肽被插入到Tf的N末端和C-結構域之間?？商娲兀委熜缘鞍踪|或多肽被插入到轉鐵蛋白分子的任何位置上。
一般地，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白可以具有一個被修飾的轉鐵蛋白來源的區(qū)域和一個治療性蛋白區(qū)域。但是，各個蛋白的多個區(qū)域可以被用于制備本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白。類似地，一種以上的治療性蛋白質被用于制備本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白，從而生成多功能的被修飾Tf融合蛋白。
在一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到轉鐵蛋白分子或其部分上的治療性蛋白或多肽或其部分或可溶的毒素受體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到轉鐵蛋白分子的N末端上的治療性蛋白質或多肽。在可替代的實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到轉鐵蛋白分子C末端上的治療性蛋白質或多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到治療性蛋白質或多肽的N末端上的轉鐵蛋白分子。在可替代的實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到治療性蛋白質或多肽的C末端上的轉鐵蛋白分子在其它實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白含有被融合到被修飾的轉鐵蛋白的N末端和C末端上的治療性蛋白質。在另一個實施方案中，被融合在N末端和C末端上的治療性蛋白質結合相同的治療性蛋白質。在可替代實施方案中，被融合在N末端和C末端上的治療性蛋白質是不同的治療性蛋白質。在另一個可替代的實施方案中，被融合在N末端和C末端上的治療性蛋白質結合不同的治療性蛋白質，這些治療性蛋白質可以被用于治療或預防相同的疾病、紊亂或病癥。在另一個實施方案中，被融合在N和C末端上的治療性蛋白質是不同的治療性蛋白質，這些治療性蛋白質可以被用于治療或預防本領域已知的通常在患者中同時發(fā)生的疾病、紊亂或病癥。
除了本發(fā)明的其中被修飾的轉鐵蛋白部分被融合到治療性蛋白部分的上N末端和/或C-末端上的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白，還可以通過將治療性蛋白質或目標肽(例如在此公開的治療性蛋白質或肽，或其片段或變體)插入到被修飾的轉鐵蛋白的內部區(qū)域中來制備本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白。被修飾的轉鐵蛋白的內部區(qū)域包括，但是不限于，鐵結合位點、鉸鏈區(qū)、碳酸氫鹽結合位點或受體結合結構域。
在被修飾的轉鐵蛋白分子的蛋白質序列中存在大量環(huán)或轉角，它們通過二硫鍵來固定。這些環(huán)對于特別是那些需要二級結構來起作用的治療活性肽的插入或內部融合是有用的，或者用于生成具有特定生物學活性的被修飾的轉鐵蛋白分子的治療性蛋白質。
當治療性蛋白質被插入或置換Tf分子的至少一個環(huán)時，除了Tf的其它區(qū)域，可以在任何一個外露表面環(huán)區(qū)域內進行插入。例如，可以在包含Tf氨基酸32-33、74-75、256-257、279-280和288-289的環(huán)內進行插入(Ali等，同上文)(參見附圖3)。如先前所描述，還可以在Tf的其它區(qū)域進行插入，例如鐵和碳酸氫鹽結合的位點、鉸鏈區(qū)和下文更詳細描述的受體結合結構域。適合于修飾/替換來插入蛋白質或肽的Tf蛋白質序列中的環(huán)還可以被用于開發(fā)隨機肽插入物的篩選庫。在被克隆到Tf結構域和/或融合到Tf末端之前，任何方法可以被用于制備生成肽文庫的核酸插入物，包括可以獲得的噬菌體和細菌展示系統(tǒng)。
Tf的N-末端是游離的，并且朝向分子本體的外方。因此，蛋白質或肽在N末端融合是優(yōu)選的實施方案。這種融合可能包括一個接頭區(qū)，例如但是不限于多聚甘氨酸序列，將Tf與治療性蛋白質分開。注意接頭序列之間的連接、選擇先導序列以及通過密碼子加工/優(yōu)化mRNA結構(主要的莖環(huán)不會抑制核糖體前進)，將會提高分泌，并且容易采用標準的重組蛋白質技術來實現(xiàn)。
Tf的C末端似乎被C末端的6個氨基酸的二硫鍵隱藏和保護。在人Tf中，C末端氨基酸是脯氨酸，按照其朝向方式，可以是朝向融合物之外或者朝向分子本體內。C末端的接頭或間隔部分可以被用于本發(fā)明的一些實施方案中。N末端附近也有脯氨酸。在本發(fā)明的一個方面，N和/或C末端的脯氨酸可以被替換掉。在本發(fā)明的另一個方面，C末端的二硫鍵可以被去除來解放(untether)C末端。
在還有其它的實施方案中，小分子的治療劑與鐵復合，并裝載到被修飾的Tf蛋白質融合物，被遞送到細胞內以及跨過BBB。添加引導肽或者例如單鏈抗體(SCA)，用于將有效負載(payload)靶向特定細胞類型，例如癌細胞。
治療性蛋白質和肽按照本發(fā)明的方法和組合物，任何治療性分子可以被用作Tf的融合配偶體。如在此所用，治療性分子通常是在體外或體內產(chǎn)生有益的生物學作用的蛋白質或肽，包括產(chǎn)生與正常的穩(wěn)態(tài)、生理學或疾病狀態(tài)相關的有益作用的蛋白質和肽。治療性分子不包括通常被用作標記或蛋白質純化輔助物的融合配偶體，例如細菌性半乳糖苷酶(參見例如，美國專利5,986,067和Aldred等(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.122960-965)。例如，與疾病狀態(tài)相關的有益作用包括對被治療個體有利的任何作用，包括疾病預防、穩(wěn)定病情、減輕或緩解疾病病癥，或調節(jié)、緩解或治療潛在缺陷來產(chǎn)生對被治療的個體有利的作用。
本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白包括至少治療性蛋白質的片段或變體，以及至少被修飾的血清轉鐵蛋白的片段或變體，它們相互結合在一起，優(yōu)選通過基因融合。
在一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白包括被連接到神經(jīng)藥物試劑上的被修飾的轉鐵蛋白分子。在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白包括轉鐵蛋白的羧基末端被連接到神經(jīng)藥物試劑的氨基末端。在可替代實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白包括轉鐵蛋白的氨基末端被連接到神經(jīng)藥物試劑的羧基末端。在特定的實施方案中，神經(jīng)藥物試劑是神經(jīng)生長因子或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白可以含有至少治療性蛋白質的片段或變體。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白可以含有蛋白質或抗體的肽片段或肽變體，其中該變體或片段保留至少一種生物學或治療性的活性。轉鐵蛋白融合蛋白可以含有治療性蛋白質，治療性蛋白質可以是長度為至少約4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個或至少約40個、至少約50個、至少約55個、至少約60個或至少約70個或更多個氨基酸的肽片段或肽變體，被融合到被修飾的轉鐵蛋白的N和/或C末端，被插入到被修飾的轉鐵蛋白的環(huán)中。
本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白可以含有一種或多種肽。增加肽的數(shù)量會提高被融合到轉鐵蛋白的肽的功能以及整個轉鐵蛋白融合蛋白的功能。通過包含具有多種功能的肽或蛋白質結構域，肽可以被用于制備兩種或多種功能的融合蛋白。例如，可以使用治療性蛋白質以及將該融合蛋白靶向特定靶點的第二種蛋白質來制備多功能融合蛋白。其它肽可以被用于誘導細胞系統(tǒng)的免疫反應，或者誘導抗病毒、抗細菌和抗病原的反應。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合分子含有治療性蛋白質，治療性蛋白質包括全長蛋白質以及在氨基酸序列的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合分子含有治療性蛋白質部分，該部分可以是包括全長蛋白質以及在氨基酸序列的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽的治療性蛋白質的片段。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合分子含有在氨基末端和羧基末端都刪除了一個或多個氨基酸的治療性蛋白質的部分。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合分子含有與在此列舉的參比治療性蛋白質或其片段至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的治療性蛋白質的部分。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合分子含有與上述具有N末端和C末端刪除的氨基酸序列的參比多肽至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的治療性蛋白質的部分。
在另一個實施方案中，被修飾的轉鐵蛋白融合分子含有與例如天然的或野生型治療性蛋白質的氨基酸序列至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的治療性蛋白質的部分。還提供了這些多肽的片段。
對應于本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的治療性蛋白質，例如細胞表面和分泌蛋白質，可以通過連接一種或多種寡糖基團來修飾。被稱作糖基化的修飾顯著地影響蛋白質的物理特性，對于蛋白質穩(wěn)定性、分泌和定位來說是重要的。糖基化發(fā)生在多肽主鏈的特定區(qū)域。通常有兩種主要類型的糖基化特征為O-聯(lián)寡糖的糖基化，O-聯(lián)寡糖被連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上；和特征為N-聯(lián)寡糖的糖基化，N-聯(lián)寡糖被連接到Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺殘基上，其中X可以是除了脯氨酸外的氨基酸。變量如蛋白質結構和細胞類型影響不同糖基化位點上鏈內的糖單位的數(shù)量和性質。在特定細胞類型中，相同位點上的糖基化異構體也是相同的。例如，多種類型的人干擾素被糖基化。
對應于本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的治療性蛋白質及其類似物和變體可以被修飾，使得一個或多個位點上的糖基化由于它們的核酸序列被表達核酸的宿主細胞加工或者由于其它表達條件而發(fā)生改變。例如，可以通過去除或插入糖基化位點來制備糖基化異構體，例如，通過氨基酸殘基的取代和刪除，例如用谷氨酰胺取代天冬酰胺，或者通過在使該蛋白質糖基化的宿主細胞中表達該蛋白質來制備未被糖基化的重組蛋白質，例如在糖基化缺陷的酵母中。這些方法在本領域是已知的。
治療性蛋白質及其核酸序列在本領域是已知的，可以從公共數(shù)據(jù)庫中獲得，例如Chemical Abstracts Services Databases(例如，CAS Registry)、GenBank和GenSeq。登錄號及其下所指的序列在此全部引入作為參考。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白具有治療活性和/或生物學活性，與在本申請別處描述的治療性蛋白質的治療活性和/或生物學活性相對應。在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的治療活性蛋白質部分是在此引用的參比序列的片段或變體。
本發(fā)明還涉及包含在此描述的治療性蛋白質的片段的被修飾的Tf融合蛋白。即使從蛋白質的N末端刪除一個或多個氨基酸，導致該治療性蛋白質部分的一種或多種生物學功能被改變或缺失，其它治療活性和/或功能活性(例如生物學活性，聚合化能力，結合配體能力)仍然被保留。例如從N末端去除不超過完整多肽的殘基的大部分，該N末端刪除的多肽通常保留誘導和/或結合識別完整或成熟形式的多肽的抗體的能力。缺乏完整多肽的N末端殘基的特定多肽是否保留這種免疫活性，可以通過在此描述的和本領域知曉的其它常規(guī)方法來分析。具有大多數(shù)N末端氨基酸殘基被刪除的突變體保留某些生物學的或免疫學的活性也是有可能的。實際上，由少至6個氨基酸殘基組成的肽常常能夠引起免疫反應。
另外如上提及，既便從治療性蛋白質的N末端或C末端刪除一個或多個氨基酸殘基導致該蛋白質的一種或多種生物學功能被改變或缺失，其它功能活性(例如生物學活性，聚合化能力，結合配體能力)和/或治療活性仍然被保留。例如從C末端去除不超過完整或成熟多肽的殘基的大部分，該C末端刪除的多肽將通常保留誘導和/或結合識別完整或成熟形式的多肽的抗體的能力。缺乏參比多肽的N末端和/或C末端的殘基的特定多肽是否保留治療活性，可以容易地通過在此描述的和本領域知曉的其它常規(guī)方法來確定。
治療性蛋白質的肽片段可以是包含或者可替代地由治療性蛋白質的多肽序列的具有治療活性和/或功能活性(例如生物學活性)的氨基酸序列組成的片段，該氨基酸序列是治療性蛋白質的一個片段。
治療性蛋白質的肽片段可以僅包含該蛋白質的N末端和C末端，即治療性蛋白質的中間部分被刪除。可替代地，肽片段可以包含治療性蛋白質的中間部分的不相鄰的和/或相鄰的部分其它的多肽片段是具有生物學活性的片段。生物學活性片段是那些具有與在本發(fā)明中使用的治療性蛋白質相似但是不必相同的活性的片段。該片段的生物學活性可能包括提高期望活性或降低不期望的活性。
一般地，蛋白質變體與對應于本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的氨基酸序列總體上十分相似，在許多區(qū)域是相同的。編碼這些變體的核酸也被包括在本發(fā)明中。
可以被用于本發(fā)明的其它治療性多肽是由多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸在本領域技術人員知曉的嚴緊雜交條件下與編碼治療性蛋白質的氨基酸序列的核酸分子的互補物雜交(參見例如，Ausubel，F(xiàn).M.等，編輯，1989Current protocol in Molecular Biology，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley & Sons Inc.，紐約)。編碼這些多肽的多核苷酸也被包括在本發(fā)明中。
具有與本發(fā)明的對照(query)氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指在對照氨基酸序列的每100個氨基酸中，除了對象(subject)多肽序列可能包括多達5個氨基酸改變之外，對象多肽的氨基酸序列與對照序列是相同的。也就是說，為了獲得具有與對照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，在對象序列中多達5％的氨基酸殘基被插入、刪除或用其它氨基酸取代。參比序列的這些改變可能發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基末端或羧基末端或者這些末端位置之間的任何地方，分別地分散在參比序列的殘基中，或者在參比序列的一個或多個鄰近基團中。
實際上，任何特定多肽是否與例如本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白或其片段(例如轉鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分或轉鐵蛋白融合蛋白的轉鐵蛋白部分)的氨基酸序列至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，通?？梢圆捎靡阎挠嬎銠C程序來確定。用于確定對照序列(本發(fā)明的序列)與對象序列之間的最佳全面匹配的優(yōu)選方法，也稱作全序列比對，可以采用基于Brufiag等(Comp.App.Biosci 245(1990))的算法的FASTDB計算機程序來確定。
本發(fā)明的多肽變體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或者兩者中具有改變。含有產(chǎn)生沉默取代、添加或刪除而不改變被編碼多肽的性質或活性的改變的多肽變體可以被用于制備被修飾的Tf融合蛋白。可以使用由于遺傳密碼子的簡并性通過沉默取代而制備的核苷酸變體。而且，其中少于約50個、少于40個、少于30個、少于20個、少于10個或者5-50個、5-25個、5-10個、1-5個或1-2個氨基酸以任何組合被取代、刪除或添加的多肽變體也可以被使用。多肽變體由于各種原因被制備，例如為了特定宿主而優(yōu)化密碼子表達(改變人mRNA中的密碼子為宿主優(yōu)選的密碼子，例如上述的酵母或大腸桿菌)。
在其它實施方案中，相對于野生型序列，治療性蛋白質部分具有保守取代。“保守取代”是指在組內替換，例如脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替換；羥基殘基Ser和Thr的替換；酸性殘基Asp和Glu的替換；氨基殘基Asn和Gln的替換；堿性殘基Lys、Arg和His的替換；芳香殘基Phe、Tyr和Trp的替換，以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替換。關于如何制備表型沉默的氨基酸取代的指導被提供在，例如Bowie等，“翻譯蛋白質序列中的信息對氨基酸取代的耐受”(″Deciphering the Message inProtein SequencesTolerance to Amino Acid Substitutions″)，Science 2471306-1310(1990)。在特定實施方案中，本發(fā)明的多肽包括或者可替代地由在此描述的治療性蛋白質和/或本發(fā)明的血清轉鐵蛋白和/被修飾轉鐵蛋白的氨基酸序列片段或變體組成，其中當與參比序列比較時，該片段或變體具有1-5個、5-10個、5-25個、5-50個、10-50個或50-150個氨基酸殘基添加、取代和/或刪除。在另一個實施方案中，氨基酸取代是保守的。編碼這些多肽的核酸也被包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的被修飾的融合蛋白可以由通過肽鍵或被修飾的肽鍵相互連接的氨基酸組成，并且含有20種編碼基因的氨基酸外的氨基酸。多肽可以通過天然加工，例如翻譯后加工，或者通過本領域熟知的化學修飾技術來修飾。這種修飾在基礎文章和更加詳細的專論以及多卷研究文獻中被充分地描述。
可以在多肽的任何位置上進行修飾，包括肽的主鏈、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端?？梢灶A期，在特定多肽的幾個位置上存在相同或不同程度的相同類型的修飾。此外，特定的多肽可以含有多種類型修飾。多肽可以是分支的，例如由于遍在蛋白質化，可以是環(huán)狀的，有或無分支。環(huán)狀的、分支的和分支環(huán)狀的多肽可以從翻譯后的天然加工中獲得，或者通過合成方法制備。修飾包括乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接亞鐵血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸，糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG化、蛋白質水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硫酸化、轉運-RNA介導的氨基酸添加到蛋白質上，例如精氨酸化和遍在蛋白質化(參見，例如，蛋白質-結構與分子特性(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約(1993)；蛋白質的翻譯后共價修飾(POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson，編輯，Academic Press，紐約，1-12(1983)；Seifter等(1990)Meth.Enzymol.182626-646；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62。
本發(fā)明的治療性蛋白質包括，但是不限于多肽、肽、抗體或其片段和變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的治療性蛋白質包括β-干擾素(β-IFN)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、EPO模擬肽(EMP-1)、T-20和可溶的毒素受體，例如突觸結合蛋白I。
β-干擾素絕大多數(shù)細胞因子，包括β-IFN，在體內生成并且局部和暫時地起作用，具有相對較短的循環(huán)半衰期。為了將β-IFN用作有效的全身性治療劑，需要相對大的劑量和頻繁的施用。這種頻繁的胃腸外施用是不便利的，而且是令人痛苦的。此外，β-IFN施用具有毒副作用，這種副作用十分嚴重，使得一些多重硬化癥的患者難以耐受這種治療。這些副作用可能與高劑量施用相關。
本發(fā)明提供半衰期延長的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白，以及穩(wěn)定性提高的含有這種融合蛋白的藥物組合物?？梢缘蛣┝康亟o患者施用這種融合蛋白，從而降低與β-IFN相關的毒副作用。本發(fā)明包括使用β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白來治療各種與β-IFN相關的疾病和病癥的用途，例如但是不限于多發(fā)性硬化、癌癥包括腦瘤和皮膚癌，以及病毒性感染，例如乙型肝炎和丙型肝炎。優(yōu)選地，β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白被用于治療患有多發(fā)性硬化癥的個體。
β-IFN是具有23kD的表觀分子量的(MW)的糖蛋白。編碼β-IFN的基因位于染色體9上。K.Hosoi等(J.Interferon Res.，8，375-384(1988))確定含有166個殘基的氨基酸序列，而Y.Kagawa等(J.Biol.Chem.，263，17508-17515(1988))報道了其配糖物的序列。
β-IFN是在對病毒或細菌感染響應或者暴露于外源細胞、大分子或RNA時由成纖維細胞分泌的。特別地，β-IFN抑制被感染細胞的增殖，刺激免疫系統(tǒng)。一般認為，同源的Hu-β-IFN的特定抗病毒活性在3×108和1×109iu/mg(國際單位/毫克總蛋白)之間，包括端點值(參見美國專利4,289,689和EP-A-94672)。
“干擾素-β”(IFN-β)或“β-干擾素”(β-IFN)包括天然的和重組的I型干擾素，與通常稱作IFN-β-1a和IFN-β-1b的I型干擾素具有相同或相似的藥學特性。
任何β-IFN序列都可以被用于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白。例如，美國專利4,738,931公開了來自人染色體DNA的人β-IFN基因。1.8kb的EcoRI片段含有編碼人β-IFN的核酸被導入到大腸桿菌中，該大腸桿菌以大腸桿菌CI4被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC31905。人β-IFN氨基酸序列的氨基酸序列的GenBank登錄號為AAA72588。β-IFN還可以是美國專利4,588,585中描述的突變蛋白，其中通常存在于野生型或天然分子的位置17上的半胱氨酸(Cys)已經(jīng)用中性氨基酸替換，例如絲氨酸或丙氨酸。Mark等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666(1984))證明，當Cys 17被替換為絲氨酸時，該IFN具有與β-IFN相同生物學活性譜，例如抗細胞和抗增殖活性，活化NK細胞和中和抗人IFN的抗體。當在70℃下培養(yǎng)時，突變蛋白的穩(wěn)定性高于天然的人(hu)β-IFN。
由于其活性，在治療和預防病毒性疾病例如皰疹、流感等，以及在治療腫瘤性病癥例如腦瘤和白血病中，β-IFN都被作為一種有效成分。β-IFN被用于治療多發(fā)性硬化、腦瘤、皮膚癌和乙型肝炎和丙型肝炎。本發(fā)明的β-IFN融合蛋白可以被用于治療這些疾病的任何一種。
人β-IFN在治療人的冠狀動脈再狹窄申也是有效的，在手術操作后，選擇性地抑制血管損傷部位的冠狀動脈平滑肌細胞的增殖，而對手術操作后冠狀動脈內皮細胞的正常增殖不具有抑制作用。美國專利5,681,558公開了給患者施用β-IFN來治療再狹窄的方法。因此，本發(fā)明的β-IFN融合蛋白可以被用于治療再狹窄。
β-IFN對來自患有低紅細胞生成的疾病的個體的祖細胞的生長具有促紅細胞生成的作用。此外，β-IFN增加祖細胞的大量形成(burst formation)并促使其更加快速成熟為正常紅細胞和晚期的網(wǎng)狀細胞。美國專利5,104,653公開了用于在患有特征為缺乏祖紅細胞成熟為紅細胞的異常的患者中刺激紅細胞生成，包括給所述患者施用促紅細胞生成有效量的人β-IFN。因此，本發(fā)明的β-IFN融合蛋白可以被用于刺激紅細胞生成。
β-IFN通過STAT1和STAT2起作用，被認為能夠上調和下調各種基因，這些基因大部分參與抗病毒的免疫反應。雖然大部分IFN反應由存在dsRNA誘導，DNA病毒和RNA病毒都對β-IFN的作用敏感(Biron，Seminars inImmunology，10383-390(1998))。
β-IFN通常在對病毒感染響應時生成。干擾素β-IFN通過結合到人細胞表面上的特定受體上來產(chǎn)生生物學作用。這種結合起始復雜的細胞內事件的級聯(lián)，導致許多干擾素誘導的基因產(chǎn)物和標記的表達，例如2′，5′-寡腺苷酸合成酶、b2-微球蛋白和新蝶呤(neopterin)。
(2′-5′)-寡腺苷酸化合成酶和dsRNA依賴的蛋白激酶是兩種最公知的IFN-β誘導的蛋白質(Biron，1998，同上文)。(2′-5′)-寡腺苷酸合成酶以獨特的2′-5′方式聚合ATP(Janeway等，免疫生物學健康和疾病狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)(ImmunobiologyThe Immune System in Health and Disease)，第四版，紐約，Elsevier Science/Garland Publishing 385-386(1999))；生成的寡聚物激活RNase L，RNase L裂解mRNA(Biron，1998，同上文)。DsRNA依賴的蛋白激酶磷酸化和滅活轉錄起始物elF2。(2′-5′)-寡腺苷酸合成酶和dsRNA依賴的蛋白激酶都僅在存在dsRNA時起作用，即在被病毒感染的細胞中起作用。這兩種蛋白質作用的最終結果是抑制蛋白質翻譯，這將會阻礙病毒復制(Biron，1998，同上文)。
TAP(與抗原加工相關的轉運子)、Lmp2、Lmp7的β-IFN依賴的上調起增加由MHC I型分子對病毒性肽的遞送，以方便CD8 T細胞識別和破壞被感染的細胞。在ER中，TAP是負責將肽片段裝載到MHC I型分子上的分子；Lmp蛋白是裂解特別用于MHC I型遞送的蛋白質的蛋白質酶體的組分(Janeway等，1999，同上文)。
一般認為，在天然殺傷(NK)細胞，β-IFN激活和誘導一定程度增殖(Janeway等，1999，同上文)。但是，干擾素本身不是促有絲分裂劑。NK細胞的增殖可能是由IFN-β誘導的中間細胞因子引起的(Biron，1998，同上文)。NK細胞能夠殺死具有不典型的MHC I型表達模式的細胞；這種細胞通常被病毒感染(Janeway等，1999，同上文)。
雖然在成功戰(zhàn)勝感染后，T細胞在免疫系統(tǒng)恢復到穩(wěn)態(tài)平衡時由于凋亡而死亡，但是一些T細胞必須避免凋亡，并進入G0/G1的記憶狀態(tài)來保存免疫記憶。這些記憶T細胞通過與基質細胞相互作用，從凋亡中被拯救過來，基質細胞分泌β-IFN和一些IFN-α(Pilling等，European Journal ofImmunology/291041-1050(1999))。T細胞凋亡可以由細胞因子去除或者Fas連接到細胞表面上來誘導，但是β-IFN能夠阻斷這兩種凋亡路徑。前一種凋亡路徑是通過β-IFN依賴的上調凋亡抑制劑Bcl-x而被阻斷。Fas連接誘導的凋亡發(fā)生十分迅速，以至難以通過上調基因來阻斷，所以β-IFN必須通過其它方式來阻斷凋亡路徑(Scheel-Toellner等，European Journal of Immunology292603-2612(1999))。存在第二種阻斷機制得到Marrack等(Journal ofExperimental Medicine 189521-529(1999))的結果的支持，Marrack等發(fā)現(xiàn)β-IFN防止T細胞凋亡而不增加Bcl-x的生成。
Der等(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 9515623-15628(1998))發(fā)現(xiàn)，在人纖維肉瘤細胞中，IFN提高100種以上的蛋白質的轉錄。從功能上看，被誘導的蛋白質的范圍包括細胞色素和細胞支架蛋白到免疫活性蛋白例如補體成分和dsRNA腺苷脫氨酶。這些結果表明β-IFN具有真正的多效性作用，其中的多種還未完全被了解。
許多對β-IFN的臨床研究集中在其被用于多發(fā)性硬化(MS)的治療。MS是一種自體免疫性疾病，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質細胞中，T細胞提高對自身的髓磷脂抗原的免疫反應(Goodkin，1999.多發(fā)性硬化對具有復發(fā)-緩和和繼發(fā)的漸進性多發(fā)性硬化的治療選擇(Multiple sclerosisTreatment optionsfor patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiplesclerosis)。<http//www.msnews.org/goodkinl_99.htm>)。在1993年，F(xiàn)DA批準皮下注射IFN-β1b來治療MS(Revelle M.，1993，F(xiàn)DA批準干擾素β-1b。(<http//www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00424.html>)。β-IFN 1b是未被糖基化形式的INF-β，在大腸桿菌中制備(Arduini等，Protein Science 81867-1877(1999))。與β-IFN 1b治療相關的不利結果包括注射部位反應(發(fā)炎、疼痛、超敏性和壞死)和flu-樣征候群(發(fā)燒、寒戰(zhàn)、焦慮和混亂)。實際上。這些不利的副作用可以通過如上述將β-IFN融合到轉鐵蛋白上來減少或減輕。
目前，β-IFN 1a(真核的、被糖基化的形式)也是可以獲得的(Goodkin，1999，同上文)。通過DNA重組技術制備β-IFN 1a。干擾素β-1a是一種166個氨基酸的糖蛋白，具有約22,500道爾頓的預測分子量。用導入了人的IFN-β基因的哺乳動物細胞(中國倉鼠卵巢細胞)來制備。β-IFN 1a的氨基酸序列與天然的人β-IFN的氨基酸序列相同，可以被用于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白。
β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白的治療還可能通過恢復抑制物T細胞的功能來緩解自體免疫疾病的發(fā)作；由于不清楚的原因，與完全反式(all-trans-)的視黃酸一起處理，似乎增加這種恢復作用(Qu等，1998.完全反式的視黃酸加強干擾素β-1b的能力(All-trans retinoic acid potentiates the ability of interferonbeta-1b)。<http//members.tripod.corn/～ThJuland/ra-betalb.html>)。β-IFN還可能抑制IL-1和IFN-γ對誘導型一氧化氮合酶(INOS)表達的誘導。在星形細胞中，由INOS生成一氧化氮已經(jīng)被認為是MS發(fā)生的一種因素(Hua等1998.β干擾素防止一氧化氮/過氧化氮破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Beta inteferon preventsnitric oxide/peroxynitrate from damaging the central nervous system)。(<http//members.tripod.com/-ThJuland/nitric-oxide beta.html>)。
在一個方面，本發(fā)明包括使用對于治療各種與β-IFN相關的疾病具有治療有效性的β-IFN類似物來生產(chǎn)β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白的用途。
在另一個方面，本發(fā)明包括β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白在上述方法中抑制或刺激各種細胞過程，和用于治療和預防上述的各種疾病和病癥的用途。特別地，β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白可以被用于治療多發(fā)性硬化、皰疹、流感、腦瘤和皮膚癌。
可以通過公知的方法，將本發(fā)明的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白配制成藥物組合物。參見，例如，E.W.Martin的雷明頓藥物科學(Remington′sPharmaceutical Sciences)，在此引入作為參考，其中描述了合適的劑型。本發(fā)明的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物可以被配制成各種形式，包括液體、凝膠、凍干，或任何其它合適形式。優(yōu)選形式將取決于所治療的特定病癥，并且對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白可以以純化的形式或以適當?shù)乃幬锝M合物的形式被施用?？梢酝ㄟ^任何被接受的模式進行施用。因此，施用可以是，例如，口服的、鼻腔的、胃腸外的、體表的、經(jīng)皮的或直腸的，形式為固體、半固體、凍干粉末或液體劑量形式，例如，片劑、栓劑、藥丸、柔軟彈性的和硬的明膠膠囊、粉末、溶液、懸浮液或氣霧劑等，優(yōu)選為適合單次精確劑量施用的單位劑量形式。該組合物包括常規(guī)的藥學載體或賦形劑以及作為活性試劑的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白，此外，可能包括其它治療劑、藥物試劑、載體、佐劑等。
一般地，根據(jù)特定的施用模式，藥學上可接受的組合物將含有重約1％到約99％的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白，和重99％到1％的合適藥物賦形劑。該組合物可以是含有重約5％-75％的β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白，而剩余部分為合適的藥物賦形劑。
施用的途經(jīng)可以為胃腸外的，采用便捷的日劑量方案，可以按照被治療的疾病特別是多發(fā)性硬化的嚴重性來調整該方案。對于這種胃腸外施用，含有β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白的藥學上可接受的組合物可以通過美國專利4,462,940、4,588,585和4,992,271中所公開的方法來制備。
可替代地，β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物可以被口服地、靜脈內地、肌肉內地、腹膜內地、經(jīng)皮地或皮下地或者以任何其它可接受的方式施用。優(yōu)選施用模式將取決于被治療的特定病癥，并且對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
美國專利6,333,032描述使用β-IFN治療溫血脊椎動物的疾病的有效方法，例如多發(fā)性硬化。多發(fā)性硬化的治療包括以適合促進所述劑量的干擾素與所述動物的口腔和咽部粘膜接觸的劑量形式，以每天0.01-約5IU/lb劑量施用β-IFN。干擾素的劑量可以為每天0.1-約4.0IU/lb，或者每天0.5-約1.5IU/1b體重。
本發(fā)明包括以適合于確保所述劑量形式中的干擾素與進行治療的人或動物的口腔和咽部粘膜最大化接觸的劑量形式施用β-IFN?？梢酝ㄟ^最大化治療溶液在口腔或咽部的停留時間來加強干擾素與粘膜的接觸。因此，當患者在口腔中含所述干擾素溶液一段時間時，似乎能夠獲得最佳結果。將干擾素與口腔和咽部粘膜接觸，進而與被治療的人或動物的淋巴系統(tǒng)接觸，無疑是施用免疫治療量的干擾素的最有效方法。
此外，本發(fā)明包括β-IFN/轉鐵蛋白在制備可用于治療與β-IFN相關的疾病的治療劑中的用途。本發(fā)明所預期的疾病包括但是不限于上述的那些疾病。
胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種調節(jié)胰島素分泌的胃腸道激素，屬于所謂腸胰島軸。腸胰島軸指定一組激素，對腸道中的營養(yǎng)成分的出現(xiàn)和吸收響應時，這組激素從胃腸道粘膜中釋放，促進胰島素較早地和加強地釋放。腸促胰島素的作用是對胰島素分泌的加強作用，對正常的葡萄糖耐受可能是重要的。GLP-1是產(chǎn)生腸促胰島素作用的原因，因此是一種生理學上重要的促胰島激素。
GLP-1是胰高血糖素原(proglucagon)的產(chǎn)物(Bell，等，Nature，1983，304368-371)。在腸道內分泌細胞中以兩個主要的大分子形式合成，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。在20世紀80年代早期，最先在克隆胰高血糖素原的cDNA和基因中確定該肽。
對全長肽GLP-1(1-37)和GLP-1(1-36酰胺)的最初研究表明，較大的GLP-1分子缺乏生物學活性。在1987年，三個不同的研究小組證明，去除前6個氨基酸生成了生物學活性升高的GLP-1分子。
Schmidt等(1985Diabetologia 28 704-707)公開GLP-1的氨基酸序列。人的GLP-1是來源于前胰高血糖素原的37個氨基酸殘基的肽，在回腸末端、胰腺和大腦的L-細胞中合成。前胰高血糖素原被加工成GLP-1(7-36酰胺)、GLP-1(7-37)，GLP-2主要存在于L-細胞中。GLP-1(7-36酰胺)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列是(SEQ ID NO6)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X其中對于GLP-1(7-36酰胺)來說，X是NH2，而對于GLP-1(7-37)來說，X是Gly。
在患有II型糖尿病(非胰島素依賴的糖尿病(NIDDM))，有時為I型糖尿病的患者中，GLP-1樣分子具有抗糖尿病活性。在僅葡萄糖水平升高時，GLP-1處理引起活性，例如胰島素分泌和生物合成增加，胰高血糖素分泌減少，胃排空延緩，從而提供一種潛在的比胰島素或磺酰脲更加安全的治療方法。使用適當?shù)腉LP-1治療，能夠使患者中的餐后葡萄糖水平趨向正常水平。還有報導表明，GLP-1樣分子具有保護，甚至恢復II型糖尿病患者中的胰腺β細胞功能的能力。
任何GLP-1序列可以被用于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白，包括GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。GLP-1還有力地作用于胃腸道。以生理劑量灌注時，GLP-1抑制五肽促胃酸激素誘導以及食物誘導的胃酸分泌(Schjoldager等，Dig.Dis.Sci.1989，35703-708；Wettergren等，Dig Dis Sci1993；38665-673)。其還抑制胃排空速率和胰腺酶分泌(Wettergren等，Dig DisSci 1993；38665-673)。在用含有糖類或脂類的溶液灌注回腸時，可以在人中產(chǎn)生對胃和胰腺的分泌和活動的類似抑制作用(Layer等，Dig Dis Sci1995，401074-1082；Layer等，Digestion 1993，54385-38)。同時，GLP-1分泌被極大地刺激，推測GLP-1可能至少部分地造成這種所謂“回腸閘(ileal-brake)”作用(Layer等，Digestion 1993；54385-38)。實際上，最近的研究表明，從生理學上看，GLP-1的回腸閘作用可能比其對胰島的作用更重要。因此，在劑量響應試驗中，GLP-1至少在低至影響胰島分泌所需的灌注速率下影響胃排空速率(Nauck等，Gut 1995；37(副刊2)A124)。
GLP-1可能對食物攝取產(chǎn)生作用。在大鼠中，心室內施用GLP-1極大地抑制食物攝取(Schick等in Ditschuneit等(編輯)，Obesity in Europe，JohnLibbey & Company 1td，1994；363-367；Turton等，Nature 1996，37969-72)。這些作用好像是高度特異的。因此，N-末端延長的GLP-1(PG 72-107)酰胺是無活性的，并且適當劑量的GLP-1拮抗劑，exendin 9-39消除了GLP-1的作用(Tang-Christensen等，Am.J.Physiol.，1996，271(4 Pt 2)R848-56)。在大鼠中，急劇外周施用GLP-1不會劇烈地抑制食物攝取(Tang-Christensen等，Am.J.Physiol.，1996，271(4 Pt 2)R848-56；Turton等，Nature 1996，37969-72)。但是，腸道L細胞分泌的GLP-1還可能作為一種過飽信號。
在糖尿病患者中，GLP的促胰島素作用和GLP-1對胃腸道的作用受到保護(Willms等，Diabetologia 1994；37，副刊1A118)，這可能有助于降低食物誘導的葡萄糖偏離(excursion)，但是，更加重要的是還可能影響食物攝取。已經(jīng)證明，在NIDDM患者中，以4ng/kg/min速率連續(xù)地靜脈內施用GLP-1一周會顯著地改善對血糖的控制，而不產(chǎn)生顯著的副作用(Larsen等，Diabetes1996；45，副刊2233A)。
包含至少一個GLP-1類似物及其片段的GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白可用于治療1型和2型糖尿病以及肥胖癥。
如在此所用，術語“GLP-1分子”是指GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物。
如在此所用，術語“GLP-1類似物”被定義為，與GLP-1相比，具有一個或多個氨基酸取代、刪除、倒置或添加的分子。許多GLP-1類似物在本領域是已知的，并且包括，例如GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-37)、Ser8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。其它的類似物包括二肽酶抵抗形式的GLP-1，其中該肽的N末端被保護。這種類似物包括，但是不限于具有其它氨基酸的GLP-1，例如被添加到N末端或取代進入N末端氨基酸(GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)中的氨基酸7或8)的組氨酸。在這些類似物中，N末端可以包括殘基His-His-Ala、Gly-His-Ala、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-Ala-Glu、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-His-Ala-Glu、His-His-Gly-Glu、His-His-Ser-Glu、Gly-His-Ala-Glu、Gly-His-Gly-GIu、Gly-His-Ser-Glu、His-X-Ala-Glu、His-X-Gly-Glu、His-X-Ser-Glu，其中X為任何氨基酸。美國專利5,118,666公開了GLP-1類似物的例子，例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)。
術語“GLP-1衍生物”被定義為具有GLP-1或GLP-1類似物的氨基酸序列，但是在一個或多個氨基酸側鏈基團、α-碳原子、末端氨基基團或末端羧酸基團的上具有其它化學修飾的分子。化學修飾包括，但是不限于，添加化學部分、產(chǎn)生新鍵和去除化學部分。
如在此所用，術語“GLP-1相關化合物”是指落入GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物的定義中的任何化合物WO 91/11457公開活性GLP-1肽7-34，7-35，7-36和7-37的類似物，也可以被用作GLP-1部分。
EP 0708179-A2(Eli Lilly & Co.)公開包括被連接到位置34的賴氨酸殘基上的N末端咪唑基團和可選擇地無支鏈的C6-C10烷基基團的GLP-1類似物和衍生物。
EP 0699686-A2(Eli Lilly & Co.)公開某些N末端截斷的GLP-1片段，它們被報導具有生物學活性。
美國專利5,545,618公開了基本上由GLP-1(7-34)、GLP1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)組成的GLP-1分子或其酰胺形式，以及其藥學上可接受的鹽，具有至少一個選自如下的修飾(a)甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-賴氨酸取代位置26和/或位置34上的賴氨酸；或者甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸或D-精氨酸取代位置36上的精氨酸；(b)抗氧化氨基酸取代位置31上的色氨酸；(c)如下取代中的至少一種取代酪氨酸取代位置16上的纈氨酸；賴氨酸取代位置18上的絲氨酸；天冬氨酸取代位置21上的谷氨酸；絲氨酸取代位置22上的甘氨酸；精氨酸取代位置23上的谷氨酸；精氨酸取代位置24上的丙氨酸；和谷氨酰胺取代位置26上的賴氨酸；和(d)如下取代中的至少一種取代甘氨酸、絲氨酸或半胱氨酸取代位置8上的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代位置9上的谷氨酸；絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代位置10上的甘氨酸；和谷氨酸取代位置15上的天冬氨酸；和(e)甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸，或D-或N-乙?；蛲榛问降慕M氨酸取代位置7上的組氨酸；其中在取代為(a)、(b)、(d)和(e)中時，被取代的氨基可選擇地是D-型的，并且在位置7上被取代的氨基酸可選擇地是N-乙?；騈-烷基化形式的。
美國專利5,118,666公開具有促胰島素活性的GLP-1分子。這種分子選自具有氨基酸序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(SEQ ID NO7)或His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(SEQ ID NO8)的肽；和所述肽的衍生物，并且其中所述肽選自藥學上可接受的所述肽的酸加成鹽；藥學上可接受的所述肽的羧酸鹽；藥學上可接受的所述肽的低級烷基酯和藥學上可接受的所述肽的酰胺，選自酰胺、低級烷基胺，和低級二烷基胺。
美國專利6,277,819教導一種降低心肌梗塞的死亡率和發(fā)病率的方法，包括給患者施用GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1衍生物。GLP-1類似物用如下的結構式表示(SEQ ID NO9)R1-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X2-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X3-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2及其藥學上可接受的鹽，其中R1選自L-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同型組氨酸、α-氟甲基-組氨酸和α-甲基-組氨酸；X1選自Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala；X2選自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；X3選自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；R2選自NH2和Gly-OH；只要GLP-1類似物具有范圍在約6.0到約9.0的等電點，而且還當R1為His，X1為Ala，X2為Glu，和X3為Glu時，R2必須是NH2。
Ritzel等(Journal of Endocrinology，1998，15993-102)公開了一種GLP-1類似物，[Ser8]GLP-1，其中N末端的第二個氨基酸丙氨酸用絲氨酸替換。這種修飾不會消弱該肽的促胰島素作用，而且生成血漿穩(wěn)定性比GLP-1更高的類似物。
美國專利6,429,197教導在急性卒中或出血后，進行GLP-1治療，優(yōu)選靜脈內施用是一種理想的治療方法，因為它為優(yōu)化胰島素分泌、提高大腦合成代謝、通過抑制胰高血糖素來增強胰島素效力，以及維持血糖正?；蜻m度低血糖而沒有嚴重的低血糖的危險或者其它不利的副作用提供一種途經(jīng)。本發(fā)明提供一種在急性卒中或出血后用GLP-1或其生物活性類似物處理局部缺血的或再灌注的大腦的方法，優(yōu)化胰島素分泌，通過抑制胰高血糖素拮抗作用來增強胰島素效力，以及維持euglycemia或適度低血糖而不產(chǎn)生嚴重的低血糖的危險。
美國專利6,277,819提供一種降低患心肌梗塞后的死亡率和發(fā)病率的方法，包括給需要的患者施用有效正?；堑膭┝康倪x自GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物或其藥學上可接受的鹽的化合物。
美國專利6,191,102公開降低需要降低體重的個體的體重的方法，通過給個體施用有效引起體重下降的劑量的包含胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽類似物(GLP-1類似物)、胰高血糖素樣肽衍生物(GLP-1衍生物)或其藥學上可接受的鹽的組合物一段時間，該時間足以引起體重下降，所述時間為至少4周。
皮下施用后，GLP-1是完全活化的(Ritzel等，Diabetologia 1995；38720-725)，但是由于二肽酶IV樣酶的降解作用，GLP-1被迅速降解(Deacon等，J Clin Endocrinol Metab 1995，80952-957；Deacon等，1995，Diabetes 441126-1131)。因此，不幸的是GLP-1及其多種類似物在人體內的血漿半衰期很短(Orskov等，Diabetes 1993；42658-661)。因此，本發(fā)明的目的在于提供包含GLP-1或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白，所述類似物的作用模式相對于GLP-1(7-37)被延長。本發(fā)明的另一個目的在于提供GLP-1的衍生物和類似物，它們的清除率比GLP-1(7-37)低。此外，本發(fā)明的目的在于提供包含穩(wěn)定性提高的GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白或GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物。此外，本發(fā)明包括GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白或GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白用于治療與GLP-1相關的疾病的用途，例如，但是不限于上面描述的疾病。
本發(fā)明的一個方面，包含GLP-1肽/轉鐵蛋白融合蛋白或GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物可以通過任何一種已經(jīng)建立的配制藥物組合物的方法來配制，例如，在雷明頓藥物科學，1995中描述的方法。該組合物可以是適合系統(tǒng)注射或灌注的形式，因而可以與合適的液體媒介物一起配制，例如無菌水或等滲鹽水或葡萄糖溶液。組合物可以通過本領域知曉的常規(guī)滅菌技術來滅菌。得到的水溶液可以被包裝備用或在無菌條件下過濾和凍干，凍干制備物在施用前與無菌水溶液混合。組合物可以含有近似生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，例如緩沖試劑、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。
本發(fā)明的GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白和GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白被改進以適合鼻腔的、經(jīng)皮的、肺部或直腸施用。在組合物中所用的藥學上可接受的載體或稀釋劑可以是任何常規(guī)的固體載體。這種固體載體的例子為乳糖、高嶺土(terra alba)、蔗糖、滑石粉、明膠、瓊脂、膠質、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂和硬脂酸。類似地，載體或稀釋劑可以包括本領域知曉的任何持續(xù)釋放物質，例如甘油基單硬脂酸或甘油基二硬脂酸，單獨地或者與臘混合。
提供持續(xù)釋放制劑形式的本發(fā)明的組合物是特別有利的。因此，組合物可以被配制成含有GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白或GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白的微囊或微粒，被包裹在或分散在合適的藥學上可接受的可生物降解的聚合物，例如多聚乳酸、多聚羥基乙酸或乳酸/羥基乙酸的共聚物中。
對于鼻腔內施用，該制備物可以含有溶解在或懸浮在噴霧應用的液體載體中，特別是水溶液載體中的GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白或GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白。該載體可以含有添加劑，例如穩(wěn)定劑，例如丙二醇，表面活性劑，吸收增強劑，例如卵磷脂(卵磷脂)或環(huán)化糊精，或者防腐劑例如對羥基苯甲酸酯類(parabenes)。
一般地，本發(fā)明的化合物被分散在單位劑量形式中，每個單位劑量包含0.5-500mg融合蛋白以及藥學上可接受的載體。
此外，本發(fā)明包括GLP-1/轉鐵蛋白和GLP-1類似物/轉鐵蛋白融合蛋白在加工藥劑產(chǎn)品中的用途，該藥劑被用于治療與葡萄糖水平升高相關的疾病，例如但是不限于上述的疾病。特別地，本發(fā)明包括GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白在治療糖尿病中的用途，包括II型糖尿病、肥胖癥、嚴重灼傷和心力衰竭，包括充血性心力衰竭和急性冠狀動脈綜合癥(acute coronary syndrome)。
GLP-1的N末端一般被酰胺化。在酵母中不發(fā)生酰胺化。在本發(fā)明的一個方面，為了彌補在酵母中不發(fā)生的N末端的酰胺化，額外氨基酸被添加到GLP-1的N末端。由于空間位阻，將氨基酸加到GLP-1的N末端可以防止二肽酶(dipeptidyl peptidase)在GLP-1的第二個氨基酸進行裂解。因此，GLP-1將保留功能活性。20種氨基酸的任何一種可以被添加到GLP-1的N末端。在某些情況下，無電荷的或帶正電荷的氨基酸被使用，優(yōu)選地，添加較小的氨基酸例如甘氨酸。然后將具有額外氨基酸的GLP-1融合到轉鐵蛋白上。因此，具有添加氨基酸的GLP-1被融合在GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白的N末端。
在一個制備對二肽酶的裂解具有更高的抵抗性的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的實施方案中，His殘基被添加到GLP-1的N末端上或者在GLP-1的N末端的His殘基后插入His，使得GLP-1的N末端以His-His開始。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽(SEQ IDNO6)的N末端的第二個殘基用另一種氨基酸取代。例如，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽的N末端的第二個殘基上的Ala殘基可以用Ser、Gly、Val或另一種氨基酸取代。
用于治療2型糖尿病的GLP-mTf融合蛋白如上所討論，GLP-1激活和調控機體內的重要內分泌激素系統(tǒng)，并在葡萄糖的代謝中起重要的操縱作用。與市場上的所有其它糖尿病治療劑不同，GLP-1作為B細胞的生長因子具有恢復潛力，從而增強胰腺分泌胰島素的能力，而且通過提高穩(wěn)定性來使已有的胰島素水平更有效地起作用和更好地穩(wěn)定葡萄糖水平。這將降低每日監(jiān)控葡萄糖水平的負擔，并且可能延遲由于糖尿病的血糖波動引起的嚴重的長期副作用。另外，GLP-1可以降低食欲和減輕體重。肥胖癥是對葡萄糖代謝控制不力的內在結果，這只會進一步惡化糖尿病的病癥。
由于天然GLP-1在循環(huán)中被迅速降解(半衰期為數(shù)分鐘)，其臨床應用受到限制。為了維持循環(huán)中的治療性水平，需要采用泵或片膜裝置進行持續(xù)高劑量的施用，這增加治療成本。對于尤其結合所有其它藥劑來治療糖尿病和監(jiān)控葡萄糖水平的長期持續(xù)應用來說，這是不方便的。GLP-1融合蛋白保留了GLP-1的活性，而且具有更長的半衰期(14-17天)，可溶性和轉鐵蛋白(mTf)的生物分布特性。這些特性使得成本低，體積小，可以每月進行s.c.(皮下)注射，這種類型的產(chǎn)品完全是長期持續(xù)使用所需的。
胰島素人胰島素含有兩條肽鏈，稱作A和B鏈，長度分別為21個和30個氨基酸，通過兩個胱氨酸二硫鍵連接。該肽具有約6kDa的分子量。胰島素的直接前體是胰島素原，胰島素原(proinsulin)是由B鏈和A鏈組成的單鏈肽，通過堿性殘基的相鄰配對被連接到被稱作C肽的約31個氨基酸的連接肽上。這三個肽在胰島素原分子中以氨基末端開始，排列如下B鏈-Arg-Arg-C-肽-Lys-Arg-A鏈。但是，當被轉化為mRNA時，生成前胰島素原，其含有在氨基末端連接長度為24個氨基酸的極度疏水的信號肽的胰島素原。
前胰島素原在胰島中的胰腺p細胞中被合成，胰島分布在整個胰腺中。信號肽的去除在粗面內質網(wǎng)中發(fā)生，然后生成的胰島素原被轉運到高爾基體中，被包裝成分泌顆粒。折疊的胰島素原通過二硫鍵被穩(wěn)定。在分泌顆粒的加工過程中，折疊的胰島素原分子的配對堿性殘基被特定的蛋白酶裂解，釋放胰島素和C肽。
在美國，糖尿病是一種襲擊約1700萬人或者6.2％人口的疾病。每年大約100萬20歲以上的人被診斷為患有糖尿病，在美國，糖尿病是第六大導致死亡的原因(http//www.niddk.nih.gov/health/diabetes/pubs/dmstats/dmstats.htm7)。大約90-95％的糖尿病病例為2型糖尿病，以前稱作成人型(adult-onset)糖尿病，該病開始為胰島素抗性(機體細胞不能正確地利用胰島素)，進展為胰腺不能生產(chǎn)胰島素。1型糖尿病，以前稱作幼年型糖尿病或者胰島素依賴的糖尿病，構成其余的5-10％的糖尿病病例。在1型糖尿病中，機體免疫系統(tǒng)破壞胰腺中生產(chǎn)胰島素的β細胞。
由于人胰島素僅含有51個氨基酸殘基，容易通過重組技術來制備，并且已經(jīng)制備大量胰島素類似物和變體。這些類似物或變體的任何一種可以被用于制備本發(fā)明的mTf融合蛋白。
糖尿病患者通常需要胰島素替代治療，包括每天通過皮下注射一種或多種劑量的藥物。但是，通過注射進行治療在心理上和生理上都是令人痛苦的，并且需要技術技巧，在施用注射中，許多糖尿病患者需要幫助。但是，由于胰島素在GI道特別是在胃的酸性環(huán)境中被快速降解，胰島素的口服制劑是不成功的。然而，作為注射的替代，例如口服、鼻腔的和局部制劑都被試驗過。美國專利5,824,638，Burnside等，描述了口服的乳劑制備物，其中胰島素被溶解在親水相中，例如水、鹽水或易溶于水的醇，用表面活性劑分散在親水相中，例如長鏈脂肪酸或脂肪酸酯。雖然乳劑使胰島素被分散，卻不能防止肽受到苛刻的胃環(huán)境的破壞。美國專利6,427,681，Gonda等中公開了在氣霧中將胰島素遞送到肺部的鼻腔制備物，在美國專利6,399,566，Dardai等公開了局部制備物。
也已經(jīng)開發(fā)出用于注射的被修飾的胰島素，含有氨基酸取代或糖基化殘基，來提高活性、抑制降解或抑制肽聚集(參見美國專利4,478,746，Kim等，糖基化的胰島素衍生物；美國專利4,992,418，Katsoyanis等，含有Asp10的胰島素(B鏈)來提高活性；美國專利5,716,927，Balschmidt等，B鏈的位置28上的Lys或Arg，或由Asn修飾為A18、A21或B3，或者B鏈的C末端的其它修飾來防止凝集和活性降低)。其它氨基酸取代物被乙?；?，賦予較長的活性期，被公開在美國專利5,750,497，Havelund等。A21 B3和B30可以用除了Lys、Arg或Cys外的任何氨基酸取代。B1可以被刪除，而B30可以用10-24個碳原子的親脂鏈取代。用于改進胰島素的重組生產(chǎn)的融合蛋白(較高的產(chǎn)量、溶解性，正確折疊)被描述在美國專利6,534,288，Habermann等。這些肽在B鏈的氨基末端含有融合部分，接著為氨基酸RDVP-Yn-A鏈，其中Y是長度為2-50個氨基酸的肽，以堿性氨基酸結束。
本發(fā)明包括包含轉鐵蛋白和胰島素蛋白或肽的融合蛋白。在一個實施方案中，融合蛋白被配制成用于口服遞送。因此，本發(fā)明還包括給需要的患者特別是糖尿病患者口服施用本發(fā)明的胰島素融合蛋白的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括包含單鏈胰島素類似物的轉鐵蛋白融合蛋白(Lee等，2000，Nature，408483)。在另一個實施方案中，轉鐵蛋白融合蛋白中的胰島素可能含有特異于胃腸道(GI)或胃腸道特定部分的蛋白酶裂解位點，使得該位點將被GI道的一種或多種酶識別。胰島素原可以以這種方式被激活。該裂解位點存在于連接A和B鏈的肽中。
EPO模擬肽(EMP)促紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，在哺乳動物腎臟中被合成，用于刺激有絲分裂性的細胞分裂和紅細胞前體細胞分化。因此，EPO起刺激和調節(jié)紅細胞生成。由于EPO在紅細胞生成中的作用，EPO可用于特征為低紅細胞生成或紅細胞生成缺陷的血液紊亂的診斷和治療中。
研究證明了EPO治療在各種疾病狀態(tài)、紊亂和造血無規(guī)律狀態(tài)中的效果，例如β-地中海貧血(Vedovato等(1984)Acta.Haematol.71211-213)；囊性纖維化(Vichinsky等(1984)J.Pediatric 10515-21)；妊娠和月經(jīng)紊亂(Cotes等(1983)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90304-311)；早期早熟貧血(early anemia ofprematurity)(Haga等(1983)Acta Pediatr.Scand.72827-831)；脊髓損傷(Claus-Walker等(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65370-374)；太空飛行病(space flight)(Dunn等(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52178-182)；急性失血(Miller等(1982)Brit.J.Haematol.52545-590)；老化(udupa等(1984)J.Lab.Clin.Med.103574-588)；伴隨異常紅細胞生成的各種贅生性疾病(Dainiak等(1983)Cancer 51101-1106)；和腎臟機能不全(renal insufficiency)(Eschbach等(1987)N.Eng.J.Med.31673-78)。在最近十五年中，EPO已經(jīng)被用于治療腎衰竭的貧血、與類風濕性關節(jié)炎相關的慢性疾病的貧血、炎癥性腸道疾病、AIDS和癌癥，以及用于治療造血惡化(hematopoietic malignancies)、骨髓移植后和自體固有的血液捐獻(autologous blood donation)的貧血。
EPO活性受其受體的調節(jié)。EPO受體(EPO-R)屬于生長因子類型的受體，被配基誘導的蛋白質二聚化激活。其它激素和細胞因子，例如人生長激素(hGH)、粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、表皮生長因子(EGF)，而胰島素能夠交聯(lián)兩分子受體，生成并置的兩個細胞質尾部。許多這些二聚化活化的受體在細胞質尾部具有蛋白激酶結構域，在二聚化的基礎上磷酸化尾部。而一些細胞質尾部缺少內在的激酶活性，這些功能與蛋白質激酶相關。EPO是后一種類型。在各種情況下，磷酸化導致信號路徑的活化。
人們對具有EPO性能的分子模擬物越來越感興趣。例如，在存在天然EPO或合成的EPO模擬肽(EMP)時，促紅細胞生成素受體(EPOR)的二聚化是細胞內事件，引起受體活化和下游信號轉換事件?？傊?，目的在于獲得具有與EPO等價效能的模擬物。
Wrighton等(1996，Science，273458-463)采用噬菌體展示方法，其中隨機肽被暴露在絲狀噬菌體的衣殼蛋白上。在該篩選系統(tǒng)中，隨機肽噬菌體文庫可以結合到EPO受體的細胞外結構域上，隨后被洗脫下來。首先采用弱結合系統(tǒng)捕獲具有CRIGPITWVC(SEQ ID NO10)的一致序列的EPO弱結合結構域(Kd 10mM)。隨后，分離出相對于200pM的EPO，親合性(Kd)為200nM的20個氨基酸的肽EMP1，(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG，SEQ ID NO11)，該序列實際上不存在于天然的EPO中。這種模擬的激動劑肽的復合物具有EPO受體的細胞外結構域，在2.8辨析率下的晶體結構表明，肽二聚體誘導該受體的幾乎完美的雙重(twofold)二聚化(Livnah等，1996 Science，273(274)464-471)。這種20個氨基酸的肽具有b-片層結構，通過C-C二硫鍵穩(wěn)定。
EMP1的生物學活性表明EMP1可以作為一種EPO模擬物。例如EMP1在受體結合分析中與EPO競爭，引起被遺傳工程化來對EPO響應的細胞系的細胞增殖(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。在對EPO響應的細胞中，EPO和EMP1都誘導類似的磷酸化事件的級聯(lián)和細胞周期進展(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。此外，通過兩種的體內分析初生紅細胞生成的不同方法進行監(jiān)控，證明EMP1在小鼠中具有顯著的促紅細胞生成作用(Wrighton等，1996，Science，273458-463)。
Johnson等(1998，Biochemistry，373699-3710)確定在分析EPO模擬作用中仍保留活性的最小肽。采取N末端和C末端刪除，他們發(fā)現(xiàn)最小活性肽為具有序列YSCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO12)的EMP20，即EMP1的氨基酸4-16。他們還發(fā)現(xiàn)EMP1的Tyr4和Trp13對于模擬作用十分重要。
本發(fā)明提供半衰期延長的EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白，以及包含這種融合蛋白的藥物組合物。任何EMP1序列可以被用于制備EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白，包括EMP1序列，其中一個或多個C殘基被刪除或替換。然后這些序列被插入到mTf環(huán)中，給融合蛋白的EMP1區(qū)域提供三維結構。本發(fā)明包括用融合蛋白治療各種與EPO相關的疾病和病癥的用途，例如但是不限于上述疾病和病癥。
在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物包含EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白，可以通過任何已經(jīng)建立的配制藥物組合物的方法來配制，例如在雷明頓藥物科學，1985中所描述的方法。該組合物可以是適合系統(tǒng)注射或灌注的形式，因而可以與合適的液體媒介物例如無菌水或等滲鹽水或葡萄糖溶液一起配制。這些藥物組合物含有緩沖液、鹽和其它賦形劑來穩(wěn)定組合物或者輔助遞送轉鐵蛋白融合蛋白。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供用于治療與EPO相關的紊亂的方法。該方法通過在有效緩解紊亂的病癥的條件下，即有效影響二聚化和EPO受體生物學活性的條件下，施用在此提供的EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白一段時間來實現(xiàn)。在為EPO的情況下，這種方法可用于治療晚期腎衰竭/透析；貧血，特別是與AIDS或慢性炎癥性疾病例如類風濕性關節(jié)炎和慢性腸道炎癥相關的貧血；自體免疫性疾病；以及用于必要時，例如在手術之前或作為輸液的預處理，增加患者的紅細胞數(shù)量。本發(fā)明的EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白作為EPO激動劑，可以被用于激活巨核細胞。
由于EPO已經(jīng)被證明對血管內皮細胞具有促有絲分裂和趨化作用，也作用于中樞膽堿能神經(jīng)元(Amagnostou等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87597805982；Konishi等(1993)Brain Res.60929-35)，本發(fā)明的化合物還可以被用于治療各種血管疾病，例如促進傷口愈合，側支冠狀血管生長(例如在心肌梗塞后發(fā)生)，損傷和血管移植后處理，以及各種神經(jīng)學紊亂，通常表現(xiàn)為絕對水平低的乙酰膽堿，或與其它刺激神經(jīng)組織的物質如神經(jīng)傳遞素相比，乙酰膽堿的水平相對低。
因此，本發(fā)明包括包含作為活性成分的本發(fā)明的EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白以及藥物載體或稀釋劑的藥物組合物。本發(fā)明的EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白可以通過口服、胃腸外(肌肉內、腹膜內、靜脈內(IV)或皮下注射)、經(jīng)皮(被動地或者采用離子電滲療法或電穿孔)或者經(jīng)粘膜(鼻腔、陰道、直腸或舌下)的施用路徑以適合于各種施用路徑的劑量形式被施用。
用于口腔施用的固體劑量形式包括膠囊、片劑、藥丸、粉末和顆粒。在這種固體劑量形式中，活性化合物與至少一種藥學上可接受的惰性載體，例如蔗糖、乳糖或淀粉一起混合。對于通常實踐，這種劑量形式還可以包含惰性稀釋劑外的其它物質，例如滑潤劑如硬脂酸鎂。在為膠囊、片劑和藥丸的情況下，該劑量形式還可以包含緩沖劑。片劑和藥丸可以另外地用腸衣制備。
用于口服施用的液體劑量形式包括藥學上可接受的乳化劑、溶液、懸浮液、糖漿，具有通常用于本領域的藥典中含有的惰性稀釋劑，例如水。除了這些惰性稀釋劑外，組合物中還可以包括佐劑，例如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑，以及甜味劑、調味劑和芳香劑。
按照本發(fā)明的用于胃腸外施用的制備物包括無菌的水溶性或非水溶性的溶液、懸浮液或乳液。非水溶性溶劑或媒介物的例子為丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄欖油或玉米油，明膠和可注射的有機酯例如油酸乙酯。這種劑量形式還可以含有佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^例如通過除菌濾器過濾、往組合物中加入滅菌劑、照射組合物或加熱組合物來進行滅菌。還可以在使用之前用無菌水或者其它無菌的可注射的媒介來加工。
用于直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選為栓劑，除了活性物質外，還含有賦形劑例如可可油或栓劑臘。用于鼻腔或舌下施用的組合物用本領域知曉的標準賦形劑來制備。
本發(fā)明的組合物中的活性成分的劑量是可變的；但是，活性成分的用量必需使得能夠獲得合適的劑量形式。劑量選擇取決于期望的治療效果、施用路徑和期望的治療持續(xù)期。通常，在0.001-10mg/kg體重之間的劑量水平被施用給哺乳動物。
此外，本發(fā)明還包括包含EMP1或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白在加工可以用于治療與低或缺乏紅細胞生成相關的疾病的藥物中的用途。這種疾病的例子不限于上述的那些疾病。
T-20和T-1249HIV感染十分流行，并且HIV相關疾病代表了主要的世界性健康問題。雖然已經(jīng)盡極大努力來成功設計有效的治療方法，目前還沒有具有治愈性的抗AIDS的抗逆轉錄病毒藥物。為了開發(fā)這種藥物，HIV生活周期的多個階段被認為是治療干涉的靶點(Mitsuya，H.等，1991，F(xiàn)ASEB J.52369-2381)。例如，病毒編碼的反轉錄酶成為藥物開發(fā)的一個焦點。大量反轉錄酶靶向藥物，包括2′，3′-二脫氧核苷酸類似物例如AZT，ddI，ddc和d4T已經(jīng)被開發(fā)，并被證明對于抵抗HIV是有用的(Mitsuya，H.等，1991，Science 2491533-1544)。這些藥物雖然是有益的，但是可能由于迅速出現(xiàn)耐藥性的HIV突變體，這些核苷酸類似物不具有治愈性(Lander，B.等，1989，Science 2431731-1734)。此外，這些藥物通常具有毒副作用，例如抑制骨髓、嘔吐和肝臟功能異常。
進入抑制劑(Entry inhibitor)顯著區(qū)別于現(xiàn)有類別的抵抗HIV的藥物。其它藥物在被感染的細胞的內部起作用。核苷酸反轉錄酶抑制劑例如AZT和abacavir以及非核苷酸反轉錄酶抑制劑例如nevirapine和efavirenz都是通過滅活反轉錄酶來起作用，HIV一旦進入細胞內部就利用反轉錄酶來復制自身。蛋白酶抑制劑滅活HIV用來包裝自身以排出的病毒蛋白酶。相反，進入抑制劑是位于細胞外膜，干擾病毒最初襲擊相關過程的藥物。
T-20是所有進入抑制劑中被研究最多的一種，是融合抑制劑種類中的首個成員。不同于在細胞內部起作用并靶向參與病毒復制的病毒性酶的現(xiàn)有AIDS藥物，T-20抑制病毒進入細胞和開始其復制過程之前的HIV與宿主細胞的融合。T-20結合到gp41的兩個螺旋狀結構域之一上。gp41是彈性裝載的(spring-loaded)HIV-1蛋白，其在CD4結合到HIV gp-120上時被激活。如果gp41的兩個螺旋狀結構域不能折疊在一起，其融合過程被抑制。T-20結合到gp41上，有效地防止該蛋白質起作用。在早期的單臂(single-arm)臨床試驗中，T-20本身使病毒侵入下降10倍以上，已經(jīng)被證明與蛋白酶抑制劑同樣的有效，并且與其它抗逆轉錄病毒劑聯(lián)合施用是安全的。
美國專利5,464,933公開了T-20(pentafuside，DP-178)作為一種36個氨基酸的合成肽。由于這種藥物是肽，容易被消化系統(tǒng)破壞，因此不能口服施用。當通過皮下注射施用時，T-20在血液中產(chǎn)生具有抗HIV活性的足夠量。一天兩次的皮下施用。但是，患者在注射部位產(chǎn)生皮膚反應。最頻繁報道的與不利事件相關的治療是適度地調節(jié)局部注射位點反應。這反應由注射部位的微痛、腫脹和紅腫構成。
美國專利6,479,055公開DP-178的肽類似物(對應于HIV-1LAI的跨膜蛋白質gp41的氨基酸殘基638-673的肽，其具有抗膜融合能力、抗病毒活性，例如抑制HIV傳播到未被感染的CD-4+細胞中的能力，或者調節(jié)涉及卷曲螺旋肽結構的細胞內處理的能力。此外，本專利涉及DP-178和DP-178的部分和/或類似物作為抗真菌或抗病毒化合物或者作為在涉及卷曲螺旋肽結構的細胞內事件的抑制劑的用途。此外，本專利教導這些肽作為診斷劑的用途。例如，DP178肽可以被用作HIV亞型特異性診斷劑。
T-1249是T-20的姐妹化合物。與T-20類似，T-1249靶向稱作gp41的HIV糖蛋白，HIV利用gp41來結合CD4細胞。在動物和實驗室研究中，T-1249被證明具有潛在的抗HIV作用。在人中，初步的安全、用量和效率的試驗給正在進行的研究提供支持。
目前，通過每天一次或兩次皮下(皮膚下)注射來施用T-1249。第一個在人中進行的T-1249的安全試驗存在兩種嚴重的不利事件超敏性反應(口腔潰瘍、斑丘疹、發(fā)燒)和嚴重的嗜中性白血球減少癥。40％的接受者產(chǎn)生注射部位反應，但是這些反應似乎是溫和的。還報道接受者中出現(xiàn)頭昏眼花、腹瀉、頭痛和發(fā)燒。沒有劑量限制的毒性被確定，并且較高劑量的試驗結果也是類似的。
T-1249已經(jīng)完成了I/II期的安全性和用量的試驗。最初結果表明，較高劑量產(chǎn)生1.3log的平均病毒侵入的下降。
已經(jīng)報道，HIV RNA發(fā)生劑量依賴的下降。在T-1249試驗中，從基線開始的平均下降范圍在0.29-1.96log拷貝/ml(Gulick 2002)。
本發(fā)明提供半衰期延長的包含T-20、T-1249或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白，以及包含該融合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明還提供用于治療目的的包含這些轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明包括這種融合蛋白作為人或非人類的逆轉錄病毒特別是HIV傳播到未被感染的細胞的抑制劑的用途。傳播被本發(fā)明的肽抑制的人的逆轉錄病毒包括，但是不限于HIV-1和HIV-2和人T-淋巴細胞病毒(HTLV-I、II、III)的所有菌株。傳播被本發(fā)明的肽抑制的非人類的逆轉錄病毒包括，但是不限于牛白血性增生病毒(bovine leukosisvirus、貓科肉瘤和白血病病毒(feline sarcoma and leukemia virus)，猿肉瘤和白血病病毒(simian sarcoma and leukemia virus)，以及綿羊漸進性肺炎病毒(sheep progress pneumonia virus)。
對于HIV，包含T-20、T-1249或其類似物的本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白可以被用作治療AIDS的治療劑。采用本領域熟知的方法來施用這些轉鐵蛋白融合蛋白。優(yōu)選地，包含這些轉鐵蛋白融合蛋白的藥物組合物被配制，并被系統(tǒng)地施用。用于配制和施用的技術可以在“雷明頓藥物科學”第18版，1990 Mack Publishing Co.，Easton，Pa中找到。合適的路徑包括口腔、直腸、經(jīng)粘膜或腸道的施；胃腸外遞送，包括肌肉內、皮下、骨髓內注射，以及膜內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射，僅列舉少數(shù)。更加優(yōu)選地，施用是靜脈內的。例如，包含T-20、T-1249或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白可以被配制在水溶液中，優(yōu)選在生理上相容的緩沖液中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或者生理鹽水緩沖液。對于這種經(jīng)粘膜施用，適合被滲透的屏障的滲透劑被用于配制。這種滲透劑是本領域通常所知的。
此外，包含T-20、T-1249或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白可以被用作先前未感染的個體在急性暴露于HIV病毒后的預防措施。肽的這種預防用途的例子包括，但是不限于，預防病毒從母親到嬰兒的病毒傳播，或者傳播到其它可能發(fā)生HIV傳播的環(huán)境中，例如，其中工作人員暴露于含有HIV的血液產(chǎn)品的健康護理環(huán)境中發(fā)生的意外。在這種情況下，包含T-20、T-1249或其類似物的本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白可被用作預防疫苗，在宿主體內產(chǎn)生抵抗本發(fā)明的融合蛋白的抗體，該抗體起抵抗HIV病毒作用，例如抑制進一步的HIV感染。因此，施用本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白作為預防疫苗，將包括給宿主施用一定濃度的轉鐵蛋白融合蛋白，有效產(chǎn)生足以中和HIV的免疫反應，通過例如抑制HIV感染細胞的能力來中和HIV。精確濃度將取決于被施用的轉鐵蛋白融合蛋白中的特定肽，但是可以通過采用分析免疫反應發(fā)生的標準技術來確定，這對于本領域普通技術人員來說是熟知的。通常通過肌肉內施用作為疫苗的轉鐵蛋白融合蛋白。
被施用的包含T-20、T-1249或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白的有效劑量可以通過本領域技術人員熟知的操作來確定，該操作測定如生物半衰期、生物利用度和毒性的參數(shù)。如在下文第6節(jié)中給出的數(shù)據(jù)，例如DP-178，在獲得10ng/ml肽的循環(huán)水平所需的劑量下，被證明在體內是有效的。
此外，本發(fā)明包括包含T-20、T-1249或其類似物的轉鐵蛋白融合蛋白在制備用于治療與病毒傳播相關的疾病的藥物中的用途。
可溶的毒素受體本發(fā)明提供包含可溶的毒素受體和轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白的融合蛋白。如在此所用，術語“毒素”是指生物來源的有毒物質。包含可溶的毒素受體的融合蛋白可被用于治療患有與毒素相關的疾病的患者。這種融合蛋白還可用于診斷目的。
毒素的例子包括，但是不限于，假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒素、相思豆毒素、炭疽毒素、志賀菌毒素、肉毒桿菌毒素、破傷風毒素、霍亂毒素、maitotoxin、水螅毒素、ciguatoxin、textilotoxin、蟾毒素、α芋螺毒素(alpha conotoxin)、泰攀蛇毒素(taipoxin)、河豚毒素、alpha tityustoxin、蛤蚌毒素、類毒素、微囊藻素、烏頭堿、exfoliatin毒素A和B、腸毒素、毒性休克綜合癥毒素(TSST-1)、Y.pestis毒素、氣性壞疽毒素等。由于這些毒素中的部分所引起的疾病的嚴重性，而且它們中的部分容易被獲得并用于生物戰(zhàn)爭，有必要開發(fā)能夠低成本獲得大量可能的抗毒素的方法。
本發(fā)明包括可溶的毒素受體作為抗毒素用于治療和預防與各種毒素相關的疾病的用途。毒素受體是結合到特異的毒素上的分子?？扇艿亩舅厥荏w是能夠被溶解的分子。通常，受體的肽或片段是可溶的。本發(fā)明在于結合特定毒素的毒素受體的可溶的肽或片段。
與上述的其它肽相似，這些肽具有較短的半衰期。本發(fā)明提供包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白上的毒素受體的可溶肽的融合蛋白。與可溶的毒素受體肽相比，生成的融合蛋白的半衰期延長了。該融合蛋白還容易通過重組方法被大量地制備。由于這些可溶的肽的結合特性未被改變，其將會在循環(huán)中結合毒素，并防止毒素結合到目標受體上，從而滅活該毒素。因此，該融合蛋白是潛在的抗毒素。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白上的可溶的毒素受體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含可溶的毒素受體的轉鐵蛋白融合蛋白在制備用于治療或預防與毒素相關的疾病或病癥的藥劑中的用途。
不同于大量制備是困難的和昂貴的抗體，本發(fā)明的轉鐵蛋白/抗毒素融合蛋白高效并且其制備是低成本的。此外，不能期望在一次生物威脅作用后進行大量施用的情況下，免疫能夠維持起保護作用所需的抗體效價。在預期的暴露中大規(guī)模地免疫群體是不切實際的。
炭疽桿菌(Bacillus Anthtracis)毒素受體炭疽毒素是熟知的來自炭疽桿菌的生物戰(zhàn)爭試劑。炭疽桿菌生成三種蛋白質，當被恰當?shù)亟Y合時形成兩種高效的毒素，共同稱作炭疽毒素(anthraxtoxin)。保護性抗原(PA，82，684Da(道爾頓))和水腫因子(EF，89，840Da)結合形成水腫毒素(ET)，而PA和致死因子(LF，90，237Da)結合形成致死毒素(LT)(Leppla，S.H.Alouf，J.E.和Freer，J.H.，編輯Academic Press，London277-302，1991)。ET和LT都遵照AB毒素模式，PA具有目標細胞結合(B)功能，EF或LF作為效應子或催化(A)部分。這些毒素的獨特特征是在缺乏PA時，LF和EF無毒性，這顯然是由于它們無法進入真核細胞的細胞質中。
最近，在細胞中確定致死因子(LF)的靶點中的兩個。LF是一種金屬蛋白酶，其特異性地裂解Mek1和Mek2蛋白激酶，這些酶是MAP-激酶信號路徑中的組成。LF的蛋白質水解活性通過裂解激活促有絲分裂原的蛋白激酶激酶1或2(MEK1或MEK2)來滅活MAP-激酶信號級聯(lián)。(Leppla，S.A.In TheComprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins.J.E.Alouf和J.H.Freer，編輯，第二版，San Diego，Academic Press，1999；243-263)。
PA能夠結合到許多類型的細胞的表面上。在PA結合到易感細胞表面的特定受體上后(Leppla，同上文，1991)，其在單個位點上被細胞表面蛋白酶裂解，可能是費林蛋白酶(furin)，生成氨基末端的19-kDa的片段，該片段從受體/PA復合物上釋放(Singh等，J.Biol.Chem.26419103-19107，1989)。從PA上去除該片段，在結合受體的63-kDa的羧基末端片段(PA63)上暴露LF和EF的高親合性結合位點。PA63和LF或EF的復合物進入細胞，并可能經(jīng)過酸化的內涵體到達細胞溶質。
PA是該毒素的無毒的、結合細胞組分，是目前可以獲得的人疫苗的重要組成。該疫苗通常從炭疽桿菌的Sterne菌株的批量培養(yǎng)中制備，雖然是無毒性的，但是仍然被要求作為III級病原體來處理。除了PA，該疫苗含有少量炭疽毒素部分、水腫因子和致死因子和一定范圍的培養(yǎng)來源蛋白。所有這些因子在一些個體中產(chǎn)生所記載的該疫苗的反應性(reactogenicity)。該疫苗是昂貴的，并且需要六個月進行四次接種。此外，目前的證據(jù)表明，這種疫苗對于抵抗某些菌株的吸入性攻擊是無效的(M.G.Broster等，Proceedings ofthe International Workshop on Anthrax，Apr.11-13，1989，Winchester UK.Salisbury med Bull Suppl No 68，(1990)91-92)。
Bradley等(Nature，2001，414225-229)公開結合PA的人炭疽熱受體的克隆。受體ATR(炭疽毒素受體(anthrax toxin receptor))是I型膜蛋白，由368個氨基酸組成。該蛋白具有一個27個氨基酸的預測的信號肽，含有3個推定的N聯(lián)糖基化位點的293個氨基酸的細胞外結構域、23個氨基酸的推定的跨膜區(qū)域和25個氨基酸的短的胞質尾巴。ATR的一個顯著特征是細胞外結構域由von willebrand因子類型A(VWA)結構域組成，已知該結構域在蛋白-蛋白相互作用中是重要的。這種VWA結構域位于氨基酸44-216上。可溶形式的ATR包含氨基酸41-227，被證明能夠結合炭疽毒素。因此，ATR的VWA結構域直接結合到PA上。
本發(fā)明提供包含炭疽抗毒素，該抗毒素被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上的ATR的細胞外結構域。本發(fā)明還涉及包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上的結合PA的ATR的細胞外結構域的片段的融合蛋白。此外，本發(fā)明涉及包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上的結合PA的ATR的細胞外結構域的小分子模擬物的融合蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明提供被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白上的ATR的氨基酸41-227。
肉毒梭桿菌(Clostridium Botulinum)毒素梭菌神經(jīng)毒素是最毒的物質。人類由于創(chuàng)傷被暴露于由破傷風梭菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素(破傷風毒素)。雖然在全世界發(fā)展中國家中，破傷風毒素仍然是嚴重的公眾健康問題，但是在西方國家，由于在孩童時期進行免疫接種，幾乎每個人都能夠預防破傷風毒素感染。人們常常由于食物中度與由肉毒梭桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素(肉素桿菌毒素)發(fā)生接觸。但是，很少發(fā)生創(chuàng)傷肉毒桿菌中毒和稱作嬰兒肉毒桿菌中毒的嬰兒定居感染。由于很少發(fā)生肉毒桿菌中毒，由于費用和疫苗的不利反應的預期比例，普通人群的免疫接種沒有得到保障。因此，人們對肉毒桿菌毒素沒有抵抗力。此外，這些毒素相對容易制備。結果，肉毒桿菌毒素是可能的生物戰(zhàn)爭試劑。
如所討論，厭氧的、革蘭氏陽性細菌肉毒梭桿菌生成最毒的生物神經(jīng)毒素，已知人類致死劑量為毫微克(ng)。毒素作用的范圍從導致腸道破壞的腹瀉疾病到能夠導致死亡的癱瘓作用。肉毒梭桿菌的孢子存在于土壤中，在未被正確滅菌和密封的家用罐裝的食物容器中生長，這就是許多肉毒桿菌中毒案例的病因。肉毒桿菌中毒的病癥通常出現(xiàn)在食用被肉毒梭桿菌培養(yǎng)物或孢子感染的食物后的18-36h。肉毒桿菌毒素顯然能夠穿過腸道的內膜而不被滅活，并攻擊外周的運動神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素中毒的病癥可以從行走、吞因和言語困難到呼吸肌癱瘓和死亡。
根據(jù)毒素進入血流的方法，肉毒桿菌中毒疾病可以分為4類。由于攝食未正確保存和不完全加熱的含有肉毒桿菌毒素的食物造成的食物攜帶肉毒桿菌中毒(即在攝食之前該毒素已經(jīng)形成)。由于肉毒梭桿菌穿過受損組織并產(chǎn)生毒性，該毒素被吸收到血流中而造成的創(chuàng)傷誘導的肉毒桿菌中毒。自從1950年以來，有30個創(chuàng)傷誘導的肉毒桿菌中毒被報道(Swartz，″厭氧孢子形成桿菌梭菌”(Anaerobic Spore-Forming BacilliThe Clostridia)，633-646，載于Davis等，(編輯)，Microbiology，第4版，J.B.Lippincott Co.(1990))。當毒素被吸入時引起的吸入性肉毒桿菌中毒。已經(jīng)報道，吸入性肉毒桿菌中毒是由于意外暴露于實驗室的結果(Holzer，Med.Klin.，411735 )，并且如果該毒素被用作生物戰(zhàn)爭的試劑，是一種潛在危險(Franz等，載于肉毒桿菌和破傷風神經(jīng)毒素(Botulinum and Tetanus Neurotoxins)，DasGupta(編輯)，PlenumPress，New York ，473-476)。由于肉毒梭桿菌定居嬰兒的腸道并產(chǎn)生毒素和吸收到血流中而引起的感染性嬰兒肉毒桿菌中毒。
不同的肉毒梭桿菌菌株產(chǎn)生用字母A-G命名的抗原性上相互區(qū)別的毒素。血清型A毒素涉及26％食物肉毒桿菌中毒的病例，類型B、E和F也涉及較小比例的食物肉毒桿菌中毒的病例(Sugiyama，Microbiol.Rev.，44419(1980))。已經(jīng)報道，創(chuàng)傷性肉毒桿菌中毒僅由A或B型毒素引起(Sugiyama，同上文)。幾乎所有的嬰兒肉毒桿菌中毒的病例都是由產(chǎn)生類型A或類型B的毒素細菌引起(例外地，一個新墨西哥州的病例是由產(chǎn)生類型F的毒素的肉毒梭桿菌引起，另一個是由產(chǎn)生類型B-類型F雜合體的肉毒梭桿菌引起)(Arnon，Epidemiol.Rev.，345(1981))。類型C毒素影響水禽、牛、馬和貂。類型D毒素作用于牛，而類型E毒素作用于人和鳥類。
肉毒梭桿菌神經(jīng)毒素作用于神經(jīng)末梢來阻斷乙酰膽堿釋放。神經(jīng)毒素通過其重鏈結合到膜受體上，這在毒素作用模式中是最重要的一步。Li等(J NatToxins 1998，7(3)215-26)采用神經(jīng)毒素親合柱層析法，從大鼠大腦突觸體中純化類型E肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/E)或類型A的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/A)。用0.5M NaCl從親合層析柱上洗脫下來的蛋白質餾分含有57kDa蛋白質作為主要的洗脫物。用抗突觸結合蛋白的抗體免疫印跡洗脫物，結果表明57kDa蛋白質是突觸結合蛋白I。已經(jīng)有人提出，在大鼠大腦中，大鼠突觸結合蛋白I是BoNT/B的受體(Nishiki等，J.Biol.Chem.269，10498-10503，1994)。Li等通過微量滴定板方法研究BoNT/A和BoNT/E與突觸結合蛋白I的結合。在用BoNT/E預培養(yǎng)該蛋白質后，突觸結合蛋白I對覆蓋在平板上的BoNT/A的結合競爭性地下降，表明BoNT/A和BoNT/E競爭性地結合到該受體上。綜合考慮，這些結果表明，相同的受體蛋白結合到所有被檢測的三種BoNT血清型上。
突觸結合蛋白I是肉毒梭桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B和E以及可能C、D、F和G的作用受體。其位于運動神經(jīng)元細胞上。突觸結合蛋白I的N末端片段，氨基酸1-53(SEQ ID NO4)負責結合各種神經(jīng)毒素血清型。該結合介導神經(jīng)毒素轉移到細胞中，并且阻斷神經(jīng)傳遞素的釋放，導致癱瘓，以及在極端情況下導致死亡。N末端片段可以通過重組方法來制備，并用于結合循環(huán)中的神經(jīng)毒素。該片段結合到神經(jīng)毒素上阻止神經(jīng)毒素結合其目標受體，從而中和該毒素。
本發(fā)明的目的在于提供肉毒梭桿菌的抗毒素，與重組制備的53個氨基酸的片段相比具有顯著更長的半衰期，使得該抗毒素在進入循環(huán)后有足夠的時間來尋找和結合神經(jīng)毒素。本發(fā)明提供包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白上的突觸結合蛋白I的N末端的53個氨基酸的融合蛋白，從而延長該片段的半衰期而不改變該片段的結合特性?？商娲兀撈慰梢酝ㄟ^化學方法被PEG化來延長其循環(huán)壽命。較長的抗毒素的半衰期將使給定劑量更加有效。與抗體不同，本發(fā)明的抗毒素融合蛋白廣泛地作用和結合到數(shù)個神經(jīng)毒素血清型上，特別是神經(jīng)毒素A、B和E。
在優(yōu)選實施方案中，在高效的微生物制備系統(tǒng)中被制備融合蛋白，該系統(tǒng)在合理的費用下生成大量抗毒素，在生物威脅作用中大量暴露后來治療群體。該融合蛋白還可以被用于暴露前的預防模式。
本發(fā)明還包括包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白分子上的突觸結合蛋白I的氨基酸1-53的肽片段或突觸結合蛋白I的氨基酸1-53的小分子模擬物的抗毒素。
融合蛋白還可以被用于阻斷肉毒桿菌通過食物或空氣污染在民眾中傳播。
在本發(fā)明的一個方面，抗毒素融合蛋白被用于治療在治療各種疾病例如偏頭痛性肌張力障礙(migraine dystonia)和多汗中由于藥物使用和意外過度劑量的肉毒桿菌神經(jīng)毒素導致的創(chuàng)傷性肉毒桿菌中毒。
在本發(fā)明的另一個方面，抗毒素融合蛋白被用于治療食物中毒引起的肉毒桿菌中毒。
白喉毒素受體白喉由細菌白喉棒桿菌引起，該細菌通常感染粘膜鼻子和咽喉是感染發(fā)生的最常見部位，但是眼睛粘膜或生殖器粘膜也會被感染。該細菌生成對組織產(chǎn)生損害的毒素，該損害在原始感染部位或一旦毒素通過血流擴散時會在機體的其它部位產(chǎn)生損害。白喉毒素的最嚴重的作用發(fā)生在心臟(肌肉損傷導致喪失泵血能力)、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)。
可以通過給予青霉素或其它抗生素來殺死細菌，以及用抗毒素清除機體中游離的毒素來治療白喉。但是抗毒素不能夠清除已經(jīng)結合到細胞上并且開始損傷細胞的毒素。較好的方法是，給予類毒素來刺激對毒素的免疫性，從而使機體能夠在一旦毒素出現(xiàn)就清除掉。對細菌毒素例如白喉毒素(DT)的免疫性可以在感染過程中天然地獲得或者通過注射脫毒形式的毒素(即類毒素)來人為地獲得(Germanier，編輯，Bacterial Vaccines，Academic Press，Orlando，F(xiàn)la.，1984)。類毒素通常通過化學修飾天然毒素來制備(例如，用福爾馬林或甲醛)(Lingood等，Brit.J.Exp.Path.44177，1963))，使它們無毒性，而仍然保留抗原性，該抗原性保護被免疫的動物抵抗天然毒素的隨后的攻擊；化學滅活的DT的一個例子是Michel和Dirkx(Biochem.Biophys.Acta 491286-295，1977)中所描述的，其中片段A的Trp-153是被修飾的殘基。類毒素最開始在2、4和6月齡給予，在18月齡和5歲再次給予，此后有規(guī)律地每10年給予一次。
數(shù)年來，白喉已不再是主要的公眾健康威脅。但是，最近在前蘇聯(lián)的新獨立國家、厄瓜多爾、泰國、阿爾及利亞和其它國家中，又出現(xiàn)了白喉。雖然白喉患者已經(jīng)用中和未結合的毒素的馬抗毒素治療，但是存活的患者常常出現(xiàn)血清學疾病，一種免疫復合物類型的疾病。因此，有必要開發(fā)更好的治療白喉患者的方法。
DT分子作為535個氨基酸的單一多肽被制備，由于在殘基190、192或193上被斷裂，該多肽容易被剪切來形成通過二硫鍵連接的兩個亞基，片段A(約21Kda的N末端)和片段B(約37Kda的C末端)(Moskaug，等，Biol Chem26415709-15713，1989；Collier等，Biol Chem，2461496-1503，1971)。片段A是DT的催化活性部分。DT是一種NAD依賴的ADP核糖基轉移酶，其特異性地靶向稱作為伸長因子2(EF-2)的蛋白質合成因子，從而滅活EF2并關閉細胞中的蛋白質合成。片段A由白喉毒素C-結構域組成。片段A通過多肽環(huán)被連接到白喉毒素片段B上。DT的片段B具有受體結合結構域(R結構域)，其識別毒素分子，并將其結合到存在于許多類型哺乳動物細胞的表面上的特定受體結構上。一旦DT通過該受體結構結合到細胞上，該受體/DT復合物被細胞通過受體介導的細胞內吞作用而吸收。片段B上的第二個功能區(qū)域(T結構域)起轉移DT穿過內吞囊泡的膜的作用，將催化活性片段A釋放到細胞的細胞溶質中。單一的片段A分子足以使特定細胞中的蛋白質合成機制失效。
Naglich等(Cell，1992，691051-1061)描述從高度毒素敏感的猴Vero細胞中表達克隆白喉毒素受體。發(fā)現(xiàn)受體氨基酸序列與細胞表面表達的肝素結合的表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)前體(proHB-EGF)的序列相同。雖然proHB-EGF被斷裂，并作為可溶的成熟HB-EGF被釋放(Goishi等，Mol.BiolCell，1995，6967-980)，高含量的proHB-EGF仍然存在于細胞表面，并作為近旁分泌的(juxtacrine)生長因子(Hagashiyama等，Science，，251929-938)和作為DT受體(Iwamoto等，EMBO J.，1994，132322-2330；Naglich等，Cell，1992，691051-1061)起作用。
Hooper等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1995，206710-717)證明，由殘基63-148(細胞外結構域或成熟的生長因子)構成的重組成熟人HB-EGF強烈地抑制放射性標記的DT結合到攜帶毒素受體的細胞上。該結果表明，有可能用成熟的HB-EGF治療白喉患者，HB-EGF是一種天然的神經(jīng)生長因子，不會引起血清學疾病。但是，成熟的HB-EGF具有生長因子活性，可能會產(chǎn)生副作用。
Cha等(Infection and Immunity，2002，70(5)2344-2350)開發(fā)了基于人DT受體/HB-EGF前體的治療劑。他們描述了重組的截斷HB-EGF，由殘基106-149組成，缺乏肝素結合結構域的大部分，能夠抑制放射性碘標記的DT結合到細胞上。但是，他們證明，該重組截斷HB-EGF是比重組的成熟HB-EGF更為有效的DT結合抑制劑。另外，這些研究人員突變了重組截斷HB-EGF的EGF樣結構域中一些殘基來破壞其部分促有絲分裂作用。已經(jīng)證明，受體類似物(I117A/L148A)具有更低的促有絲分裂作用。截斷的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白仍然保留高度DT結合親合性。Cha等的工作表明，截斷的HB-EGF蛋白是安全的EGF受體的抗毒素。
本發(fā)明提供包含被融合到轉鐵蛋白或被修飾的轉鐵蛋白上的截斷的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的抗毒素融合蛋白。本發(fā)明還提供包含結合DT并具有最小促有絲分裂活性的截斷的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的片段的轉鐵蛋白/抗毒素融合蛋白。此外，本發(fā)明提供包含結合DT并具有最小促有絲分裂活性的截斷的(I117A/L148A)HB-EGF蛋白的類似物的轉鐵蛋白/抗毒素融合蛋白。
其它毒素受體細菌蘇云金芽孢桿菌(BT)(Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生細菌蛋白，該蛋白對于有限范圍內的昆蟲有毒，主要是鱗翅目的、鞘翅目的和雙翅目的。Bt毒素被用于控制病蟲害，通過將蘇云金芽孢桿菌應用于植物或轉化植物本身，使得植物借助其轉基因特性產(chǎn)生毒素。如Hofte，H.等Microbiol Rev(1989)53242所描述，該毒素本身是cry基因的糖蛋白產(chǎn)物。美國專利5,693,491描述了來自煙草天蛾幼蟲的編碼糖蛋白受體的cDNA，其結合蘇云金芽孢桿菌的毒素。cDNA的獲得，使得可以在其它昆蟲和生物體中修復編碼同源受體的DNA，設計分析潛在的殺蟲劑的細胞毒性和結合親合性的方法，以及開發(fā)加工天然的和/或導入的同源受體的方法，從而破壞目標細胞、組織和/或生物體。
大部分通過刪除編碼霍亂毒素(CT)的ctxA基因而構建的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)疫苗能夠產(chǎn)生高的抗體反應，但是，半數(shù)以上的疫苗仍然會引起中度腹瀉(Levine等，Infect.Immun.，56(1)161-167(1988))。考慮在缺乏CT時產(chǎn)生的大量腹瀉，推測霍亂弧菌產(chǎn)生其它腸道毒素因子，這種因子仍存在于刪除了ctxA序列的菌株中(Levine等，同上文)。結果，發(fā)現(xiàn)由霍亂弧菌產(chǎn)生的第二種毒素zonula occludens毒素(下文稱作“ZOT”)，其導致了其余的腹瀉(Fasano等，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，85242-5246(1991))。Zot基因緊鄰ctx基因。在霍亂弧菌菌株中同時存在高比例的zot基因和ctx基因(Johnson等，J.Clin.Microb.，31/3732-733(1993)；和Karasawa等，F(xiàn)EBSMicrobiology Letters，106143-146(1993))，這表明在急性脫水性腹瀉型的霍亂的病因中，ZOT可能起協(xié)同作用。還在其它腸道病原體中確定了zot基因(Tschape，2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salomellosis，47(摘要)(1994))。美國專利5,864,014公開了純化的zonula occludens毒素的受體。
腹瀉可以由小的、熱穩(wěn)定肽毒素(ST)引起，這些肽毒素由各種病原性細菌產(chǎn)生(Thompson，M.R.，1987，Pathol.Immunopathol.Res.6，103-116)。在發(fā)展中國家中，這種毒素引起被報道的腹瀉病例的50％-80％(Giannella，R.A.，1981，Ann.Rev.Med.32，341-357)。在實驗室和家養(yǎng)動物中，ST也是主要的腹瀉病因(Burgess等，1978，Infect.Immun.21，526-531)。已經(jīng)證明，在腸道中，熱穩(wěn)定性腸毒素結合到細胞表面受體上，隨后引起鳥苷酸環(huán)化酶的活化(Field等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，2800-2804；Guerrant等，1980，J.InfectiosDiseases 142，220-228)。然后，環(huán)化GMP的增多刺激液體分泌，從而引起腹瀉。已經(jīng)報道，根據(jù)部分層析從鳥苷酸環(huán)化酶中分離去垢劑所溶解的ST結合蛋白，ST受體是顯著地區(qū)別于鳥苷酸環(huán)化酶的蛋白。(Kuno等，1986，J.Biol.Chem.261，1470-1476；Waldman，等，1986，Infect.Immun.51，320-326)。美國專利5,237,051公開克隆編碼腸道受體的核酸，該受體識別熱穩(wěn)定腸毒素，并具有鳥苷酸環(huán)化酶活性。數(shù)據(jù)表明，該受體通常通過環(huán)化的GMP第二信使系統(tǒng)來結合腸毒素和信號。
膿毒癥(Sepsis)最通常由感染或由毒素誘導的損傷引起。膿毒癥的最初病癥通常包括寒戰(zhàn)、大汗、無規(guī)律的間歇性發(fā)燒、虛弱等，接著為持續(xù)發(fā)燒，血壓過低導致休克，嗜中性白血球減少癥，白血球減少癥，彌漫性血管內凝血，成人呼吸窘迫綜合癥和多重器官衰竭。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥誘導的毒素與病原性細菌、病毒、植物和毒液相關。在被充分描述的細菌中，毒素是革蘭氏陰性細菌的內毒素或脂多糖(LPS)。這些分子是廣泛存在于革蘭氏陰性菌的外膜中的糖脂類。已經(jīng)報道，膜固定的CD14作為蛋白質結合內毒素(LPS)復合物的受體，并介導內毒素的細胞作用(Wright等，1990，Science，2491431)。在氨基酸71處截斷的可溶的CD14(N71)含有脂糖結合序列。已經(jīng)證明，N71中和循環(huán)中的LPS，即作為內毒素的拮抗劑(Higuchi等，Pathobiology，2002，70103)。
遞送抗毒素融合蛋白的方法在一個實施方案中，本發(fā)明的抗毒素融合蛋白將被包裝在具有兩個相鄰腔室的單活塞注射器中。第一個腔室將含有稀釋劑，第二個腔室含有凍干的抗毒素融合蛋白。當下壓活塞時，稀釋劑會被推進到下一個腔室中，溶解抗毒素融合蛋白，而融合蛋白將會從針頭中排出用于直接肌肉內注射。該稀釋劑可以含有抗凍劑例如甘油，以在冷藏條件下起作用。該凍干產(chǎn)品在溫熱條件下仍然保持穩(wěn)定。
本發(fā)明包括以這種方式將本發(fā)明的抗毒素融合蛋白遞送給進入戰(zhàn)場的士兵，在該條件下他們暴露于毒素的危險性很大?？苟舅厝诤系鞍卓梢员挥糜谠趹?zhàn)場上的直接治療和作為奔赴戰(zhàn)場前的預防藥。
核酸本發(fā)明還提供編碼包含被共價地連接或結合到治療性蛋白質，優(yōu)選為治療性蛋白質上的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白部分的轉鐵蛋白融合蛋白的核酸分子。如下文更加詳細的討論，任何治療性蛋白質可以被使用。融合蛋白還可以包含接頭區(qū)，例如少于約50個、40個、30個、20個或10個氨基酸殘基的接頭。該接頭被共價地連接到轉鐵蛋白或其部分與治療性蛋白質，優(yōu)選治療性蛋白質之間。本發(fā)明的核酸分子被純化或未被純化。
用于復制核酸分子和表達被編碼的融合蛋白的宿主細胞和載體也被提供。任何載體或宿主細胞都可以被使用，無論是原核或真核的細胞，但是真核表達系統(tǒng)，特別是酵母表達系統(tǒng)是優(yōu)選的。許多用于該目的載體和宿主細胞在本領域是已知的。選擇用于期望應用的恰當表達系統(tǒng)完全在本領域的能力內。
編碼轉鐵蛋白、轉鐵蛋白部分和目標治療性蛋白的DNA序列可以從本領域知曉的各種基因組或cDNA文庫中克隆得到。采用探針方法分離這種DNA序列的技術是常規(guī)技術，是本領域技術人員熟知的。用于分離這種DNA序列的探針可以基于公開的DNA或蛋白質序列(參見，例如，Baldwin，G.S.(1993)來自不同物種的轉鐵蛋白的比較Comp.Biochem.Physiol106B/1203-218及其所引用的全部參考文獻，在此全部引入作為參考)?？商娲兀梢圆捎肕ullis等(美國專利4,683,195)和Mullis(美國專利4,683,202)描述的聚合酶鏈式反應(PCR)方法，在此引入作為參考。用于分離這種DNA序列的文庫的選擇和探針的選擇在本領域普通技術人員水平內。
如本領域所知，兩條多核苷酸或多肽之間的“相似性”，是通過將一條多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物與第二條多核苷酸或多肽的序列比較來確定。如本領域所知，“同一性”是指兩條多肽或兩條多核苷酸序列之間的序列相關程度，通過鑒定這種序列兩條鏈之間的匹配程度來確定。同一性和相似性都很容易計算(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，編輯，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編輯，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編輯，M Stockton Press，NewYork，1991)。
雖然存在大量測定兩條多肽或多核苷酸序列之間的同一性和相似性的方法，術語“同一性”和“相似性”對于技術人員來說是熟知的(SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，等，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。通常用于確定兩條序列之間的同一性或相似性的方法包括，但是不限于那些被公開在Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，編輯，Academic Press，SanDiego，1994，和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.481073(1988)的方法。
確定同一性的優(yōu)選方法被設計來在兩條被檢測的序列之間產(chǎn)生最大匹配。確定同一性和相似性的方法被編寫在計算機程序中。確定兩條序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選的計算機程序方法包括，但是不限于，GCG程序軟件包(Devereux，等，Nucl.Acid Res.12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，等，J.Mol.Biol.215403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被確定為兩條序列之間的相同程度，通常表示第一條序列衍生于第二條序列。兩條核酸序列之間的相同程度可以通過本領域知曉的計算機程序來確定，例如在GCG程序軟件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch J.MolBiol.48443-453(1970))。為了確定本發(fā)明的兩條核酸序列之間的相同程度，使用GAP，具有如下設定5.0的GAP產(chǎn)生(creation)罰分和0.3的GAP延長(extension)罰分。
密碼子優(yōu)化遺傳密碼的簡并性使得可以改變轉鐵蛋白和/或目標的治療性蛋白質的核苷酸序列，而仍然生成具有與天然DNA序列編碼的多肽相同的氨基酸序列的多肽。該操作稱作“密碼子優(yōu)化”(被描述在美國專利5,547,871中，在此全文引入作為參考)，提供設計這種被改變的DNA序列的方法。密碼子優(yōu)化的基因的設計應當考慮各種因素，包括生物體中密碼子利用的頻率、最接近的鄰近頻率、RNA穩(wěn)定性、二級結構形成的可能性、合成路徑以及確定的將會對該基因進行的DNA操作。特別地，當采用酵母表達系統(tǒng)時，采用可獲得的方法來用那些最容易被酵母識別的密碼子替換編碼特定融合蛋白的密碼子。
遺傳密碼的簡并性使得相同的氨基酸序列可以用多種不同方式來編碼和翻譯。例如，亮氨酸、絲氨酸和精氨酸分別由六種不同的密碼子編碼，而纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和甘氨酸分別由四種不同密碼子編碼。但是，在真核細胞和原核細胞中，這種同義密碼子的使用頻率在基因組之間是不同的。例如，同義密碼子的選擇模式在哺乳動物中十分類似，而在進化距離遠的生物體例如酵母(例如釀酒酵母)、細菌(例如大腸桿菌)和昆蟲(例如D.Melanogaster)中，則表現(xiàn)出明顯不同的遺傳密碼利用頻率模式(Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，8，49-62(1980)；Grantham，R.，等，Nucl.Acid Res.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.，等，Nucl.Acid Res.，14，151-197(1986)；Aota，S等，Nucl.Acid Res.，16，315-402(1988)；Wada，K.等，Nucl.Acid Res.，19 Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，F(xiàn)EBS Lett.，285，165-169(1991))。密碼子選擇模式的這些差別似乎通過調節(jié)肽伸長比例來影響各個基因的整體表達水平。(Kurland，C.G.，F(xiàn)EBS Lett.，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBO J.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，JMol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。
合成基因的優(yōu)選密碼子利用頻率應當反映來源于精確的(或者盡可能密切相關)細胞/生物體的基因組的核基因的密碼子利用，該細胞/生物體將被用于重組蛋白的表達，特別是酵母屬的細胞/生物體。如上所討論，在一個優(yōu)選實施方案中，在此所描述的修飾之前或之后，人Tf序列被密碼子優(yōu)化以用于酵母表達，該序列可以是治療性蛋白質的核苷酸序列。
載體用于本發(fā)明的表達單位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地連接轉錄啟動子、分泌信號序列、被連接到編碼目標的治療性蛋白質或肽的DNA序列上的編碼包含轉鐵蛋白或轉鐵蛋白的部分的被修飾的Tf融合蛋白的DNA序列，以及轉錄終止子。如上所討論，被融合到Tf部分上或者被融合在Tf部分內的治療性蛋白質或肽的任何排列可以被用于本發(fā)明的載體中。合適的啟動子、信號序列和終止子的選擇，將通過所選擇的宿主細胞來確定，對于本領域的技術人員來說是顯然的，將在下文中被更加清楚地討論。
用于本發(fā)明中的合適酵母載體在美國專利6,291,212中被描述，包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1978)、YEp13(Broach等，Gene 8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母質粒載體還包括pRS403-406、pRS413-416和得自Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA的畢赤氏酵母(Pichia)載體。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型質粒(YIps)并且納入了酵母可選擇標記HIS3、TUPI、LEU2和URA3。質粒pRS413-41.6是酵母中心粒質粒(YCps)。
這種載體通常包括可選擇的標記，可以是任意大量具有顯性表型的基因之一，由此，可以進行表型分析來選擇轉化體。優(yōu)選的可選擇標記是那些彌補宿主細胞營養(yǎng)缺陷的標記，產(chǎn)生抗生素抗性或使細胞能夠利用特定的碳源，包括LEU2(Broach等ibid.)、URA3(Botstein等，Gene 817，1979)、HIS3(Struhl等，ibid.)或POT1(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合適的選擇性標記包括CAT基因，其賦予酵母細胞氯霉素抗性。用于酵母中的優(yōu)選啟動子包括來自酵母糖分解基因的啟動子(Hitzeman等，J Biol.Chem.22512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，美國專利4,599,311)或乙醇脫氫酶基因的啟動子(Young等，載于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，(編輯)，355，Plenum，紐約，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)。從這一點看，特別優(yōu)選的啟動子是TPI1啟動子(Kawasaki，美國專利4,599,311)和ADH2-4C(美國專利6,291,212啟動子(Russell等，Nature 304652-654，1983)。表達單位可能還包括轉錄終止子。優(yōu)選的轉錄終止子為TPI1終止子(Alber和Kawasaki，ibid.)。其它優(yōu)選載體和優(yōu)選組分例如酵母表達系統(tǒng)中的啟動子和終止子被公開在歐洲專利EP 0258067、EP 0286424、EP 0317254、EP0387319、EP 0386222、EP 0424117、EP 0431880和EP 1002095；歐洲專利申請公開EP 0828759、EP 0764209、EP 0749478和EP 0889949；PCT公開WO 00/44772和WO 94/04687；和美國專利5,739,007；5,637,504；5,302,697；5,260,202；5,667,986；5,728,553；5,783,423；5,965,386；6150,133；6,379,924和5,714,377中，在此全部引入作為參考。
除了酵母，本發(fā)明的被修飾的融合蛋白可以在絲狀真菌中表達，例如，在曲霉菌菌株中。有用的啟動子的例子包括那些來源于Aspergillus nidulans糖分解基因的啟動子，例如adh3啟動子(McKnight等，EMBO J.42093-2099，1985)和tpiA啟動子。合適的終止子的例子為adh3終止子(McKnight等，ibid.)。利用這種元件的表達單位可以被克隆到能夠插入到例如曲霉菌的染色體DNA中的載體中。
用于實現(xiàn)本發(fā)明的哺乳動物表達載體將包括能夠引導被修飾的Tf融合蛋白的轉錄的啟動子。優(yōu)選啟動子包括病毒啟動子和細胞啟動子。優(yōu)選的病毒啟動子包括來自腺病毒2的主要晚期啟動子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.21304-13199，1982)和SV40啟動子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1854-864，1981)。優(yōu)選的細胞啟動子包括小鼠金屬硫蛋白1啟動子(Palmiter等，Science 222809-814，1983)和小鼠Vκ(參見美國專利6,291,212)啟動子(Grant等，Nuc.Acids Res.155496，1987)。特別優(yōu)選的啟動子是小鼠VH(參見美國專利6,291,212)啟動子(Loh等，ibid.)。這種表達載體還可以含有位于啟動子下游和編碼轉鐵蛋白融合蛋白的DNA序列上游的一套RNA剪切位點。優(yōu)選的RNA剪切位點可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲得。
在表達載體中還含有位于目標編碼序列下游的聚腺苷酸信號。聚腺苷酸信號包括來自SV40的早期或晚期聚腺苷酸信號(Kaufman和Sharp，ibid.)，來自腺病毒5E1B區(qū)以及人生長基因終止子的聚腺苷酸信號(DeNoto等，Nucl.Acid Res.93719-3730，1981)。特別優(yōu)選的聚腺苷酸信號為VH(參見美國專利6,291,212)基因終止子(Loh等，出處同上)。表達載體可以包括非編碼的病毒前導序列，例如腺病毒2的三聯(lián)前導序列，位于啟動子和RNA剪切位點之間。優(yōu)選的載體還可以包括增強子序列，例如SV40增強子和小鼠μ(參見美國專利6,291,212)增強子(Gillies，Cell 33717-728，1983)。表達載體還可以包括編碼腺病毒VARNA的序列。
轉化體用于轉化真菌的技術在本領域是已知的，被描述在例如Beggs(ibid.)、Hinnen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929-1933，1978)、Yelton等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811740-1747，1984)和Russell(Nature 301167-169，1983)中。還可以使用將克隆DNA序列導入真菌細胞中的其它技術，例如電穿孔(Becker和Guarente，Methods in Enzymol.194182-187，1991)。宿主細胞的基因型通常具有遺傳缺陷，該缺陷由存在表達載體上的選擇標記來彌補。選擇特定宿主和可選擇的標記在本領域普通技術人員的能力之內。
可以通過例如磷酸鈣介導的轉染將包含本發(fā)明的被修飾的Tf融合蛋白的克隆DNA序列導入到被培養(yǎng)的哺乳動物細胞中(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)。還可以采用將克隆DNA序列導入哺乳動物細胞中的其它技術，例如電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)或脂轉染。為了鑒定已經(jīng)整合了克隆DNA的細胞，通常將可選擇標記以及目標基因或cDNA插入到細胞中。培養(yǎng)哺乳動物細胞的優(yōu)選可選擇標記包括賦予對藥物的抗性的基因，這些藥物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤?？蛇x擇標記可以是可擴增的選擇標記。優(yōu)選的可擴增的選擇標記為DHFR基因。特別優(yōu)選的可擴增標記為DHFRr(參見美國專利6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802495-2499，1983)?？蛇x擇標記在Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.)中被評述，并且選擇可選擇的標記在本領域普通技術人員的能力內。
宿主細胞本發(fā)明還包括被轉化來表達本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的細胞，優(yōu)選為酵母細胞。除了被轉化的宿主細胞本身，本發(fā)明還包括這些細胞在營養(yǎng)液中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(純系同源的)培養(yǎng)物或者來源于單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。如果多肽被分泌，則培養(yǎng)液中含有該多肽和細胞，或者細胞被過濾或離心掉，則不含細胞。
用于實現(xiàn)本發(fā)明的宿主細胞包括真核細胞，有時為原核細胞，能夠用外源DNA轉化或轉染，并在培養(yǎng)液中生長，例如被培養(yǎng)的哺乳動物、昆蟲、真菌、植物和細菌細胞。
真菌細胞，包括酵母類(例如酵母屬，裂殖酵母屬，畢赤氏酵母屬)可以被用作本發(fā)明中的宿主細胞。包括被期望用于實現(xiàn)本發(fā)明、作為表達本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的酵母的真菌的例子是畢氏酵母屬(其中的某些種類以前被分類為漢遜酵母屬(Hansenula))，酵母屬，克魯維酵母菌屬，曲霉菌屬，念珠菌屬，球擬酵母屬(Torulopsis)，孢圓酵母屬(Torulaspora)，裂殖酵母，固囊酵母屬(Citeromyces)，Pachysolen，接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，德巴利酵母屬(Debaryomyces)，木霉屬(Trichoderma)，頭孢霉屬，腐質霉菌屬(Humicola)，毛霉菌屬，脈孢菌屬，Yarrowia，Metschunikowia，Rhodosporidium，Leucosporidium，Botryoascus，鎖擲孢酵母屬(Sporidiobolus)，擬內孢霉菌屬(Endomycopsis)等。酵母菌屬的例子為釀酒酵母、S.italicus和S.Rouxii克魯維酵母菌屬的例子為K fragilis、K lactis和Kmarxianus。合適的孢圓酵母屬種類為T.delbrueckii。畢赤氏酵母菌屬的例子為P.angusta(以前稱作H.polymorpha)、P.anomala(以前稱作H.anomala)和P.pastoris。
用于制備本發(fā)明的Tf融合蛋白的特別有用的宿主細胞為甲基營養(yǎng)Pichia pastoris(Steinlein等(1995)Protein Express.Purif 6619-624)。自從Pichia pastoris的醇氧化酶(alcohol oxidase)啟動子被分離和克隆以來，Pichiapastoris已經(jīng)被開發(fā)作為制備外源蛋白的重要宿主；其轉化體首次在1985年被報導。在缺乏葡萄糖時，P.pastoris能夠利用甲醇作為碳源。P.pastoris表達系統(tǒng)能夠利用甲醇誘導的醇氧化酶(AOX1)啟動子，該啟動子控制編碼用于醇氧化酶的表達的基因，醇氧化酶催化甲醇代謝的第一個步驟。該啟動子被表征，并且被插入到一系列P.pastoris表達載體中。由于在P.pastoris中生成的蛋白質通常能夠正確地折疊，并被分泌到培養(yǎng)液中，遺傳工程化的P.pastoris的發(fā)酵提供一種作為大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)良替代。大量蛋白質已經(jīng)采用這種系統(tǒng)進行制備，包括破傷風毒素片段、百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)粘著素(pertactin)、人血清白蛋白和溶菌酶。
釀酒酵母菌株是另一種優(yōu)選宿主。在一個優(yōu)選實施方案中，使用酵母細胞，或者特別是在糖蛋白的天冬酰胺偶聯(lián)的糖基化所需的基因中具有遺傳缺陷的釀酒酵母宿主細胞。具有這種缺陷的釀酒酵母宿主細胞通過常規(guī)的突變和選擇技術來制備，盡管許多可以獲得的酵母菌株已經(jīng)被修飾來防止或減少糖基化或超甘露糖基化。Ballou等(J.Biol.Chem.2555986-5991，1980)已經(jīng)描述了缺乏影響天冬酰胺偶聯(lián)糖基化的基因的甘露糖蛋白生物合成突變體的分離。Gentzsch和Tanner(Glycobiology 7481-486，1997)已經(jīng)描述了一個至少6個基因(PMT1-6)的家族，這些基因編碼負責酵母中的O-聯(lián)糖基化的第一步的酶。缺乏這些基因中的一個或多個的突變體表現(xiàn)出O-聯(lián)糖基化下降和/或O-聯(lián)糖基化的特異性改變。
為了優(yōu)化異源蛋白的制備，優(yōu)選宿主菌株具有突變，例如釀酒酵母的pep4突變(Jones，Genetics 8523-33，1977)，導致蛋白質水解活性下降。對于制備大量本發(fā)明的Tf融合蛋白來說，在其它蛋白酶編碼區(qū)中具有突變的宿主菌株是特別有用的。
含有本發(fā)明的DNA構建體的宿主細胞在適當生長培養(yǎng)液中生長。如在此所用，術語“適當?shù)纳L培養(yǎng)液”是指含有細胞生長所需營養(yǎng)的培養(yǎng)液。細胞生長所需營養(yǎng)包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質和生長因子。生長培養(yǎng)液通常用于篩選含有DNA構建體的細胞，通過例如藥物選擇或缺乏關鍵營養(yǎng)，營養(yǎng)缺乏通過DNA構建體上的可選擇標記來彌補，或者用DNA構建體共轉染。酵母細胞，例如，優(yōu)選在化學成分確定的培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中含有碳源，例如蔗糖，非氨基酸的氮源，無機鹽，維生素和必需氨基酸添加劑。培養(yǎng)液的pH優(yōu)選維持在大于2并小于8的pH下，優(yōu)選為pH5.5-6.5。維持穩(wěn)定的pH的方法包括進行緩沖和持續(xù)的pH控制。優(yōu)選的緩沖試劑包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺偶聯(lián)糖基化所需基因的酵母細胞優(yōu)選在含有滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)液中生長。優(yōu)選的滲透穩(wěn)定劑是被添加到培養(yǎng)液中的山梨醇，其濃度在0.1M和1.5M之間，優(yōu)選為0.5M或1.0M。
被培養(yǎng)的哺乳動物細胞一般在可以購買得到的含血清或無血清培養(yǎng)液中生長。選擇適合于特定細胞系的培養(yǎng)液在本領域普通技術人員的能力內。被轉染的哺乳動物細胞生長一段時間，通常為1-2天，并開始表達目標DNA序列。然后進行藥物選擇，選擇以穩(wěn)定的方式表達可選擇標記的細胞的生長。對于已經(jīng)用可擴增的選擇標記轉染的細胞來說，可以逐步提高藥物濃度來選擇拷貝數(shù)增加的克隆序列，從而提高表達水平。
桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)也可以被用于制備本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白。BacPAKTM桿狀表達表達系統(tǒng)(BD Biosciences(Clontech))在昆蟲宿主細胞中高水平地表達重組蛋白。目標基因被插入到轉化載體中，該載體與線性化的BacPAK6病毒DNA一起被共轉染到昆蟲宿主細胞中。BacPAK6 DNA缺乏桿狀病毒基因組的關鍵部分。當DNA與載體結合時，該關鍵元件被恢復，而目標基因被轉移到桿狀病毒的基因組中。重組后，少數(shù)病毒斑被挑取和純化，驗證重組表型。然后，新分離的重組病毒被擴增，并用于感染昆蟲細胞培養(yǎng)物來制備大量的期望蛋白質。
本發(fā)明的Tf融合蛋白還可以用轉基因植物和動物來制備。例如，綿羊和山羊在其乳汁中生成治療性蛋白質。煙草植物在其葉片中包括該蛋白質。轉基因植物和動物生產(chǎn)蛋白質，都包括將編碼融合蛋白的新基因添加到生物體的基因組中。轉基因生物體不僅能夠生成新的蛋白質，而且能夠將這種能力傳遞給其后代。
分泌信號序列術語“分泌信號序列”或者“信號序列”或者“分泌前導序列”可以被相互交換使用，被描述在美國專利6,291,212和美國專利5,547,871中，這兩個專利在此全部引入作為參考。分泌信號序列或信號序列或分泌前導序列編碼分泌肽。分泌肽是引導成熟多肽或蛋白質從細胞中分泌出來的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于一個疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是唯一地)存在于新合成的蛋白質的氨基末端。在分泌過程中，分泌肽通常從成熟蛋白質上被裂解下來。分泌肽可能含有加工位點，使得在經(jīng)過分泌路徑時，信號肽從產(chǎn)生蛋白質上裂解下來。加工位點被編碼在信號肽申，或者例如通過誘變被添加到信號肽中。
分泌肽可以被用于引導本發(fā)明的被修飾Tf融合蛋白的分泌?？捎糜谂c其它分泌肽結合的一種這種分泌肽為α交配因子前導序列。分泌信號序列或信號序列或分泌前導序列是一系列復雜的翻譯后加工步驟所需的，這些步驟導致蛋白質的分泌。如果存在完整的信號序列，被表達的蛋白質進入粗面內質網(wǎng)的內腔，然后通過高爾基體轉運到分泌小泡中，最后被轉運到細胞外。通常，信號序列緊跟在起始密碼子后面，并且編碼被分泌的蛋白質的氨基末端的信號肽。在大多數(shù)情況下，信號序列被稱作信號肽酶的特定蛋白酶裂解掉。優(yōu)選的信號序列提高由病毒、哺乳動物或酵母病毒載體表達的重組蛋白質的加工和外排效率。在有些情況下，天然的Tf信號序列被用于表達和分泌本發(fā)明的融合蛋白。
接頭本發(fā)明的被修飾轉鐵蛋白融合蛋白的Tf部分和治療性蛋白質可以直接融合或者采用各種長度的接頭肽來融合，以在被融合的蛋白質之間產(chǎn)生更大的物理分離和更大的空間靈活性，從而最大化治療性蛋白質的例如結合其關聯(lián)受體的可達性。接頭肽由柔韌的或剛性更大的氨基酸組成。例如，接頭例如但是不限于多聚甘氨酸序列。接頭可以少于約50個，40個，30個，20個或10個氨基酸殘基。接頭可以被共價地連接到轉鐵蛋白或其部分與治療性蛋白質之間。
Tf融合蛋白的檢測生物活性的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的檢測分析包括Western轉移、蛋白質印跡或菌落濾膜(colony filter)，以及檢測包含轉鐵蛋白和治療性蛋白質的融合蛋白的活性分析。Western轉移濾膜可以采用Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354，1979)描述的方法來制備。簡而言之，樣本在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。將凝膠中的蛋白質通過電泳轉移到硝化纖維紙上。蛋白質印跡濾膜通過用例如Minifold(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)將上清液樣本或濃縮物過濾在硝化纖維濾紙上來制備。菌落濾膜通過在硝化纖維素濾膜培養(yǎng)菌落來制備，該濾膜被鋪展在適當?shù)纳L培養(yǎng)液上。在這種方法中，固體培養(yǎng)液是優(yōu)選的。細胞在濾膜上生長至少12小時。用不會去除結合到濾膜上的蛋白質的恰當緩沖液來沖洗濾膜，去除細胞。優(yōu)選的緩沖液包含25mM Tris-堿，19mM甘氨酸，pH8.3，20％甲醇。
本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白用放射性同位素或者其它顯像劑標記，用于體內診斷目的。優(yōu)選的放射性同位素顯像劑包括碘-125和锝-99，锝-99是特別優(yōu)選的。用于制備蛋白質表位偶聯(lián)物的方法在本領域是已知的，被描述在例如Eckelman等(美國專利4,652,440)，Parker等(WO 87/05030)和Wilber等(EP 203,764)中?？商娲?，轉鐵蛋白融合蛋白被結合到自旋標記物增強劑上，用于磁共振(MR)顯像。合適的自旋標記物增強劑包括穩(wěn)定的、空間障礙的、自由基化合物，例如硝基氧。用于MR顯像標記配體的方法被公開在，例如Coffman等(美國專利4,656,026)中。
通過將治療性蛋白質偶聯(lián)(即物理上連接)到可檢測的物質上來方便本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的檢測?？蓹z測的物質的例子包括各種酶，輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三連氮基胺(dichlorotriazinylamine)熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括發(fā)光氨；生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶、蟲熒光素和發(fā)光蛋白質，合適的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一個實施方案中，分析本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白結合或與抗原競爭結合抗體的能力，可以采用本領域知曉的各種免疫測定方法，包括但是不限于，采用例如放射性免疫測定、ELISA(酶鏈式免疫吸收分析)、夾心式免疫測定、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散分析、原位免疫分析(例如采用膠體金、酶或放射性同位素標記)、western印跡、沉淀反應、凝集分析(例如凝膠凝集分析)、補體結合分析、熒光免疫分析、蛋白A分析和免疫電泳分析等的競爭性和非競爭性的分析體系。在一個實施方案中，通過檢測轉鐵蛋白融合蛋白上的標記來檢測轉鐵蛋白融合蛋白的結合。在另一個實施方案中，通過檢測與轉鐵蛋白融合蛋白相互作用的第二抗體或試劑的結合來檢測轉鐵蛋白融合蛋白。在另一個實施方案中，第二抗體或試劑被標記。已知在本領域有許多方法被用于檢測免疫測定中的結合，這些方法在本發(fā)明的保護范圍內。
還通過測定治療性蛋白質部分的活性來檢測本發(fā)明的融合蛋白。特別地，采用本領域普通技術人員知曉的分析方法來分析本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學活性或治療活性)。此外，本領域技術人員能夠采用熟知的分析方法常規(guī)地分析對應于本發(fā)明的融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質的活性。此外，本領域技術人員能夠采用熟知的分析方法常規(guī)地分析被修飾的轉鐵蛋白的片段的活性。
例如，在一個實施方案中，可以采用本領域的各種免疫測定方法來分析本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白結合或與治療性蛋白質競爭地結合抗治療性多肽的抗體和/或抗轉鐵蛋白的抗體的能力，包括但是不限于，采用例如放射性免疫測定、ELISA(酶鏈式免疫吸收分析)、夾心式免疫測定、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散分析、原位免疫分析(例如采用膠體金、酶或放射性同位素標記)、western印跡、沉淀反應、凝集分析(例如凝膠凝集分析)、補體結合分析、熒光免疫分析、蛋白A分析和免疫電泳分析等的競爭性和非競爭性的分析體系。在一個實施方案中，通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗體結合。在另一個實施方案中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結合來檢測第一抗體。在還有一個實施方案中，第二抗體被標記。許多本領域已知的方法用于檢測免疫測定中的結合，這些方法在本發(fā)明的保護范圍內。
在還有一個實施方案中，當治療性蛋白質的結合配偶體(例如受體或配基)被確定，含有治療性蛋白質作為融合物的治療性蛋白質部分的轉鐵蛋白融合蛋白與結合配偶體的結合可以例如，通過本領域知曉的方法來測定，這些方法例如還原的和非還原的凝膠層析、蛋白質親合層析和親合印跡。其它方法對于技術人員來說是已知的，在本領域的保護范圍之內。
融合蛋白質的制備本發(fā)明還提供采用在此公開的核酸分子制備本發(fā)明的被修飾的融合蛋白的方法。總的來說，重組形式的蛋白質的制備通常包括如下步驟。
首先獲得編碼本發(fā)明的轉鐵蛋白融合蛋白的核酸分子。然后優(yōu)選將核酸分子以可操作的連接與合適的控制序列連接在一起，如上所述，形成含有蛋白質開放閱讀框的表達單位。用表達單位來轉化合適的宿主，在允許重組蛋白生成的條件下培養(yǎng)被轉化的宿主?？蛇x擇地，從培養(yǎng)液或從細胞中分離重組蛋白質；在某些允許存在一些雜質的情況下，蛋白質的回收和純化不是必需的。
前述的各個步驟可以各種方式來完成。例如，在各種宿主中，可操作的表達載體的構建采用如上列舉的適當復制子和控制序列來實現(xiàn)?？刂菩蛄小⒈磉_載體和轉化方法取決于表達基因的宿主細胞類型，先前已經(jīng)被詳細討論過，同樣是本領域技術人員知曉的。如果在正常情況下不能獲得合適的限制性位點，可以被添加到編碼序列的末端，產(chǎn)生可以被插入到這些載體中的可切割基因。技術人員能夠容易地改進本領域熟知的任何宿主/表達系統(tǒng)，與本發(fā)明的核酸分子一起使用來制備期望的重組蛋白質。
如上所討論，可以采用任何表達系統(tǒng)，包括酵母、細菌、動物、植物、真核和原核系統(tǒng)。在某些實施方案中，酵母、哺乳動物細胞培養(yǎng)物和轉基因動物或植物生產(chǎn)系統(tǒng)是優(yōu)選的。在其它實施方案中，采用被改進來降低天然酵母糖基化、超糖基化或蛋白質水解活性的酵母系統(tǒng)。
被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的分離/純化從宿主細胞培養(yǎng)液中分離被分泌的具有生物活性的被修飾轉鐵蛋白融合蛋白，宿主細胞在允許生物活性融合蛋白分泌的條件下生長。從培養(yǎng)液中去除細胞物質，采用本領域知曉的分離技術分離生物活性融合蛋白。合適的技術包括通過各種層析方法來進行沉淀和分餾，包括凝膠過濾、離子交換層析和親合層析。
特別優(yōu)選的純化方法是在離子結合或金屬螯合柱上進行親合層析，或采用定向抗多肽融合物的轉鐵蛋白或治療性蛋白質的抗原進行免疫親合層析。這些抗原優(yōu)選被固定在或結合到固體支持物或基底上。特別優(yōu)選的基底是CNBr-活化的瓊脂糖(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通過這種方法，在允許結合發(fā)生的條件下，培養(yǎng)液與抗原/基底結合。洗滌復合物來去除未被結合的物質，采用不利復合物形成的條件來釋放或洗脫轉鐵蛋白融合蛋白。特別有用的洗脫方法包括改變pH，其中在第一個pH下，被固定的抗原對轉鐵蛋白融合蛋白具有很高的親合性，而在第二個(更高或更低)pH下，親合性下降；改變洗脫液的濃度；或者使用去垢劑。
將藥物或治療性蛋白質遞送到細胞內部和/或跨越血腦屏障(BBB)在本發(fā)明的保護范圍內，被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白可以被用作載體來將復合到轉鐵蛋白的鐵離子上的分子或小分子遞送到細胞的內部或者跨越血腦屏障或者其它屏障，包括跨越任何天然表達或者被工程化來表達Tf受體的細胞類型的細胞膜。在這些實施方案中，Tf融合蛋白通常被工程化或者被修飾來抑制、防止或去除糖基化，延長融合蛋白和/或治療性蛋白質部分的血清半衰期。特別包括添加目標肽來進一步將Tf融合蛋白靶向到特定細胞類型上，例如癌細胞。
在一個實施方案中，含鐵的抗貧血藥物，鐵-山梨糖醇-檸檬酸鹽復合物被添加到被本發(fā)明的修飾的Tf融合蛋白中。已經(jīng)證明，鐵-山梨糖醇-檸檬酸鹽(FSC)在體外抑制各種鼠癌細胞的增殖，在體內致使腫瘤衰退，但是對非惡性細胞的增殖不產(chǎn)生任何作用(Poljak-Blazi等(June 2000)CancerBiotherapy and Radiopharmaceuticals(美國)，15/3285-293)。
在另一個實施方案中，都與鐵離子形成復合物的抗腫瘤藥物阿霉素(doxorabicin)和/或化療藥物博來霉素，被添加到本發(fā)明的Tf融合蛋白上。在其它實施方案中，制備藥物的鹽，例如，檸檬酸鹽或碳酸鹽，并與鐵離子復合，然后結合到Tf上。由于腫瘤細胞常常具有較高的鐵周轉率(turnoverrate)；轉鐵蛋白被修飾來攜帶至少一種抗腫瘤劑，提供一種提高試劑暴露或加載到腫瘤細胞上的方法(Demant，E.J.，(1983)Eur.J.Biochem.137/(1-2)113-118；Padbury等(1985)J.Biol.Chem.260/137820-7823)。
藥物制劑與治療方法采用標準的施用操作，將包含本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白的被修飾的融合蛋白施用給需要的患者。例如，本發(fā)明的被修飾的Tf轉鐵蛋白可以單獨或結合或順序結合其它調節(jié)特定病理過程的試劑來被提供。如在此所用，當兩種試劑同時被施用或者以使得兩種試劑同時或接近同時起作用的方式被施用時，這兩種試劑被認為是被組合地施用。
本發(fā)明的融合蛋白可以通過胃腸外、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、經(jīng)皮和口腔的路徑被施用。例如，一種試劑通過微灌注(microinfusion)被局部地施用到損傷部位。可替代地，或者同時地，施用可以是非侵入性的，通過口服、吸入、鼻腔或肺部路徑。被施用的劑量將取決于受體的年齡、健康狀況和體重，并行治療法的類型，如果存在，治療頻率和期望的作用特點。
雖然任何施用方法可以被用于遞送本發(fā)明的mTF融合蛋白，對于特定類型的融合蛋白或對于治療特定病癥來說，口服施用或遞送是優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明還提供含有一種或多種本發(fā)明的融合蛋白的組合物。雖然個體需要是不同的，確定各種組分的有效量的最佳范圍屬于本領域的技術。典型的劑量包含約1pg/kg到約100mg/kg體重。用于系統(tǒng)施用的優(yōu)選劑量包含約100ng/kg到約100mg/kg體重。通過微灌注直接施用到部位的優(yōu)選劑量包含約1ng/kg到約1mg/kg體重。當通過直接注射或微灌注施用時，本發(fā)明的被修飾融合蛋白可以被工程化來減少或不與鐵結合，以部分地防止局部化的鐵毒性。
除了藥學活性的融合蛋白，本發(fā)明的組合物含有合適的藥學上可接受的載體，包括方便將活性化合物加工成制備物的賦形劑和輔料，可以在藥學上使用制備物來遞送到作用部位。用于胃腸外施用的合適制劑包括可溶于水形式的活性化合物的水溶液，例如，可溶于水的鹽。此外，可以施用作為適當?shù)挠托宰⑸鋺腋∫旱幕钚曰衔锏膽腋∫?。合適的親脂性溶劑或媒介物包括油脂，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水溶性注射懸浮液可以含有提高懸浮液的粘性的物質，包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖?？蛇x擇地，該懸浮液還可以含有穩(wěn)定劑。脂質體也可以被用于包囊被遞送到細胞中的試劑。
按照本發(fā)明的用于系統(tǒng)施用的藥物制劑可以被配制成用于腸道的、胃腸外的或局部的施用。實際上，可以同時使用所有三種類型的制劑，達到系統(tǒng)施用活性成分的效果。用于口服施用的合適制劑包括硬的或軟的明膠膠囊，藥丸，片劑，包括糖衣片劑，藥丹，懸浮液，糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
本發(fā)明的藥物組合物可以為劑量單位形式，例如，為片劑或膠囊。在這種形式中，組合物被細分成含有適當含量活性成分的單位劑量；單位劑量形式可以是被包裝的組合物，例如，被包裝的粉末，藥水瓶，針劑，預裝的注射器或含有液體的袋子。單位劑量形式可以是，例如，膠囊或片劑本身，或者可以是合適數(shù)量的包裝形式的任何這種組合物。被用于治療中的劑量必需由主治醫(yī)生主觀確定。
在實施本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的融合蛋白可以單獨地或組合地或結合其它治療性或診斷性試劑地被使用。在特定優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物可以與其它化合物共同施用，這些化合物按照通?？山邮艿尼t(yī)療實踐被開成處方用于這些病癥。本發(fā)明的組合物可以在體內使用，通常在哺乳動物中，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠，或者體外使用。
口服藥物組合物以及遞送方法在本發(fā)明中，Tf融合蛋白，包括但是不限于被修飾的Tf融合蛋白，可以被配制用于口服遞送。特別地，被用于治療特定類型的疾病或醫(yī)學病癥的本發(fā)明的特定融合蛋白特別適合于口服制劑和遞送。這種類型的疾病或病癥包括，但是不限于，急性的、慢性的和反復發(fā)作的疾病。慢性的或反復發(fā)作的疾病包括，但是不限于，病毒性疾病或感染，癌癥，代謝疾病，肥胖，自體免疫性疾病，炎癥性疾病，過敏癥，移植物抗宿主疾病，全身性微生物感染，貧血，心血管疾病，精神病，遺傳病，神經(jīng)退行性疾病，造血細胞異常，內分泌系統(tǒng)疾病或生殖疾病，胃腸道疾病。這些類型的疾病的例子包括糖尿病，多發(fā)性硬化，哮喘，HCV或HIV感染，高血壓，高膽固醇血癥，動脈硬化(scherosis)，關節(jié)炎和Alzheimer病。在許多慢性疾病中，本發(fā)明的Tf融合蛋白的口服制劑和施用方法是特別有用的，這是由于通過在家口服施用可以長期進行患者護理和治療，而不依賴于可注射的治療或藥物方案。
包含本發(fā)明的Tf融合蛋白性口服制劑和遞送方法部分地利用轉鐵蛋白受體介導的轉胞吞作用穿過胃腸道(GI)上皮。Tf受體高濃度地存在于人GI上皮，轉鐵蛋白對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化具有極高的抵抗力，而Tf化學偶聯(lián)物已經(jīng)被用于成功地遞送蛋白質和肽穿過GI上皮(Xia等，(2000)J.Pharmacol.Experiment.Therap.，295594-600；Xia等(2001)PharmaceuticalRes.，18(2)191-195；和Shah等(1996)J.Pharmaceutical Sci.，85(12)1306-1311，全部在此全文引入作為參考)。一旦被轉運穿過GI上皮，本發(fā)明的Tf融合蛋白在血清中的半衰期被延長，與未被融合狀態(tài)下的治療性蛋白質或肽相比，被連接或插入到Tf中的治療性蛋白質或肽具有被延長的血清半衰期。
可以制備適合被轉運到GI上皮的本發(fā)明的Tf融合蛋白的口服制劑，以在胃內保護Tf融合蛋白和其它的活性組分。這種制劑可以包括載體和分散組分，可以為任何合適的形式，包括氣霧劑(用于口腔或肺部遞送)、糖漿、藥丹、片劑，包括可咀嚼的片劑，硬的或軟的膠囊、藥片、止咳糖漿、水溶性的或油性的懸浮液、乳劑、扁膠劑或球形顆粒，和可分散的粉末。優(yōu)選地，Tf融合蛋白制劑以適合于精確劑量的簡便施用，優(yōu)選口服施用的固體劑量形式被使用?？诜┯玫墓腆w劑量形式優(yōu)選為片劑、膠囊等。
對于片劑或膠囊形式的口服施用，需要注意確保有足夠的活性成分被宿主吸收以產(chǎn)生有效反應。因此，例如，應當提高Tf融合蛋白的含量超過理論所需量，或者采用其它已知措施例如包被或膠囊化，防止多肽在胃內被酶促作用。
典型地，肽和蛋白質藥物通過注射被施用，這是由于當通過非胃腸外施用，特別是口服施用時，它們的生物利用度很低。這些藥物傾向于化學和構象不穩(wěn)定，常常被胃內的酸性條件以及胃內的和胃腸道的酶降解。為了克服這些遞送問題，已經(jīng)開發(fā)出某些用于口服遞送的技術，例如封裝在作為藥物載體的由具有疏水主鏈和親水分支的聚合物組成的納米顆粒中，封裝在微粒中，插入到乳劑中的脂質體中，和偶聯(lián)到其它分子上。所有這些都可以與本發(fā)明的Tf融合分子一起使用。
納米顆粒的例子包括用殼聚糖和Carbopol包被的粘膜吸附納米顆粒(Takeuchi等，Adv.Drug Deliv.Rev.47(1)39-54，2001)和含有帶電的組合聚酯、多聚(2-磺丁基-乙烯醇)和多聚(D，L-乳酸共羥基乙酸)(Jung等，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)147-160，2000)。當含有具有多聚-N-異丙基丙烯酰胺區(qū)和陽離子多聚-乙烯酰胺基團的表面聚合物的納米顆粒被口服施用給大鼠時，表現(xiàn)為鮭降鈣素(salmon calcitonin)吸收改善。
由藻酸鹽和膠質組成的藥物遞送顆粒，用多聚賴氨酸加強，具有相對的酸堿抵抗性，可以被用作藥物的載體。這些顆粒結合了生物附著、增強吸收和持續(xù)釋放的優(yōu)點(Liu等，J.Pharm.Pharmacol.51(2)141-149，1999)。
此外，脂氨基酸基團和脂糖基團被偶聯(lián)到肽例如合成的生長激素抑制素的N末端和C末端上，形成兩性的表面活性劑，生成了保留生物學活性的組合物(Toth等，J.Med.Chem.42(19)4010-4013，1999)。
其它的肽遞送技術的例子包括carbopol包被的含有目標肽的粘膜附著乳劑，亞硝基N-乙酰-D，L-青霉胺和carbolpol或牛磺膽酸和聚羧乙烯(carbopol)。已經(jīng)證明，當這些物質被口服施用給大鼠時，有效降低血清的鈣濃度(Ogiso等，Biol.Pharm.Bull.24(6)656-661，2001)。來自卵磷脂的磷脂酰乙醇被用于制備作為胰島素載體的含有磷脂酰乙醇的脂質體。已經(jīng)證明，當被口服施用給大鼠時，這些脂質體是有活性的(Kisel等，Int.J.Pharm.216(1-2)105-114，2001)。
胰島素也被配制在多聚(乙烯醇)中-凝膠球體，該球體含有胰島素和蛋白酶抑制劑，例如抑酶肽或桿菌肽。已經(jīng)證明，在大鼠中這些凝膠球體具有降低葡萄糖的特性，而胰島素在小腸下段(lower intestine)被大量釋放(Kimura等，Biol.Pharm.Bull.19(6)897-900，1996。
已經(jīng)用多聚(烷基氰基丙烯酸酯)構成的納米顆粒研究胰島素的口服遞送，該納米顆粒與表面活性劑分散在油相中(Damge等，J.Pharm.Sci.86(12)1403-1409，1997)，并采用用殼聚糖包被的藻酸鈣珠(Onal等，Artif.Cells BloodSubstit.Immobil.Biotechnol.30(3)229-237，2002)。
在其它方法中，肽的N末端和C末端被連接到聚乙二醇上，然后連接到烯丙基鏈上形成偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物對酶促降解的抵抗性和通過GI壁的擴散性都被提高(www.nobexcorp.com)。
BioPORTER是一種陽離子脂質混合物，非共價地與肽相互作用來產(chǎn)生保護性包被或涂層。肽-脂質復合物能夠融合到細胞的質膜上，該肽被內化到細胞中(www.genetherapysystems.com)。
在采用脂質體作為起始材料的方法中，螺旋形的顆粒被開發(fā)作為藥物媒介物。將肽添加到主要含有負電荷脂質的脂質體懸浮液中。鈣的加入引起脂質體瓦解，融合成由脂質雙層構成的大片層，然后該片層自發(fā)地卷曲或堆疊成螺旋形(美國專利5,840,707；http//www.biodeliverysciences.com)。
用于口服用途的含有Tf融合蛋白的組合物可以按照任何本領域知曉的用于藥物組合物加工的方法來制備，這種組合物含有一種或多種選自甜味劑的試劑，以產(chǎn)生藥學上優(yōu)良的和美味的制備物。例如，為了制備可口服遞送的片劑，Tf融合蛋白與至少一種藥物賦形劑混合，按照已知方法將該固體制劑壓成片劑，被遞送到胃腸道中。片劑組合物通常用添加劑配制，例如糖類或纖維素載體，粘合劑例如淀粉糊或甲基纖維素，填充劑，分解劑或其它通常用于藥物制備物加工的添加劑。為了制備口服遞送的膠囊，DHEA與至少一種藥物賦形劑混合，將固體制劑放置在適合遞送到胃腸道中的囊狀容器中?？梢匀缋酌黝D藥物科學第18版，1990(Mack Publishing Co.EastonPa.18042)第89章中一般描述的方法來制備保護Tf融合蛋白的組合物，其在此引入作為參考。
如上所述，本發(fā)明的口服制劑可能含有抵抗胃環(huán)境并在腸道中釋放生物活性物質的惰性成分。這種制劑或腸衣在本領域是熟知的。例如，可以使用含有與無毒的藥學上可接受的賦形劑混合的Tf融合蛋白的片劑，該賦形劑適合于片劑加工。這些賦形劑可以是惰性的稀釋劑，例如碳酸鈣，碳酸鈉，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；?；瘎┖头纸鈩?，例如玉米淀粉、明膠或阿拉伯樹膠，以及滑潤劑，例如硬脂酸鎂硬脂酸或滑石粉。
片劑可以是未包被的，或者用已知技術包被來延遲在胃腸道中的分解和吸收，從而在一段較長的時間內產(chǎn)生持續(xù)的作用。例如，延時物質，例如甘油基一硬脂酸鹽或甘油基二硬脂酸鹽可以單獨地或與臘一起應用。
用于口服使用的制劑還可以用明膠膠囊遞送，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如，碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土，或者作為軟的明膠膠囊遞送，其中活性成分與水溶性或油性溶液混合，例如，花生油(rachis oil)，花生油(peanut oil)，液體石蠟或橄欖油。
水溶性懸浮液可以含有與適合水溶性懸浮液加工的賦形劑混合的Tf融合蛋白。這種賦形劑是懸浮劑，例如，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥基丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤劑可以是天然磷脂，例如，卵磷脂，或氧化亞烴基與脂肪酸的縮聚產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯硬脂酸鹽，或氧化乙烯與長鏈脂肪醇的濃縮產(chǎn)物，例如七癸基乙基氧化十六烷醇(heptadecylethyloxycetanol)或氧化乙烯和來源于脂肪酸與己糖醇的不完全酯的縮聚產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯，或氧化乙烯與來源于脂肪和己糖醇酐的不完全酯的縮聚產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。水溶性懸浮液還可以含有一種或多種防腐劑，例如亞基或n-丙基p-羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種調味劑，和一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。
油性懸浮液可以通過將活性成分懸浮在植物油中來配制，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或者懸浮在礦物油中，例如液體石蠟。油性懸浮液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或十六醇。還可以添加甜味劑，例如上面列舉的那些，以及調味劑來產(chǎn)生一種美味的口服制備物?？梢酝ㄟ^添加一種抗氧化劑例如抗壞血酸來保存這些組合物。
適合于通過添加水來制備水溶性懸浮液的可分散的粉末和顆粒提供具有活性成分以及含有分散劑或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。合適的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑由上面提及的那些試劑例證。還存在其它賦形劑，例如甜味劑、調味劑和著色劑。
含有Tf融合蛋白的藥物組合物還可以是油溶于水的乳劑形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或者礦物油，例如，阿拉伯樹膠或黃蓍膠，天然卵磷脂(phosphotides)，例如大豆卵磷脂，以及來源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或不完全酯，例如，山梨聚糖一油酸和相同的不完全酯與氧化乙烯的縮聚產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。乳劑還可以含有甜味劑和調味劑。
還可以用甜味劑來配制含有Tf融合蛋白的糖漿和藥丹，例如，甘油，山梨醇或蔗糖。這種制劑還可以含有緩和劑、防腐劑和調味劑和著色劑。藥物組合物可以是可注射的無菌制備物形式，例如，作為可注射的無菌水溶性或油質性懸浮液。該懸浮液可以采用那些合適的上面提及的分散劑或濕潤劑和懸浮劑，按照已知方法來配制?？勺⑸涞臒o菌制備物還可以是溶于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的可注射的無菌溶液或懸浮液，例如，溶于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶劑中，可以被使用的是水，Ringer溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油脂通常被用作溶劑或懸浮液。此時，任何無味的不揮發(fā)性油可以被使用，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可以用于注射劑的制備。
還可以采用聚酯微球、玉米蛋白微球、類蛋白微球、多聚氰基丙烯酸鹽微球和脂質系統(tǒng)來配制用于口服遞送的藥物組合物(參見，例如DiBase和Morrel，Oral Delivery of Microencapsulated Proteihs，載于Protein DeliveryPhysical Systems，Sanders和Hendren(編輯)，255-288(Plenum Press 1997))。
藥物活性Tf融合蛋白與載體和/或其它物質的比例可以在約0.5到約100wt％(重量百分比)之間變化。對于口服使用，藥物制劑通常含有重量為約5到約100％的活性物質。對于其它使用，該制劑將通常含有約0.5到約50wt％的活性物質。
用于本發(fā)明的Tf融合蛋白制劑被施用給個體時產(chǎn)生有效量的Tf融合蛋白。如本文所用，Tf融合物的“有效量”是足以有效改善疾病病癥的含量。
雖然不是必需的，可以每日施用有效改善病癥的含量的本發(fā)明的Tf融合蛋白組合物。一般地，總日劑量至少為約50mg，優(yōu)選至少為約100mg，更加優(yōu)選為至少約200mg，和最優(yōu)選不超過500mg/天，口服施用，例如以4粒膠囊或片劑，每粒含有50mgTf融合蛋白。用于口服遞送的膠囊或片劑通常含有每天全部的口服劑量，例如200mg或更高劑量。
在特別優(yōu)選的實施方案中，包含Tf融合蛋白的藥物組合物被配制成緩沖的液體形式，然后被封裝到軟包被或硬包被的明膠膠囊中，然后在膠囊上包裹適當?shù)哪c衣。對于本發(fā)明的口服藥物組合物來說，釋放區(qū)域可以是GI系統(tǒng)中的任何部位，包括小腸(十二指腸、空腸或回腸)或者大腸。
在其它實施方案中，用已知的延時釋放制劑配制本發(fā)明的口服組合物，在GI系統(tǒng)中緩釋活性成分，包括本發(fā)明的Tf融合蛋白。
用于口服遞送的本發(fā)明的Tf融合蛋白能夠結合存在于GI上皮中的Tf受體。為了便于這種結合以及受體介導的轉運，本發(fā)明的Tf融合蛋白通常被制備成Tf部分上結合了鐵，有時為碳酸鹽。往本發(fā)明的融合蛋白組合物的Tf部分上添加鐵和碳酸鹽的處理和方法是本領域已知的。
在一些本發(fā)明的藥物組合物中，Tf融合蛋白的Tf部分被修飾來提高Tf部分對鐵的親合性或親合力。這些方法在本領域是已知的。例如，可以采用誘變來制備對鐵的親合力高于天然轉鐵蛋白的突變轉鐵蛋白部分。在人血清轉鐵蛋白中，作為金屬鐵螯合的配基的氨基酸包括但是不限于SEQ ID NO3的N端圓形突出物(N lobe)的氨基酸Asp63，Tyr95，Tyr188，Lys206，His207和His249；以及C端圓形突出物(C lobe)的氨基酸Asp392，Tyr426，Tyr517和His585(氨基酸邊上的數(shù)字表示該氨基酸殘基在一級氨基酸序列上的位置，而成熟蛋白的纈氨酸被指定為位置1)。參見美國專利5,986,067，其在此引入作為參考。在一個實施方案中，N端圓形突出物中的Lys206和His207的殘基分別用Gln和Glu替換。
在本發(fā)明的一些藥物制劑中，Tf融合蛋白被工程化，在治療性蛋白質或肽和Tf部分之間含有裂解位點。這種可裂解的位點或接頭在本領域是已知的。
本發(fā)明的藥物組合物和本發(fā)明的方法包括添加轉胞吞作用增強劑，方便融合蛋白轉運穿過GI上皮。這些增強劑在本領域是已知的。參見Xia等，(2000)J.Pharmacol.Experiment.Therap.，295594-600；和Xia等(2001)Pharmaceutical Res.，18(2)191-195。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，口服藥物制劑包括包含被融合到上述的胰島素或GLP-1蛋白質或肽的N末端上的被修飾的Tf部分的Tf融合蛋白，被修飾的Tf部分的糖基化減少或無糖基化。通過口服施用包含有效劑量的融合蛋白的藥物組合物，這種藥物組合物可以被用于治療葡萄糖失衡的紊亂，例如糖尿病。
融合蛋白的有效劑量可以通過多種方法來測定，包括被計算來減輕患者中的與特定疾病相關的病癥的劑量，例如糖尿病病癥。在其它制劑中，計算的劑量包括在患者中誘導血糖水平的可檢測變化的融合蛋白的有效量。血糖中的這種可檢測的變化可以包括血糖水平下降約1％和90％之間，或者在約5％和約80％之間。血糖水平的下降將取決于被治療的疾病病癥，而可以改進藥物組合物或者施用的方法來在各個患者中達到期望結果。在其它情況下，配制藥物組合物和改進施用方法，檢測患者中治療性蛋白質或肽的活性水平的升高，例如，胰島素或GLP-1的活性的可檢測的升高。這種制劑和方法可以遞送約1pg到約100mg/kg體重的融合蛋白，約100ng到約100μg/kg體重的融合蛋白，約100μg/到約100mg/kg體重的融合蛋白，約1μg到約1g的融合蛋白，約10μg到約100mg融合蛋白或者約10mg到約50mg融合蛋白。還可以采用單位測定治療性蛋白質活性方法來計算制劑，例如約5-到約500單位的人胰島素或約10到約100單位的人胰島素。重量或活性的測定值可以采用被融合到Tf上的各個治療性蛋白質或肽的已知標準物來計算。
本發(fā)明還包括口服施用本發(fā)明的藥物組合物的方法。這種方法可以包括但是不限于，由患者或護理人員實施的口服施用的步驟。這種施用步驟可以包括間隔施用，例如每天一次或兩次，取決于Tf融合蛋白，疾病或患者病癥或者個別患者。這種方法還包括施用各種劑量的各種Tf融合蛋白。例如，藥物組合物的第一個劑量可是較高含量，產(chǎn)生期望效果，例如血糖水平下降。一旦獲得期望效果，就可以降低隨后的劑量。對施用方案的這些改變或修改可以由主治醫(yī)生或衛(wèi)生保健人員來實現(xiàn)。在有些情況下，可以由各個患者來改變施用方案，例如，當患者正在監(jiān)控血糖水平被施用本發(fā)明的mTf-胰島素或mTf-GLP-1口服組合物時。
本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的口服組合物或藥劑組合物的方法，包括將本發(fā)明的Tf融合蛋白配制成可口服施用的形式。在其它情況下，本發(fā)明包括制備本發(fā)明的組合物或藥劑組合物的方法，包括將本發(fā)明的Tf融合蛋白配制成適合口服施用的形式。
此外，本發(fā)明包括肺部遞送Tf融合蛋白制劑。肺部遞送特別可用于遞送難以通過其它施用路徑遞送的大分子。由于被遞送到肺部的藥物很容易通過肺泡區(qū)域直接吸收到血液循環(huán)中，這種肺部遞送對于系統(tǒng)遞送以及局部遞送來治療肺部疾病來說是有效的。
本發(fā)明提供適合形成用于口腔吸入(肺部遞送)來治療各種病癥或疾病的藥物分散體的組合物。Tf融合蛋白制劑可以通過不同方法來遞送，例如液體噴霧器、氣霧計量劑量吸入器(MDI′s)和干粉分散裝置。在配制用于肺部遞送的組合物中，通常加入藥學上可接受的載體包括表面活性劑(Surface activeagent)或表面活性劑(surfactant)和填充載體(bulk carrier)，來產(chǎn)生穩(wěn)定性、分散性、一致性，和/或提高該組合物均衡地肺部遞送給患者的分散特性。
表面活性劑(Surface active agent)或表面活性劑(surfactant)促進多肽通過粘膜或內層被吸收。有用的表面活性劑(Surface active agent)或表面活性劑(surfactant)包括脂肪酸及其鹽、膽汁鹽、磷脂或烷基糖。脂肪酸及其鹽的例子包括辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)和豆蔻酸(C14)的鈉鹽、鉀鹽和賴氨酸鹽。膽汁鹽的例子包括膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰帷⒏拾冰Z脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、?；敲撗跄懰?、石膽酸和熊脫氧膽酸。磷脂的例子包括單鏈磷脂，例如溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌糖和溶血磷脂酰絲氨酸；或雙鏈磷脂，例如二酰磷脂酰膽堿、二酰磷脂酰甘油、二酰磷脂酰乙醇胺、二酰磷脂酰肌糖和二酰磷脂酰絲氨酸。烷基糖的例子包括烷基葡萄糖苷或烷基甘露糖苷，例如癸基葡萄糖苷和十二烷基葡萄糖苷。
可用作載體的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白(HSA)；填充劑(bulking agent)如糖類、氨基酸和多肽；pH調節(jié)劑或緩沖劑；鹽如氯化鈉，等等。這些載體可以是結晶的或者無定形的形式或者兩種的混合物。
用作填充劑的糖類的例子包括單糖如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；環(huán)化糊精，例如2-羥基丙基-.β.-環(huán)化糊精；以及多糖，例如棉子糖、麥芽糖糊精、葡聚糖等；醛醇，例如甘露醇、木糖醇等。用作填充劑的多肽的例子包括天冬氨酰苯丙氨酸甲酯。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，甘氨酸是優(yōu)選的。
添加劑是組合物中的最小組分，包含它們來在噴霧干燥過程中穩(wěn)定構象和提高粉末的分散性。這些添加劑包括疏水性氨基酸，例如色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等。
合適的pH調節(jié)劑或緩沖劑包括從有機酸和堿中制備得到的有機鹽，例如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等，檸檬酸鈉是優(yōu)選的。
用于肺部遞送的Tf融合物組合物可以被包裝成單位劑量，其中治療有效量的組合物被添加到單位劑量容器中，例如泡狀包裝物或明膠膠囊等。典型地采用包裝領域通常熟知的方法來加工泡狀包裝物或明膠膠囊。
美國專利6,524,557公開了藥物氣霧制劑，包括(a)HFA推進劑；(b)可分散在推進劑中的藥物活性肽；和(c)表面活性劑，如C8-C16脂肪酸或其鹽、膽汁鹽、磷脂或烷基糖類，這些表面活性劑增強在呼吸道后端系統(tǒng)地吸收多肽。本發(fā)明還提供加工這種制劑的方法和這種制劑在治療患者中的用途。
肺部遞送干燥粉末的方法利用用于產(chǎn)生加壓氣體來源的手泵的手持裝置。加壓氣體通過粉末分散裝置急速釋放，例如文氏管管口，分散的粉末可以被患者吸入。
干燥粉末分散裝置在幾個專利中被描述。美國專利3,921,637描述了具有用于刺穿簡單的粉末藥物的膠囊的針頭的手動泵。在EP 0467172；國際專利公開WO 91/02558；和WO 93/09832；美國專利4,627,432；4,811,731；5,035,237；5,048,514；4,446,862；5,048,514，和4,446,862中描述了多種藥物的托盤或條帶的用途。
蛋白治療劑的氣霧化被公開在歐洲專利EP 0289336中。治療性的氣霧劑被公開在國際專利公開WO 90/09781中。
本發(fā)明提供配制用于口腔吸入的Tf融合蛋白。制劑包含Tf融合蛋白和適合肺部遞送的藥物賦形劑。本發(fā)明還提供通過口腔吸入將Tf融合蛋白組合物施用給需要的患者。
轉基因動物在本發(fā)明的一個實施方案中，包括制備轉基因的非人類動物，該動物含有血清半衰期、血清穩(wěn)定性或生物利用度升高的本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合構建體。在一些實施方案中，乳鐵蛋白可以被用作融合蛋白的Tf部分，使得在乳汁中產(chǎn)生和分泌融合蛋白。
在大量專利和出版物中描述了成功制備轉基因的非人類動物，例如美國專利6,291,740(2001年9月18日授權)；美國專利6,281,408(2001年8月28日授權)；和美國專利6,271,436(2001年8月7日授權)，其內容在此完全引入作為參考。
對動物的遺傳組成進行改變，可以進行廣泛的商業(yè)應用，這些動物例如家養(yǎng)動物，包括奶牛、豬、山羊、馬、肉牛和綿羊。這些應用包括動物生產(chǎn)，這些動物表達大量容易回收形式的外源蛋白(例如，表達到乳汁或血液中)，體重增加、飼養(yǎng)效率、胴體組成、乳汁產(chǎn)量或含量升高、抗病性和對特定微生物感染的抵抗的動物生產(chǎn)，提高生長率或繁殖特性的動物生產(chǎn)。在其基因組中含有外源DNA序列的動物被稱作為轉基因動物。
最廣泛用于生產(chǎn)轉基因動物的方法是將DNA顯微注射到受精胚的原核中(Wall等，J.Cell.Biochem.49113 )。其它用于生產(chǎn)轉基因動物的方法包括用逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體感染胚胎。用野生型或重組的逆轉錄病毒感染移植前或移植后的小鼠胚胎已經(jīng)被報導(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260 ；Janenich等，Cell 24519 ；Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817151 ；Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826927 ；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 826148-6152 ；Stewart等，EMBO J.6383-388 )。
用逆轉錄病毒感染胚胎的可替代方法是將病毒或生產(chǎn)病毒的細胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等，Nature 298623 )。已經(jīng)報導，采用子宮內逆轉錄病毒感染妊娠中期的小鼠胚胎，將轉基因導入小鼠的幼殖體中(Jahner等，同上文 )。已經(jīng)報導用逆轉錄病毒或逆轉錄病毒載體感染牛和綿羊的胚胎，來生產(chǎn)轉基因動物。這些方案包括將逆轉錄病毒顆?；蛘哚尫拍孓D錄病毒顆粒的生長停滯(即，絲裂菌素C處理的)細胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵周隙中(PCT國際專利申請WO 90/08832 ；和Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40386 。PCT國際專利申請WO 90/08832描述將野生型貓科白血病病毒B注射到2-8個細胞階段的綿羊胚胎的卵周隙中。由被注射胚胎發(fā)育得到胎兒被證明含有多個整合位點。
美國專利6,291,740(2001年9月18日授權)描述采用轉導分化細胞(例如來源于鼠白血病病毒[MLV]的載體)的逆轉錄病毒載體，將外源DNA導入成熟前卵母細胞和成熟的未受精的卵母細胞(即，受精前的卵母細胞)中來生產(chǎn)轉基因動物。該專利還描述了通過細胞巨化病毒啟動子起始以及小鼠乳腺癌LTR來表達各種重組蛋白的方法和組合物。
美國專利6,281,408(2001年8月28日授權)描述采用胚胎干細胞生產(chǎn)轉基因動物的方法。簡而言之，胚胎干細胞與桑椹胚混合共培養(yǎng)來產(chǎn)生轉基因動物。在共培養(yǎng)之前，通過例如電穿孔、微注射或逆轉錄遞送，將外源遺傳物質導入導胚胎干細胞中。通過選擇標記例如新霉素，選擇以這種方式轉染的ES細胞，其中發(fā)生基因整合。
美國專利6,271,436(2001年8月7日)描述轉基因動物的生產(chǎn)，采用的方法包括分離原始生殖細胞，培養(yǎng)這些細胞以產(chǎn)生原始生殖細胞來源細胞系，轉化原始生殖細胞和被培養(yǎng)的細胞系，使用這些被轉化的細胞和細胞系來生產(chǎn)轉基因動物。生產(chǎn)轉基因動物的效率被極大地提高，因而，在生產(chǎn)轉基因的非嚙齒類動物物種中可以采用同源重組方法。
基因治療在本發(fā)明的一個實施方案中，包括被修飾的轉鐵蛋白融合構建體用于基因治療的用途，其中被修飾的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白結構域被連接到治療性蛋白質或肽上。血清半衰期或血清穩(wěn)定性提高的本發(fā)明的被修飾的轉鐵蛋白融合構建體特別適合于基因治療。
成功使用基因治療來表達可溶的融合蛋白已經(jīng)被描述。簡而言之，最近在Ijima等(June 10，2001)Human Gene Therapy(美國)12/91063-77中說明，通過注射含有編碼可溶的融合蛋白的基因的腺病毒載體進行基因治療，可溶的融合蛋白由細胞毒性淋巴細胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分組成。在該基因治療應用中，通過關節(jié)內注射載體成功地治療了II型膠原誘導的關節(jié)炎的鼠模型。
基因治療還在大量美國專利中被描述，包括美國專利6,225,290(2001年5月1日授權)；美國專利6,187,305(2001年2月13日授權)和美國專利6,140,111(2000年10月31日)。
美國專利6,225,290提供方法和構建體，其中哺乳動物個體的腸上皮細胞被遺傳改進，可操作地插入表達具有期望治療作用的蛋白質的基因。通過施用主要由裸DNA組成的制劑，實現(xiàn)腸道細胞的轉化，該DNA被口服施用?？诜幕蚱渌改c道內的施用路徑提供了一種簡單的施用方法，而采用裸核酸避免與使用病毒載體進行基因治療相關的并發(fā)癥。表達的蛋白質被直接分泌到胃腸道和/或血流中，獲得治療性血液水平的蛋白質，從而治療需要該蛋白質的患者。被轉化的腸道上皮細胞短期或長期地治療與缺乏特定蛋白質相關的疾病，或者通過過度表達一種蛋白質進行治療。
美國專利6,187,305提供在脊椎動物，特別是哺乳動物來源的細胞中進行基因或DNA靶向的方法。簡而言之，通過DNA的同源重組或靶向，將DNA導入到脊椎動物來源的原代(primary)或次代(secondary)細胞中，DNA被導入到初級或次級細胞的基因組DNA的預先選擇的位點上。
美國專利6,140,111(2000年10月31日授權)描述逆轉錄病毒基因治療的載體。所公開的逆轉錄病毒載體包括目標基因的插入位點，能夠在廣泛的各種轉染細胞類型中表達高水平的蛋白質，該蛋白質來源于目標基因。還公開了缺乏可選擇標記的逆轉錄病毒載體，從而使得它們適合于在各種疾病狀態(tài)的治療中進行人的基因治療，而不會共表達標記產(chǎn)物，例如抗生素。這些逆轉錄病毒載體特別適合用于特定包裝細胞系中。逆轉錄病毒載體能夠插入到哺乳動物細胞的基因組中，使得它們成為人類和動物的遺傳疾病的基因治療中的特別有前景的候選?；蛑委煹湫偷匕?1)在體內將新的遺傳物質增加到患者細胞中，或者(2)從機體中取出患者細胞，將新的遺傳物質添加到細胞中，并將細胞重新導入機體中，即，體外基因治療。對于如何使用逆轉錄病毒載體在各種細胞中進行基因治療的討論，存在于例如1989年9月19日授權的美國專利4,868,116和1990年12月25日授權的美國專利4,980,286(上皮細胞)，1989年8月10日公開的WO 89/07136(肝細胞)，1990年7月25日公開的EP 378,576(成纖維細胞)和1989年6月15日公開的WO 89/05345和1990年6月28日公開的WO/90/06997(內皮細胞)中，這些專利的公開內容在此引入作為參考。
含有轉鐵蛋白融合蛋白的試劑盒在還有一個實施方案中，本發(fā)明提供含有轉鐵蛋白融合蛋白的試劑盒，該試劑盒可以被用于，例如，治療性或非治療性應用。試劑盒包含具有標簽的容器。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶和試管。容器可以用各種材料制備，例如玻璃或塑料。容器中裝有包括轉鐵蛋白的組合物，如上所述，轉鐵蛋白對于治療性或非治療性的應用是有效的。組合物中的活性試劑是治療性蛋白質。容器上的標簽指明該組合物被用于特定的治療或非治療性應用，可能還指明用于體內的或體外的用途，例如如上所描述的那些用途。
本發(fā)明的試劑盒通常還包括上述的容器，以及一個或多個包含商業(yè)和使用者期望的物質的其它容器，包括緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，注射器和具有用途說明的包裝插入物。
無需進一步描述，通過利用前面的描述和如下的說明性實施例，相信本領域的普通技術人員能夠利用本發(fā)明并實施要求保護的方法。例如，當與未被融合的治療性部分的可比較的活性相比時，技術人員能夠容易地確定本發(fā)明的融合蛋白構建體的體外和體內的生物活性。類似地，本領域技術人員能夠容易地確定按照本發(fā)明的構建體的血清半衰期和血清穩(wěn)定性。因此，如下的工作實施例特別地指示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，不被解釋為以任何方式限制公開的剩余權利。
實施例實施例1T-20/轉鐵蛋白融合蛋白T-20是HIV基因融合抑制劑肽，具有如下氨基酸序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO17)。
本發(fā)明提供半衰期延長的包含T-20和被修飾的轉鐵蛋白(mTf)的融合蛋白，用于治療與病毒傳播相關的疾病的這種融合蛋白的藥物組合物。下面描述的實施例也可以用于生產(chǎn)具有肽T-20的類似物的轉鐵蛋白融合蛋白。
利用釀酒酵母將T-20融合到被修飾的轉鐵蛋白(mTf)上，制備本發(fā)明的具有抗-HIV活性的轉鐵蛋白融合蛋白。因此，首先，將SEQ ID NO17反譯為DNA，密碼子優(yōu)化為適合釀酒酵母，融合到mTf的N末端或C末端來生產(chǎn)T-20融合構建體。
5′端融合作為一個例子，采用在兩端具有限制性位點突出端的重疊引物，例如用于連接到適當載體中的XbaI和KpnI位點，將T-20融合到mTf的5′端?？商娲?，可以制備具有其它限制性位點突出端的重疊引物，或者引物可以退火到具有適當?shù)南拗菩晕稽c突出端的銜接子上，用于連接到特定設計載體上。
載體被特別設計來具有限制性位點，例如XbaI和KpnI位點，使得治療性分子可以融合到mTf的N末端。利用XbaI和KpnI位點或者被修飾的轉鐵蛋白(mTf)的載體的5′端上的其它合適限制性位點，將引物退火并克隆到該載體中。然后，從該載體中切出編碼T-20/mTf融合蛋白的表達盒，并克隆到用于蛋白表達的酵母載體中。
特別地，具有限制性突出端的如下重疊引物被設計來制備5′T-20融合物 重疊引物具有如下序列P0038CTAGAGAAAAGGTACACTAGCTTAATACAC(SEQ ID NO18)P0039TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTACCTTTTCT(SEQ ID NO19)P0040TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG(SEQ ID NO20)P0041TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT(SEQ ID NO21)P0042AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTGTAC(SEQ ID NO22)P0043AAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC(SEQ ID NO23)引物在65℃下退火，被連接到特別設計的pREX0004載體上，用XbaI和KpnI酶切生成pREX0016。通過測序確定正確克隆后，匯集正確的克隆，并用另一對合適的限制性酶例如PsiI和AgeI，從pREX0016中切取編碼T-20/mTf融合蛋白的表達盒。將該表達盒連接到用PsiI和AgeI酶切的酵母載體例如pSAC3中。然后，含有T-20/mTfN末端融合蛋白的pSAC3通過電穿孔進入到酵母細胞中，用于蛋白質生產(chǎn)。
3′端融合以相同的方式，采用兩端具有限制性位點突出端的重疊引物，例如Sal1和HindIII或其它限制性酶，將T-20融合物融合到T-20的3′端上。一旦退火，利用限制性位點例如Sal1和HindIII將該片段克隆到特別設計的載體pREX0001上。在測序確定正確克隆之后，用Sal1和HindIII酶切質粒，將片段亞克隆到pREX0004中，pREX0004被特別地設計成具有獨特的Sal1和HindIII位點，以使治療性蛋白被融合到mTf的C末端上。得到的質粒是pREX0017。然后，用適當?shù)拿咐鏟siI和AgeI來酶切pREX0017，以從該載體中取出T-20/mTf表達盒。將T-20/m-Tf表達盒亞克隆到酵母載體例如pSAC3中，以在酵母中表達。
特別地，具有限制性突出端的如下重疊引物被設計來制備被融合到mTf的C末端的T-20融合物 重疊引物具有如下序列
P0044TCGACCTTACACTAGCTTAATACAC(SEQ ID NO24)P0045TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAAGG(SEQ ID NO25)P0040TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG(SEQ ID NO26)P0041TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT(SEQ ID NO27)P0046AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTTAATA(SEQ ID NO28)P0047AGCTTATTAAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC(SEQ ID NO29)引物在65℃下退火，被連接到用Sal1和HindIII酶切的特別設計載體上。在測序確定正確克隆后，匯集正確的克隆，并用另一對合適的限制性酶例如PsiI和AgeI來從載體中切取編碼T-20/mTfC末端融合蛋白的表達盒。將該表達盒連接到用PsiI和AgeI酶切的酵母載體例如pSAC3中。然后，含有T-20/mTf融合蛋白的pSAC3通過電穿孔進入到酵母細胞中，用于蛋白質生產(chǎn)。
C末端修飾在mTf的3′端進行修飾，確定它們是否會提高融合物表達水平、T-20融合物活性和/或肽在mTf的C末端的肽的靈活性(mobility)。
RRP刪除首先，mTf的3′末端的脯氨酸被去除。除了脯氨酸，相鄰的兩個精氨酸殘基可能會呈現(xiàn)潛在的Kex2p蛋白酶裂解位點，被去除。被刪除的序列被顯示在下面的未被修飾的3′T-20mTf融合插入物(pREX0017，SEQ ID NO31)和具有RRP刪除的3′T-20mTf融合插入物(pREX0032，SEQ ID NO30)的比對中
ArgArgPro (pREX0032SEQ ID NO30) (pREX0017SEQ ID NO31)特別地，用與所述序列相鄰區(qū)域同源的引物刪除RRP序列，用于產(chǎn)生刪除的引物為P0060TCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCTACACTAGCTTAATACACTCCTT(SEQ ID NO32)P0061AAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTGCAGGCTTCCAGGAGTGATGA(SEQ ID NO33)采用外引物(external primer)，以pREX0017作為模板進行誘變PCR反應，生產(chǎn)缺失編碼RRP的9個堿基的產(chǎn)物。然后，用SphI/HindIII酶切該產(chǎn)物，并克隆到用SphI/HindIII酶切的pREX0017中，制備pREX0032。然后用AgeI/PsiI酶切pREX0032，亞克隆到酵母載體例如pSAC3中，轉化到酵母中來表達蛋白。
C402-C674二硫鍵的去除在接下來的步驟中，去除伸展在mTF分子的Cys402和Cys674之間的二硫鍵。這是通過將兩個半胱氨酸殘基突變?yōu)楦拾彼釟埢鶃韺崿F(xiàn)。首先，采用誘變引物將Cys402突變?yōu)镚ly。誘變引物為P0064TTGTCTACATAGCGGGCAAGGGTGGTCTGGTGCCTGTCTTG (SEQ ID NO34)P0065CAAGACAGGCACCAGACCACCCTTGCCCGCTATGTAGACAA (SEQ ID NO35)采用外引物，以pREX0017作為模板進行PCR反應，產(chǎn)生具有期望突變的產(chǎn)物。然后用HpaI/PstI酶切產(chǎn)物，再克隆到pREX0017中來產(chǎn)生一個Gly402中間體，pREX0039。接著，按照相同程序，采用pREX0004作為模板，使用如下引物將Cys674突變?yōu)镚ly674P0068TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGTACTTTCCGTCGACCTTAA(SEQ ID NO36)P0069CTTATTAAGGTCGACGGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGTGG(SEQ ID NO37)生成的產(chǎn)物周SphI/HindIII酶切，并亞克隆到新的Gly402中間體pREX0039中，生成pREX0038。該質粒不含T-20肽，使得它將來可用于其它mTf融合物中。為了將T-20肽插入pREX0038中，克隆pREX0017的SalI/AgeI片段來形成pREX0034。然后用AgeI/PstI酶切pREX0034。將該表達盒亞克隆到酵母載體如pSAC3中，轉化到酵母中來進行蛋白表達。該突變被顯示在下面的未被修飾的3′T-20mTf融合質粒插入物(pREX0017)和具有C402-C674二硫鍵刪除的3′T-20mTf融合插入物的比對中 (SEQ ID NO38)(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)(SEQ ID NO41)二硫鍵和RRP去除組合在第三步中，RRP刪除和C402-C674二硫鍵刪除被組合。開始，以與pREX0032相同的方式制備中間體質粒pREX0041，除了在引物中存在Cys674突變。如下引物被采用P0066TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGCACTTTCTACACTAGCTTAATA(SEQ ID NO42)P0067GTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGT(SEQ ID NO43)
然后用SphI/HindIII酶切pREX0041，并亞克隆到pREX0039中來生成pREX0033。然后用AgeI/PsiI酶切pREX0033。將表達盒亞克隆到酵母載體例如pSAC3中，然后轉化到酵母中來進行蛋白表達。如下的pREX0033與pREX0017的mTf3′T-20融合物的比對顯示生成的產(chǎn)物的突變。
(SEQ ID NO38)(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)(SEQ ID NO44)mTf-T20在兔子中的藥物代謝動力學通過上述方法將T20融合到mTf的C末端，以生產(chǎn)mTf-T-20融合蛋白。將50μg mTf-T20融合蛋白靜脈注射到新西蘭白兔體內，并且在指定時間(參見附圖4)采集3ml血液，分離血漿并冷凍保存。隨后在特異于人轉鐵蛋白而不與兔子內源轉鐵蛋白發(fā)生交叉反應的ELISA檢測中分析血漿樣本。在注射2h后測定的mTf-T20的濃度通常是最高的，被視為100％。其它濃度與2小時時的濃度相比較。計算得到清除半衰期為44±2小時。附圖4顯示mTf-T20在兩只兔子體內的藥物代謝動力學。
mTf在人體內的半衰期約14天，在兔子體內為60小時。因此，可以預期mTf-T20在人體內的半衰期超過7天，比所報道的T20的2小時的半衰期顯著地延長了。
實施例2EMP1/轉鐵蛋白融合蛋白已經(jīng)證明，EMP1(SEQ ID NO11)通過引起受體二聚化，能夠模擬EPO活性。該肽是環(huán)化的，與EPO不同源。為了具有活性，該肽得與其它肽一起作用，例如作為二聚體，使得兩個拷貝的受體足夠接近以形成活性復合物。與許多肽一樣，肽二聚體的半衰期短，融合到轉鐵蛋白上將會延長壽命，是有益的。本發(fā)明提供具有EPO模擬活性的融合蛋白。作為例子，本發(fā)明的融合蛋白包含肽EMP1肽(SEQ ID NO11)和半衰期延長的被修飾的轉鐵蛋白(mTf)。本發(fā)明還提供這種融合蛋白的藥物組合物，用于治療與低或缺乏紅細胞生成相關的疾病。
EMPI-mTF的融合與插入起始融合到mTf上包括融合到mTf的N末端，C末端，以及N末端與C末端上。各個融合物能夠結合受體，但是不能使受體活化。雙融物(dualfusion)，其中一個是區(qū)別于另一個的不同密碼子組成以防止重組，使能結合到受體上并引起受體的活化。
以兔模型1JNF作為模板，采用ExPasy Swiss Model Server檢驗人Tf的N-結構域(PDB標識符1A8E)和全長Tf模式AAAaoTfwo，表明存在大量潛在位點，用于插入肽，直接插入，或者通過替換大量殘基來插入。這些位點與C-結構域的等價位點重復。

這些環(huán)中的兩個是插入EMP1肽的優(yōu)選位點N1His289(286-292)和N2Asp166(162-170)。這些位點提供結合EPO受體的兩半所需的正確方位。當插入位點在N結構域的N1和N2結構域上時，這兩個亞結構域之間具有鉸鏈的柔韌性，使得它們能夠結合到受體上。
由于N結構域和C結構域之間的結構相似性，C結構域上的等同插入位點(C1489-495，C2623-628)可以用于使該分子多價化。這可通過上面指出的位于N或C結構域上的潛在插入位點或者兩個結構域上的位點的組合來實現(xiàn)。
N1＝SEQ ID NO13N2＝SEQ ID NO14C1＝SEQ ID NO15C2＝SEQ ID NO16制備EMP1/mTf融合蛋白的步驟在本實施例中，采用EMP1肽和mTf的編碼核酸，將兩條EMP1肽(SEQID NO11)工程化到轉鐵蛋白支架上。
1 ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggtg g t y s c h f g p l t w v c k p q g g核酸序列SEQ ID NO45氨基酸序列SEQ ID NO11AEMP1肽被工程化到mTf的His289和Gly290之間。轉鐵蛋白分子固有的重復，即兩個結構域相互映襯，使得可能將第二條EMP1肽工程化到C結構域的重復區(qū)中，在Glu625和Thr626之間。
N 277 D-KSKE--FQ LFSSP KDL LFKDSAHGFL KVPPRMDAKM YLGYEYVTAIC 611 NVTDCSGNFC LFRS KDL LFRDDTVCLA KLHDRNTYEK YLGEEYVKAVN-結構域SEQ ID NO13C-結構域SEQ ID NO16作為一個例子，對于各種插入，合成兩個重疊誘變引物(參見下文)。采用含有編碼mTf的核酸的載體作為模板，例如pREX0010，使用各種誘變引物和來自Tf cDNA的5′端或3′端的外引物進行反應。然后，將來自這兩個反應的產(chǎn)物混合，用外引物進一步反應來將兩種產(chǎn)物連接在一起。His289-Gly290插入子的PCR產(chǎn)物用XbaI和HpaI消化，并連接到用XbaI/HpaI消化的pREX0010中。然后用HpaI和SalI消化得到的載體，連接用HpaI/SalI消化的Glu625-Thr626插入子的PCR產(chǎn)物。
His289-Gly290插入(SEQ ID NO46)←-------------2031 agacaaatca[aaagaatttc aactattcag ccctcctcat ggtggtactt actcttgtca ttttggtccatctgtttagt tttcttaaag ttgataagtc gagaggagta ccaccatgaa[tgagaacagt aaaaccaggt>>.............EMOm..............>
>....................................Tf....................................>
>.................................N結構域..................................>
2101 ttgacttggg tttgtaagcc]acaaggtggt gggaaggacc tgctgtttaa ggactctgcc cacgggttttaactgaaccc aaacattcgg tgttccacca cccttcctgg acgacaaatt cctgagacgg]gtgcccaaaa-----------→>............EMOm.............>>
>....................................Tf..................................>
>.................................N結構域................................>
Glu625-Thr626插入(SEQ ID NO47)←-------------3081 cctatttgga agcaacgtaa ctgactgctc[gggcaacttt tgtttgttcc ggtcggaagg tggtacttacggataaacct tcgttgcatt gactgacgag cccgttgaaa acaaacaagg ccagccttcc accatgaat[g>>...EPOm...>
>...................................C結構域................................>
>....................................Tf....................................>
KpnI-------3151 tcttgtcatt ttggtccatt gacttgggtt tgtaagccac]aaggtggtac caaggacctt ctgttcagagagaacagtaa aaccaggtaa ctgaacccaa acattcggtg ttccaccatg gttcctggaa gacaagtctc-----------→>......................EPOm.......................>>
>.................................C結構域.................................>
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3221 atgacacagt atgtttggcc aaacttcatg acagaaacac atatgaaaaa tacttaggag aagaatatgttactgtgtca]tacaaaccgg tttgaagtac tgtctttgtg tatacttttt atgaatcctc ttcttataca>................................C結構域..................................>
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用適當?shù)南拗菩悦?，從載體上切出含有EMP1/mTF融合蛋白的表達盒，并連接到酵母載體中，例如pSAC35。將pSAC35轉化到酵母中來表達蛋白質。
用于插入EPO模擬肽或者任何其它肽的可替代位點是轉鐵蛋白C-結構域的兩個糖基化位點，N413和N611。這些位點的優(yōu)點在于，一旦實現(xiàn)插入，就會通過破壞N-X-S/T序列來防止糖基化。
實施例3GLP-1/轉鐵蛋白融合蛋白GLP-1是調控胰島素分泌的肽。在患有糖尿病特別是II型糖尿病的人類患者中，GLP-1具有抗糖尿病活性。與其它肽相同，GLP-1在人體內的血漿半衰期短。本發(fā)明提供半衰期延長的被融合到mTf上的GLP-1融合蛋白，以及可以口服施用的這種融合蛋白的藥物組合物，它們可以用于治療與異常葡萄糖水平相關的疾病。
本發(fā)明還提供包含GLP-1類似物和mTF的融合蛋白。在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-1類似物在N末端具有額外His殘基。His殘基可以被添加到GLP-1的N末端，或者在GLP-1的N末端的His殘基后插入His殘基。在另一個實施方案中，GLP-1類似物包含在位置2上的氨基酸取代。例如，GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)肽(SEQ ID NO6)上的Ala被另一種氨基酸取代。
在該實施例中，描述了制備GLP-1/mTf融合蛋白的步驟。相同的步驟可以被用于生產(chǎn)具有GLP-1肽類似物的轉鐵蛋白融合蛋白。
采用GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列來制備GLP-1/mTf融合蛋白。
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr (SEQ ID NO48)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg (SEQ ID NO64)例如，GLP-1(7-36)的肽序列可以被反譯成DNA，并針對酵母進行密碼子優(yōu)化catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaah a e g t f t s d v s s y l e g q a a k etttattgcttggttggttaaaggtaga (SEQ ID NO49)f i a w l v k g r(SEQ ID NO48)特別地設計引物，以在退火后形成5′XbaI和3′KpnI粘性末端，并且可以被直接連接到XbaI/KpnI酶切的pREX0052中，正好位于前導序列的5′末端和mTf的N末端?？商娲兀筛脑斐善渌恼承阅┒?，連接到其它載體中。
XbaI-+-----1 aggtctctag agaaaaggca tgctgaaggt acttttactt ctgatgtttc ttcttatttgtccagagatc tcttttccgt acgacttcca tgaaaatgaa gactacaaag aagaataaac>>......FL.......>>
r s l e k r (SEQ ID NO52)>>..................GLP-1....................>
(SEQ ID NO48)h a e g t f t s d v s s y lKpnI------+61 gaaggtcaag ctgctaaaga atttattgct tggttggtta aaggtagggt acctgatacttccagttc gacgatttct taaataacga accaaccaat ttccatccca tggactat>......................GLP-1......................>>
e g q a a k e f i a w l v k g r>>..mTf..>>
v p d頂端的鏈SEQ ID NO50底端的鏈SEQ ID NO51頂端的鏈的引物P0056(SEQ ID NO50的核苷酸7-112)底端的鏈的引物P0057(SEQ ID NO51的核苷酸9-108)
在退火和連接后，對克隆進行測序來確定正確插入。該載體被命名為pREX0094。用NotI從pREX0094中切出表達盒，并亞克隆到NotI酶切的酵母載體pSAC35中，制備pREX0100。
然后將該質粒通過電穿孔進入到宿主酵母屬酵母菌中，在極限培養(yǎng)基平板上選擇亮氨酸原養(yǎng)型的轉化體。在液體極限培養(yǎng)基(minimal media)中培養(yǎng)，通過SDS-PAGE、western印跡和ELISA分析上清液來檢測表達。
實施例4β-IFN/轉鐵蛋白融合蛋白β-IFN可有效用于治療各種疾病，例如，但是不限于，多發(fā)性硬化、腦瘤、皮膚癌和乙型肝炎和丙型肝炎。與大多數(shù)細胞因子相同，β-IFN的循環(huán)半衰期短。本發(fā)明提供包含被融合到mTf上的β-IFN的融合蛋白，其半衰期被延長，并且提高了在患者中的功效。本實施例描述制備可以口服施用的β-IFN/mTf融合蛋白的步驟。
在本實施例中，IFNβ-1被融合到被修飾的轉鐵蛋白的N末端或C末端。從ATCC(No.39517)獲得IFNβ-1克隆。用特定設計的引物確定IFNβ-1克隆的DNA序列。這些引物在IFNβ-1DNA序列外，被設計來從載體開始閱讀，以獲得該克隆的全長序列。所用的引物為P0070 GCTATGACCAACAAGTGTCTC (SEQ ID NO53)P0071 CGCACCTGTGGCGCCGGTGATG (SEQ ID NO54)N末端融合一旦確定DNA序列，設計將IFNβ-1融合到mTf上的引物。N末端融合是一個兩步的過程。采用具有XbaI和KpnI位點的引物的直接融合，將破壞KpnI位點，并修剪(clip)mTf的起始。設計一種接頭，引物為P0082(SEQ IDNO55的核苷酸18-48)和P0083(SEQ ID NO56的核苷酸17-39)，通過bp486的單一沉默突變，由T變?yōu)镚(黑體)，在IFNβ-1的3′末端產(chǎn)生內部KpnI位點，具有5′XbaI突出端和與KpnI位點退火的3′GTAC。突出端破壞存在于pREX0052的KpnI位點。接頭被退火并連接到用XbaI/KnpI酶切的pREX0054上，生成具有未被改變的mTf和KpnI位點的中間體載體，該載體可以用于將IFNβ-1融合在mTf的N末端。
XbaI KpnI-+----- -----+>>............P0082.............>>
ctgcttactc taggtctcta gagaaaacag ggtacctccg aaacgtacct gataaaactggacgaatgag atccagagat ctcttttgtc ccatggaggc tttgcatgga ctattttgac<<........P0083........<<
>>.........MFa-1..........>>
a y s r s l e k (SEQ ID NO57)>>....IFN-B-1.....>>
t g y l r n (SEQ ID NO58)>>.....mTf......>
v p d k t(SEQ ID NO59)頂端的鏈SEQ ID NO55底端的鏈SEQ ID NO56
第二套引物，P0084(SEQ ID NO60)和P0085(SEQ ID NO61)被設計來裁剪IFNβ-1基因的末端，借助XbaI和KpnI位點，通過誘變PCR順序插入到中間體載體中。用XbaI/KpnI消化該被裁剪的基因，去除IFNβ-1的最后5個氨基酸；然而，將它們工程化到中間體載體中。將用XbaI/KpnI剪切的IFNβ-1基因連接到用XbaI/KpnI剪切的中間體載體上，得到的構建體pREX0048。
P0084 (SEQ ID NO60)>>-------FL--------->>
>>----IFNβ-1------->>
XbaICTCTAGGTC GAAAAGGAGCTACAACTTGCTTGGATTCP0085 (SEQ ID NO61)<<--------IFNβ-1-------<<
KpnIGTTTCGGA CTGTAAGTCTG
在建立pREX0048構建體后，進行測序來確定正確插入。然后，NotI片段的表達盒被亞克隆到NotI酶切的酵母載體pSAC35中，制備pREX0050。
C-末端融合
用特定設計的引物P0086(SEQ ID NO62)和P0087(SEQ ID NO63)PCR擴增起始克隆，此外，用于裁剪IFNβ-1的末端，以分別在5′和3′末端產(chǎn)生SalI和HindIII位點。將新裁剪的產(chǎn)物連接到用SalI/HindIII酶切的pREX0052上，產(chǎn)生pREX0049。
P0086 (SEQ ID NO62)>>---mTf---->>
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HindIIICATAAAATCATAAGAATT TATTAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGT在建立Prex0049構建體后，進行測序來確定正確插入。然后，將NotI片段的表達盒亞克隆到NotI酶切的酵母載體中，例如pSAC35，制備pREX0051。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將Cys17(成熟蛋白中的)突變?yōu)镾er，使β-IFN-1(GenBank登錄號NM_002176，SEQ ID NO65)變得更穩(wěn)定和更易溶。通過常規(guī)的誘變反應，例如采用特定設計的引物，和以編碼β-IFN-1的核酸作為模板進行誘變PCR反應，將Cys17突變?yōu)镾er。
此外，通過修飾N聯(lián)糖基化位點NES(SEQ ID NO65的殘基80-82)/T，來修飾β-IFN-1，以防止糖基化。作為一個例子，N可以被誘變?yōu)镼，而S/T可以被誘變?yōu)锳la和其它氨基酸?？梢圆捎锰囟ㄔO計的引物，以編碼β-IFN-1的核酸作為模板進行誘變PCR反應來進行這種誘變。
實施例5胰島素-轉鐵蛋白融合蛋白胰島素是一種由胰腺中的胰島分泌的肽激素，其調節(jié)碳水化合物和脂肪的代謝，特別是在葡萄糖轉化為糖原中。胰島素被施用給患有I型和II型糖尿病的病人，以及糖尿病動物。目前，胰島素必需通過皮下注射來施用，在人體中的半衰期短。本發(fā)明提供半衰期延長的被融合到mTf上的胰島素的融合蛋白，以及可以口服施用的這種融合蛋白的藥物組合物，用于治療與異常葡萄糖水平相關的疾病。
在本實施例中，描述了用于制備胰島素/mTf融合蛋白的步驟?？梢圆捎妙愃撇襟E來制備具有胰島素肽類似物的轉鐵蛋白融合蛋白。
對于在酵母屬中進行表達，首先在基礎載體pREX0052中制備構建體，包括具有用于在酵母中表達mTf的表達盒的大腸桿菌克隆載體，被插入到5′XhaI/KpnI位點之間用于N末端融合或者在3′SalI/HindIII位點上用于C末端融合。
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這些構建體形成具有(5′到3′)酵母PRB1啟動子、引導分泌到生長培養(yǎng)液中的前導序列、(N末端融合)、mTf序列、(C末端融合)、終止密碼和ADH1終止子序列的表達盒。一旦被構建，該表達盒作為NotI片段被取出，并插入到NotI的消化大腸桿菌/酵母穿梭載體pSAC35中。
所用的胰島素序列對應于Genbank登錄號NM_000207，SEQ ID NOS71(DNA)和72(蛋白質)，如下所示。
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e n y c n421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagctctctctacc ttatttcggg aacttggtcg上述序列的cDNA可通過多種方法制備，例如通過RT-PCR，從cDNA庫中獲得，或者通過重疊合成寡核苷酸。為了從cDNA庫中制備克隆，合成兩條引物，作為PCR引物。
5′端引物5′-tttgtgaaccaacacctgtgcggc-3′(SEQ ID NO73)3′端引物3′-gacgagggagatggtcgacctcttgatgacgttg-5′(SEQ ID NO74)為了進行N末端插入，使用5′誘變引物，以第一PCR產(chǎn)物作為模板來生成第二PCR產(chǎn)物。該引物插入了前導序列的最后5個氨基酸和XbaI位點。由于KpnI位點的形成會導致氨基酸改變，所以不能通過這種方法插入KpnI位點。作為替代，用XbaI/PvuII消化PCR產(chǎn)物。然后用具有PvuII5′末端和3′突出端的兩個重疊寡聚物生成接頭，3′突出端會連接到KpnI消化的pREX0052的KpnI突出端上。通過退火，并將該接頭連接到被消化的PCR片段上，將生成的產(chǎn)物連接到用XbaI/KpnI消化的pREX0052上，生成質粒pREX0052N-胰島素(SEQ ID NOS75和76分別為DNA和蛋白質)。
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c t s i c s l y q l e n y c n>>mTfv5′引物5′-gcttactctaggtctctagataagaggtttgtgaaccaacacctgtgcg-3′(SEQ IDNO77)接頭5′-ctggagaactactgcaacgtac-3′(SEQ ID NO78)3′-gacctcttgatgacgttg-5′(SEQ ID NO79)為了進行C末端插入，以第一PCR產(chǎn)物作為模板，用5′和3′誘變引物來生成第二PCR產(chǎn)物。然后用SalI/HindIII消化，并連接到用SalI/HindIII消化的pREX0052中，生成質粒pREX0052C-胰島素(SEQ ID NO80和81)。
SalI-+-----1 tgcactttcc gtcgaccttt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagctacgtgaaagg cagctggaaa acacttggtt gtggacacgc cgagtgtgga ccaccttcga>>......mTf......>>
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a -5′引物5′-tgcactttccgtcgaccttttgtgaaccaacacctgtgcg-3′(SEQ ID NO82)3引物3′-gacctcttgatgacgttgattattcgaattaa-5′(SEQ ID NO83)一旦檢測并確定了N末端和C末端插入的DNA序列后，用NotI消化質粒pREX0052N-胰島素和pREX0052C-胰島素，取出表達盒。然后將表達盒連接到NotI消化的pSAC35中，生成pSAC35N-胰島素和pSAC35C-胰島素。然后這些質粒通過電穿孔進入到宿主酵母屬酵母菌中，在極限培養(yǎng)基平板上篩選亮氨酸原養(yǎng)型的轉化體。在液體極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過SDS-PAGE、western印跡、ELISA和BIAcore分析上清液來檢測表達。
這些融合構建體生成連接到轉鐵蛋白上的胰島素原。雖然最終的表達產(chǎn)物可能僅含有胰島素原，但是酵母中的蛋白酶可能在胰島素原生成和分泌時將其轉化為胰島素。在那種情況下，在表達后，可以用適當?shù)募兓鞍酌笇⒁葝u素原轉化為胰島素。
將胰島素/被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白口服施用給大鼠為了檢測胰島素/mT融合蛋白的胰島素活性，首先制備糖尿病大鼠。雌性Sprague-Dawley大鼠禁食24小時，用所測定的血糖含量建立基線。然后給大鼠腹膜內注射60mg/ml鏈脲霉素(STZ)溶液，繼續(xù)以60mg/kg劑量I.p.注射STZ四天以上，具有300mg/dl以上的禁食血糖水平的大鼠被選擇作為糖尿病大鼠。
在PBS或碳酸氫鈉中制備單獨的融合蛋白的溶液和胰島素溶液，以當被施用給大鼠時提供7-80單位胰島素/kg的劑量。作為對照，大鼠僅用PBS處理。在禁食12小時后，給大鼠口腔灌入所述溶液或將PBS，在0、30和60分鐘后，然后以每2小時的間隔，從尾巴收集血液樣本。在給藥之后的0、0.5、1、3、5、7、9和11小時的血糖水平用設計用于糖尿病的血糖監(jiān)控裝置來測定，在給藥之后11小時開始飼喂大鼠。
通過持續(xù)測定血糖水平下降來測定胰島素活性，通過僅用PBS處理的樣本的任何升高或下降來修正下降。比較融合蛋白的胰島素活性與未被融合的胰島素的活性。
為了檢測腸道粘膜中的轉鐵蛋白受體對融合蛋白的結合，如上所述，將融合蛋白和作為對照的未被融合的胰島素施用給誘發(fā)糖尿病的大鼠，采用標準的夾心ELISA和血清樣本來測定轉運?？商娲?，如上所述，通過口腔強飼，以80U胰島素/kg的劑量將125I標記的融合蛋白或125I標記的未被融合的胰島素施用給誘發(fā)糖尿病的大鼠。再如上所述，在0、30和60分鐘后，然后以每2小時的間隔，從尾巴收集血液樣本，通過HPLC分析血清樣本，采用例如Sephacryl柱，并用PBS洗脫樣本。含有125I標記的轉鐵蛋白、125I標記的胰島素、125I標記的融合蛋白的標準物也在Sephacryl柱上進行洗脫，確定它們的最大洗脫次數(shù)和餾分數(shù)量。用γ計數(shù)器測定各個餾分的放射性，并通過280nm下的吸光度來確定各個餾分的蛋白質含量。來自用融合蛋白處理的大鼠的血清樣本不會立即出現(xiàn)融合蛋白，可能會延遲數(shù)小時。
實施例6制備鐵親合性升高的治療性mTf融合蛋白制備鐵親合性升高的治療性mTf融合蛋白。作為制備鐵結合能力提高的被修飾的轉鐵蛋白融合蛋白的例子，對上述實施例5的操作進行如下改進。這些融合蛋白可以被用于方便融合蛋白跨越胃腸道上皮的攝取和轉運。
上述含有mTf序列的克隆載體，例如pREX0052，用一種限制性酶或一對限制性酶進行酶切，取出mTf基因部分。采用本領域的標準技術，對該片段進行定點誘變，使用在對應于SEQ ID NO1的核苷酸723的位置上導入突變的引物，將密碼子AAG(Lys)轉化為CAG(Gln)或GAG(Glu)。類似地，使用在對應于SEQ ID NO1的核苷酸726和728的位置上導入突變的引物，將密碼子CAC(His)轉化為CAG(Gln)或GAG(Glu)。還可以使用在全部三個核苷酸位置上都導入突變的引物，取代兩個鄰近氨基酸。這些核苷酸位點對應于由前導序列編碼的蛋白質的氨基酸225和226以及成熟蛋白質的氨基酸206和207。然后通過RT-PCR擴增突變片段，再連接到克隆載體中。含有突變的載體被用于后面的步驟，導入編碼治療性蛋白質的DNA分子。如上面的實施例5所述，可以將mTf融合蛋白序列導入酵母表達載體中，并轉化到酵母屬或其它酵母中來生產(chǎn)蛋白質。
如前面所討論，可以突變其它氨基酸來獲得鐵親合性升高的治療性mTf蛋白。
實施例7可溶的毒素受體/轉鐵蛋白梭菌屬神經(jīng)毒素是有毒物質。突觸結合蛋白I是肉毒梭桿菌神經(jīng)毒素血清型的主要作用受體。突觸結合蛋白I的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)是導致結合到不同神經(jīng)毒素血清型上的原因。如同其它肽，可溶的毒素受體的半衰期短，例如氨基酸1-53。本發(fā)明提供包含被融合到mTf上的氨基酸1-53的融合蛋白，與具有SEQ ID NO1-53序列的可溶毒素受體相比，其半衰期延長了。
本發(fā)明提供具有抗毒素活性和半衰期延長的融合蛋白。特別地，在本實施例中，融合蛋白包含被修飾的Tf和由突觸結合蛋白I的氨基酸1-53(SEQID NO4)組成的肽，是通過將一個或多個拷貝的編碼肽的核苷酸序列融合到Tf的核苷酸序列上來制備具有被融合到Tf的N末端或C末端上的肽的融合蛋白。
為了插入編碼SEQ ID NO4的序列，具有被修飾的轉鐵蛋白cDNA的載體pREX0010用限制性酶XbaI/KpnI消化來在5′末端插入該序列，用SalI/HindIII消化來在3′端插入該序列。
對于5′端插入，合成兩條重疊的寡聚物，在編碼SEQ ID NO4的核酸的5′末端形成XbaI突出端，在3′末端形成KpnI突出端。然后將這些寡聚物一起退火，并連接到用XbaI/KpnI消化的pREX0010載體上。
然后在酵母中進行轉化、選擇和表達。
雖然，參照上面的實施例詳細地描述了本發(fā)明，應當理解，在不偏離本發(fā)明的精神的前提下，可以進行各種改進。因此，本發(fā)明僅由下面的權利要求書來限定。在該說明書中提及的所有被引用的專利、專利申請和公開物在此完全引入作為參考。
序列表<110>比奧雷克西斯藥物公司(BIOREXIS PHARMACEUTICAL CORPORATION)<120>被修飾的轉鐵蛋白的融合蛋白<130>54710-5001-01-WO<150>US 60/406,977<151>2002-08-30<150>US 10/378,094<151>2003-03-04<160>90<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2318<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(51)..(2147)<223>GenBank登錄號NM_001063，轉鐵蛋白的基因和蛋白<220>
<221>信號肽<222>(51)..(107)<400>1gcacagaagc gagtccgact gtgctcgctg ctcagcgccg cacccggaag atg agg 56Met Arg1ctc gcc gtg gga gcc ctg ctg gtc tgc gcc gtc ctg ggg ctg tgt ctg 104Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu5 10 15gct gtc cct gat aaa act gtg aga tgg tgt gca gtg tcg gag cat gag 152Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu20 25 30gcc act aag tgc cag agt ttc cgc gac cat atg aaa agc gtc att cca 200Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro35 40 45 50tcc gat ggt ccc agt gtt gct tgt gtg aag aaa gcc tcc tac ctt gat 248Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp55 60 65tgc atc agg gcc att gcg gca aac gaa gcg gat gct gtg aca ctg gat 296Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp70 75 80gca ggt ttg gtg tat gat gct tac ctg gct ccc aat aac ctg aag cct 344Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro85 90 95gtg gtg gca gag ttc tat ggg tca aaa gag gat cca cag act ttc tat 392Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr100 105 110tat gct gtt gct gtg gtg aag aag gat agt ggc ttc cag atg aac cag 440Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln115 120 125 130
ctt cga ggc aag aag tcc tgc cac acg ggt cta ggc agg tcc gct ggg 488Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly135 140 145tgg aac atc ccc ata ggc tta ctt tac tgt gac tta cct gag cca cgt 536Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg150 155 160aaa cct ctt gag aaa gca gtg gcc aat ttc ttc tcg ggc agc tgt gcc 584Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala165 170 175cct tgt gcg gat ggg acg gac ttc ccc cag ctg tgt caa ctg tgt cca 632Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro180 185 190ggg tgt ggc tgc tcc acc ctt aac caa tac ttc ggc tac tcg gga gcc 680Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala195 200 205 210ttc aag tgt ctg aag gat ggt gct ggg gat gtg gcc ttt gtc aag cac 728Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His215 220 225tcg act ata ttt gag aac ttg gca aac aag gct gac agg gac cag tat 776Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr230 235 240gag ctg ctt tgc ctg gac aac acc cgg aag ccg gta gat gaa tac aag 824Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys245 250 255gac tgc cac ttg gcc cag gtc cct tct cat acc gtc gtg gcc cga agt 872Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser260 265 270atg ggc ggc aag gag gac ttg atc tgg gag ctt ctc aac cag gcc cag 920Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln275 280 285 290gaa cat ttt ggc aaa gac aaa tca aaa gaa ttc caa cta ttc agc tct 968Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser295 300 305cct cat ggg aag gac ctg ctg ttt aag gac tct gcc cac ggg ttt tta 1016Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu310 315 320aaa gtc ccc ccc agg atg gat gcc aag atg tac ctg ggc tat gag tat 1064Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr325 330 335gtc act gcc atc cgg aat cta cgg gaa ggc aca tgc cca gaa gcc cca 1112Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro340 345 350aca gat gaa tgc aag cct gtg aag tgg tgt gcg ctg agc cac cac gag 1160Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu355 360 365 370agg ctc aag tgt gat gag tgg agt gtt aac agt gta ggg aaa ata gag 1208Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu375 380 385tgt gta tca gca gag acc acc gaa gac tgc atc gcc aag atc atg aat 1256Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn390 395 400gga gaa gct gat gcc atg agc ttg gat gga ggg ttt gtc tac ata gcg 1304
Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala405 410 415ggc aag tgt ggt ctg gtg cct gtc ttg gca gaa aac tac aat aag agc 1352Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser420 425 430gat aat tgt gag gat aca cca gag gca ggg tat ttt gct gta gca gtg 1400Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val435 440 445 450gtg aag aaa tca gct tct gac ctc acc tgg gac aat ctg aaa ggc aag 1448Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys455 460 465aag tcc tgc cat acg gca gtt ggc aga acc gct ggc tgg aac atc ccc 1496Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro470 475 480atg ggc ctg ctc tac aat aag atc aac cac tgc aga ttt gat gaa ttt 1544Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe485 490 495ttc agt gaa ggt tgt gcc cct ggg tct aag aaa gac tcc agt ctc tgt 1592Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys500 505 510aag ctg tgt atg ggc tca ggc cta aac ctg tgt gaa ccc aac aac aaa 1640Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys515 520 525 530gag gga tac tac ggc tac aca ggc gct ttc agg tgt ctg gtt gag aag 1688Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys535 540 545gga gat gtg gcc ttt gtg aaa cac cag act gtc cca cag aac act ggg 1736Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly550 555 560gga aaa aac cct gat cca tgg gct aag aat ctg aat gaa aaa gac tat 1784Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr565 570 575gag ttg ctg tgc ctt gat ggt acc agg aaa cct gtg gag gag tat gcg 1832Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala580 585 590aac tgc cac ctg gcc aga gcc ccg aat cac gct gtg gtc aca cgg aaa 1880Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys595 600 605 610gat aag gaa gct tgc gtc cac aag ata tta cgt caa cag cag cac cta 1928Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu615 620 625ttt gga agc aac gta act gac tgc tcg ggc aac ttt tgt ttg ttc cgg 1976Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg630 635 640tcg gaa acc aag gac ctt ctg ttc aga gat gac aca gta tgt ttg gcc 2024Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala645 650 655aaa ctt cat gac aga aac aca tat gaa aaa tac tta gga gaa gaa tat 2072Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr660 665 670gtc aag gct gtt ggt aac ctg aga aaa tgc tcc acc tca tca ctc ctg 2120Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu
675 680 685 690gaa gcc tgc act ttc cgt aga cct taa aatctcagag gtagggctgc 2167Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro695caccaaggtg aagatgggaa cgcagatgat ccatgagttt gccctggttt cactggccca 2227agtggtttgt gctaaccacg tctgtcttca cagctctgtg ttgccatgtg tgctgaacaa 2287aaaataaaaa ttattattga ttttatattt c 2318<210>2<211>698<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu1 5 10 15Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu20 25 30His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val35 40 45Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr50 55 60Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr65 70 75 80Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu85 90 95Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr100 105 110Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met115 120 125Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser130 135 140Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu145 150 155 160Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser165 170 175Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu180 185 190Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser195 200 205Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val210 215 220Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp225 230 235 240Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu245 250 255Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala
260 265 270Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln275 280 285Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe290 295 300Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly305 310 315 320Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr325 330 335Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu340 345 350Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His355 360 365His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys370 375 380Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile385 390 395 400Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr405 410 415Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn420 425 430Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val435 440 445Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys450 455 460Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn465 470 475 480Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp485 490 495Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser500 505 510Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn515 520 525Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val530 535 540Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn545 550 555 560Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys565 570 575Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu580 585 590Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr595 600 605Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln610 615 620His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu
625 630 635 640Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys645 650 655Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu660 665 670Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser675 680 685Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro690 695<210>3<211>679<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>成熟的轉鐵蛋白<400>3Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala1 5 10 15Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser20 25 30Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu100 105 110Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp225 230 235 240
Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met245 250 255Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr325 330 335Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys355 360 365Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly385 390 395 400Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp405 410 415Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val420 425 430Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys435 440 445Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met450 455 460Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe465 470 475 480Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys485 490 495Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu500 505 510Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly515 520 525Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly530 535 540Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu545 550 555 560Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn565 570 575Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp580 585 590Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe
595 600 605Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser610 615 620Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys625 630 635 640Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val645 650 655Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu660 665 670Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro675<210>4<211>53<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>突觸結合蛋白I的氨基酸1-53<400>4Met Val Ser Glu Ser His His Glu Ala Leu Ala Ala Pro Pro Val Thr1 5 10 15Thr Val Ala Thr Val Leu Pro Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro20 25 30Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met35 40 45Asn Glu Leu His Lys50<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嗜中性乳鐵蛋白剪切變體<400>5Glu Asp Cys Ile Ala Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala1 5 10<210>6<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>胰高血糖素樣肽<220>
<221>未知特征<222>(31)..(31)<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221>未知特征<222>(37)..(37)<223>Xaa可以表示GLP-1中的Gly或GLP-2中的NH2<400>6His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>7<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有促胰島素活性的GLP-1分子<400>7His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys20 25<210>8<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有促胰島素活性的GLP-1分子<400>8His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly20 25<210>9<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GLP-1類似物<220>
<221>未知特征<222>(1)..(1)<223>Xaa可以是Ala，Gly，Val，Thr，Ile，或alpha-methyl-Ala<220>
<221>未知特征<222>(14)..(14)<223>Xaa可以是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，或Gly<220>
<221>未知特征<222>(20)..(20)<223>Xaa可以是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser或Gly<400>9
Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly Gln1 5 10 15Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EPO結構域<400>10Cys Arg Ile Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys1 5 10<210>11<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EMP1肽<400>11Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly20<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EMP20肽<400>12Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lysl 5 10<210>13<211>47<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>轉鐵蛋白的N1亞結構域<400>13Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His Gly Lys Asp1 5 10 15Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg20 25 30Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr Ala Ile35 40 45<210>14
<211>45<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>轉鐵蛋白的N2亞結構域<400>14Pro Glu Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser1 5 10 15Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys20 25 30Gln Leu Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln35 40 45<210>15<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>轉鐵蛋白的C1亞結構域<400>15Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly1 5 10 15Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu20 25 30Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly35 40<210>16<211>49<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>未知特征<223>轉鐵蛋白的C2亞結構域<400>16Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu Thr1 5 10 15Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu His20 25 30Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys Ala35 40 45Val<210>17<211>36<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220>
<223>HIV T-20抗融合肽(antifusogenic peptide)
<400>17Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0038<400>18ctagagaaaa ggtacactag cttaatacac 30<210>19<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0039<400>19tgcgattctt caattaagga gtgtattaag ctagtgtacc ttttct 46<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0040<400>20tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0041<400>21taattccaat aattcttgtt cattcttttc ttgctggttt40<210>22<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0042<400>22
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt gtac54<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0043<400>23aaaccaattc cacaaacttg cccatttatc 30<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0044<400>24tcgaccttac actagcttaa tacac25<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0045<400>25tgcgattctt caattaagga gtgtattaag ctagtgtaag g 41<210>26<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0040<400>26tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg40<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0041<400>27taattccaat aattcttgtt cattcttttc ttgctggttt40<210>28<211>55<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物P0046<400>28aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt taata 55<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0047<400>29agcttattaa aaccaattcc acaaacttgc ccatttatc 39<210>30<211>175<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0032插入物<400>30caaggctgtt ggtaacctga gaaaatgctc cacctcatca ctcctggaag cctgcacttt60ctacactagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 120acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggtttt aataa175<210>31<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pREX0017插入物<400>31caaggctgtt ggtaacctga gaaaatgctc cacctcatca ctcctggaag cctgcacttt60ccgtcgacct tacactagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga 120aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttta 180ataa184<210>32<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0060<400>32tcatcactcc tggaagcctg cactttctac actagcttaa tacactcctt 50<210>33<211>50<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物P0061<400>33aaggagtgta ttaagctagt gtagaaagtg caggcttcca ggagtgatga 50<210>34<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0064<400>34ttgtctacat agcgggcaag ggtggtctgg tgcctgtctt g 41<210>35<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0065<400>35caagacaggc accagaccac ccttgcccgc tatgtagaca a 41<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0068<400>36tccacctcat cactcctgga agccggtact ttccgtcgac cttaa 45<210>37<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0069<400>37cttattaagg tcgacggaaa gtaccggctt ccaggagtga tgaggtgg 48<210>38<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從1501開始的pREX0017質粒<400>38tagcgggcaa gtgtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 50
<210>39<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從1501開始的pREX0034質粒<400>39tagcgggcaa gggtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 50<210>40<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從2301開始的pREX0017質粒<400>40tgctccacct catcactcct ggaagcctgc actttccgtc gaccttacac 50<210>41<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從2301開始的pREX0034質粒<400>41tgctccacct catcactcct ggaagccggt actttccgtc gaccttacac 50<210>42<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0066<400>42tccacctcat cactcctgga agccggcact ttctacacta gcttaata 48<210>43<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0067<400>43gtgtattaag ctagtgtaga aagtaccggc ttccaggagt gatgaggt 48<210>44<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從2301開始的pREX0033質粒<400>44
tgctccacct catcactcct ggaagccggt actttctaca c41<210>45<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼具有EPO活性的肽的合成寡核苷酸<400>45ggtggtactt actcttgtca ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggt60<210>46<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>His289-Gly290插入PCR產(chǎn)物<400>46agacaaatca aaagaatttc aactattcag ctctcctcat ggtggtactt actcttgtca60ttttggtcca ttgacttggg tttgtaagcc acaaggtggt gggaaggacc tgctgtttaa 120ggactctgcc cacgggtttt 140<210>47<211>210<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Glu625-Thr626插入PCR產(chǎn)物<400>47cctatttgga agcaacgtaa ctgactgctc gggcaacttt tgtttgttcc ggtcggaagg60tggtacttac tcttgtcatt ttggtccatt gacttgggtt tgtaagccac aaggtggtac 120caaggacctt ctgttcagag atgacacagt atgtttggcc aaacttcatg acagaaacac 180atatgaaaaa tacttaggag aagaatatgt210<210>48<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胰高血糖素樣肽-1<400>48His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>49<211>90<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>編碼胰高血糖素樣肽-1的序列<400>49catgctgaag gtacttttac ttctgatgtt tcttcttatt tggaaggtca agctgctaaa60gaatttattg cttggttggt taaaggtaga 90<210>50<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>頂端的鏈合成寡核苷酸<220>
<221>未知特征<222>(7)..(112)<223>頂端的鏈引物P0056<400>50aggtctctag agaaaaggca tgctgaaggt acttttactt ctgatgtttc ttcttatttg60gaaggtcaag ctgctaaaga atttattgct tggttggtta aaggtagggt acctgata 118<210>51<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>底端的鏈合成寡核苷酸<220>
<221>未知特征<222>(9)..(108)<223>底端的鏈引物P0057<400>51tatcaggtac cctaccttta accaaccaag caataaattc tttagcagct tgaccttcca60aataagaaga aacatcagaa gtaaaagtac cttcagcatg ccttttctct agagacct 118<210>52<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由pREX00052編碼的N-末端側翼肽<400>52Arg Ser Leu Glu Lys Arg1 5<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0070
<400>53gctatgacca acaagtgtct c 21<210>54<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0071<400>54cgcacctgtg gcgccggtga tg 22<210>55<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IFN β-1融合到mTf上的融合物的序列<220>
<221>未知特征<222>(18)..(48)<223>引物P0082序列<400>55ctgcttactc taggtctcta gagaaaacag ggtacctccg aaacgtacct gataaaactg60<210>56<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IFN β-1融合到mTf上的融合物的序列<220>
<221>未知特征<222>(17)..(39)<223>引物P0083序列<400>56cagttttatc aggtacgttt cggaggtacc ctgttttctc tagagaccta gagtaagcag60<210>57<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MFa-l序列<400>57Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Glu Lys1 5<210>58<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IFN-B-1序列<400>58Thr Gly Tyr Leu Arg Asn1 5<210>59<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>mTf序列<400>59Val Pro Asp Lys Thr1 5<210>60<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0084<400>60ctctaggtct ctagagaaaa ggagctacaa cttgcttgga ttc43<210>61<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0085<400>61gtctgaatgt cccatggagg ctttg25<210>62<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0086<400>62actttccgtc gacctagcta caacttgctt ggattc36<210>63<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P0087<400>63tgaatgtcca atggaggctt tgattatttc gaattaagaa tactaaatac 50<210>64
<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GLP-1(7-37)氨基酸序列<400>64His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>65<211>757<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(564)<223>GenBank登錄號NM_002176，干擾素-β1<400>65atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg ttg tgc ttc tcc48Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga96Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg 144Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45ctt gaa tat tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag 192Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc 240Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct 288Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc 336Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag 384Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125aaa gaa gat ttt acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa 432Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt 480Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac 528His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175
ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga agatctccta 574Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185gcctgtccct ctgggactgg acaattgctt caagcattct tcaaccagca gatgctgttt634aagtgactga tggctaatgt actgcaaatg aaaggacact agaagatttt gaaattttta694ttaaattatg agttattttt atttatttaa attttatttt ggaaaataaa ttatttttgg754tgc 757<210>66<211>187<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>66Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln lle Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210>67<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pREX0052X的baI/KpnI區(qū)域<400>67aggtctctag agaagagggt acctgata 28
<210>68<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pREX0052的SalI/HindIII區(qū)域<400>68actttccgtc gaccttaata agcttaattc 30<210>69<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由pREX0052的XbaI/KpnI區(qū)域編碼的氨基酸序列<400>69Arg Ser Leu Glu Lys Arg Val Pro Asp1 5<210>70<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由pREX0052的SalI/HindIII區(qū)域編碼的氨基酸序列<400>70Thr Phe Arg Arg Pro1 5<210>71<211>450<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(45)..(377)<223>GenBank登錄號NM_000207，人胰島素<400>71gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgcc atg gcc ctg tgg 56Met Ala Leu Trp1atg cgc ctc ctg ccc ctg ctg gcg ctg ctg gcc ctc tgg gga cct gac 104Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Trp Gly Pro Asp5 10 15 20cca gcc gca gcc ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc tca cac ctg gtg 152Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val25 30 35gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc ttc tac aca ccc 200Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro40 45 50aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg cag gtg gag ctg 248Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu55 60 65
ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg gcc ctg gag ggg296Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly70 75 80tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt acc agc atc tgc344Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys85 90 95 100tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac tag acgcagcccg caggcagccc 397Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn105 110cccacccgcc gcctcctgca ccgagagaga tggaataaag cccttgaacc agc 450<210>72<211>110<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>72Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly20 25 30Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe35 40 45Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly50 55 60Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu65 70 75 80Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys85 90 95Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn100 105 110<210>73<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰島素序列的5’引物<400>73tttgtgaacc aacacctgtg cggc 24<210>74<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰島素序列的3’引物<400>74gttgcagtag ttctccagct ggtagaggga gcag 34<210>75<211>289
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述質粒pREX0052N-胰島素<220>
<221>CDS<222>(1)..(288)<400>75gct tac tct agg tct cta gat aag agg ttt gtg aac caa cac ctg tgc48Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15ggc tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc96Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly20 25 30ttc ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg 144Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val35 40 45ggg cag gtg gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc 192Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro50 55 60ttg gcc ctg gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc 240Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys65 70 75 80tgt acc agc atc tgc tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac gta c 289Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Val85 90 95<210>76<211>96<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述質粒pREX0052N-胰島素<400>76Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly20 25 30Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val35 40 45Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro50 55 60Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys65 70 75 80Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Val85 90 95<210>77<211>49<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’胰島素克隆引物<400>77gcttactcta ggtctctaga taagaggttt gtgaaccaac acctgtgcg 49<210>78<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰島素的接頭<400>78ctggagaact actgcaacgt ac 22<210>79<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于克隆胰島素的接頭<400>79gttgcagtag ttctccag18<210>80<211>290<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述質粒pREX0052 C-胰島素<220>
<221>CDS<222>(1)..(276)<400>80tgc act ttc cgt cga cct ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc tca cac48Cys Thr Phe Arg Arg Pro Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His1 5 10 15ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc ttc ttc tac96Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr20 25 30aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg ggg cag gtg 144Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val35 40 45gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc ttg gcc ctg 192Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu50 55 60gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc tgt acc agc 240Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser65 70 75 80
atc tgc tcc crc tac cag ctg gag aac tac tgc aac taataagctt aatt290Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn85 90<210>81<211>92<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述質粒pREX0052C-胰島素<400>81Cys Thr Phe Arg Arg Pro Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His1 5 10 15Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr20 25 30Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val35 40 45Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu50 55 60Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser65 70 75 80Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn85 90<210>82<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’胰島素克隆引物<400>82tgcactttcc gtcgaccttt tgtgaaccaa cacctgtgcg40<210>83<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3’胰島素克隆引物<400>83aattaagctt attagttgca gtagttctcc ag32<210>84<211>676<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>84Val Thr Glu Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Asn Asp His Glu Ala1 5 10 15
Ser Lys Cys Ala Asn Phe Arg Asp Ser Met Lys Lys Val Leu Pro Glu20 25 30Asp Gly Pro Arg Ile Ile Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys35 40 45Ile Lys Ala Ile Ala Ala His Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala50 55 60Gly Leu Val His Glu Ala Gly Leu Thr Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val65 70 75 80Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Tyr85 90 95Ala Val Ala Leu Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asn Glu Leu100 105 110Gln Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp115 120 125Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys130 135 140Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Ser Phe Phe Ser Gly Ser Cys Val Pro145 150 155 160Cys Ala Asp Gly Ala Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly165 170 175Cys Gly Cys Ser Ser Val Gln Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe180 185 190Lys Cys Leu Lys Asp Gly Leu Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Gln Glu195 200 205Thr Ile Phe Glu Asn Leu Pro Ser Lys Asp Glu Arg Asp Gln Tyr Glu210 215 220Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Glu Gln225 230 235 240Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val245 250 255Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu260 265 270His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Gly Asp Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro275 280 285His Gly Lys Asn Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Tyr Gly Phe Phe Lys290 295 300Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Asn Leu Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val305 310 315 320Thr Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Gly Ile Cys Pro Asp Pro Leu Gln325 330 335Asp Glu Cys Lys Ala Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg340 345 350Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Thr Ser Gly Gly Leu Ile Glu Cys355 360 365Glu Ser Ala Glu Thr Pro Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly370 375 380
Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Ile Ala Gly385 390 395 400Gln Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu Ser Thr Asp405 410 415Cys Lys Lys Ala Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Ser Val Ala Val Val Lys420 425 430Lys Ser Asn Pro Asp Ile Asn Trp Asn Asn Leu Glu Gly Lys Lys Ser435 440 445Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly450 455 460Leu Leu Tyr Asn Arg Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Arg465 470 475 480Gln Gly Cys Ala Pro Gly Ser Gln Lys Asn Ser Ser Leu Cys Glu Leu485 490 495Cys Ile Gly Pro Ser Val Cys Ala Pro Asn Asn Arg Glu Gly Tyr Tyr500 505 510Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala515 520 525Phe Val Lys Ser Gln Thr Val Leu Gln Asn Thr Gly Gly Arg Asn Ser530 535 540Glu Pro Trp Ala Lys Asp Leu Lys Glu Glu Asp Phe Glu Leu Leu Cys545 550 555 560Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Glu Ala His Asn Cys His Leu565 570 575Ala Lys Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Lys Asp Lys Ala Ala580 585 590Cys Val Lys Gln Lys Leu Leu Asp Leu Gln Val Glu Tyr Gly Asn Thr595 600 605Val Ala Asp Cys Ser Ser Lys Phe Cys Met Phe His Ser Lys Thr Lys610 615 620Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Lys Cys Leu Val Asp Leu Arg Gly625 630 635 640Lys Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Asp Tyr Ile Lys Ala Val645 650 655Ser Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Arg Leu Leu Glu Ala Cys Thr660 665 670Phe His Lys His675<210>85<211>676<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>85Val Pro Asp Lys Thr Val Lys Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Asn1 5 10 15Thr Lys Cys Ile Ser Phe Arg Asp His Met Lys Thr Val Leu Pro Ala20 25 30
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<221>未知特征<222>(308)..(308)<223>Xaa可以是任何天然氨基酸<400>89Val Ala Gln Lys Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Asn Gln Glu Ala1 5 10 15Asn Lys Cys Ser Ser Phe Arg Glu Asn Met Ser Lys Ala Val Lys Asn20 25 30
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Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Val Ala Leu Asp Gly Gly Leu Val Tyr385 390 395 400Thr Ala Gly Val Cys Gly Leu Val Pro Val Met Ala Glu Arg Tyr Asp405 410 415Asp Glu Ser Gln Cys Ser Lys Thr Asp Glu Arg Pro Ala Ser Tyr Phe420 425 430Ala Val Ala Val Ala Arg Lys Asp Ser Asn Val Asn Trp Asn Asn Leu435 440 445Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp450 455 460Val Ile Pro Met Gly Leu Ile His Asn Arg Thr Gly Thr Cys Asn Phe465 470 475 480Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Pro Pro Asn Ser485 490 495Arg Leu Cys Gln Leu Cys Gln Gly Ser Gly Gly Ile Pro Pro Glu Lys500 505 510Cys Val Ala Ser Ser His Glu Lys Tyr Phe Gly Tyr Thr Gly Ala Leu515 520 525Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Ile Gln His Ser Thr530 535 540Val Glu Glu Asn Thr Gly Gly Lys Asn Lys Ala Asp Trp Ala Lys Asn545 550 555 560Leu Gln Met Asp Asp Phe Glu Leu Leu Cys Thr Asp Gly Arg Arg Ala565 570 575Asn Val Met Asp Tyr Arg Glu Cys Asn Leu Ala Glu Val Pro Thr His580 585 590Ala Val Val Val Arg Pro Glu Lys Ala Asn Lys Ile Arg Asp Leu Leu595 600 605Glu Arg Gln Glu Lys Arg Phe Gly Val Asn Gly Ser Glu Lys Ser Lys610 615 620Phe Met Met Phe Glu Ser Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Leu625 630 635 640Thr Lys Cys Leu Phe Lys Val Arg Glu Gly Thr Thr Tyr Lys Glu Phe645 650 655Leu Gly Asp Lys Phe Tyr Thr Val Ile Ser Ser Leu Lys Thr Cys Asn660 665 670Pro Ser Asp Ile Leu Gln Met Cys Ser Phe Leu Glu Gly Lys675 680 68權利要求
1.包含被融合到治療性蛋白質或肽上的被修飾的轉鐵蛋白(Tf)的融合蛋白，其中Tf蛋白的糖基化減少，金屬結合降低或受體結合降低。
2.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽選自包含β-干擾素(IFN)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、促紅細胞生成素模擬肽(EMP1)、T-20、胰島素和可溶的毒素受體的組。
3.權利要求2的融合蛋白，其中可溶的毒素受體是突觸結合蛋白I。
4.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽或者可溶的毒素受體被融合到Tf的C末端。
5.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽或者可溶的毒素受體被融合到Tf的N末端。
6.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽或者可溶的毒素受體被插入到Tf的至少一個環(huán)中。
7.權利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白質對轉鐵蛋白受體(TfR)的親合性下降。
8.權利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳鐵蛋白。
9.權利要求7的融合蛋白，其中Tf蛋白不結合TfR。
10.權利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對鐵的親合性下降。
11.權利要求10的融合蛋白，其中Tf蛋白不結合鐵。
12.權利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一個防止糖基化的突變。
13.權利要求12的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳鐵蛋白。
14.權利要求1的融合蛋白，其在存在衣霉素時被表達。
15.權利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白質的N-結構域的部分、橋連肽和Tf蛋白質的C-結構域的部分。
16.權利要求15的融合蛋白，其中橋連肽將治療性蛋白質或肽連接到Tf上。
17.權利要求15的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽被插入到Tf蛋白質的N末端和C-結構域之間。
18.權利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白質在鉸鏈區(qū)包含至少一個氨基酸取代、刪除或添加。
19.權利要求18的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)選自SEQ ID NO3的約殘基94到約殘基96、SEQ ID NO3的約殘基245到約殘基247、SEQ IDNO3的約殘基316到約殘基318、SEQ ID NO3的約殘基425到約殘基427、SEQ ID NO3的約殘基581到約殘基582或SEQ ID NO3的約殘基652到約殘基658。
20.權利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白質在SEQ ID NO3中的選自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458或Gly 459的位置上具有至少一個氨基酸取代、刪除或添加。
21.權利要求6的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽替換Tf的至少一個環(huán)。
22.權利要求12的融合蛋白，其中糖基化位點選自對應于SEQ ID NO3的氨基酸N413和SEQ ID NO3的N611的氨基酸殘基組成的組。
23.權利要求7或9的融合蛋白，其中所述Tf蛋白質在SEQ ID NO3的選自Asp 63、Gly 65、Tyr 95、Tyr 188、Lys 206、His 207、His 249、Asp 392、Tyr 426、Tyr 514、Tyr 517、His 585、Thr 120、Arg 124、Ala 126、Gly 127、Thr 452、Arg 456、Ala 458或Gly 459的位置上具有至少一個氨基酸取代、刪除或添加。
24.權利要求4的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸殘基被刪除。
25.權利要求4的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸環(huán)被刪除。
26.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽的血清半衰期被延長，超過了未被融合的治療性蛋白質或肽或可溶的毒性受體的血清半衰期。
27.權利要求1的融合蛋白，其中Tf融合蛋白不結合TfR。
28.權利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化減少或無糖基化。
29.權利要求28的融合蛋白，包含至少一個防止糖基化的突變。
30.編碼權利要求1的融合蛋白的核酸分子。
31.包含權利要求30的核酸分子的載體。
32.包含權利要求31的載體的宿主細胞。
33.包含權利要求30的核酸分子的宿主細胞。
34.表達Tf融合蛋白的方法，包括在表達被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權利要求32的宿主細胞。
35.表達Tf融合蛋白的方法，包括在表達被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權利要求33的宿主細胞。
36.權利要求32的宿主細胞，其中該細胞是原核細胞或真核細胞。
37.權利要求33的宿主細胞，其中該細胞是原核細胞或真核細胞。
38.權利要求36的宿主細胞，其中該細胞是酵母細胞。
39.權利要求37的宿主細胞，其中該細胞是酵母細胞。
40.包含權利要求30的核酸分子的轉基因動物。
41.制備Tf融合蛋白的方法，包括從權利要求40的轉基因動物中分離融合蛋白。
42.權利要求41的方法，其中Tf融合蛋白包含乳鐵蛋白。
43.權利要求42的方法，其中融合蛋白從來自轉基因動物的生物體液中分離。
44.權利要求42的方法，其中體液是血清或乳汁。
45.在患者中治療疾病或疾病病癥的方法，包括施用權利要求1的融合蛋白的步驟。
46.權利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在該蛋白的各端具有N-結構域。
47.權利要求46的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽或可溶的毒素受體與Tf蛋白的各個N-結構域融合。
48.權利要求2的融合蛋白，其中可溶的毒素受體特異地結合毒素。
49.權利要求2的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽是β-IFN、GLP-1、促紅細胞生成素模擬肽(EMP1)、T-20、胰島素或可溶的毒素受體的類似物，其中該類似物可有效用于治療、預防或緩解疾病、病癥或紊亂。
50.藥物組合物，包含權利要求1、2或3的融合蛋白以及載體。
51.治療個體的方法，包括給個體施用治療有效量的權利要求1的融合蛋白。
52.權利要求51的方法，其中該個體患有多發(fā)性硬化、腦瘤、皮膚癌、乙型肝炎或丙型肝炎，并且其中融合蛋白包含β-IFN或其類似物。
53.權利要求52的方法，其中該個體患有多發(fā)性硬化。
54.權利要求51的方法，其中該個體患與健康個體相比的高水平的葡萄糖，并且其中融合蛋白包含GLP-1或其類似物。
55.權利要求54的方法，其中高水平的葡萄糖與糖尿病相關。
56.權利要求55的方法，其中糖尿病是II型糖尿病。
57.權利要求51的方法，其中個體遭受與健康個體相比的低或缺乏紅細胞生成，其中融合蛋白包含EMP1或其類似物。
58.權利要求57的方法，其中低或缺乏紅細胞生成與貧血、β-地中海貧血、妊娠或月經(jīng)紊亂、類風濕性關節(jié)炎、AIDS或癌癥有關。
59.權利要求51的方法，其中個體患有由逆轉錄病毒傳播引起的疾病，并且其中治療性肽是病毒侵入的抑制劑。
60.權利要求59的方法，其中逆轉錄病毒是人逆轉錄病毒。
61.權利要求60的方法，其中人逆轉錄病毒選自HIV-1、HIV-2和人T-淋巴細胞病毒I(HTLV-1)、HTLV-II和HTLV-III組成的組。
62.權利要求59的方法，其中逆轉錄病毒是非人類逆轉錄病毒。
63.權利要求62的方法，其中非人類逆轉錄病毒選自牛白血性增生病毒、貓科肉瘤和白血病病毒、猿肉瘤和白血病病毒以及綿羊漸進性肺炎病毒組成的組。
64.權利要求59的方法，其中抑制劑是T-20、T-1249或其類似物。
65.權利要求59的方法，其中疾病是AIDS。
66.預防或治療與毒素相關的疾病或病癥的方法，包括給個體施用治療有效量的包含被融合到可溶的毒素受體的被修飾Tf蛋白的融合蛋白，其中被修飾的Tf蛋白的糖基化減少、金屬結合下降或受體結合下降。
67.權利要求66的方法，其中可溶的毒素受體選自炭疽毒素受體、肉毒桿菌毒素受體和白喉毒素受體。
68.權利要求67的方法，其中可溶的肉毒桿菌毒素受體是突觸結合蛋白的氨基酸1-53(SEQ ID NO4)。
69.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽被插入到一個或多個轉鐵蛋白的環(huán)中。
70.權利要求69的融合蛋白，其中治療性蛋白質被插入到5個轉鐵蛋白環(huán)的每一個中。
71.權利要求2的融合蛋白，其中GLP-1在N末端還包含其它氨基酸。
72.權利要求71的融合蛋白，其中氨基酸是Gly。
73.權利要求71的融合蛋白，其中GLP-1類似物被融合到被修飾的轉鐵蛋白的N末端。
74.調節(jié)個體中的葡萄糖水平的方法，包括給個體施用治療有效量的包含被融合到GLP-1或其類似物上的被修飾的Tf蛋白的融合蛋白，其中被修飾的Tf蛋白的糖基化減少、金屬結合下降或者受體結合下降。
75.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽在SEQ ID NO3中的選自Asp33、Asn55、Asn75、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231和Cys241組成的組的一個或多個位點上被插入到mTf的N-結構域中。
76.權利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽在SEQ ID NO3中的對應于Asp33、Asn55、Asn75、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231或Cys241的一個或多個位點上被插入到mTf的C-結構域。
77.權利要求75的融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽還在SEQ ID NO3中的對應于Asp33、Asn55、Asn75，、Asp90、Gly257、Lys280、His289、Ser298、Ser105、Glu141、Asp166、Gln184、asp197、Lys217、Thr231或Cys241的一個或多個位點上被插入到mTf中。
78.權利要求2的融合蛋白，其中治療性肽是EMP1，而其中EMP1在選自SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一個或多個位點上被插入到mTf的N-結構域中。
79.權利要求2的融合蛋白，其中治療性肽是EMP1，而其中EMP1在選自SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一個或多個位點上被插入到mTf的C-結構域中。
80.權利要求78的融合蛋白，其中治療性肽還在對應于SEQ ID NO3的His289和SEQ ID NO3的Asp166的一個或多個位點上被插入到mTf的C-結構域中。
81.權利要求1融合蛋白，其中mTf還通過刪除C末端的Pro來被修飾。
82.權利要求81的融合蛋白，其中mTf還通過刪除與C末端的Pro相鄰的Arg-Arg來修飾。
83.權利要求1的融合蛋白，其中mTf還通過去除SEQ ID NO3的Cys402和Cys674之間的二硫鍵來修飾。
84.權利要求83的融合蛋白，其中通過將SEQ ID NO3的Cys402和Cys674突變?yōu)镚ly殘基來去除二硫鍵。
85.權利要求82的融合蛋白，其中mTf還通過將SEQ ID NO3的Cys402和Cys674突變?yōu)镚ly殘基來修飾。
86.權利要求1融合蛋白，其中治療性蛋白質或肽被插入到一個或多個選自N1(286-292)、N2(162-170)、C1(489-495)和C2(623-628)的SEQ ID NO3的環(huán)中。
87.權利要求1融合蛋白，其中被修飾的Tf蛋白包含單一的N-結構域。
88.權利要求51的方法，其中該個體患與健康個體相比的高水平的葡萄糖，并且其中融合蛋白包含胰島素或其類似物。
89.權利要求88的方法，其中高水平的葡萄糖是與糖尿病相關。
全文摘要
公開了轉鐵蛋白與包括可溶的毒素受體的治療性蛋白或肽的被修飾的融合蛋白，其血清半衰期或者血清穩(wěn)定性被提高。優(yōu)選的融合蛋白包括那些使轉鐵蛋白部分不發(fā)生或減少糖基化，結合鐵和/或結合轉鐵蛋白受體的修飾。
文檔編號C07K7/06GK1713920SQ03824739
公開日2005年12月28日 申請日期2003年8月28日 優(yōu)先權日2002年8月30日
發(fā)明者克里斯托弗·P·普里奧爾, 查爾－休伊·萊, 霍馬揚·薩德吉, 安德魯·J·特納 申請人:比奧雷克西斯藥物公司